JP2833561B2 - Ｒｎａの特定位置切断用化合物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、有用な蛋白質の量産や
機能改良または構造と機能の関係の解明に、また一方で
は有害ＲＮＡウイルスの無毒化およびその利用あるいは
有効な治療法の確立などに役立ち、更にはこれらを成し
遂げる過程における分子生物学的研究などにおいて、Ｒ
ＮＡレベルでの操作に際してＲＮＡの特定位置を選択的
に切断でき、たとえば欠失ミュータント作成の有力な手
段となるオリゴマーに関する。 【０００２】 【従来の技術】ＲＮＡ分子を位置選択的に切断すること
は、多くの機能性ＲＮＡ分子の構造解明と機能の研究の
際の有力な手段となる。たとえば、有用蛋白質や酵素蛋
白質をコードするｍ−ＲＮＡの翻訳率にかかわる構造や
安定性の研究、ｒ−ＲＮＡの構造と機能の研究、また、
動植物に有害なＲＮＡウイルス遺伝子の分子レベルでの
構造と機能にかかわる研究などに利用できる 【０００３】従来、ＲＮＡ分子を特異的に切断する方法
としては、天然から得られた塩基特異的ＲＮＡ分解酵
素、たとえばＲＮａｓｅ Ｔ₁ ，Ｕ₂ などを用いる方法
のほか、ＲＮＡ分子と相補的配列を有するＤＮＡとの二
重鎖を作らせて、ＲＮａｓｅＨ（リポヌクレアーゼＨ）
を作用させることにより、その二重鎖部位のＲＮＡを切
断する方法（Ｈ．Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１７９，１９７
９）などが知られている。前者については、特定の位置
のみで切断することは困難で、多数の個所で切断が起
り、むしろ塩基特異的に切断することから、ＲＮＡ分子
の塩基配列決定法として広く用いられている（Ｈ．Ｄｏ
ｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４，２５２７，１９７７）。後
者については、ＤＮＡ鎖を長くすれば種々の個所で切断
が起り、逆にＤＮＡの長さを４塩基、６塩基と短くすれ
ば選択的に切断を起すことができるが、配列が短いと種
々の個所と二重鎖を作りうるためにやはり位置選択性を
向上させることができず、位置選択的にＲＮＡ分子を切
断することは従来知られている方法では行うことができ
なかった。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】有用蛋白質の量産や、
その機能改良あるいは、構造と機能の関係の解明を図る
うえで、あるいは有害ＲＮＡウイルスの無毒化及びその
利用あるいはそれらに対する有効な治療法の確立を図る
うえで、機能性ＲＮＡの構造解明や機能の研究に重要
な、ＲＮＡ分子のその分子鎖の長短や塩基配列にかかわ
らず、位置選択的に簡便に切断できる技術を開発するこ
とである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点を解決するため鋭意研究を重ねた結果、先に報告さ
れた２′−Ｏ−メチル化ＲＮＡが相補的配列を有するＲ
ＮＡ分子と安定な二重鎖を作るという知見（Ｈ．Ｉｎｏ
ｕｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ．，Ｎｏ．１６，１６
５，１９８５）（１）に基づき、さらに、その安定な二
重鎖のＲＮＡ鎖および２′−Ｏ−メチル化ＲＮＡ鎖がＲ
ＮａｓｅＨにより共に切断されないという新たな知見を
得た。 【０００６】すなわち、本発明者らは、２′−Ｏ−メチ
ル化ＲＮＡと直接にＤＮＡを連結させた混合オリゴマー
を簡便に製造できること、および、その混合オリゴマー
と相補的配列を有するＲＮＡ分子とで二重鎖を作らせ、
ＲＮａｓｅＨと処理することにより、混合オリゴマー中
のＤＮＡオリゴマー部分が、両端又は片端に２′−Ｏ−
メチル化ＲＮＡが連結しているにもかかわらず、ＤＮＡ
オリゴマーと識別され、すなわち、その部位のみがＲＮ
ａｓｅＨの認識切断部位となり、そのＤＮＡオリゴマー
に相補的なＲＮＡ部位を選択的に切断できる、という事
実を見出し、この知見に基づいて本発明を完成させるに
至った。 【０００７】すなわち、本願はＤＮＡオリゴマーの片端
または両末端にＲＮＡ誘導体オリゴマーが結合した混合
オリゴマーである。なお、本発明の混合オリゴマーにお
けるＤＮＡオリゴマーの塩基数は３〜６、好ましくは４
〜５である。さらに、ＤＮＡオリゴマーとＲＮＡ誘導体
オリゴマーとの結合は通常リボースまたはデオキシリボ
ース部分の５′−水酸基と３′−水酸基との間でリン酸
ジエステル結合を介しており、ＲＮＡ誘導体オリゴマー
の糖部分の２′−位水酸基の全てがアルコキシ基で置換
されたＲＮＡ誘導体オリゴマーであることが好ましい。
即ち、本発明のＲＮＡの特定位置切断用化合物（混合オ
リゴマー）は、位置選択的にＲＮＡ（＋鎖）を切断でき
る相補的ＤＮＡ（−鎖）より成るが、このＤＮＡ（−
鎖）の一部はＲＮＡ誘導体で置換され、かつリボヌクレ
アーゼＨ活性を有する酵素を作用させたとき前記ＤＮＡ
（−鎖）の非置換部分に対応する位置で選択的にＲＮＡ
（＋鎖）を切断できるようにしたことを特徴とするもの
である。本発明のＲＮＡの特定位置切断用化合物（混合
オリゴマー）は、切断を目的とするＲＮＡ（＋鎖）と二
重鎖を形成する相補的ＤＮＡ（−鎖）であり、このよう
な化合物としては、必ずしも従来より知られているもの
に限らず、従来技術を利用して調製可能なものを含む。
またＲＮＡ（＋鎖）の全体にＤＮＡ（−鎖）で二重鎖部
分を構成する必要はなく、一部でもよい。また、一か所
だけでなく複数か所で二重鎖部分を構成していてもよ
い。 【０００８】ＤＮＡ（−鎖）の一部をＲＮＡ誘導体オリ
ゴマーで置換する場合のＤＮＡ（−鎖）の一部とは、前
記二重鎖部分を構成する−鎖のＤＮＡ分子の部分でもよ
く、また複数か所で二重鎖部分を構成する場合にあって
はその少なくとも一か所に存するＤＮＡ（−鎖）分子全
体であってもよい。 【０００９】ＲＮＡ誘導体オリゴマーは、例えば糖部分
の２′−位水酸基の全てに後述のような置換基を有する
ものである。 【００１０】前記ＤＮＡ（−鎖）の一部が置換されたオ
リゴマーとして、次に述べる混合オリゴマーを採用する
のが簡便である。 【００１１】また、その混合オリゴマーは、ＲＮＡ誘導
体オリゴマーとＤＮＡオリゴマーとを直接にリボースま
たはデオキシリボース部分の５′−水酸基と３′−水酸
基との間でリン酸ジエステル結合を介して結合させるこ
とにより得られる。 【発明の実施の形態】 【００１２】本発明の混合オリゴマー中の例えば２′−
Ｏ−メチル化オリゴマー部分を製造するためには、大別
して２つの方法を用いることができる。その１つは、前
記井上らの文献（１）に記載された方法に従い製造する
方法である。すなわち、２′−Ｏ−メチル−Ｎ⁴ −ベン
ゾイルシチジン（化合物Ｉ）、２′−Ｏ−メチル−Ｎ⁶
−ベンゾイルアデノシン（化合物II）、２′−Ｏ−メチ
ル−Ｎ² −イソブチリルグアノシン（化合物III)および
２′−Ｏ−メチルウリジン（化合物IV）を製造し、それ
ぞれの化合物をさらにジメトキシトリチル基（−ＤＭＴ
ｒ）で５′−位水酸基を保護し、化合物（Ｉａ，IIａ，
III ａ，IVａ）を製造する。化合物（Ｉａ〜IVａ）の
３′−位水酸基は文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，８，５４６１，１９８０）に記載の方法に従
ってオルトクロロフェニルリン酸基を導入し、それぞれ
化合物（Ｉｂ₁ ，IIｂ₁ ，III ｂ₁ ，IVｂ₁ ）を製造す
ることができる（Ａ法）。 【００１３】別に、化合物（Ｉａ，IIａ，III ａ，IV
ａ）の３′−位水酸基は文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，２４，２４５（１９８３）又は、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，４５３９（１
９８４））に記載の方法に従って、ジイソプロピルアミ
ノメトキシホスフィンまたはジイソプロピルアミノシア
ノエトキシホスフィンを用いて、３′−ホスホルアミダ
イト化合物（Ｉｂ₂ ，IIｂ₂ ，III ｂ₂ ，IVｂ₂ ，Ｉｂ
₃ ，IIｂ₃ ，III ｂ₃ ，IVｂ₃ ）とすることができる
（後述の実施例１１，１２参照）（Ｂ法）。 【００１４】また、化合物（Ｉａ〜IVａ）からは、文献
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，５５０
７，１９８０）記載の方法に従って、１％クロスリンク
ポリスチレン樹脂にスペーサを介して結合させ、それぞ
れ化合物（Ｉｃ₁ ，IIｃ₁ ，III ｃ₁ ，IVｃ₁ ）を製造
することができる。 【００１５】一方、化合物（Ｉａ，IIａ，III ａ，IV
ａ）からは文献（Ｋ．Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔ ａｌ．Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，５４９１（１
９８０））記載の方法に従って３′−スクシニル体（Ｉ
ｅ，IIｅ，III ｅ，IVｅ）を活性エステル体（Ｉｆ，II
ｆ，III ｆ，IVｆ）とし、それを長鎖アルキルアミノコ
ントロールポアガラス（Ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋ
ｙｌａｍｉｎｏ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇ
ｌａｓｓ ＣＰＧ）に結合させ、それぞれ化合物（Ｉｃ
₂ ，IIｃ₂ ，III ｃ₂ ，IVｃ₂ ）を製造することができ
る（後述の実施例１３参照）。 【００１６】一方、前記混合オリゴマー中のＤＮＡオリ
ゴマー部分に関しては、文献（Ｍ．Ｉｋｅｈａｒａ ｅ
ｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，８１，５９５６，１９８４）（２）記載の方法
に従って（Ａ法）、化合物（Ｉｄ₁ ，IIｄ₁ ，III
ｄ₁ ，IVｄ₁ ）を順次縮合することにより製造できる
（Ａ法）。 【００１７】または文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，２
８１（１９８５））記載の方法に従って化合物（Ｉ
ｄ₂ ，IIｄ₂ ，III ｄ₂ ，IVｄ₂ ）を表２の方法に従
い、あるいは化合物（Ｉｄ₃ ，IIｄ₃ ，III ｄ₃ ，IVｄ
₃ ）を順次結合することにより製造できる（Ｂ法）。 【００１８】 【化１】【００１９】 【化２】【００２０】 【化３】【００２１】従って、化合物IVｃ₁ を出発原料として順
次化合物III ｂ₁ ，IIｄ₁ ，IIｄ₁，IVｄ₁ ，III ｄ₁ I
II ｂ₁ ，IIｂ₁ ，Ｉｂ₁ を表１に示す反応条件（後述
の実施例１参照）で縮合させることにより、次の配列を
有する混合オリゴマー（化合物Ｖ）を製造することがで
きた。 ３′ＵｍＧｍＡＡＴＧＧｍＡｍＣｍ５′ （Ｖ） （ｍの付いているユニットは、Ｏ−メチル化ＲＮＡを示
し、他はＤＮＡオリゴマーを示す。） 【００２２】同様にして、次のオリゴマー（化合物VI〜
VIII）を製造した。 【００２３】 ３′ＵｍＧｍＡｍＡＴＧＧｍＡｍＣｍ５′ （VI） ３′ＵｍＧｍＡＡＴＧＧＡｍＣｍ ５′ （VII) ３′ＵｍＧｍＡｍＡｍＴＧＧＡＣｍ ５′ （VIII) 【００２４】これらの混合オリゴマーと同じ配列を有す
