JPH0134238B2

JPH0134238B2 -

Info

Publication number: JPH0134238B2
Application number: JP56132484A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Tanaka; Isao Uchida
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1981-08-24
Filing date: 1981-08-24
Publication date: 1989-07-18
Also published as: JPS58109498A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はオリゴリボヌクレオチドに関する。本発明のオリゴリボヌクレオチドは、5′末端の
ヒドロキシル基の水素原子が下記一般式（）で
示される基で置換されていると共に、（上記一般式（）中、R¹はフエニル基を、
R²は水素原子を夫々表わすか、又はR¹とR²はＮ
と共にモルホリン環を形成する基を表わす） 2′末端のヒドロキシル基の水素原子が下記一般
式（）で表わされる基で置換されているもので
ある。（上記一般式中、R³は水素原子またはアルコ
キシ基を表わす）具体例を挙げれば、次式（）（上記一般式中、B¹，B²およびB³はそれぞれ
独立して、アデニル基、グアニル基、シトシル基
またはウラシル基を表わす。）で示されるリボヌ
クレオチド三量体、次式（）（上記一般式（）中、B¹，B²，B³は、一般
式（）のB¹，B²，B³と同意義を表わす）で示
される三量体、並びに前記（）式及び（）式
の一般式の化合物においてリボヌクレオチドの数
を２個および４〜12個にかえた二量体および四量
体ないし12量体等が挙げられる。しかして、本発明化合物は、下記(イ)および(ロ)の
反応により容易に製造しうる。 (イ) リボヌクレアーゼ（以下、RNaseと略記）
の逆反応による二量体の製造ジヤーナルオブバイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）第81巻1237〜
1246頁（1977年）に記載の方法に準じ、下記反
応式により製造される。 (ロ) 三量体の製造 (イ)の反応により得られる二量体をプライマー
として、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（以
下、PNPaseと略記）を用いて、2′位のヒドロ
キシル基の水素原子がオルトニトロベンジル基
で置換されたリボヌクレオシドジリン酸を一残
基延長して三量体（）を製造する。反応式は
下記の通り。二量体および四量体以上も同様な方法により
容易に製造しうる。本発明化合物は、オリゴリボヌクレオチド調製
の素材として有用である。すなわち本発明化合物
は5′末端及び2′末端が、夫々前記（）及び
（）式で示される基で置換されている（3′末端
は、2′末端の置換基で立体障害されている）が、
次式のように、酸処理または光照射により、5′末
端または2′末端の置換基を容易に脱離しうる。そして得られた上記式（）および（）で表
わされる化合物は、RNAリガーゼを使用すれば
容易に連結しうる。化合物（）および（）
は、それぞれ5′末端及び2′末端に置換基を有して
いるから収率よく両者が連結した六量体を得るこ
とができる。また得られた六量体は、それぞれ、
5′末端および2′末端に置換基を有している本発明
化合物であるから、一方の置換基を脱離して、再
度オリゴリボヌクレオチド製造の素材とすること
ができる。しかして、種々の塩基配列について（B¹，B²，
B³の種々の組合せについて）、本発明化合物を用
意しておけば、希望に応じて、画一的な反応系で
容易に所望の塩基配列のオリゴリボヌクレオチド
を調製することができる。そして、きまつた塩基
配列のオリゴリボヌクレオチドが得られるなら
ば、特定の遺伝子やメツセンジヤーRNAの調製、
RNAを基質とする酵素の調製などに利用でき、
研究用試薬および遺伝子工学分野の材料として有
用である。以下、本発明方法を実施例によりさらに詳細に
説明する。以下の実施例において、Ｃ、Ａ及びＵ
は何れもリボヌクレオシドで、Ｃは塩基がシトシ
ン、Ａは塩基がアデニン、Ｕは塩基がウラシルで
あるものを表わすaniおよびＭはリン酸アミデー
トを形成したときのアニリン残基

