KR20040014479A - 올리고뉴클레오티드의 용액상 합성을 위한 구성 단위 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 용액상 합성을 위한 구성 단위 Download PDF

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KR20040014479A
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요게쉬 에스. 상비
비센떼 고또르
미구엘 페레로
수잔나 페르난데
하비에르 가르시아
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아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
유니베시다드 데 오비에도
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Abstract

본 발명은 효소적 접근법을 사용하여 공통적인 전구체로부터 3' O 및 5' O-레불리닐 뉴클레오시드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

올리고뉴클레오티드의 용액상 합성을 위한 구성 단위{BUILDING BLOCKS FOR THE SOLUTION PHASE SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2001년 3월 30일 출원된 미국 특허 출원 일련번호 09/822,903호를 우선권 주장의 기초로 하고 있으며, 상기 출원의 내용은 본 명세서에서 명백히 참고문헌으로 포함된다.
대부분의 질병 상태를 포함하여, 포유동물에서의 신체 상태는 단백질에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 직접적으로 또는 효소적 기능을 통해 작용하는 이러한 단백질들은, 상당 부분, 동물 및 사람에서의 많은 질병의 원인이 된다. 전통적인 치료법은 일반적으로, 질병을 유발하거나 질병을 증진시키는 기능을 완화시키기 위한 노력에서 이러한 단백질과의 상호작용에 촛점을 맞추고 있다. 그러나, 최근들어, 단백질의 합성을 유발하는 분자, 예컨대 세포내 RNA와의 상호작용에 의해 이러한 단백질의 실제 생산을 완화시키기 위한 시도가 행해지고 있다. 단백질의 생성을 방해함으로써, 최대의 효과 및 최소의 부작용을 가진 치료 결과를 가져올 것으로 기대되었다. 이러한 치료적 접근법의 일반적인 목적은, 원하지 않는 단백질 형성을 일으키는 유전자 발현을 방해하거나 그를 완화시키는데 있다.
특정한 유전자 발현을 억제하기 위한 한가지 방법은 "안티센스"제로서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하는 것이다. 특정한 표적, 메신저 RNA (mRNA)서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 사용된다. 안티센스 방법은 종종, 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 한가닥 mRNA 또는 한가닥 DNA에 대해 상보적 하이브리드형성시켜, 세포간 핵산의 정상적이고 필수적인 기능을 붕괴시키는 것에 관한 것이다. 하이브리드형성은 RNA 또는 단일-사슬 DNA의 왓슨-크릭 염기 쌍에 대한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 서열 특이적 수소 결합이다. 이러한 염기 쌍들은 서로 상보적인 것으로 언급된다.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 치료 및 진단 방법을 위해 상당한 가망이 있는 치료제이다. 그러나, 치료 목적, 진단 목적 및 연구 시약을 위해 안티센스 제로서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 적용하는 것은, 종종 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 다량으로 합성될 것을 필요로 한다.
3개의 기본적 방법이 올리고뉴클레오티드의 합성을 위해 사용되었다. 문헌 [Reese, Tetrahedron 1978, 34, 3143]에 기재된 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Beaucage, Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides andAnalogs; Agrawal, ed.; Humana Press: Totowa, 1993, Vol. 20, 33-61]에 기재된 포스포르아미디트 방법] 및 문헌 [Froehler, Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs Agrawal, ed,; Humana Press: Totowa, 1993, Vol. 20, 63-80]에 기재된 H-포스포네이트 방법.
포스포트리에스테르 접근법은 용액상 합성을 위해 널리 사용되는 반면, 포스포르아미디트 및 H-포스포네이트 방법은 고체상 합성에서 널리 사용되고 있다. 최근들어, 리스(Reese)는 H-포스포네이트 결합 위에서 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성에 관한 새로운 접근법은 보고하였다. 문헌 [Reese 등, Nucleic Acids Research, 1999, 27, 963-971] 및 [Reese 등, Biorg.Med.Chem. Lett. 1997, 7, 2787-2792] (본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨) 참조. 용액상 합성은 대규모 량의 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 선택된 방법이다.
이러한 용액상 방법은 3'-O 및/또는 5'-O 위치에서 보호기를 가진 뉴클레오시드 단량체 구성 단위를 사용하는 것을 필요로 한다. 보호기는 결합 조건에 안정해야 하고, 분자내의 다른 보호기에 영향을 미치지 않으면서 선택적으로 분열되어야 한다. 이러한 한가지 보호기는 레불리닐기, -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다. 그러나, 보호기를 가진 뉴클레오시드의 제조는 몇 가지 장황한 화학적 보호/탈보호 및/또는 정제 단계를 포함한다.