るＤＮＡオリゴマー（化合物IX）は前記池原らの文献
（２）に従って、また、混合オリゴマー（化合物Ｖ〜I
X）と相補的な配列を有する低分子ＲＮＡオリゴマー
（Ｘ）は、文献（Ｓ．Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ，Ｂｕｌｌ．，３３，４６１８，１９８
５）（３）の記載の方法に従って製造した。 【００２５】 ３′ｄ（ＴＧＡＡＴＧＧＡＣ）５′ （IX） ５′ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ３′ （Ｘ） 【００２６】別の配列を有する混合オリゴマー（XI，XI
I)、及びそれと相補的配列を有するＲＮＡオリゴマー
（XIII、XIV)も上記文献（２），（３）記載の方法によ
り同様に製造した。 【００２７】 ３′ＣｍＡｍＴＴＣＡＵｍＡｍＧｍ５′ （XI） ３′ＧｍＵｍＣＣＡＡＣｍＣｍＡｍ５′ （XII) ５′ＧＵＡＡＧＵＡＵＣ３′ （XIII) ５′ＣＡＧＧＵＵＧＧＵ３′ （XIV) 【００２８】一方、高分子ＲＮＡＷＳ−Ｓ（＋）（９０
ｍｅｒ、化合物XV）の製造は、ＳＰ６−ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いてＩｎ Ｖｉｔｒｏ転写反応を利用して調製
することを計画し、その際正確にＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ
の塩基配列の５′末端から転写させるため、ＳＰ６−プ
ロモーター配列と直接にＷＳ−Ｓ（＋）配列を連結させ
た二重鎖ＤＮＡ（XVI)を図１のスキームに従って化学
的、酵素的に合成した。 【００２９】先ず、ＤＮＡオリゴマー（１〜９）を文献
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０ ２８１（１９８５））記載
の方法に従い化学合成し、二段階に分け、リガーゼ反応
により二重鎖ＤＮＡ（XVI)を得た。得られた化合物（XV
I)は、Ｍ１３・ｍｐ１９ベクターのＳｐｈＩ及びＳｍａ
Ｉサイトにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０３をトランスホーメーションして、転写用ベクターＭ
１３ＡＪ−１を製造した。 【００３０】得られた転写用ベクターＭ１３ＡＪ−１の
合成二重鎖ＤＮＡ配列部分は文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４，５４６３（１
９７７））記載の方法に従いＭ１３ジデオキシ法を用い
て、正しい塩基配列であることを確認した。 【００３１】次に、Ｍ１３ＡＪ−１を制限酵素ＳｍａＩ
でリニアライズした後ＳＰ６−ポリメラーゼを用いて、
文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，
７０３５（１９８４））記載の方法に従い、Ｉｎ．Ｖｉ
ｔｒｏ．ＲＮＡ転写反応を行い、期待通り正確に５′末
端から転写されたＲＮＡＷＳ−Ｓ（＋）（XV）を製造す
ることができた。 【００３２】ここに得られた高分子ＲＮＡＷＳ−Ｓ
（＋）（XV）の切断反応を検討するため、Ａ法に比べ
て、より簡便かつ汎用的に使用されているＢ法を用い
て、混合オリゴマーを化学合成することを検討した。す
なわち、化合物IVｃ₂ を出発原料にして、表２に示す通
常ＤＮＡ自動合成に使用する反応条件（後述の実施例１
４参照）を用いて、順次化合物III ｂ₂ ，III ｂ₂ ，II
I ｂ₂ ，Ｉｂ₂ ，Ｉｂ₂ ，IIIｂ₂ ，IIｂ₂ ，IVｂ₂ ，
Ｉｂ₂ ，IVｂ₂ ，IIｄ₂ ，III ｄ₂ ，III ｄ₂ ，Ｉｄ₂
を縮合させ、常法に従い精製したところＤＮＡ合成とほ
ぼ同様に混合オリゴマー（XVIII)を製造することができ
た。 【００３３】 ３′−ＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＧｍＡｍＵｍＣｍＵｍＡＧＧＣ−５′ （XVIII) 【００３４】同様にして、次の混合オリゴマー（XVII，
XIX,XXII〜XXIV）を製造した。 ３′−ＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＧｍＡｍＵｍＣｍＴＡＧＧＣ−５′ （XVII） ３′−ＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＧｍＡｍＵｍＣｍＵｍＡｍＧＧＣ−５′ （XIX) ３′−ＡＧＧＣＣｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍ−５′ （XXII） ３′−ＧＧＣＣｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍ−５′ （XXIII) ３′−ＵｍＧｍＡＡＡＧＣＵｍＣｍ （XXIV） 【００３５】また、化合物IVｄ₄ を出発原料として表２
に示す反応条件（後述の実施例１５参照）を用いて、順
次IIｄ₃ ，III ｄ₃ ，III ｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，IIｂ
₃ ，Ｉｂ₃ ，IIｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，IIｂ₃ を縮合させ、混合
オリゴマー（XX）を製造することができた。 ３′ＴＡＧＧＣｍＣｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍ５′ （XX) 【００３６】同様にして混合オリゴマー（XXI) ３′ＴＡＧＧＣＣｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍ５′ （XXI) を製造した。 【００３７】得られた混合オリゴマーはＷＳ−Ｓ（＋）
ＲＮＡ（XV）と、それぞれ相補性を有し、化合物（XVII
〜XIX)は、３′端のみがＯ−メチルＲＮＡで置換され、
化合物（XX〜XXIII)は５′端のみがＯ−メチルＲＮＡで
置換され、化合物（XXIV）は前記した化合物（Ｖ〜XIII
及びXI，XII)と同様両端がＯ−メチルＲＮＡで置換され
た混合オリゴマーである。 【００３８】混合オリゴマー（XVII〜XXIII)は、ＷＳ−
Ｓ（＋）ＲＮＡの５′側から１９〜２４番目の間のステ
ム内の切断を行う為にデザインした化合物で、混合オリ
ゴマー（XXIV）は３６〜４６番目の配列のループ内の切
断を行う為にデザインした化合物である。 【００３９】図２に混合オリゴマー（XVII〜XXIV）とＷ
Ｓ−Ｓ（＋）ＲＮＡ（XV）との相補的配列の関係と、Ｗ
Ｓ−Ｓ（＋）ＲＮＡの二次構造を示した。 【００４０】上記混合オリゴマーの製造に用いた化合物
Ｉ〜IVの誘導体において、Ｘに関してはジメトキシトリ
チル基（−ＤＭＴｒ）やモノメトキシトリチル基（−Ｍ
ＭＴｒ）の代りにトリチル基などの通常のＤＮＡやＲＮ
Ａ合成に用いる保護基に代えることができる。また、リ
ン酸の保護基としては、Ａ法においては、構造式中のオ
ルト−クロロフェニル基の代わりにパラ−クロロフェニ
ル基、シアノエチル基、トリクロロエチル基などの通常
のＤＮＡやＲＮＡ合成の保護基に代えることができる。
また、Ｂ法においては、構造式Ｒ₂ ，Ｒ₃ 中、ジイソプ
ロピルアミノ基の代りにジメチルアミノ基、モルホリノ
基などの保護基に代えるこができる。また、Ｂ法に関連
した方法として、Ｒ₂ ，Ｒ₃ の代りにＨ−ホスホネート
にかえ、ピバロイルクロリドでアシル化し、テトラゾー
ルで活性化する方法にかえることもできる。さらに、Ｒ
₁ ，Ｒ₂ ，Ｒ₃ の代りにメチルホスホニックイミダゾリ
ドにかえ、メチルホスホネート型で５′−水酸基および
３′−水酸基を結合させたオリゴマーにかえることがで
きる。 【００４１】Ｚに関しては、メトキシ基の代わりに水酸
基、アルコキシ基（エチル、プロピル、ブチル基などの
通常の核酸化学における化学処理では除去できない置換
基を有する水酸基）に代えることができる他に、ＯＱに
も代えることができる（ただし、Ｑはｔ−ブチルジメチ
ルシリル基、テトラヒドロピラニル基など通常ＲＮＡ合
成に用いる保護基を意味する。）。 【００４２】低分子ＲＮＡ（Ｘ，XIII，XIV)の切断反応
および切断位置の確認は次のようにして行った。 【００４３】ＲＮＡ分子（Ｘ，XIII，XIV)をそれぞれＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼと〔τ^-32 Ｐ〕ＡＴＰに
より５′位水酸基を標識し、それぞれ相補的ＤＮＡオリ
ゴマー（IX）並びに相補的混合オリゴマー（Ｖ〜VIII及
びXI，XII)と混合し、ＲＮａｓｅＨによる切断反応を行
い、反応液をホモクロマトグラフィーによって切断個所
及び切断の程度を調べた。用いた反応条件は４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、４ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１ｍＭ ＤＴＴ、４％グリセロール、０．００３
％ウシ血清アルブミン中、³²Ｐ−標識ＲＮＡオリゴマー
（Ｘ，XIII，XIV)（３〜４万ｃｐｍ）、非標識ＲＮＡオ
リゴマー（Ｘ，，XIII，XIV)（１μＭ〜５μＭ）と、化
合物（Ｘ）の相補的ＤＮＡオリゴマー（IX）、（１０μ
Ｍ）、あるいは相補的混合オリゴマー（Ｖ〜VIII及びX
I，XII)（１０μＭ〜２５μＭ）とを混合し、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１由来のＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）
（５Ｕ〜１０Ｕ）を添加し、２０℃、または３０℃で、
２〜４８時間反応させる。 【００４４】切断位置の確認は、標識ＲＮＡ分子（Ｘ，
XIII，XIV)をそれぞれＳｎａｋｅＶｅｎｏｍ Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｄ ｉ’ｅｓｔｅｒａｓｅにより限定分解したも
のを同時にホモクロマトグラフィーすることにより行っ
た。 【００４５】切断個所及び、切断の程度をまとめると次
の様になった。 【００４６】 ↓↓↓↓ 二重鎖 ５′ ＡＣＵＵＡＣ ＣＵＧ３′ （Ｘ） ３′ｄ（ＴＧＡＡＴＧ ＧＡＣ）５′ （IX） ↓↓↓ 二重鎖 ５′ＡＣＵＵＡＣ ＣＵＧ３′ （Ｘ） ３′−−−ＡＴＧ−−−−５′ （VI） ↓ 二重鎖 ５′ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ３′ （Ｘ） ３′−−ＡＡＴＧ−−−５′ （Ｖ） ↓ 二重鎖 ５′ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ３′ （Ｘ） ３′−−ＡＡＴＧＧ−−５′ （VII) ↓ ↓↓ 二重鎖 ５′ＡＣＵＵＡＣＣＵ Ｇ３′ （Ｘ） ３′−−−−ＴＧＧＡ−−５′ （VIII) ↓ 二重鎖 ５′ＧＵＡＡＧＵＡＵＣ３′ （XIII) ３′−−ＴＴＣＡ−−−５′ （XI） ↓ 二重鎖 ５′ＣＡＧＧＵＵＧＧＵ３′ （XIV) ３′−−ＣＣＡＡ−−−５′ （XII) （矢印は切断個所を表わす。矢印の数は切断の程度を定性的に表す。また、実 線−はＯ−メチルオリゴマー部分を表わす） 【００４７】実際にはホモクロマトグラフィーのスポッ
