JPH0134238B2 - - Google Patents

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JPH0134238B2
JPH0134238B2 JP56132484A JP13248481A JPH0134238B2 JP H0134238 B2 JPH0134238 B2 JP H0134238B2 JP 56132484 A JP56132484 A JP 56132484A JP 13248481 A JP13248481 A JP 13248481A JP H0134238 B2 JPH0134238 B2 JP H0134238B2
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JP
Japan
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group
ani
papupc
general formula
hydrogen atom
Prior art date
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JP56132484A
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English (en)
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JPS58109498A (ja
Inventor
Hideaki Tanaka
Isao Uchida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Kasei Corp
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
Agency of Industrial Science and Technology
Mitsubishi Kasei Corp
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明はオリゴリボヌクレオチドに関する。 本発明のオリゴリボヌクレオチドは、5′末端の
ヒドロキシル基の水素原子が下記一般式()で
示される基で置換されていると共に、 (上記一般式()中、R1はフエニル基を、
R2は水素原子を夫々表わすか、又はR1とR2はN
と共にモルホリン環を形成する基を表わす) 2′末端のヒドロキシル基の水素原子が下記一般
式()で表わされる基で置換されているもので
ある。 (上記一般式中、R3は水素原子またはアルコ
キシ基を表わす) 具体例を挙げれば、次式() (上記一般式中、B1,B2およびB3はそれぞれ
独立して、アデニル基、グアニル基、シトシル基
またはウラシル基を表わす。)で示されるリボヌ
クレオチド三量体、 次式() (上記一般式()中、B1,B2,B3は、一般
式()のB1,B2,B3と同意義を表わす)で示
される三量体、並びに前記()式及び()式
の一般式の化合物においてリボヌクレオチドの数
を2個および4〜12個にかえた二量体および四量
体ないし12量体等が挙げられる。 しかして、本発明化合物は、下記(イ)および(ロ)の
反応により容易に製造しうる。 (イ) リボヌクレアーゼ(以下、RNaseと略記)
の逆反応による二量体の製造 ジヤーナル オブ バイオケミストリー
(Journal of Biochemistry) 第81巻1237〜
1246頁(1977年)に記載の方法に準じ、下記反
応式により製造される。 (ロ) 三量体の製造 (イ)の反応により得られる二量体をプライマー
として、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ(以
下、PNPaseと略記)を用いて、2′位のヒドロ
キシル基の水素原子がオルトニトロベンジル基
で置換されたリボヌクレオシドジリン酸を一残
基延長して三量体()を製造する。反応式は
下記の通り。 二量体および四量体以上も同様な方法により
容易に製造しうる。 本発明化合物は、オリゴリボヌクレオチド調製
の素材として有用である。すなわち本発明化合物
は5′末端及び2′末端が、夫々前記()及び
()式で示される基で置換されている(3′末端
は、2′末端の置換基で立体障害されている)が、
次式のように、酸処理または光照射により、5′末
端または2′末端の置換基を容易に脱離しうる。 そして得られた上記式()および()で表
わされる化合物は、RNAリガーゼを使用すれば
容易に連結しうる。化合物()および()
は、それぞれ5′末端及び2′末端に置換基を有して
いるから収率よく両者が連結した六量体を得るこ
とができる。また得られた六量体は、それぞれ、
5′末端および2′末端に置換基を有している本発明
化合物であるから、一方の置換基を脱離して、再
度オリゴリボヌクレオチド製造の素材とすること
ができる。 しかして、種々の塩基配列について(B1,B2
B3の種々の組合せについて)、本発明化合物を用
意しておけば、希望に応じて、画一的な反応系で
容易に所望の塩基配列のオリゴリボヌクレオチド
を調製することができる。そして、きまつた塩基
配列のオリゴリボヌクレオチドが得られるなら
ば、特定の遺伝子やメツセンジヤーRNAの調製、
RNAを基質とする酵素の調製などに利用でき、
研究用試薬および遺伝子工学分野の材料として有
用である。 以下、本発明方法を実施例によりさらに詳細に
説明する。以下の実施例において、C、A及びU
は何れもリボヌクレオシドで、Cは塩基がシトシ
ン、Aは塩基がアデニン、Uは塩基がウラシルで
あるものを表わすaniおよびMはリン酸アミデー
トを形成したときのアニリン残基
【式】およびモルフオリン残 基
【式】を示す。Pはフオフ エートで、>Pはリボヌクレオシドの2′および
3′位のヒロドロキシ基とエステルを形成している
cyclic Pを表わす。 φはリボヌクレオチドの2′―OHの水素と置換
されているオルトニトロベンジル基を表わす。
ppはジフオスフエートを示す。 例えば、ani pApUpC〓は()式においてR1
がフエニル基、R2は水素原子、B1がアデニル基、
B2がウラシル基およびB3がシトシル基である化
合物を意味する。 実施例 1 (1) ani pApUpC〓,pApUpC〓およびani
pApUpCの調製 (イ) ppC〓の調製 C〓300mg(0.8mmol)にPOCl30.2ml
(2.18mmol)とPO(OCH332.5mlを加え、4
℃で2時間反応させて、pC〓を得た。pC〓に
トリエチルアミンを加えて塩とし、これにt
―ブタノール8ml、H2O8ml、モルフオリン
