JPH0149367B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（技術分野） 本発明は、免疫血清学的診断試薬に有効なラテ
ツクスの製造方法に関する。 （技術分野） 免疫血清学の進歩に伴い、臨床検査における技
術の向上はめざましい。免疫血清学検査は、試験
管を用いて行われ、血清希釈にはメスピペツトが
使用される。このような試験管やピペツトによる
作業の繁雑さと、検査件数の増加に伴う大量の検
体処理とが免疫血清学検査の精度を低くしている
原因でもある。しかし、臨床検査の自動化導入に
よつて、免疫血清学検査の領域においても患者か
らの採血量を少なくし、微量の検査材料で正確な
検査データが得られる微量検査法（マイクロタイ
ター法）が実施されるに至つている。このマイク
ロタイター法は1955年ハンガリーのTakatsyによ
つて考案され、さらに、1962年に、アメリカの
Severによつて改良された。1963年にアメリカで
マイクロタイターキツトが市販されて以来、これ
が免疫血清学的検査に採用され、世界中で使用さ
れるようになつた。1967年、アメリカのCDC
（Center for Disease Control）がこれを補体結
合反応の標準検査法として採用した。Public
Health Serviceのトレーニングマニユアルにマ
イクロタイター法の手法が使用されている。我国
では、ウイルス学の研究者によつて比較的はやく
紹介され、輸入品によつてウイルスの血清学的検
査（血球凝集反応、血球凝集阻止反応、補体結合
反応など）や細胞・組織などの培養が行なわれて
いる。これらマイクロタイター法の特徴は、微
量の血清で多項目の検査ができること；操作が
簡便で多数の検体を短時間で迅速に希釈すること
ができること；抗原、抗血清、試薬などが現行
法にくらべ少量ですみ経済的であること；１枚
のプレートで全体の反応がみられ、凝集像や溶血
が鮮明で判定しやすいこと；現行法との反応の
感度や精度が変わらず、再現性もよいことなどで
ある。これらマイクロタイター法に用いられる血
球の主流はヒツジ赤血球およびニワトリの血球で
ある。これら動物血球を用いた場合には血球の腐
敗および変性が激しく、長期の保存性に欠けるこ
と、および固体差が大きいために検査値のバラツ
キ幅が広く正確なデータがなかなか得られないこ
と等の問題がある。そのうえ、血球そのもの自体
に抗原を含んでいるため、これが検査を受ける血
清中の種々の抗原と反応し、その結果、まぎらわ
しい反応を起こしやすい。これら血球の代替品と
して近年、合成ラテツクスが用いられつつある。
例えば、特開昭51−9716号公報には合成ラテツク
ス試薬が開示されている。この合成ラテツクスは
界面活性剤（乳化剤）を用いて製造される。この
他にも界面活性剤を用いた合成ラテツクス試薬が
知られている。その製法は、例えば、水中にアニ
オン系、ノニオン系またはカチオン系の乳化剤を
混合したもの、スチレンモノマーや水溶性ラジカ
ル開始剤等を共存させて、好ましくは酸素を除い
た雰囲気で、適当な温度に適当な時間保つという
ものである。合成されたこれらラテツクスは、一
般には、重合の際に用いた乳化剤の一部がポリス
チレンラテツクス粒子の表面に吸着されるか化学
的に結合され、残りはラテツクス中に遊離の状態
で存在する。これらの状態の間には乳化剤のポリ
スチレンラテツクス粒子表面に対する吸着脱着平
衡が成立している。このように通常の方法で製造
されるポリスチレンラテツクスにおいては乳化剤
は安定なラテツクスの形成に不可欠であるが、そ
の反面、遊離の乳化剤は前述の抗原または抗体に
よるラテツクスの凝集反応に対して好ましくない
影響を与える。診断試薬を製造するには、まず、
既述のようにポリスチレンラテツクスに抗原また
は抗体を感作させる。しかし、遊離の乳化剤を含
むラテツクスを用いるとこの段階ですでに凝集し
てしまう。次に、抗原または抗体を感作させたラ
テツクスを用いてこの抗原または抗体に反応する
抗体または抗原をラテツクスの凝集反応によつて
検出する際には、検出されるべき抗体または抗原
を含む血清と接触すれば感作ラテツクスは凝集
し、かかる抗体または抗原を含まない血清と接触
しても感作ラテツクスは凝集しないことが必須要
件とされるにもかかわらず、これら遊離の乳化剤
を含む感作ラテツクスの場合には陰性血清と接触
しても凝集してしまい、いわゆる非特異的凝集反
応となることが多い。これら乳化剤をラテツクス
からイオン交換法や透析法の技術を用いて除くこ