예를들어, DCC (디시클로헥실카르보디이미드)의 존재하에서 뉴클레오시드를 레불린산과 반응시킴으로써 뉴클레오시드가 히드록실 부위에서 선택적으로 아실화되는 기존의 방법을 사용하여, 뉴클레오시드의 3',5'-디-O-레불리닐 보호를 달성할 수 있다. 이러한 방법의 사용에도 불구하고, 적어도 하나의 심각한 문제가 발생된다. 이 방법은 최적의 수율을 달성하기 위해 과량의 DCC를 필요로 한다. 과량의 DCC는 반응 완결시에 DCU (디시클로헥실카르보디이미드)로 전환되고, 반응 혼합물로부터 분리되어야 한다. 유감스럽게도, 대규모 합성을 위하여, 분리 단계는 상당한 시간과 비용을 필요로 한다.
본 발명에 앞서서, 모 뉴클레오시드를 레불린산 및 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오다이드와 반응시킴으로써 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드의 합성이 달성되었다. 문헌 [Iwai 등, Nucleic Acids Res. 1988, 16, 9443-9456: Iwai 등, Tetrahedron 1990, 46, 6673-6688]. 그러나, 이 방법은 5'-히드록실 작용기의 선택적 아실화를 제공하지 않고, 3'-아실 및 3',5'-디아실 유도체가 둘다 반응에서 형성되기 때문에, 추가의 정제 및 탈보호 단계가 필요하다. 3',5'-디아실 유도체를 크로마토그래피에 의해 분리한 후에, 3'-아실 화합물을 제거하기 위해서는 잔류물을 DMTrCl로 처리해야 한다. 마지막으로, 크로마토그래피에 의한 추가의 정제는 매우 낮은 수율로 5'-O-레불리닐 유도체를 단리시킨다.
지금까지, 모 뉴클레오시드를 레불린산 또는 레불린 안히드라이드 및 DCC로 처리함으로써, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드 (2'-데옥시 또는 2'-보호)의 합성이 달성되었다. 이 방법의 주된 단점의 하나는, 레불린산으로 아실화되기에 앞서서 5'-히드록실 작용기가 5'-O-DMTr기로서 보호되는 것이 필요하다는 점이다. 3'-O-보호된 뉴클레오시드를 수득하기 위해서는 5'-O-DMTr기가 산 매질 중에서 제거되어야한다. [Reese 등, Nucleic Acids Res. 1999. 27, 963-971] 및 [Reese 등, J.Chem.Soc., Perkin Trans. 1 1999, 1477-1486] 참조.
올리고뉴클레오티드의 대규모 합성을 위해 통상적으로 실행가능한 방법이 계속적으로 연구되고 있다. 유기 합성에서 생체촉매를 적용하는 것이 종래의 화학 방법의 매력적인 대안법으로 밝혀졌다. 문헌 [Carrea 등, Angew,Chem. Int. Ed. 2000, 39, 2226-2254; Bornscheuer 등, Hydrolases in Organic Synthesis. Regio- and Stereoselective Biotransformations; Wiley-VCH: Weinheim, 1999] 참조. 효소는 높은 화학-, 위치- 및 입체-선택성을 가진 반응을 촉매작용한다. 문헌 [Ferrero 등, Chem.Rev.2000, 100, 4319-4347; Ferrero 등, Monatsh, Chem. 2000, 131, 585-616] 참조. 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 리파제 B (CAL-B)는 높은 선택성으로 뉴클레오시드의 5'-히드록실 기에서의 아실화를 촉매작용하는 것으로 앞서 보고되었다. 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 리파제(PSL)는 2'-데옥시뉴클레오시드의 3'-위치에서 2차 알콜에 대해 독특한 위치선택성을 나타낸다. 문헌 [Moris 등, J.Org.Chem. 1993, 58, 653-660; Gotot 등 Synthesis 1992, 626-628].
최근 몇 년 내에, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 놀라운 신규의 치료 실례로서 드러났다. 그 결과, 매우 다량의 치료적으로 유용한 올리고뉴클레오티드가 가까운 미래에 요구된다. 올리고뉴클레오티드 구성 단위의 합성을 위해 요구되는 상당한 비용과 시간을 고려할 때, 증가된 효율 및 생성물 순도로 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 성공적인 방법을 개발하기 위하여 오랫동안 노력이 지속되어 왔다.