0.4mlとジシクロヘキシルカルボジイミド0.8
g/t―ブタノール16mlを加えて1時間還流
下反応させ、さらにモルフオリン0.4mlとジ
シクロヘキシルカルボジイミド0.8gを加え
て反応させて、pC〓モルフオリデートを得
た。 別途リン酸160μlと(nC4H93N600μlとを
ピリジン2mlに加え乾固したものにピリジン
2ml、pC〓モルフオリデートを加え、3η℃で
一夜反応させて、ppC〓を得た。収率は30%
であつた。 (ロ) ani pA>pの調製 pAp Ba塩とDowex50×2(100〜200メツ
シユ)アニリン塩と水50mlを混合し、室温で
一夜放置し過して、pApアニリン塩を得
た。 pApアニリン塩0.89mmol、水10mlt―ブ
タノール25ml、アニリン1ml、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド2.06gを混合し、3時間
還流して反応させて、ani pA>pを得た。
収率29%であつた。 (ハ) ani pApUの調製 ジヤーナルオブバイオケミストリー第81巻
1237〜1246頁(1977年)に記載の方法に準じ
て、RNase U2を用いて調製した。 RNase U21500単位とウリジン800μmolと
を含有する0.1M酢酸Na酢酸緩衝液PH4.5を0
℃〜1℃で一夜放置して、ani pApUを得
た。収率41%。 (ニ) ani pApUpC〓の調製 ビオキミカ・ビオフイジカ・アクタ565巻
(1979年)192〜198頁に記載の方法に準じ、
ppC〓11.2mM,ani pApU2.5mM、トリス塩
酸PH8.5 0.1M,Mncl2 2mMおよびマイクロ
コツカスリゾデイクチカス由来のPNPase
(シグマ社製)50単位をかつ色びんに入れ、
37℃で一夜放置した。 高速液体クロマトグラフイーによる分取
〔8mm径、充填剤としてμBONDPAKC10(ウ
オーター社販売)を使用。流量4ml/min。 20%のCH3OH含有NH4HCO30.05Mで展
開〕で、収率23.2%でani pApUpC〓を得た。
生成物の同定は、RNaseT2で分解し、
anipApとUpとCpが1:1:1の比で生成す
ることを、別途に合成した標品にて確認する
ことによりおこなつた。 (ホ) ani pApUpCの調製 ani pApUpC〓50mlと水50mlをドーナツ型
光照射フラスコに入れ100w超高圧水銀灯で
光照射(>290nm)した。水道水冷却下で12
時間照射した。 ジエチルアミノエチルセルロース
(DEAEA25)のカラム(0.7×10cm)に加
え、NH4HCO3OM→1Mの勾配にて展開し、
ani pApUpCを得た。収率56%。 (ヘ) pApUpC〓の調製 ani pApUpC〓の12%メタノール含有
0.05M NH4HCO3 100μlと1N HCl10μlを加
えてPH1.5として37℃で24時間置いた。高速
液体クロマトグラフイーによる分取〔8mm
径、充填剤としてμBONDPAKC13(ウオータ
ー社販売)を使用。流量1ml/minで、25%
のメタノール含有0.05M NH4HCO3で展開〕
で、収率73%でpApUpC〓を得た。 (2) T4RNAリガーゼによる反応 ani pApUpC 0.1mM(5nmol)、pApUpC〓
0.2mM(10nmol)、トリス塩酸PH8.0 50mM,
MgCl210mM、ジチオスレイトール10mM、ア
デノシン三リン酸0.1mMを含む反応液45μlに
T4RNAリガーゼ5単位を加え、4℃で3日間
反応させた。 反応液を分子量4万の限外過器(ミリポア
製ウルトラフリー)を用いて酵素を除き、高速
液体クロマトグラフイー〔4mm径、充填剤半井
薬品COSMOSIL C18を用い、20%メタノール
0.05M NH4HCO3で展開〕で分取し、収率75
%でani pApUpCpApUpC〓を得た。 得られた六量体の同定はR Nase T2で分
解して、分解物がani pApとUpとApとCpとC〓
がそれぞれ1:2:1:1:1であることを別
途合成した標品にて確認することによりおこな
つた。 実施例2 (MpApU〓) 実施例1の(ロ)と同様にして、R Nase U2
用い、pApとモルフオリンとからジシクロヘキシ
ルカルボジイミド中で、MpA>pを得た。実施
例1の(ハ)と同様にして、R Nase U2を用い、
MpA>pとUpとからMpApU〓を製造した。収率
は83%であつた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 5′末満のヒドロキシル基の水素原子が下記一
    般式()式で示される基で置換されていると共
    に、 (上記一般式()中、R1はフエニル基を、
    R2は水素原子を夫々表わすか、又はR1とR2はN
    と共にモルホリン環を形成する基を表わす) 2′末端のヒドロキシル基の水素原子が下記一般
    式()で示される基で置換されているオリゴリ
    ボヌクレオチド。 (上記一般式()中、R3は水素原子または
    アルコキシ基を示す)
JP13248481A 1981-08-24 1981-08-24 オリゴリボヌクレオチド Granted JPS58109498A (ja)

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JPS58109498A JPS58109498A (ja) 1983-06-29
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP6139029B2 (ja) * 2013-06-21 2017-05-31 ザ カトリック ユニバーシティ オブ コリア インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション 薬物送達用還元性または非還元性ポリヌクレオチド高分子及びその製造方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5638199A (en) * 1979-09-07 1981-04-13 Takashi Kato Concentrating filtration technique of aggregated sludge and its apparatus
JPS57176998A (en) * 1981-03-27 1982-10-30 University Patents Inc Phosphoramidate compound and manufacture

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