とは可能であるが、これら遊離の乳化剤をラテツ
クスから除いてしまうと、前述の如く遊離の乳化
剤とラテツクス粒子表面に吸着された乳化剤との
間の吸着脱着平衡の成立によるラテツクス安定化
がくずれてしまい、ラテツクスの安定性は極端に
悪くなり実際上は使用不可能となつてしまう。特
開昭57−14610にはスチレンを乳化剤の不存在下
に過硫酸塩を重合開始剤として水中で重合させた
後アルカリ性条件下で加熱して得られるラテツク
スの開示がある。このようにして得られたラテツ
クスを試薬化すると乳化剤を使用していないため
非特異的凝集反応が起こらない。かつラテツクス
の安定性にも優れている。しかし、このようなラ
テツクスは比重が小さいため、ラテツクスを試薬
化して、検体との凝集性を調べる場合には長い時
間を必要とする。 （発明の目的） 本発明の目的は、ロツト間のバラツキがなく長
期間安定に保持しうる診断試薬用ラテツクスの製
造方法を提供することである。本発明の他の目的
は、自己凝集および非特異凝集が少なく誰もが簡
単にしかも短時間で評価できる、マイクロタイタ
ー法に最適なソープフリー系ラテツクスの製造方
法を提供することにある。本発明のさらに他の目
的は、高精度で検査値を得ることのできるラテツ
クスの製造方法を提供することにある。本発明の
さらに他の目的は、所望の粒径および比重のラテ
ツクスを製造しうる方法を提供することにある。 （発明の構成） 本発明の診断試薬用ラテツクスの製造方法は、
スチレンを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開始剤
として重合させ重合体粒子の懸濁液を得る工程、
該懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱処理する工
程、そして該懸濁液を塩素化処理する工程を包含
し、そのことにより上記目的が達成される。 本発明において開始剤として用いられる過硫酸
塩としては、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫
酸カリウム、過硫酸ナトリウムなどがある。これ
らの過硫酸塩のスチレンに対する割合は８重量％
以下、好ましくは0.09〜６重量％、さらに好まし
くは0.1〜５重量％である。 本発明では共重合反応は、水の仕込まれた反応
器にスチレンと開始剤とを加えて撹拌しながら加
熱して重合反応を行う。スチレンを単独重合させ
た後、アルカリ性条件下で加熱する。アルカリ性
条件下で加熱されることにより開始剤の過硫酸が
分解される。このときの加熱温度は、通常、50〜
100℃好ましくは60〜85℃である。このときの加
熱時間は0.3〜50時間、好ましくは５〜30時間で
ある。その際の反応系のPHは7.5〜12.5特に8.0〜
11.5の範囲に保たれるのがよい。加熱処理された
懸濁液は、次いで、塩素化処理に供される。その
ときの温度は、懸濁液の仕込み量および処理条件
により異なるが、通常、５〜65℃好ましくは10〜
60℃である。最終塩素化量は５〜40％好ましくは
10〜30％である。塩素化処理時間は10〜500分好
ましくは30〜400分であり、より好ましくは60〜
360分である。 上記処理条件を外れると、得られるラテツクス
の表面の損傷が激しく自己凝集の原因となる。か
りにうまく処理できても今度はラテツクス自体の
比重が大きすぎてマイクロタイター法等で評価し
たとき早く沈降しすぎ、±〜＋付近の凝集がすべ
て逆転してしまい正確なデータが得られない。 本発明によれば、重合および塩素化の反応条件
をコントロールすることにより所望の粒径と比重
のラテツクスが得られる。このようにして得られ
たラテツクスは、非特異的凝集反応を起こさない
ためマイクロタイター法に用いられるラテツクス
として特に好適である。ラテツクスの比重は1.4
前後がマイクロタイター用として適している。 （実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。 実施例 １ (A) ラテツクスの調製：スチレンモノマー75ｇ、
過硫酸カリウム0.40ｇおよびイオン交換水450
ｇを反応容器に仕込んだ。そして、容器を窒素
ガスで置換し反応温度を68℃〜72℃の範囲にお
さまるようコントロールしながら28時間重合さ
せた。重合終了後、ラテツクス懸濁液のPHを
8.5に調節した。これを、次いで、70℃で24時
間PH8.5に保ちながら反応させた。反応器を停
止し容器からラテツクスを取り出し東洋濾紙No.