トを切り取り液体シンチレンションカウンター（ＰＡＣ
ＫＡＲＤ ＴＲＩ−ＣＡＲＢ６４０Ｃ）を用いて、放射
能をチエレンコフ測定により定量した。 【００４８】以上の結果からＲＮＡ分子（Ｘ）を切断す
る時、単に相補的ＤＮＡオリゴマー（IX）との二重鎖
の場合は、５′側から５，６，７番目の右側を切断し、
選択性がないのに対し、二重鎖、二重鎖の如く、４
塩基、５塩基のＤＮＡオリゴマーを含む相補的混合オリ
ゴマー（Ｖ，VII)を用いた場合は５′側から６番目の右
側を選択的に切断できた。また、相補的混合オリゴマー
（VIII）を用いた場合は５′側から８番目の右側を選択
的に切断することが判明した。塩基配列の異なるＲＮＡ
分子（XIII，XIV)と、それらの相補的混合オリゴマー
（XI，XII)をそれぞれ用いた二重鎖、の場合も塩基
配列にかかわらず二重鎖と同様の結果が得られ、５′
側から６番目の右側を選択的に切断することが判明し
た。 【００４９】以上の結果から、モデルとして用いた低分
子ＲＮＡ（９ｍｅｒ）の場合には基本的には相補的混合
オリゴマーを製造する時には、含まれるＤＮＡオリゴマ
ーの数は３〜６、好ましくは４〜５塩基が適当であるこ
と、及び切断しようとするＲＮＡ分子の特定の位置を想
定したならその個所から、ＲＮＡ分子の５′側への４塩
基、あるいはその個所から３′側へ１塩基ずらしてから
５′側への５塩基の配列に相補的なＤＮＡオリゴマーを
含む相補的混合オリゴマーを製造し、ＲＮａｓｅＨ処理
すればよいことがわかり、相補的混合オリゴマー製造の
デザインを可能にした。また選択性を高める為には反応
温度や酵素量を変化させることによる反応条件の検討を
通常の生化学的知識を加味して行えばよい。 【００５０】次にここで得られた、ＲＮＡ切断反応法が
より普遍的に高次構造（二次構造、三次構造）を有する
機能性ＲＮＡの切断へも適用できるかどうかを検討する
ため、前記した様にして得た高分子ＲＮＡＷＳ−Ｓ
（＋）（XV）を用いたＲＮＡ切断反応を検討した。高分
子ＲＮＡＷＳ−Ｓ（＋）（XV）の切断反応および切断位
置の確認は次の様にして行った。低分子ＲＮＡ（Ｘ）の
場合と同様に、ＲＮＡを放射性リンで標識する必要があ
るが、ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ（XV）は、Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ転写により調製した為、５′末端にトリリン酸を有す
る。従って、３′末端を文献（Ｎａｔｕｒｅ ２７５
５６０ １９７８）記載の方法に従い、３２ｐＣｐを用
い、ＲＮＡリガーゼにより結合させ、標識した。その反
応物を７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを用
いて電気泳動し、オートラジオグラフィーで分析したと
ころ、生成物は１つの鎖長の異なる混合物として得られ
た、（９０ｍｅｒと９１ｍｅｒ）。この原因は不明であ
るが、混合物を調製用の同種のゲル電気泳動により分離
し、ゲルより常法に従い、抽出して、３′末端標識した
ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡを得た。これを０．０２ｐｍｏｌ
／μｌの濃度に水に溶かし、以下の実験に用いた。 【００５１】まず３′末端標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ
３．３ｎＭ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．
７）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．００３％ＢＳＡ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、４％グリセロール、混合オリゴマー（８３
ｎＭ〜８．３ｎＭ）、ＲＮａｓｅＨ（０．１７〜０．８
３Ｕｎｉｔｓ／μｌ）で，数時間反応を行った。ただ
し、ＲＮａｓｅＨを加える前に６５℃で２分間加熱し、
アニーリングした。反応は３０℃で行い、ｌｏａｄｉｎ
ｇ ｓｏｌ．（１０Ｍ尿素、０．０２％キシレニシアノ
ール、０．０２％ブロモフェノールブルー）を加え、反
応を停止し、７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲ
ルにて泳動しオートラジオグラフィーのバンドの位置に
より切断位置を分析した。尚マーカーとして３′末端標
識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡをアルカリ分解、ＲＮａｓｅＴ
₁ 、Ｕ₂ ＰｈｙＭで分解したサンプルを用いた。 【００５２】得られた切断反応の結果を図３に示す（切
断位置を矢印で表わす）。 【００５３】５′側にＤＮＡ部分を有する混合オリゴマ
ーの方が３′側にＤＮＡ部分を有するものより相対的に
切断活性が高かった。この原因として前者の場合、Ａ⁷
〜Ｕ²⁴のＳｔｅｍ構造の両側のＳｔｒａｎｄに及ぶ領域
に相補性があるのに対し、後者ではＳｔｅｍ中のＣ¹⁹〜
Ｕ²⁴のＳｔｒａｎｄにしか相補性がないため、この反応
に重要な安定な相補的二本鎖の形成の影響が現われたた
めと考えられる。従って、ＤＮＡ部分がどちらの端に存
在するかによる差についてこれだけでは判らないが、Ｒ
ＮＡ自身が本来とりうる二次構造の影響は極めて重要で
ある。例えばｌｏｏｐ上に相補性を有する混合オリゴマ
ー（XXIV）では他に比べ速やかに切断が生じていた。 【００５４】一方、５′側にＤＮＡ部分を有するXVII，
XVIII ，XIX の比較において、いずれも相補的領域は等
しくＤＮＡ部分の長さが異なるが、切断部位は微妙に違
っている。XVIII は今回行ったすべての条件を通じて切
断部位はＧ²¹−Ｇ²²のみであった。このXVIII よりＤＮ
Ａ部分が１つ短かくなったXIX ではＧ²¹−Ｇ²²に加え、
１つ５′側（混合オリゴマー上で）に寄った位置でも切
断し、逆に混合オリゴマー中のＤＮＡ部分が１つ３′側
に長くなったXVIIでは、切断部位はその方向に１つずれ
ている。従って３′側に２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、５′
側にＤＮＡより成る混合オリゴマーを用いた場合ＤＮＡ
の３′側より４番目と５番目の間で優先的に切断すると
いう事が言える。この結果は低分子ＲＮＡ（Ｘ，XIII，
XIV)の切断反応の時には用いていない片端だけＯ−メチ
ルＲＮＡを有した混合オリゴマーの場合に得られた結果
であるが、低分子ＲＮＡ（Ｘ）切断反応の結果得られた
オリゴマーデザインと一致している。 【００５５】また逆に、５′側に２′−Ｏ−メチルＲＮ
Ａ、３′側にＤＮＡより成る混合オリゴマー（XX，XXI)
を用いた場合に於いても、ＷＳ−Ｓ（＋）（XV）の二次
構造などの影響で、切断活性は低いものの、XXI では１
個所で切断が起っていた。両端にＯ−メチルＲＮＡを有
した混合オリゴマー（XXIV）の場合は低分子ＲＮＡ
（Ｘ，XIII，XIV)の場合と比べて、１塩基ＲＮＡ分子の
３′側で切断が起り、低分子ＲＮＡ（Ｘ，XIII，XIV)切
断反応の結果と１塩基ずれていた。 【００５６】以上の切断個所の確認は後述（実施例２
３）するように、切断個所の５′末端を、³²Ｐ標識し、
ヌクレアーゼＰ₁ で５′−ヌクレオチドユニットに分解
し、ろ紙電気泳動で分析した結果得られた。尚、XXI を
用いた場合は、図１０の電気泳動分析より切断されたオ
リゴマーの泳動位置より推定した。 【００５７】以上の結果をまとめると、低分子ＲＮＡを
切断する際その分子が二次構造をとっていない場合は前
記した、オリゴマー合成のデザインが適用できるが、高
分子ＲＮＡで高次構造を有するＲＮＡを切断する際には
その切断位置がループ内なのか、あるいはステム内なの
か、また二次構造を考慮に入れて用いる混合オリゴマー
を、３′側あるいは５′側にＯ−メチルＲＮＡを有する
もののいずれが適当か等を充分考慮して混合オリゴマー
をデザインする必要があるが、高分子ＲＮＡ切断におい
ても基本的には、前記したオリゴマー合成のデザインが
適用でき、充分選択的に行うことができる。 【００５８】一方、混合オリゴマー中のＤＮＡオリゴマ
ーの数は３〜６、好ましくは４〜５個が適当であること
には変りがない。 【００５９】また選択性を高める為には反応温度や酵素
量を変化させることによる反応条件の検討を通常の生化
学的知識を加味して行えばよい。 【００６０】このようにして、本発明によりＲＮＡ分子
一般の特異的切断法が確立された。 【００６１】以下、実施例により本発明を具体的に説明
する。 【００６２】 【実施例】 〔実施例１〕 混合オリゴヌクレオチドの製造 （５′ＣｍＡｍＧｍＧＴＡＡＧｍＵｍ３′（Ｖ）の製造
例 ｍはＯ−メチルヌクレオチドユニットを表わす。他はデ
オキシヌクレオチドユニットを表わす。） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−メチル−ウ
リジン６μｍｏｌを結合した１％クロスリンクポリスチ
レン樹脂５０ｍｇをグラスフィルター付きの反応容器に
入れ、ジクロルメタン−メタノール（容積比７：３）の
混合液２ｍｌで３回洗浄した。次に２％ベンゼンスルホ
ン酸のジクロルメタン−メタノール（容積比７：３）溶
液を２ｍｌ加え、１分間振とうした。反応後、反応液を
濾過し、樹脂をジクロルメタン−メタノール（容積比
７：３）混合液２ｍｌで洗浄した。更に前記のベンゼン
スルホン酸溶液２ｍｌで１分間反応させ、次に前者の混
合液２ｍｌで２回、更にピリジン２ｍｌで３回洗浄し
た。次にピリジン０．３ｍｌを加え、減圧下ピリジンを
留去することにより樹脂を乾燥した。次に５′−ジメト
キシトリチル−２′−Ｏ−メチルグアニン−３′−オル
トクロルフェニルリン酸（III ｂ₁ ）のピリジン溶液
（２０ｍｇ／０．３ｍｌ）を加え、減圧下ピリジンを留
去した。次にメシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾールのピリジン溶液（２０ｍｇ／０．３ｍｌ）を加
え、４０℃に加温し、２０分間振とうした。反応液は濾
過により樹脂より除き、樹脂はピリジン２ｍｌで２回洗
浄した。 【００６３】次に０．１Ｍジメチルアミノピリジン溶液
１．８ｍｌと無水酢酸０．２ｍｌを加え、３分間振とう
し、未反応の５′水酸基をアセチル基によりキャッピン
グした。反応液を濾去した後、樹脂をピリジン２ｍｌで
３回洗浄した。 【００６４】前記の一連の操作をくり返し、続いてIIｄ
₁ ，IIｄ₁ ，IVｄ₁ ，III ｄ₁ ，III ｂ₁ ，IIｂ₁ ，Ｉ
ｂ₁ の順にヌクレオチドユニットを縮合し鎖長を延長し
た。各縮合反応の収率は（４７％〜１０５％）であるこ
とを脱ジメトキシトリチル化により生成したジメトキシ
トリタノールを過塩素酸−エタノール中で発色させて５
００ｎｍの吸光度より算出した。また通算収率は２５％
であった。 【００６５】次に反応終了後の樹脂をジオキサンで洗浄
後、２−ピリジニアルドキシム・テトラメチルグアニジ
ンの１Ｍジオキサン溶液を０．５ｍｌ、ジオキサン０．
４ｍｌ、水０．１ｍｌを加え３０℃で一晩振とう後、溶
液を濾過し、更に樹脂を５０％ピリジン水２ｍｌで３回
洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせて溶媒を減圧留去し
た後、残渣をピリジン１ｍｌに溶解して封管に入れ、２
８％アンモニア水１０ｍｌを加え、密栓し、６０℃で５
時間反応した。反応液は減圧濃縮乾固後、逆相シリカゲ
ル（Ｗａｔｅｒｓ社製、μ・ＢｏｎｄａｐａｃｋＣ１
８、粒径３５−１００μ）を詰めた直径０．７ｍｌ、長
さ１２ｃｍのカラムにアプライし、移動相として、５％
から３５％アセトニトリルの直線濃度勾配をかけた５０
ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液を用いたカラムクロ
マトグラフィーを行い２５４ｎｍにおける吸光度で定量
し、５′−ジメトキシトリチル混合オリゴヌクレオチド
を分離した。溶媒を減圧留去した後、８０％酢酸水溶液
１ｍｌを加え、室温で２０分間放置した。反応液は減圧
留去した後、更に水と減圧共沸させることにより酢酸を
除去した。 【００６６】残渣は水に溶かし、酢酸エチルで洗浄後、
減圧留去し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。すなわちＮｎｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８により、移動
相として、１３％〜２１％の直線濃度勾配をかけた０．
１Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ７．０）を用
い１ｍｌ／分の流速で行い、溶出された主ピークを分取
し、０．０７μｍｏｌｅ（収率１．１７％）の混合オリ
ゴヌクレオチドを得た。 【００６７】得られた混合オリゴヌクレオチドは陰イオ
ン交換カラム（ＤＥＡＥ２ＳＷ）を用いた高速液体クロ
マトグラフィーで、分析を行い、単一なピークを与え、
純粋なことを確認した。 【００６８】なお、表１に鎖長延長反応の１サイクルを
示した。 【００６９】 【表１】【００７０】塩基配列の確認は、混合オリゴヌクレオチ
ド０．０５ＯＤユニットを用い、５′末端水酸基を³²Ｐ
で標識リン酸化し、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７０ １２０９〜１２１３，
１９７３）に記載されている方法に従って行った。その
オートラジオグラフィーにより塩基配列が正しいことを
確認した。 【００７１】他の混合オリゴヌクレオチド（VI〜VIII、
及びXI，XII)につていも上記した方法により同様に製造
した。 【００７２】〔実施例２〕 二重鎖の切断反応 標識ＲＮＡオリゴマー（Ｘ、２万ｅｐｍ）及び非標識Ｒ
ＮＡオリゴマー（Ｘ、１μＭ）と前記池原らの文献
（２）に記載の方法に従って製造した相補的ＤＮＡオリ
ゴマー（IX、１０μＭ）を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．７）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、４％グリセロール、０．００３％ＢＳＡ（Ｃｏｏｐ
ｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｗｏｒｔｈ
ｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｕｃｌｅａ
ｓｅｆｒｅｅ）中、ＲＮａｓｅＨ（５Ｕ）を加え（全量
２０μｌ）、２０℃で反応させた。経時的に４μｌづつ
サンプリングし、ホモクロマトグラフィーにより分析し
た（図４）。 【００７３】次に各スポットを切りとり、液体シンチレ
ーションカウンターで放射能を測定し、切断率を算出し
た（図５）。切断個所による切断率をグラフに表わした
（図６）。 【００７４】以上の結果を定性的に切断個所及び切断の
程度を矢印を用いて表わすと次の様になり、ＲＮＡオリ
ゴマー（Ｘ）の５′側から５，６番目の間、６，７番目
の間、７，８番目の間が切断された。 【００７５】（結果） （矢印は切断個所を表わす。矢印の数は切断の程度を定
性的に表す。また、実線−はＯ−メチルオリゴマー部分
を表わす） 【００７６】〔実施例３〕 二重鎖及びの切断反応 標識ＲＮＡオリゴマー（Ｘ、４万ｃｐｍ）及び非標識Ｒ
ＮＡオリゴマー（Ｘ、５μＭ）と相補的混合オリゴマー
（VIまたはVII 、各２５μＭ）をそれぞれ別に、実施例
２と同様の緩衝液中、ＲＮａｓｅＨ（５Ｕ）を加え（全
量１０μｌ）、２０℃４８時間（図７）、または３０℃
１６時間（図８）反応させ実施例２と同様に分析した。 【００７７】（結果） （矢印は切断個所を表わす。矢印の数は切断の程度を定
性的に表す。また、実線−はＯ−メチルオリゴマー部分
を表わす） （結果） 【００７８】以上の如く、混合オリゴマー（VII)を用い
て、３０℃１６時間反応させれば、ＲＮＡオリゴマー
（Ｘ）の５′側から６，７番目の間を選択的に切断する
ことができた。 【００７９】〔実施例４〕 二重鎖の切断反応につい
て、 標識ＲＮＡオリゴマー（Ｘ、３万ｃｐｍ）及び非標識Ｒ
ＮＡオリゴマー（Ｘ、１μＭ）と相補的混合オリゴマー
（Ｖ、１０μＭ）を実施例２と同様の緩衝液中、ＲＮａ
ｓｅＨ（１０Ｕ）を加え（全量２０μｌとし）、２０℃
または３０℃で１７時間反応させ実施例２と同様に分析
した（図９）。 【００８０】（結果） （矢印は切断個所を表わす。また、実線−はＯ−メチル
オリゴマー部分を表わす） 【００８１】以上の如く、混合オリゴマー（Ｖ）を用い
て、ＲＮＡオリゴマー（Ｘ）の５′側から６，７番目の
間を選択的に切断することができた。 【００８２】〔実施例５〕 二重鎖の切断反応 標識ＲＮＡオリゴマー（Ｘ、３万ｃｐｍ）及び非標識Ｒ
ＮＡオリゴマー（Ｘ、１μＭ）と相補的混合オリゴマー
（VIII、１０μＭ）を実施例２と同様の緩衝液中、ＲＮ
ａｓｅＨ（１０Ｕ）を加え、（全量２０μｌ）、２０℃
または３０℃で１７時間反応させ実施例２と同様に分析
した（図１０）。 【００８３】（結果）（矢印は切断個所を表わす。矢印の数は切断の程度を定
性的に表す。また、実線−はＯ−メチルオリゴマー部分
を表わす） 【００８４】以上の如く、混合オリゴマー（VIII）を用
いることによりＲＮＡオリゴマー（Ｘ）の５′側から
８，９番目の間を選択的に切断することができた。 【００８５】〔実施例６〕 二重鎖の切断反応につい
て、 標識ＲＮＡオリゴマー（XIII、３万ｃｐｍ）及び非標識
ＲＮＡオリゴマー（ＸII、１μＭ）と相補的混合オリゴ
マー（XI、１０μＭ）を実施例２と同様の緩衝液中、Ｒ
ＮａｓｅＨ（０，２，５，１０Ｕ）をそれぞれ加え、
（全量２０μｌとし）、３０℃１時間反応させ、実施例
２と同様に分析した（図１１）。 【００８６】（結果） （矢印は切断個所を表わす。また、実線−はＯ−メチル
オリゴマー部分を表わす） 【００８７】以上の如く、ＲＮＡオリゴマー（XIII）の
５′側から６，７番目の間を選択的に切断することがで
きた。 【００８８】〔実施例７〕 二重鎖の切断反応につい
て、 標識ＲＮＡ（XIV 、３万ｃｐｍ）及び非標識ＲＮＡオリ
ゴマー（XIV 、１μＭ）と相補的混合オリゴマー（XII
、１０μＭ）を実施例２と同様の緩衝液中、ＲＮａｓ
ｅＨ（５Ｕ）を加え（全量２０μｌ）、２０℃、３０ｍ
ｉｎ、１２ｈｒ、３０℃、３０ｍｉｎ、１２ｈｒ、反応
させた。実施例２と同様に分析した（図１２）。 【００８９】（結果） （矢印は切断個所を表わす。また、実線−はＯ−メチル
オリゴマー部分を表わす） 【００９０】以上の如く、ＲＮＡオリゴマー（XIV)の
５′側から６，７番目の間を選択的に切断することがで
きた。 【００９１】〔実施例８〕 ＲＮＡオリゴマー（Ｘ，XI
II，XIV)それぞれの５′水酸基の³²Ｐによるリン酸標識
方法 前記岩井らの文献（３）記載の方法により製造したＲＮ
Ａオリゴマー（Ｘ）２０ｐｍｄｅと３０μＣｉの〔ｒ
^-32 Ｐ〕ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）を
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭ ＤＴＴ、
０．１ｍｇ／ｍｌＧｅｌａｔｉｎに溶解し（全量２５μ
ｌ）Ｔ４−ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓ
ｅ（１Ｕ、宝酒造社）を加え、３７℃、１時間反応させ
て、５′リン酸化した。反応液はフェノール−クロロホ
ルム抽出した後、セファデックスＧ−７５カラム（全量
１０ｍｌ）にかけた。移動相として、１０ｍＭトリエチ
ルアミン−炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、はじめの
放射能を含むフラクションを集め、標識ＲＮＡオリゴマ
ーとした。 【００９２】ＲＮＡオリゴマー（XIII，XIV)についても
同様に標識ＲＮＡオリゴマーを調製した。 【００９３】〔実施例９〕 ホモクロマトグラフィーの
条件 酵素反応液を適当量（数万ｃｐｍ）、ＰＯＬＹＧＲＡＭ
ＣＥＬ ３００ ＤＥＡＥ／ＨＲ−２／１５（Ｍｅｃ
ｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）にスポットし、Ｈｏｍｏｍ
ｉｘ IVにより６０℃で展開後、−８０℃で一晩、Ｘ線
フィルム（コダックエックス−ホーマットＲＰフィルム
Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｃ社）に感光させた。Ｈｏｍ
ｏｍｉｘの調製については文献（Ｅ．Ｊａｙ ｅｔ．ａ
ｌ．Ｎｎｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１ ３３１
１９７４）に従って行った。 【００９４】〔実施例１０〕 Ｖｅｎｏｍ ｐｈｏｓｐ
ｈ ｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅによる限定分解（ＶＰＤ分
解物の調製） ５′末端標識したＲＮＡオリゴマー（Ｘ，XIII，XIV 、
５〜７万ｃｐｍ）、キャリアーＲＮＡ０．２〜０．３Ｏ
Ｄ（Ｔｏｌｕｒａ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ Ｔｙｐｅ VI
ＳＩＧＭＡ社）、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、ＶＰＤａｓｅ０．
２〜０．３μｇ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を全量１０
μｌとし、３７℃で反応させ、２，５，１０，２０，３
０分毎に、それぞれ２μｌずつ、サンプリングし５ｍＭ
ＥＤＴＡ ５μｌの入ったエッペンチューブに入れ、
１００℃２分でそれぞれ反応を停止させた。それぞれの
反応液を混合し、ホモクロマトグラフィー用のマーカー
（図４，７，８，９，１０，１１，１２中、ＶＰＤ分解
物と表示）として用いた。 【００９５】〔実施例１１〕 ２′−Ｏ−メチルヌクレ
オシド−３′−ホスホロアミダイト類（Ｉｂ₂ ，II
ｂ₂ ，III ｂ₂ ，IVｂ₂ ）の合成 Ｎ⁶ −ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
２′−メチルアデノシン（化合物IIａ）３４４ｍｇ
（０．５ｍｍｏｌ）を２ｍｌの無水ＴＨＦに溶解し、ア