발명의 요약
본 발명자들은 예를들어 올리고뉴클레오티드의 대규모 합성에서 유용한 방법 및 시약을 찾아내었다. 본 발명의 방법은 효소적 접근을 사용하여 원하는 결과를 얻기 위해 필요한 단계의 수를 최소화하는데 도움이 된다. 일부 구현양태에서, 본 발명은 공통적인 전구체로부터 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드 및 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 모두 합성하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 이러한 구현양태에서, 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 탈보호는, 여기에 개시된 매개변수에 의존하여, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드 또는 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 생성한다. 특히, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드 또는 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드는 상응하는 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드 전구체를 특정한 가수분해효소, 예컨대 리파제와 접촉시킴으로써 선택적으로 제조될 수 있다. 놀랍게도, 탈보호 반응 프로토콜에서 선택된 가수분해효소, 예컨대 리파제가 존재하면, 선택되어진 리파제에 의존하여, 3'- 또는 5'-위치에서 탈-아실화의 위치선택성이 생긴다.
다른 구현양태에서, 본 발명은 선택된 가수분해효소 (예, 리파제)의 존재하에서 레불리닐기를 도입하기 위해 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시킴으로써 3'-O 또는 5'-O 위치에서 레불리닐을 갖는 뉴클레오시드를 선택적으로 제조하는 방법을 제공한다. 놀랍게도, 반응을 촉매화하기 위해 선택되는 특정한 가수분해효소에 의존하여, 뉴클레오시드의 3'-O 또는 5'-O 위치에서 선택적인 아실화가 수득될 수 있음을 알아내었다.
일부 구현양태에 따르면, 다른 레불리닐 위치에서 원하지 않는 수준의 가수분해를 일으키지 않으면서 하나의 레불리닐 위치상에서 위치선택적 가수분해를 유발하는데 효과적인 가수분해효소, 예를들어 리파제를 선택하고, 3'-O-레불리닐 또는 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 얻기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 리파제와 접촉시켜 3'-O-레불리닐 또는 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하는 것을 포함하는, 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 위치선택적으로 탈보호하기 위한 방법이 제공된다. 본 발명에 사용되는 가수분해효소의 예는, 칸디다 안타르티카(Candida antarctica) 리파제B (CAL-B), 칸디다 안타르티카 리파제 A (CAL-A), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 리파제 (PSL), 돼지 췌장 리파제, 크로모박테리아움 비스토숨(Chromobacteriaum viscosum) 리파제, 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei) 리파제, 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제, 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti) 리파제, 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제, 등을 포함한다.
일부 구현양태에 따르면, 다른 레불리닐 위치에서 원하지 않는 수준의 아실화를 일으키지 않으면서 뉴클레오시드의 하나의 -OH 위치상에서 위치선택적 아실화를 유발하는데 효과적인 가수분해효소, 예를들어 리파제를 선택하고, 3'-O-레불리닐 또는 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 얻기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 뉴클레오시드를 레불리닐 위치를 도입하기 위한 아실화제 및 선택된 리파제와 접촉시키는 것을 포함하는, 뉴클레오시드를 위치선택적으로 아실화하기 위한 방법이 제공된다. 본 발명에 사용될 수 있는 리파제의 예는 칸디다 안타르티카리파제B (CAL-B), 칸디다 안타르티카 리파제 A (CAL-A), 슈도모나스 세파시아 리파제 (PSL), 돼지 췌장 리파제, 크로모박테리아움 비스토숨 리파제, 뮤코르 미에헤이 리파제, 후미콜라 라누기노사 리파제, 페니실리움 카멤베르티 리파제, 칸디다 루고사 리파제, 등을 포함한다.
본 발명의 일부 구현양태에 따르면, 3'-O-레불리닐 위치에 영향을 미치지 않으면서 5'-O-레불리닐 위치를 위치선택적으로 가수분해하는데 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 이보호된 뉴클레오시드를 CAL-B와 접촉시킴으로써, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 탈보호한다.
본 발명의 다른 구현양태에 따르면, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 형성하기 위해, 5'-위치에서 뉴클레오시드를 위치선택적으로 아실화하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, CAL-B의 존재하에서 레불리닐기를 도입하기 위한 아실화제와 뉴클레오시드를 접촉시킴으로써, 5'-OH 위치 (또는 간단히 5'-위치)에서 뉴클레오시드를 선택적으로 아실화한다.