２（直径12.5CM）を用いて濾過精製処理を行な
つた。次いで、70℃乾燥機を用いてこのラテツ
クスを乾燥し、得られた精製固型分を秤量した
ところ、12.1（Ｗ／Ｗ）％であつた。次に、３
反応容器に水1800ｇと、精製ラテツクスを蒸
留水で10％に希釈したラテツクス430ｇとを投
入したのち、100Wの水銀灯下において反応温
度を25〜27℃に保ちながら160分間塩素ガスを
吹きこみ塩素化処理した。窒素ガスで容器内を
127分間置換した後、得られた塩素処理ラテツ
クスを取り出し東洋濾紙No.２を用いて濾過精製
処理した。塩素化処理後のラテツクス中の塩素
量は反応溶液中のHCl分析を行なつた結果26.4
％であつた。塩素処理後のラテツクスを電子顕
微鏡で観察した結果、平均粒径は0.49μｍそし
て粒径のバラツキは変動係数（粒径の標準偏
差／平均粒径）で表して0.009であつた。この
ラテツクスの比重は1.40であつた。 (B) Ｒ―PHA法凝集反応によるラテツクス評
価：(A)項で得られたポリスチレンラテツクスを
PH7.4のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％と
したもの１容と、モルモツトの産生したHBs
モノスペシフイツクス抗体（セフアローズ4B
に固定したHBs抗原のカラムに２回通液した
アフイニテイークロマトグラフイーによる精製
品）を同じくリン酸緩衝液中に40μｇ／mlの濃
度に溶解したもの１容とを混合し、37℃で60分
間インキユベートしてラテツクスに抗体を結合
させた。次に、この感作ラテツクスを
15000rpmにて15分間遠心分離し、未吸着の抗
体を除去した。この上澄中の抗体価はPHA（受
身赤血球凝集反応）法により測定され少なくと
も99.5％以上の抗体がラテツクスに吸着してい
ることがわかつた。この沈降したラテツクスを
18000rpmで８分間遠心分離し、上澄み液を捨
て、沈降した処理後の感作ラテツクスをPH7.0
のリン酸緩衝液に再分散してラテツクス試薬の
調製を終了した。このようにして調製されたラ
テツクスを用い現在市販されているリバーセル
（山の内製薬製）のうちの感作赤血球を該ラテ
ツクスにおきかえてＲ―PHA（逆受身血球凝集
反応）試験法を試みた。 マイクロタイターにマイクロドロツパーを用い
緩衝液50μを各管に分注した。そして、1μｇの
HBs抗原を含む検体50μを取り出し、すみやか
にダイリユーターで倍々希釈した。そして、上記
方法で得られたラテツクスを50μ管に分注した
のちミキサーで30秒間振盪した。これを270分
間・420分間静置後凝集像を判定した。比較のた
めに、ラテツクスの代わりにあらかじめヒツジ赤
血球に抗HBs抗体を吸着させたＲ―PHAセルを
同時に用いラテツクス凝集との比較として評価し
た。その結果を第１表および第２表に示す。第１
表および第２表は、それぞれ270分間静置後およ
び420分間静置後の凝集像の判定結果である。な
お以下の表における符号の意味は次の通りであ
る。 − ：凝集が認められない ± ：ゆるやかな凝集が認められる ＋ ：明瞭な凝集が認められる ＋＋：完全な凝集が顕著に認められる

【表】

【表】 以上の試験結果から、本発明によるラテツクス
は、乳化剤が使用されていないため、自己凝集お
よび非特異凝集が少なく、保存性に優れロツト間
のバラツキもないことがわかる。粒子がよく揃い
かつ比重が比較的大きいため凝集反応を、だれも
が簡単に、しかも短時間で評価できる。しかも検
査値への影響が少なくマイクロタイター法等にも
つとも適したラテツクスであることが明らかであ
る。 比較例 (A) ラテツクスの調製：スチレンモノマー90ｇ、
ノニオン乳化剤（第一工業製薬社製、エマルジ
ツト49）２ｇ、過硫酸カリウム0.6ｇおよびイ
オン交換水450ｇを反応容器に仕込み、容器を
窒素ガスで置換し反応温度を70〜72℃の範囲に
おさまるようコントロールしながら24時間重合
した。得られたラテツクスを電子顕微鏡で観察