ルゴン気流中室温で撹拌しながらジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＰＥＡ）３６２μｌ（２ｍｍｏｌ）を、次
いで、Ｎ，Ｎジイソプロピルアミノメトキシクロロホス
フィン３００μｌ（１．５ｍｍｏｌ）を１分間で加え
た。５分後ＤＩＰＥＡ塩酸塩の白色沈澱を生じたが、室
温で更に撹拌し４５分後反応の進行をシリカゲル６０Ｔ
ＬＣ（移動相、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１／５％
トリエチルアミン）で調べた。原料のスポット（Ｒ_f 値
０．５２）が消失し、新たにIIｂ_２のスポットがＲ_ｆ
値０．７６に現われたのを確認後、氷冷下酢酸エチル２
０ｍｌを加えた。次に氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液１５ｍｌで２回、更に氷冷した飽和食塩水１５ｍ
ｌで１回洗浄後有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させ
た。硫酸ナトリウムを濾去後濾液は濃縮乾固した。得ら
れた油状残渣は減圧乾燥後２ｍｌのジクロルメタンに溶
解し、−５０℃に冷却したｎ−ヘキサン２００ｍｌに撹
拌しながら滴下し白色沈澱を精製させた。IIｂ₂ の白色
沈澱は濾取し直ちにデシケーター内に入れ、室温にて一
晩減圧乾燥し、４０７ｍｇのIIｂ₂ を９５％の収率で得
た。 【００９６】尚、同様の操作によりＮ² −イソブチリル
−５′−Ｏ−モノメトキシトリチル−２′−Ｏ−メチル
グアノシン−３′−ホスホロアミダイト(IIIｂ₂ ）、Ｎ
⁴ −ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′
−Ｏ−メチルシチジン−３′−ホスホロアミダイト（Ｉ
ｂ₂ ）及び５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−
メチルウリジン−３′−Ｏ−ホスホロアミダイト（IVｂ
₂ ）をほぼ同様の収率で合成した。 【００９７】以下に³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトル、ＦＡＢ−
Ｍａｓｓスペクトル及びＵＶ吸収スペクトルのデーター
を示した。³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトル 測定溶媒：ＣＤＣｌ₃ 、外部標準：トリメチルホスフェ
ート（ＰＰＭ） Ｉｂ₂ １４８．５４７０、１４８．３５０９ IIｂ₂ １４９．４５２０、１４８．５９９８ IIIｂ₂ １４９．５７２６、１４８．９６１８ IVｂ₂ １４８．８７８８、１４８．３１３２ （これらはｉｓｏｍｅｒとして２本のシグナルを与え
た。） 【００９８】〔実施例１２〕 ２′−Ｏ−メチルヌクレ
オシド−３′−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎジイソプロピ
ルアミノホスフィン（Ｉｂ₃ ，IIｂ₃ ，III ｂ₃ ，IVｂ
₃ ）の製造 Ｎ⁶ −ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
２′−Ｏ−メチルアデノシン３４４ｍｇ（０．５ｍｍｏ
ｌ）を２ｍｌのＴＨＦ（金属ナトリウム存在下蒸留）に
溶解し、アルゴン気流下室温で撹拌しながらジイソプロ
ピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）３６２μｌ（２ｍｍｏ
ｌ）、次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン−β−シア
ノエチルクロロホスフィン１．５ｍｍｏｌを加えた。５
分後ＤＩＰＥＡ塩酸塩の白色沈澱を生じたが室温で更に
撹拌し、３０分後反応の進行をシリカゲル６０ＴＬＣ
（移動相ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１／５％トリエ
チルアミン）で調べた。原料（化合物IIａ）のスポット
が消失し、アミダイト体（化合物IIｂ₃ ）のスポットが
現われたのを確認後、氷冷下酢酸エチル２０ｍｌを加え
た。次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍｌで２
回、更に氷冷した飽和塩化ナトリウム水溶液１５ｍｌで
１回洗浄後、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させ
た。硫酸ナトリウムを濾去後、濾液は濃縮乾固し、得ら
れた泡状残渣を２ｍｌの０．２％トリエチルアミンを含
む酢酸エチルに溶解させ、シリカゲル６０、２．５ｇを
詰めたカラムにアプライした。０．２％トリエチルアミ
ンを含む酢酸エチルで溶出させ化合物IIｂ₃ の純粋画分
を集め濃縮乾固し、４０７ｍｇ（０．４８５ｍｍｏ
ｌ）、９７％の収率で得た。 【００９９】尚、同様の操作により、Ｎ² −イソブチリ
ル−５′−Ｏ−モノメトキシトリチル−２′−Ｏ−メチ
ルグアノシン−３′−ホスホロアミダイト（化合物III
ｂ₃）、Ｎ⁴ −ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２′−Ｏ−メチルシチジン−３′−ホスホロアミ
ダイト（化合物Ｉｂ₃ ）及び５′−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２′−Ｏ−メチルウリジン−３′−ホスホロアミ
ダイト（化合物IVｂ₃）をほぼ同様の収率で得た。 【０１００】以下に³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトル、ＦＡＢ−
ＭＡＳＳスペクトル及びＵＶ吸収スペクトルのデーター
を示した。³¹ Ｐ−ＮＭＲスペクトル 測定媒体ＣＤＣｌ₃ 、外部標準トリメチルホスフェート （８ｐｐｍ） 化合物 Ｉｂ₃ １４８，８１２７、１４８，３２２４ 化合物 IIｂ₃ １４９，２１２５、１４８，４５８２ 化合物 IIIｂ₃ １４８，４５８２、１４８，２５４５ 化合物 IVｂ₃ １４８，８２０３、１４８，３６０１ ＦＡＢ−ＭＡＳＳスペクトル Ｍ−Ｈ⁺ （ｍ／ｚ） 化合物 Ｉｂ₃ ８６４ 化合物 IIｂ₃ ８８８ 化合物 IIIｂ₃ ８４０ 化合物 IVｂ₃ ７６２ ＵＶ吸収スペクトル 測定溶媒：エタノール （ｎｍ） 化合物 Ｉｂ₃ ： λ_max ．３０５，２６０，２３６ λ_min ．２８９，２５０，２２３ 化合物 IIｂ₃ λ_max ．２７９，２３４ λ_min ．２５７，２２３ 化合物 IIIｂ₃ λ_max ．２８０，２５４，２３５ λ_min ．２７２，２４４，２２７ 化合物 IVｂ₃ λ_max ．２６４，２３３ λ_min ．２５３，２２６ 【０１０１】〔実施例１３〕 ２′−Ｏ−メチルヌクレ
オシド結合固体担体（Ｉｃ₂ ，IIｃ₂ ，III ｃ₂ ，IVｃ
₂ ）の合成 Ｎ⁶ −ベンゾイル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
２′−Ｏ−メチルアデノシン（IIａ）、３４４ｍｇ
（０．５ｍｍｏｌ）及び４−Ｎ，Ｎジメチルアミノピリ
ジン（ＤＭＡＰ）９２ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を無水
ピリジン２ｍｌに溶かし、３０℃で撹拌しながら無水こ
はく酸７５０ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を加えた。一晩
撹拌した後反応液を濃縮乾固し、得られた油状残渣をク
ロロホルム２０ｍｌに溶解させ、０．１Ｍトリエチルア
ミン−炭酸緩衝液（ＴＥＡＢ緩衝液）ｐＨ７．５、２０
ｍｌで３回洗浄した。クロロホルム層は無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させた後濃縮乾固した。得られた残渣（IIｅ
及びＤＭＡＰの混合物）を２．７ｍｌのＤＭＦに溶か
し、ペンタクロロフェノール２００ｍｇ（０．７５ｍｍ
ｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
１５４ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を加え３０℃で一晩撹
拌した。次に析出した不溶物を濾去し、濾液を濃縮乾固
して得られた残渣をクロロホルム３ｍｌに溶解し、クロ
ロホルムで平衡化させたシリカゲル６０のカラム（２０
ｇ、直径４ｃｍ×長さ２．５ｃｍ）にアプライした。ク
ロロホルムを移動層として用い、溶出されたIIｆの純粋
画分（シリカゲル６０ＴＬＣ、クロロホルム：メタノー
ル＝２０：１にてＲ_f 値０．８１）を集めて濃縮乾固
し、IIｆを約９０％の収率で得た。 【０１０２】尚、同様の操作により、Ｉｆ，III ｆ，IV
ｆをほぼ同様の収率で得た。 シリカゲル６０ＴＬＣでのＲ_f 値 Ｒ_f 値 移動相 Ｉｆ ０．７６ クロロホルム：メタノール＝１５：１ IIIｆ ０．６８ クロロホルム：メタノール＝１０：１ IVｆ ０．７４ クロロホルム：メタノール＝１５：１ 【０１０３】次に、コントロールドポアグラスサポート
（ＣＰＧ／ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎａｌｋｙｌａｍｉｎ
ｅ，Ｐｏｒｅ Ｄｉａ．５００Å，Ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｓｉｚｅ １２２−１７７μ，ＮＨ₂ −：３０μｍｏｌ
／ｇ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）、６８
０ｍｇ（ＮＨ₂ −：２０μｍｏｌ）をグラスフィルター
付き反応容器に入れ、１ｍｌのＤＭＦで洗浄後アルゴン
ガス気流中で１分間乾燥させた。次に活性エステル体
（Ｉｆ，IIｆ，III ｆ，IVｆ）（０．４５ｍｍｏｌ）を
それぞれ４．５ｍｌのＤＭＦに溶かし、トリエチルアミ
ン１１４μｌ（０．８２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液
を先程のＣＰＧに加え密栓し、３０℃で一晩振とう後ア
ルゴンガス圧により反応液を濾去した。固相担体は５ｍ
ｌのＤＭＦで３回、次いで５ｍｌのＴＨＦで３回洗浄後
アルゴンガス気流下で１分間乾燥させた。次にＤＭＡＰ
２７３ｍｇ、２，６ルチジン９４０ｍｇ、無水酢酸０．
４４ｍｌ、ＴＨＦ４ｍｌの混合液を加え、３０℃で３０
分間振とうし未反応のアミノ基をアセチル化した。反応
液を濾去後５ｍｌのＴＨＦで３回、次いで５ｍｌのジエ
チルエーテルで３回洗浄後アルゴン気流中で乾燥、更に
真空で乾燥した。得られたヌクレオチド−サポート（Ｉ
ｃ₂ ，IIｃ₂ ，III ｃ₂ ，IVｃ₂ ）を少量秤り取り、３
％トリクロロ酢酸でジメトキシトリチル（又はモノメト
キシトリチル基）を切断後遊離したトリタノールを過塩
素酸−エタノール溶液で発色定量を行った結果、ヌクレ
オシドの結合量はいずれも２９〜３０μｍｏｌ／ｇであ
った。 【０１０４】〔実施例１４〕 混合オリゴヌクレオチド
の製造（メトキシ体より） （５′ＣＧＧＡＵｍＣｍＵｍＡｍＧｍＣｍＣｍＧｍＧｍ
ＧｍＵｍ３′（XVIII)の製造例、ｍはＯ−メチルヌクレ
オチドユニットを表し、他はデオキシヌクレオチドユニ
ットを表わす。） 【０１０５】５′−ジメトキシトリチル２′−Ｏ−メチ