추가의 구현양태에서, 5'-O-레불리닐 위치에 영향을 미치지 않으면서, 3'-O-레불리닐 위치를 위치선택적으로 가수분해하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 이보호된 뉴클레오시드를 CAL-A 또는 PSL-C와 접촉시킴으로써 3'-O-레불리닐 위치에서 3'-, 5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 탈보호시킨다.
다른 구현양태에서, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 생성하기 위해, 3'-OH 위치에서 뉴클레오시드를 위치선택적으로 아실화하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 CAL-A 또는 PSL-C의 존재하에 레불리닐 기를 도입하기 위한 아실화제와 뉴클레오시드를 접촉시킴으로써, 뉴클레오시드를 3'-OH 위치에서 위치선택적으로 아실화한다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 3'-O-레불리닐 위치 위에서 가수분해를 일으키지 않으면서 5'-O-레불리닐 위치의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 리파제를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 리파제와 접촉시키는 것을 포함하는, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 위치선택적으로 탈보호하기 위한 방법이 개시되며, 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실, 2'-치환기 또는 2'-보호된 치환기이고;
R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3, 레불리닐기이다.
또 다른 구현양태에서, 5'-O-레불리닐 위치의 가수분해를 일으키지 않으면서 3'-O-레불리닐 위치의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 리파제를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 리파제와 접촉시키는 것을 포함하는, 3'-O-레불리닐 위치에서 뉴클레오시드를 위치선택적으로 탈보호하기 위한 방법이개시되며, 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R6은 -H, -히드록실이고;
R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 3'-O 위치의 아실화를 일으키지 않으면서 5'-O 위치의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 리파제를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 뉴클레오시드를 레불리닐기를 도입하기 위한 아실화제 및 리파제와 접촉시키는 것을 포함하는, 5'-OH 위치에서 뉴클레오시드에 레불리닐기를 위치선택적으로 도입하기 위한 방법이 개시되며, 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실, 2'-치환기 또는 2'-보호된 치환기이고;
R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3, 레불리닐기이다.
또 다른 구현양태에서, 5'-O 위치의 아실화를 일으키지 않으면서 3'-O 위치의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 리파제를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 뉴클레오시드를 레불리닐기를 도입하기 위한 아실화제 및 리파제와 접촉시키는 것을 포함하는, 3'-OH 위치에서 뉴클레오시드를 위치선택적으로 아실화하기 위한 방법이 제공되며, 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R6은 -H, -히드록실이고;
R2, R3, R4및 R5은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
3'-O 위치에서 위치선택적 아실화를 위해 바람직한 리파제는 예를들어 CAL-A 또는 PSL-C이다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치에서 에스테르를 형성하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 중합체 지지체에 부착된 카르보디이미드와 같은 결합제의 존재하에서 핵산을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치에서 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드와 같은 핵산의 히드록실 잔기를 아실화하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 중합체 지지체는 시클로헥실카르보디이미드에 부착된 폴리스티렌 또는 폴리에틸렌 글리콜 중합체 지지체를 포함한다.
본 발명은 레불린산의 히드록실 잔기와 레불리닐 기 사이에서 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 히드록실 잔기를 함유한 화합물을 레불린산과 반응시킴으로써, 탄수화물 또는 스테로이드 분자에서 발견되는 것과 같은 히드록실 잔기의 에스테르화 또는 아실화를 포함한다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 히드록실 잔기와 레불리닐기 사이에서 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 고체 지지체에 부착된 결합제, 예컨대 PS-시클로헥실카르보디이미드의 존재하에서 상기 화합물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식을 가진 화합물 위에 있는 하나 이상의히드록실 잔기를 아실화하기 위한 방법이 제공된다:
상기 식에서,
Bx는 뉴클레오염기이고;
T1및 T2는 독립적으로 -히드록실, 히드록실 보호기, 활성화 포스페이트 기, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드이고;
R은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2' 치환기이고;
단 적어도 하나의 T1, T2또는 R은 -히드록실이다.
바람직한 구현양태에서, 하기 화학식:
(상기 식에서, Lev는 -레불리닐이다)
을 가진 화합물을 형성하기 위해 효과적인 조건하에 효과적인 시간동안 고체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 상기 화합물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식을 가진 화합물의 3'-O 및 5'-O 위치를 아실화하기 위한 방법이 제공된다:
상기 식에서,
Bx는 뉴클레오염기이고;
R은 히드록실 또는 임의로 보호된 2'-치환기이다.