【式】およびモルフオリン残基

【式】を示す。Ｐはフオフエートで、＞Ｐはリボヌクレオシドの2′および
3′位のヒロドロキシ基とエステルを形成している
cyclic Ｐを表わす。 φはリボヌクレオチドの2′―OHの水素と置換
されているオルトニトロベンジル基を表わす。
ppはジフオスフエートを示す。例えば、ani pApUpC〓は（）式においてR¹
がフエニル基、R²は水素原子、B¹がアデニル基、
B²がウラシル基およびB³がシトシル基である化
合物を意味する。実施例１ (1) ani pApUpC〓，pApUpC〓およびani
pApUpCの調製 (イ) ppC〓の調製 C〓300mg（0.8mmol）にPOCl₃0.2ml
（2.18mmol）とPO（OCH₃）₃2.5mlを加え、４
℃で２時間反応させて、pC〓を得た。pC〓に
トリエチルアミンを加えて塩とし、これにｔ
―ブタノール８ml、H₂O8ml、モルフオリン
0.4mlとジシクロヘキシルカルボジイミド0.8
ｇ／ｔ―ブタノール16mlを加えて１時間還流
下反応させ、さらにモルフオリン0.4mlとジ
シクロヘキシルカルボジイミド0.8ｇを加え
て反応させて、pC〓モルフオリデートを得
た。別途リン酸160μlと（nC₄H₉）₃N600μlとを
ピリジン２mlに加え乾固したものにピリジン
２ml、pC〓モルフオリデートを加え、3η℃で
一夜反応させて、ppC〓を得た。収率は30％
であつた。 (ロ) ani pA＞ｐの調製 pAp Ba塩とDowex50×２（100〜200メツ
シユ）アニリン塩と水50mlを混合し、室温で
一夜放置し過して、pApアニリン塩を得
た。 pApアニリン塩0.89mmol、水10mlｔ―ブ
タノール25ml、アニリン１ml、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド2.06ｇを混合し、３時間
還流して反応させて、ani pA＞ｐを得た。
収率29％であつた。 (ハ) ani pApUの調製ジヤーナルオブバイオケミストリー第81巻
1237〜1246頁（1977年）に記載の方法に準じ
て、RNase U₂を用いて調製した。 RNase U₂1500単位とウリジン800μmolと
を含有する0.1M酢酸Na酢酸緩衝液PH4.5を０
℃〜１℃で一夜放置して、ani pApUを得
た。収率41％。 (ニ) ani pApUpC〓の調製ビオキミカ・ビオフイジカ・アクタ565巻
（1979年）192〜198頁に記載の方法に準じ、
ppC〓11.2mM，ani pApU2.5mM、トリス塩
酸PH8.5 0.1M，Mncl₂ 2mMおよびマイクロ
コツカスリゾデイクチカス由来のPNPase
（シグマ社製）50単位をかつ色びんに入れ、
37℃で一夜放置した。高速液体クロマトグラフイーによる分取
〔８mm径、充填剤としてμBONDPAKC₁₀（ウ
オーター社販売）を使用。流量４ml／min。 20％のCH₃OH含有NH₄HCO₃0.05Mで展
開〕で、収率23.2％でani pApUpC〓を得た。
生成物の同定は、RNaseT₂で分解し、
anipApとUpとCpが１：１：１の比で生成す
ることを、別途に合成した標品にて確認する
ことによりおこなつた。 (ホ) ani pApUpCの調製 ani pApUpC〓50mlと水50mlをドーナツ型
光照射フラスコに入れ100w超高圧水銀灯で
光照射（＞290nm）した。水道水冷却下で12
時間照射した。ジエチルアミノエチルセルロース
（DEAEA25）のカラム（0.7×10cm）に加
え、NH₄HCO₃OM→1Mの勾配にて展開し、
ani pApUpCを得た。収率56％。 (ヘ) pApUpC〓の調製 ani pApUpC〓の12％メタノール含有
0.05M NH₄HCO₃ 100μlと1N HCl10μlを加
えてPH1.5として37℃で24時間置いた。高速
液体クロマトグラフイーによる分取〔８mm
径、充填剤としてμBONDPAKC₁₃（ウオータ
ー社販売）を使用。流量１ml／minで、25％
のメタノール含有0.05M NH₄HCO₃で展開〕
で、収率73％でpApUpC〓を得た。 (2) T4RNAリガーゼによる反応 ani pApUpC 0.1mM（5nmol）、pApUpC〓
0.2mM（10nmol）、トリス塩酸PH8.0 50mM，
MgCl₂10mM、ジチオスレイトール10mM、ア
デノシン三リン酸0.1mMを含む反応液45μlに
T4RNAリガーゼ５単位を加え、４℃で３日間
反応させた。反応液を分子量４万の限外過器（ミリポア
製ウルトラフリー）を用いて酵素を除き、高速
液体クロマトグラフイー〔４mm径、充填剤半井
薬品COSMOSIL C₁₈を用い、20％メタノール
0.05M NH₄HCO₃で展開〕で分取し、収率75
％でani pApUpCpApUpC〓を得た。得られた六量体の同定はＲ Nase T₂で分
解して、分解物がani pApとUpとApとCpとC〓
がそれぞれ１：２：１：１：１であることを別
途合成した標品にて確認することによりおこな
つた。実施例２（MpApU〓）実施例１の(ロ)と同様にして、Ｒ Nase U₂を
用い、pApとモルフオリンとからジシクロヘキシ
ルカルボジイミド中で、MpA＞ｐを得た。実施
例１の(ハ)と同様にして、Ｒ Nase U₂を用い、
MpA＞ｐとUpとからMpApU〓を製造した。収率
は83％であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ 5′末満のヒドロキシル基の水素原子が下記一
般式（）式で示される基で置換されていると共
に、（上記一般式（）中、R¹はフエニル基を、
R²は水素原子を夫々表わすか、又はR¹とR²はＮ
と共にモルホリン環を形成する基を表わす） 2′末端のヒドロキシル基の水素原子が下記一般
式（）で示される基で置換されているオリゴリ
ボヌクレオチド。（上記一般式（）中、R³は水素原子または
アルコキシ基を示す）