ルウリジン、０．２μｍｏｌを結合したコントロールド
ポアグラス（化合物IVｃ₂ ）８ｍｇをカートリッジに詰
めＤＮＡシンセサイザーｍｏｄｅｌ３８０Ａ（Ａｐｐｌ
ｉｅａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし表２に
示した操作でホスホロアミダイトをIII ｂ₂ ，III
ｂ₂ ，III ｂ₂ ，Ｉｂ₂ ，Ｉｂ₂ ，III ｂ₂ ，IIｂ₂ ，
IVｂ₂ ，Ｉｂ₂ ，IVｂ₂ ，IIｄ₂ ，III ｄ₂ ，III
ｄ₂ ，Ｉｄ₂ の順に使用し１４サイクル繰り返して保護
された混合オリゴマーを合成した。次に表３に示した操
作で、３ｍｌのバイアルにアンモニア溶液として固相担
体（ＣＰＧ）より切り出し密封し５０℃で１２時間加温
し塩基部アシル基を除去した。冷却後アンモニアを除去
し、酢酸エチル１ｍｌで２回洗浄し水層は濃縮乾固し
た。得られた残渣は１０％アセトニトリルを含む０．１
Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液ｐＨ７．０（ＴＥＡ
Ａ）２００μｌに溶かし逆相シリカゲル（Ｗａｔｅｒｓ
社Ｐｒｅｐ ＰＡＫ−５００／Ｃ−１８）を詰めた直径
１ｃｍ、長さ１０ｃｍのカラムにアプライし、移動相と
して１０％から３５％アセトニトリルの直線濃度勾配を
かけた０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）を用いたカラ
ムクロマトグラフィーを行い２５４ｎｍにおける吸光度
で定量し、５′−ジメトキシトリチル混合オリゴヌクレ
オチドを２．２ＯＤユニットを分離した。溶媒を減圧留
去した後８０％酢酸水溶液１ｍｌを加え、室温で１０分
間放置した。反応液は減圧留去した後、更に水と減圧共
沸することにより酢酸を除去した。残渣は水に溶かし酢
酸エチルで洗浄後減圧留去し高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した。すなわちＹＭＣ ｐａｃｋ ＯＤＳ
（山村科学社製）カラムにより移動相として５％〜２５
％アセトニトリルの直線濃度勾配をかけた０．１Ｍ Ｔ
ＥＡＡ（ｐＨ７．０）を用い、１２ｍｌ／分の流速で行
い溶出された主ピークを分取し０．９１ＯＤユニット
（約６ｎｍｏｌ、収率３．０％）の混合オリゴヌクレオ
チドXVIII を得た。 【０１０６】尚、同様の操作により ５′ＣＧＧＡＴＣｍＵｍＡｍＧｍＣｍＣｍＧｍＧｍＧｍ
Ｕｍ３′（XVII）を２．５％の収率で、５′ＣＧＧＡｍ
ＵｍＣｍＵｍＡｍＧｍＣｍＣｍＧｍＧｍＧｍＵｍ３′
（XIX)を３．０％の収率で、５′ＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍ
ＣｍＣｍＣＧＧＡ３′（XXII）を６．８％の収率で、
５′ＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＣｍＣＧＧ３′（XXIII)
を８．６％の収率で、５′ＣｍＵｍＣＧＡＡＡＧｍＵｍ
３′（XXIV）を３．２％の収率でそれぞれ単離した。 【０１０７】なお、鎖長延長反応操作の１サイクル（0.
2μＭ ＣＧＰresin使用）及びＣＧＰresinからの切り
離し操作をそれぞれ表２および表３に示す。 【０１０８】 【表２】【０１０９】 【表３】【０１１０】〔実施例１５〕 混合オリゴヌクレオチド
の製造（β−シアノエチル体による）（５′ＡｍＣｍＡ
ｍＣｍＡｍＣｍＣｍＣｍＧＧＡＴ３′（XX）の製造例
１。ｍはＯ−メチルヌクレオチドユニットを表わす。他
はデオキシヌクレオチドユニットを表わす。） ５′−ジメトキシトリチルチミジン０．２μｍｏｌを結
合したコントロールドポアグラスカートリッジ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、表
２に示した操作で、ホスホロアミダイトをIIｄ₃ ，III
ｄ₃ ，III ｄ₃，Ｉｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，IIｂ₃ ，Ｉ
ｂ₃ ，IIｂ₃ ，Ｉｂ₃ ，IIｂ₃ の順に使用し、１１回サ
イクルを繰り返して保護された混合オリゴマーを合成し
た。次に表３に示した操作で３ｍｌのバイアルにアンモ
ニア溶液として、固相担体（ＣＰＧ）より切り離し、密
封して、５０℃、９時間加温し、β−シアノエチル基及
び塩基部アシル基を除去した。冷却後、アンモニアを除
去し、酢酸エチル１ｍｌで２回洗浄し、水層は濃縮乾固
した。残された残渣は１０％アセトニトリルを含む０．
１Ｍ酢酸−トリエチルアミンバッファー（ＴＥＡＡ ｐ
Ｈ７．０）２００μｌに溶解し、逆相シリカゲル（Ｗａ
ｔｅｒｓ社、Ｐｒｅｐ．ＰＡＫＣ−５００／Ｃ−１８）
を詰めた直径１ｃｍ、長さ１０ｃｍのカラムにアプライ
し移動相として、１０％から３５％アセトニトリルの直
線濃度勾配をかけた０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、２５４ｎｍ
における吸光度から５′−ジメトキシトリチル混合オリ
ゴマー９．５ＯＤユニットを分離した。溶媒を減圧留去
した後、８０％酢酸水溶液１ｍｌを加え、室温で１０分
間放置した。反応液は減圧留去した後水と減圧共沸さ
せ、酢酸を除去し、残渣は水に溶解し、酢酸エチルで洗
浄後減圧留去し、高速液体クロマトグラフィーにより精
製した。すなわちＹＭＣ ｐａｃｋ（山村科学社製）カ
ラムにより、移動相として、５％〜２５％アセトニトリ
ルの直線濃度勾配をかけた０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ
７．０）を用い、１．２ｍｌ／分の流速で行い、溶出さ
れた主ピークを分取し、１．９ＯＤユニット（約１６ｎ
ｍｏｌ収率８．１％）の混合オリゴヌクレオチド（XX）
を得た。 【０１１１】尚、同様の操作により混合オリゴマー５′
ＡｍＣｍＡｍＣｍＡｍＣｍＣｍＣＧＧＡＴ３′（化合物
（XXI)）を、９．３％の収率で得た。 【０１１２】〔実施例１６〕 二重鎖ＤＮＡ（XVI)の合
成 市販の化合物（Ｉｄ₄ 〜IVｄ₄ ）、及び（Ｉｄ₂ 〜IVｄ
₂ ）（ＡＢＩ社）を用いＤＮＡ自動合成機によりＤＮＡ
オリゴマー（１〜９、鎖長１７〜４７）を合成し、常法
により精製した。ＤＮＡオリゴマーそれぞれを１ｎｍｏ
ｌｅづつとり、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）４μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂ ・４μｌ、０．２ｍ
Ｍ ＡＴＰ１０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ・４μｌ、Ｈ₂
Ｏ１４μｌに溶解し、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造）２μｌ（５Ｕ）を加え３７℃、４０分反応さ
せ、続けて、同量のキナーゼを加え、４０分反応させ
た。５′位リン酸化した化合物（１，２，５，６）（Ａ
液）及び（３，４，７，８，９）（Ｂ液）をそれぞれ別
々に混合しＡ液、Ｂ液とした。８０℃の湯浴につけ約３
時間かけ２０℃まで冷却した。Ａ液に２ｍＭ ＡＴＰ４
０μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ４０μｌ、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造）１μｌ（１７５Ｕ）を加え（Ｔｏｔａｌ
１００μｌ）１５℃で２０時間反応させた。Ｂ液にも
２ｍＭ ＡＴＰ２５μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ２５μｌ、
リガーゼ０．５μｌ（８７Ｕ）を加え、同様に反応させ
た。反応液をそれぞれフェノール処理した後に、ゲルロ
過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TE６Ｈ１０／３０）移動
相：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）にかけ、分取し、二重鎖Ａ：５９０ｐｍ
ｏｌｅ（１．０７ＯＤ）、Ｂ：３１１ｐｍｏｌｅ（０．
６２ＯＤ）を得た。 【０１１３】次にＡ鎖３４７ｐｍｏｌｅとＢ鎖３１１ｐ
ｍｏｌｅを混合し、１４０μｌの反応液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、０．２ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中、３
７℃、１時間放置後、室温でアニーリングし、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ０．５μｌ（８７Ｕ）を加え、１５℃、
１．５時間反応させた。フェノール−クロロホルム処理
後エタノール沈でん処理をし、減圧乾固した。 【０１１４】６ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１２５ｍＭＮａＣｌ、７ｍ
Ｍ ＤＴＴの溶液９５μｌを加え溶解し、ＳｐｈＩ５μ
ｌ（２０Ｕ）を加え、３７℃３０分間、続けて室温で２
日間反応させた。フェノール−クロロホルム処理した後
エタノール沈でん処理をし、前記したゲルロ過カラム
（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TH６Ｈ１０／３０）にかけ分取し、
エタノール沈でん後、６８ｐｍｏｌｅ（７．６μｇ）の
二重鎖ＤＮＡ（XVI)を得た。 【０１１５】〔実施例１７〕 転写用ベクターＭ１３−
ＡＪ−１の調製 Ｍ１３ｍｐ１９ ２μｌ（宝酒造、０．１μｇ／１μ
ｌ）を６ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭＤＴＴ溶
液２０μｌ中、ＳｐｈＩ（２Ｕ宝酒造）を加え、３７
℃、３０分反応させた。常法によりフェノール−クロロ
ホルム処理、エタノール沈でんを行った後、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＤＴＴ溶液２０μｌ
中、ＳｍａＩ（５Ｕ、宝酒造）を加え、３０℃、３０分
間反応させた。常法によりフェルール−クロロホルム処
理、エタノール沈でんを行った後、減圧乾固した。次に
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、０．２ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ
溶液２０μｌに溶解し、実施例１６で得た二重鎖ＤＮＡ
（XVI)０．０４μｇを加え、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ２Ｕ
を加え、１６℃、３時間続けて、４℃、一晩反応させ
た。この液を１μｌ、２μｌ、４μｌづつそれぞれ次の
トランスホーメーションに使用した。 【０１１６】文献（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ １０１ ２０−７８ １９８３）記載の方法
に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０３のコンピテントＣ
ｅｌｌをトランスホーメーションし、白色プラークをス