본 발명의 일부 구현양태에 따르면, 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 수득하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 유기 용매 중에서 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체를 탈수제, 예컨대 토실 클로라이드 또는 POCl3과 반응시키는 것을 포함하는, 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체로부터 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현양태에서, 사용된 유기 용매는 CH2Cl2, CHCl3, 헥산, 또는 피리딘이다.
본 발명의 다른 구현양태에서, 염을 형성하기 위해 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체를 탈수제와 반응시키고, 이어서 염을 수용액, 예컨대 수성 NaOH와 접촉시켜 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 형성하는 단계를 포함하는, 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체로부터 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 생성하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명은 효소적 접근을 사용하여 공통적인 전구체로부터 3'-O 및 5'-O 레불리닐 뉴클레오시드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드의 대규모 합성을 위해 유용하다.
본 발명의 여러 목적 및 장점들은 첨부된 상세한 설명 및 하기 도면을 참조로 하여 당업자에 의해 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 레불린산 및 DCC 또는 레불린산 및 PS-카르보디이미드를 사용하는 2'-데옥시뉴클레오시드의 3',5'-디-O-아실화를 나타낸다.
도 2는 3',5'-디-O-레불리닐 2'-데옥시뉴클레오티드의 효소 위치선택적 가수분해를 나타낸다.
도 3은 3',5'-디-O-레불리닐 2'-치환된 뉴클레오티드의 효소 위치선택적 가수분해를 나타낸다.
도 4는 뉴클레오시드 2a 내지 2g의 위치선택적 가수분해 결과를 나타낸 표이다.
도 5는 2'-데옥시뉴클레오시드의 위치선택적 아실화를 나타낸다.
도 6은 2'-데옥시리보뉴클레오시드 1a, 1c, 1e 및 1g의 위치선택적 아실화 결과를 나타내는 표이다.
도 7은 리보뉴클레오시드의 위치선택적 아실화를 나타낸다.
도 8은 리보뉴클레오시드 5a 내지 5g의 위치선택적 아실화 결과를 나타내는 표이다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 대규모 합성에서 특히 유용한, 3',5'-디-O-레불리닐뉴클레오시드, 3'-O-레불리닐뉴클레오시드 및 5'-O-레불리닐뉴클레오시드와 같은 뉴클레오시드 구성 단위의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현양태에 따르면, 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치에서 에스테르를 형성하기 위해 효과적인 조건하에 효과적인 시간동안, 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 핵산을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치에서 핵산의 히드록실 잔기를 보호하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 뉴클레오시드이고, 중합체 지지체는 결합제, 예컨대 시클로헥실카르보디이미드에 결합된 폴리스티렌 지지체 또는 폴리에틸렌 글리콜 지지체이다.
바람직한 구현양태에서, 핵산은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서,
Bx는 뉴클레오염기이고;
T1및 T2는 독립적으로 -히드록실, 보호된 히드록실, 활성화 포스페이트 기, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드이고;
R은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2' 치환기이고;
단 적어도 하나의 T1, T2또는 R은 -OH이다.
바람직한 구현양태에서, T1및 T2는 -OH이고 R은 H이다.
본 발명의 보호 방법은 뉴클레오시드의 히드록실기의 아실화에 한정되지 않는다. 탄수화물 또는 스테로이드 분자에서 발견되는 것을 포함하여 어떠한 히드록실 작용기라도 본 발명의 방법을 사용하여 아실화할 수도 있다.
본 발명의 일부 구현양태에 따르면, 도 1을 참조로 할 때, 촉매로서 DMAP의 존재하에서 레불린산과 PS-카르보디이미드를 1,4-디옥산 중에서 처리함으로써 상응하는 천연 뉴클레오시드로부터 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드(2)를 제조하였다. 폴리스티렌 비이드로부터 여과해내어, 중합체에 결합되어진 우레아 및 N-레불리닐우레아 유도체를 제거하였다. 3',5'-디-O-레불리닐티미딘(2a) 및 3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신(2d)가 각각 91% 및 95% 수율로 단리되었다. 유기 용매 중에서 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체를 탈수제와 반응시킴으로써, 고가의 시약인 PS-디카르보디이미드를 회수한다. 바람직한 탈수제는 POCl3및 토실 클로라이드를 포함한다. 바람직한 유기 용매는 CH2Cl2, CHCl3, 헥산 및 피리딘을 포함한다.