した結果、平均粒径は0.75μｍそして粒径のバ
ラツキは変動係数で表して0.127であつた。こ
のラテツクスの比重は1.04であつた。 (B) Ｒ―PHA法凝集反応によるラテツクス評
価：(A)項で得られたポリスチレンラテツクスを
PH7.4のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％と
したもの１容と、モルモツトの産生したHBs
モノスペシフイツクス抗体（セフアローズ4B
に固定したHBs抗原のカラムに２回通液した
アフイニテイークロマトグラフイーによる精製
品）を同じくリン酸緩衝液中に40μｇ／ml濃度
に溶解したもの１容とを混合し、37℃で、60分
間インキユベートしてラテツクスに抗体を結合
させた。次に、この感作ラテツクスを
15000rpmにて15分間遠心分離し、未吸着の抗
体を除去した。この沈降したラテツクスを
15000rpmで15分間遠心分離し、上澄液を捨て、
沈降した処理後の感作ラテツクスをPH7.0のリ
ン酸緩衝液に再分散してラテツクス試薬の調製
を終了した。このようにして調製されたラテツ
クスを用い市販のリバーセル（山の内製薬製）
のうちの感作赤血球を該ラテツクスにおきかえ
てＲ―PHA（逆受身血球凝集反応）試験法を試
みた。 マイクロタイターにマイクロドロツパーを用い
て緩衝液50μを各管に分注した。次に、1μｇの
HBs抗原を含む検体50μを取り出し、すみやか
にダイリユーターで倍々希釈した。そして上記方
法で得られたラテツクスを50μ各管に分注した
のちミキサーで分注後30秒間振盪した。そして、
これを270分間および420分間静置して後、得られ
る凝集像を判定した。270分間・420分間後の判定
では静置前と全く凝集像の変化は認められなかつ
た。(A)項で得られたラテツクスを用い実施例に準
じてラテツクス試薬を調製しこれを用いて種々の
濃度のHBs抗原を含むヒト血清に対する凝集の
強さを測定した。その結果を第３表に示す。

【表】 次に、リバーセイア（HBs抗原検出EIAキツト
山の内製薬製）を用いて、血清中のHBs抗原
が0.4ng／ml以下であることが判明している158人
の正常なヒト血清について同様のテストを行つ
た。158検体中、陽性が20件そして偽陽性が27件
であつた。 以上の試験結果より、比較例のラテツクスを使
用し試薬化したラテツクスは非特異的な凝集反応
を起こすことが明らかである。 （発明の効果） 本発明によれば、このように、乳化剤を全く含
まないにもかかわらず、常時は安定で抗原抗体反
応に鋭敏に感応して高凝集性が得られるラテツク
スが製造される。このラテツクスはしかも粒径が
よく揃つている。このラテツクスは、乳化剤を全
く含まないために免疫血清学的診断試薬として用
いると、非特異的凝集反応による検査値のバラツ
キがない。ラテツクスの調製時に反応条件をコン
トロールすることにより所望の粒径および比重の
ラテツクスを得ることができる。そのため、この
ラテツクスはマイクロタイター法等に特に偉力を
発揮しうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スチレンを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開
   始剤として重合させ重合体粒子の懸濁液を得る工
   程、該懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱処理す
   る工程、そして該懸濁液を塩素化処理する工程を
   包含する診断試薬用ラテツクスの製造方法。 ２ 前記アルカリ性条件下での加熱処理が50〜
   100℃にて５〜30時間行なわれる特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３ 前記塩素化処理が５〜65℃にて0.3〜50時間
   行なわれる特許請求の範囲第１項に記載の方法。