クリーニングした。約１０ケの白色プラークからそれぞ
れファージをとり、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０３液１．
５ｍｌ（菌を１晩別に３７℃で培養し、１００倍希釈し
たもの）に加え、６時間３７℃で培養し、１２０００ｒ
ｐｍ５分遠心して、上清を得た。常法に従い、１本鎖Ｄ
ＮＡをそれぞれ得、ジデオキシ法により挿入した合成二
重鎖部分をシークエンスし、目的クローンを得た。 【０１１７】尚、１ｌの大量培養したＪＭ １０３液
（０．３ＯＤ／５７０ｎｍ）に上記上清１００μｌのフ
ァージ液を加え、３７℃、７時間培養し、常法に従い、
目的のベクターＭ１３ＡＪ−１ ４４５μｇを得た。 【０１１８】〔実施例１８〕 ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡの
調製 Ｍ１３−ＡＪ−１ ５０μｇをＳｍａＩ、７０ユニット
を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＤＴ
Ｔ溶液１００μｌ中、３０℃、２時間反応させ、１％ア
ガロースで直鎖になったことを確認した。フェノール−
クロロホルム処理し、エタノール沈でんの後、１ｍｌの
水に溶解し、２６０ｎｍでＵＶ測定をした（０．８４Ｏ
Ｄ／ｍｌ：４２μｇ）。再度減圧乾固し、水８４μｌに
溶解し、次の転写反応に使用した。方法は文献（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２ ７０３５（１９８
４））に従い、１．５ｍｌのエッペンチューブに１０ｍ
ＭのＡＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰをそれぞれ５μｌ
づつとり１００μｌの〔５−³ Ｈ〕−ＵＴＰ（１００μ
ｃｉ、２．２×１０⁸ ｄｐｍ／７．３ｎｍｏｌｅ、アマ
シャム社製）を加え、減圧乾固した。 【０１１９】次に５倍の転写用バッファー（２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０ｍＭスペルミジン）２０μｌ、１００ｍＭ
ＤＴＴ１０μｌ、ＲＮａｓｉｎ５μｌ（１５０Ｕ）、上
記ＳｍａＩ ｃｕｔ ＤＮＡ液３０μｌ（１５μｇ）、
ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ１０μｌ（１５０Ｕ）、ジ
エチルピロカーボネート処理した水２５μｌを加え、全
量１００μｌとし、４０℃、１時間反応させた。更に、
ＳＰ６−ポリメラーゼ３μｌ（４５Ｕ）を加え、２時間
反応させた。反応液にＲＱＩＤＮａｓｅ１５μｌ（１５
Ｕ）とＲＮａｓｉｎ４μｌ（１２０Ｕ）を加え、３７℃
１５分反応させた。１００μｌのフェノール−クロロホ
ルム、１００μｌのクロロホルム、１００μｌのエチル
エーテルでそれぞれ１回抽出した後減圧乾固した。（以
上使用した試薬は〔³ Ｈ〕ＵＴＰ（アマシャムジャパン
社製）を除きすべてプロメガ、バイオテク社製キットを
用いた。） 【０１２０】次に約２００μｌの水に溶解し、ＮＥＮＳ
ＯＲＢ２０（ジャポン社製）処理し、５０％溶離液約１
ｍｌを減圧乾固し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ５００μｌに溶解し
た。 【０１２１】得られた溶液を５μｌをサンプリングし、
液体シンチレーションカウンター（パッカード社、ＴＲ
Ｉ−ＣＡＲＢ４０４０）にて測定し、計算よりＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡ３μｇを含むことを確認した。また、２６
０ｎｍでのＵＶ測定より約９μｇのＤＮＡを含むことを
推定した。 【０１２２】ここで得られたＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ溶液
を次の実施例１９の実験に用いた。 【０１２３】 〔実施例１９〕ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡの３′−³²ｐＣｐ標識 ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ ３３６ｎｇ（１１．２ｐｍｏｌ）０．５６ μＭ 〔５′−³²Ｐ〕ｐＣｐ（アマシャムジャパン社製） ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ０．８２５μＭ ＡＴＰ ６ μＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．３） ５０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １０ ｍＭ ＤＴＴ ３．３ ｍＭ ＤＭＳＯ １０％（ｖ／ｖ） ＢＳＡ １０μｇ／ｍｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １５％（ｖ／ｖ） ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｐ．Ｌ．ファルマシア社製） ２Ｕ ──────────────────────────────────── ↓ 全量 ２０μｌ ４．５℃、１６時間 【０１２４】上記条件で反応を行った。ただし、ＲＮＡ
リガーゼ及〔５′−³²Ｐ〕ｃＰｃを加える前に６５℃、
５分間加熱後直ちに氷冷しておいた。反応後２０μｌの
ｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０％尿素、０．
０２％キシレンシアノール、０．０２％ブロムフェノー
ルブルー）を加え、７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルア
ミドゲル（長さ５０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ）にアプライ
し、２０００Ｖ、２時間電気泳動した。泳動後のゲルは
オートラジオグラフィーを行い鎖長の１つ異なる部分を
別々に切り取り、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの方法に
従いゲルより抽出した。抽出物はＮＥＮＳＯＲＢ^TM２０
（Ｄｕ ｐｏｎｔ社製）により脱塩し、鎖長の一つ異な
る３′−³²ｐＣｐラベルしたＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡと１
つ鎖長の短いＲＮＡをそれぞれ０．７２５ｐｍｏｌ（合
計１．４５ｐｍｏｌ、収率１３％）得た。尚、定量はチ
ェレンコフ法によるβ線量測定で行った。次に０．０２
ｐｍｏｌ／μｌの濃度になるようにＨ₂ Ｏを加えて溶か
し、−８０℃にて保存した。尚次の切断反応には³²ｐＣ
ｐ標識したＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡを用いた。 【０１２５】〔実施例２０〕 ＲＮＡ鎖切断反応 一般的方法を下記に示した。 ３′−³²ｐＣｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ ３．３ ｎＭ 混合オリゴマー ８３ｎＭ〜８．３μＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７） ４０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ４ ｍＭ ＢＳＡ ０．００３％ ＤＴＴ １ ｍＭ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ４ ％ ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製） ０．１７〜０．８３ｕｎｉｔｓ／μｌ ──────────────────────────────────── 全量 ６ μｌ 【０１２６】ＲＮａｓｅＨを加える前に上記混合物は６
５℃で２分間加熱し、アニーリングを行った。反応は３
０℃で行い適時６μｌのｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎを加え停止し、２μｌを７モル尿素を含む８％ポリ
アクリルアミドゲルによる電気泳動を行った。（厚さ
０．２ｍｍ、長さ３５ｃｍ、２０００Ｖ、２時間） 【０１２７】尚、混合オリゴマー８．３μＭ（ＲＮＡに
対し２５００倍）、ＲＮａｓｅＨ０．１７ｕｎｉｔｓ／
μｌで２時間反応を行い、８％ＰＡＧＥによるオートラ
ジオグラフィーを行ったものを図１３に示す。 【０１２８】ｌａｎｅ８は、ループ上の４３番目のＧと
４４番目のＡの間で切断が起っている。ｌａｎｅ１０は
ステム内のＧ²¹とＧ²²の間で選択的に切断が起ってい
る。ｌａｎｅ１１は二ケ所で切断が起っている。ｌａｎ
ｅ２のＤＮＡ４４ｍｅｒでは選択的に切断できず、ｌａ
ｎｅ３の相補的ＤＮＡ６ｍｅｒでは全く切断されない。 【０１２９】図１４は酵素量を０．８３ｕｎｉｔｓ／μ
ｌとし、同様に反応させた結果である。酵素量を増加し
たためｌａｎｅ６，７は切断が起っている。 【０１３０】図１３と図１４は泳動時に熱をかけたもの
（図１４）とかけないもの（図１３）であり、ｌａｎｅ
９，１０（１１）においては混合オリゴマーの影響によ
るＲＮＡの構造変化を反映した泳動位置の変化が見られ
る。 【０１３１】〔実施例２１〕実施例２０と同様の条件に
おいて、混合オリゴマーの量を１／１０、１／１００
（ＲＮＡに対して２５倍、２５００倍）に減らし、ＲＮ
ａｓｅＨは０．４２ｕｎｉｔｓ／μｌを用いて実験した
結果を図１５に示す。 【０１３２】ｌａｎｅ５，６，７及び１１，１２，１３
から、混合オリゴマー（XXIV及びXVIII)を用いた場合
は、２５倍に下げても切断が起り、原料は消失している
ことが判る。混合オリゴマー（XIX)を用いた場合、切断
が起り、Ｇ²¹とＧ²²及びＧ²²とＧ²³の間で切断されてい
た。混合オリゴマー（XXI)を用いた場合、２５００倍で
はわずかに切断が起り、Ｇ²¹とＧ²²の間で切断されてい
る。 【０１３３】〔実施例２２〕 ＲＮＡ鎖長マーカーの調
製 ３万〜６万ｃｐｍの３′−³²ｐＣｐ−標識ＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡを使用し、Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用
い、（ＲＮａｓｅＴ₁ は三共社製使用）その使用マニュ
アル通りに反応し、反応液２μｌを電気泳動に用いた。
即ちアルカリ分解は１μｌの３′末端³²Ｐ標識ＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡ（約５００００ｃｐｍ）及びキャリアーｔ
ＲＮＡ２μｇ／μｌを１μｌ、ＣＯ₃ ／ＨＣＯ₃ 溶液１
μｌを加え、９０℃で６分間加熱後氷冷し、３μｌの尿
素−色素溶液（５ｍＭトリス、５ｍＭホウ酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０１％キシレシアノールＦＦ、０．０１
％ブロムフェノールブルー、１０Ｍ尿素）を加え、その
うち２μｌを電気泳動にアプライした。 【０１３４】ＲＮａｓｅＴ₁ 分解は１μｌの３′末端³²
Ｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ（約５００００ｃｐｍ）及
び緩衝液（３３ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０、
１．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％キシレンシアノール
ＦＦ、０．０８％ブロムフェノールブルー、１ｍｇ／ｍ
ｌキャリアーｔＲＮＡ、７Ｍ尿素）を３μｌ、蒸留水１
μｌ、ＲＮａｓｅＴ₁ （三共社製）０．０１ユニット／
μｌを１μｌ加え、５５℃で１２分間反応後氷冷し、そ
のうち２μｌを電気泳動にアプライした。 【０１３５】ＲＮａｓｅＵ₂ 分解は１μｌの３′末端³²
Ｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡ（約５００００ｃｐｍ）及
び緩衝液（３３ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．５、
１．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０４％キシレンシアノール
ＦＦ、０．０８％ブロムフェノールブルー、１ｍｇ／ｍ
ｌキャリアーｔＲＮＡ、７Ｍ尿素）を３μｌ、蒸留水１
μｌ、ＲＮａｓｅＵ₂ （ファルマシア社製）２ユニット
／μｌを１μｌ加え、５５℃で１２分間反応した。反応
後氷冷し、そのうち２μｌを電気泳動にアプライした。 【０１３６】〔実施例２３〕 ＲＮａｓｅ切断物の５′
末端塩基分析 （５′ＣｍＵｍＣＧＡＡＡＧｍＵｍ３′（XXIV）を用い
た場合の切断物の分析例） 【０１３７】３′末端を³²ｐＣｐで標識したＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡ０．０２ｐｍｏｌ（約２００ｃｐｍ：チェ
レンコフ法で測定）の５′ＣｍＵｍＣＧＡＡＡＧｍＵｍ
３′とＲＮａｓｅＨによる切断反応液６μｌに、溶液Ａ
（０．１Ｍトリス塩酸、１０ｍＭトリエチルアミン、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）２００μｌを加え希釈
し、ＮＥＮＳＯＲＢ^TM２０核酸精製用カートリッジ（Ｄ
ｕ ＰＯＮＴ社製）にアプライし、３ｍｌの溶液Ａ次い
で１ｍｌの蒸留水で洗浄後５００μｌの５０％メタノー
ル水で溶出した。溶出液は減圧濃縮乾固し、文献（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，２５２，３１７６〜３１８４（１９７
７年））記載の方法により５′末端リン酸を高比活性³²
Ｐに交換した。即ち、上記濃縮乾固物に０．５Ｍイミダ
ゾール−塩酸緩衝液１μｌ、０．１Ｍ塩化マグネシウム
１μｌ、１ｍＭスペルミジン１μｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
１μｌ、５０ｍＭジチオスレイトール１μｌ、蒸留水２
μｌ、３ｍＭ ＡＤＰ１μｌを加えて溶かし、６５℃で
２分間加温後直ちに氷冷した。 【０１３８】次に、この混合液を〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ、
２０ｐｍｏｌ、１００μＣｉ（アマシャム・ジャパン社
製）を予め濃縮乾固しておいた容器に加え、更にＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ７ユニット／μｌ（宝酒造社
製）を１μｌを加えて３７℃で３０分間反応した。反応
液に１０Ｍ尿素、０．０２％キシレンシアノール、０．
０２％ブロムフェノールブルーを含む液を１０μｌ加
え、全量を７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル
（厚さ０．２ｍｍ、長さ３５ｃｍ）による電気泳動（２
０００Ｖ、２時間）を行い分離した。泳動後オートラジ
オグラフィーを行い約４８鎖長付近のバンドを切り取
り、細かく切断し０．５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを３００μｌ加え室温で１日放置した。ゲ
ルは遠心分離することにより除き溶出液は減圧濃縮乾固
した。得られた４８鎖長の切断物は溶液Ａ（０．１Ｍト
リス塩酸、１０ｍＭトリエチルアミン、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．７）２００μｌを加え希釈しキャリアーｔ
ＲＮＡ４μｇを加え、ＮＥＮＳＯＲＢ^TM２０核酸精製用
カートリッジ（Ｄｕ ＰＯＮＴ社製）にアプライし、３
ｍｌの溶液Ａ、次いで１ｍｌの精製水で洗浄後５００μ
ｌの５０％メタノール水で溶出した。溶出液（８００ｃ
ｐｍチェレンコフ法による測定）は減圧濃縮乾固後、蒸
留水８μｌ、０．４Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０ １
μｌ、及びヌクレアーゼＰ１（ヤマサ醤油社製）０．１
μｇ／１μｌを加えて溶かし３７℃、３０分間反応し
た。反応液は東洋濾紙Ｎｏ．５１（４０ｃｍ）にスポッ
トし、０．２Ｍ酢酸モルホリン緩衝液（ｐＨ３．５）中
での濾紙電気泳動（９００Ｖ、３．５ｍＡ、９０分間）
を標品５′ＣＭＰ、５′ＡＭＰ、５′ＧＭＰ、５′ＵＭ
Ｐ及び３′末端³²ｐＣｐ標識酵母５ＳＲＮＡの同条件の
ヌクレアーゼＰ１分解物とともに行った。泳動後ラジオ
オートグラフィーを行った結果、図１６−Ａに示したよ
うに５′ＡＭＰが検出された。以上のことから切断部位
は４３番目のＧと４４番目のＡの間であることが確認で
きた。 【０１３９】尚、XVII、XVIII を用いた場合の切断物に
ついても３′末端を³²ｐＣｐで標識したＷＳ−Ｓ（＋）
ＲＮＡの切断物をそれぞれ約０．０２ｐｍｏｌ（約１０
００ｃｐｍ：チェレンコフ法で測定）用いて同様の操作
で５′末端分析を行った。即ち、５′末端リン酸を高比
活性³²Ｐで交換された切断分として、３３００ｃｐｍ
（XVIIの切断物）、４８００ｃｐｍ（XVIII の切断物）
それぞれ単離し、それらをヌクレアーゼＰ１で完全分解
後、酸性濾紙電気泳動を行いそのラジオオートグラフィ
ーの結果を図１６−Ｂに示した。いずれも５′末端はＧ
であり、鎖長マーカーとの比較（図１４）を考え合わ
せ、切断位置はXVIIはＣ²⁰＿Ｇ²¹、XVIII はＧ²¹＿Ｇ²²
であることを確認した。 【０１４０】 【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ＲＮＡ分子をその分子鎖の長短にかかわらず、特定位置
を選択的に切断することができるから、種々の機能性Ｒ
ＮＡの構造解明と機能の研究が容易になり、有用蛋白質
の量産などへの利用が期待される。

【図面の簡単な説明】 【図１】ＷＳ−Ｓ（＋）配列を連結させた二重鎖ＤＮＡ
（XVI)の化学的、酵素的な合成方法を示すものである。 【図２】混合オリゴマー（XVII〜XXIV）とＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡ（XV）との相補的配列の関係と、ＷＳ−Ｓ
（＋）ＲＮＡの二次構造を示すものである。 【図３】各種混合オリゴマーを用いた場合の切断箇所 【図４】本発明にかかる標識ＲＮＡオリゴマーおよび非
標識ＲＮＡオリゴマーと相補的ＤＮＡオリゴマーからな
る化合物の経時的切断過程を示すホモクロマトグラフィ
ーである。 【図５】図４の時間と切断個所の切断率を示すグラフで
ある。 【図６】図４の時間と切断個所の切断率を示すグラフで
ある。 【図７】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオリ
ゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時的
切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図８】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオリ
ゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時的
切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図９】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオリ
ゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時的
切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図１０】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオ
リゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時
的切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図１１】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオ
リゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時
的切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図１２】標識ＲＮＡオリゴマーおよび非標識ＲＮＡオ
リゴマーと相補的混合オリゴマーからなる化合物の経時
的切断過程を示すホモクロマトグイラフィーである。 【図１３】３′−³²ｐＣｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡと
混合オリゴマーの切断過程を示すオートラジオグラフィ
ーである。 【図１４】３′−³²ｐＣｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡと
混合オリゴマーの切断過程を示すオートラジオグラフィ
ーである。 【図１５】３′−³²ｐＣｐ標識ＷＳ−Ｓ（＋）ＲＮＡと
混合オリゴマーの切断過程を示すオートラジオグラフィ
ーである。 【図１６】図１３、１４におけるＲＮａｓｅ切断物の
５′−末端塩基分析例を示すオートラジオグラフィーで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 向井 佐知子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 (72)発明者 西原 徹 岡山県倉敷市幸町１−37 審査官 新見 浩一 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07H 1/00 - 23/00

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．塩基数が３〜６であるＤＮＡオリゴマーの片端また
   は両末端に、糖部分の２′−位水酸基の全てをアルコキ
   シ基で置換されたＲＮＡ誘導体オリゴマーが、リボース
   またはデオキシリボース部分の５′−水酸基と３′−水
   酸基との間でリン酸ジエステル結合を介して結合してい
   る混合オリゴマー。 ２．アルコキシ基がメトキシ基である特許請求の範囲第
   １項記載の混合オリゴマー。