도 1을 다시 참조하면, 촉매로서 DMAP의 존재하에서 1,4-디옥산 중에서 5.2 당량의 레불린산(LevOH)과 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)로 처리함으로써 상응하는 천연 뉴클레오시드(1)로부터 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 대안적으로 제조할 수 있다. O-아실우레아 중간체를 수득하기 위해 레불린산을 DCC로 활성화함으로써 반응이 일어난다. 과량의 부가물은 안정한 N-아실우레아로 발전되어, 공정에서의 부산물인 DCU로서 단리된다. 플래시 크로마토그래피 후에, 3',5'-디레불리닐 유도체(2)가 고 수율 (70 내지 95%)로 수득되었다. N-아실우레아를 제거하기 위해 반응의 조 잔류물을 Et2O로 세척하고, 이어서 EtOAc에 용해시키고, 이로부터 나머지 DCU를 여과에 의해 분리하였다. 이러한 아실화 반응에서 거의 정량적인 수율이 달성되었다. 순도의 수준은1H-NMR을 기초로 하였으며, 이것은 미량의 DCU 및 N-레불리닐우레아를 나타내었다. 이러한 조건하에서, 2'-데옥시아데노신(1d) 및 2'-데옥시구아노신(1f)의 아미노기에서는 아실화가 관찰되지 않았다. 2'-데옥시시티딘(1b)의 경우에, 아미노아실 유도체의 형성을 최소화하기 위해 적은 양의 LevOH 및 DCC (3당량)가 사용되었다. 그 결과, 더 오랜 반응 시간이 필요하고, 어느 정도 량의 출발 물질은 변화되지 않은 채로 남아있었다. 그럼에도 불구하고, 플래시 크로마토그래피 후에 68% 단리된 수율의 3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘(2b)이 수득되었다.
3'-O-레불리닐 위치에서 가수분해를 일으키지 않으면서 5'-O-레불리닐 위치에서 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소, 예를들어 리파제를 선택하고, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 이보호된 뉴클레오시드를 리파제와 접촉시킴으로써, 5'-O-레불리닐 위치에서 공통 전구체 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 탈보호가 실행된다. 일부 구현양태에서, 이보호된 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다.
상기 식에서,
R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2'-치환기이고;
R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
예를들어, 도 2를 참조하면, 18%의 1,4-디옥산을 함유하는 0.15M 포스페이트 완충액(pH=7) 중에서 40℃에서 3',5'-디-O-레불리닐티미딘(2a)을 CAL-B로 처리하였다. 문헌 [Myers 등, Trends Pharmacol.Sci. 2000, 21, 19-23; Cook, NucleosidesNucleotides 1999, 18, 1141-1162; Crooke 등, Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1996, 36, 107-129; 및 Matteucci 등, 1996, 384, 20-22] (이들의 내용은 모두 여기에서 참고문헌으로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 일반적인 준비 후에, TLC는 62시간 후에 출발 물질의 완전 소실을 나타내었다 (표 1, 표제번호 1).1H-NMR 스펙트럼은 5'-레불린 에스테르의 선택적 가수분해 및 독특한 생성물로서의 3'-O-레불리닐티미딘(3a)의 존재를 나타내었다. 효소 반응에서 형성된 미량의 티미딘(TLC에 의해 나타남)이 추출 후에 수성상에 남아있었다. 따라서, 순수한 화합물(3a)이 85% 수율로 단리되었다.
도 4에 나타낸 표 1은, CAL-B의 존재하에서 가수분해될 때, 기질 3',5'-디-O-레불리닐 시토신(2b), 3',5'-디-O-레불리닐 아데노신(2d) 및 3',5'-디-O-레불리닐-N-이소부틸구아노신(2g)이 5'-위치에 대해 뛰어난 선택성을 나타낸다는 것을 보여준다. 5'-O-레불리닐 유도체의 부재 및 반응이 일어날 때의 높은 수율은 주목할만하다. 또한, 이 경우에, TLC는 완전히 가수분해된 미량의 뉴클레오시드를 나타내며, 이것은 수성 추출에 의해 쉽게 제거되었다.
N-벤조일-디-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘(2c) 및 N-벤조일-디-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신(2e) 위에서 CAL-B에 의해 촉매화된 가수분해 반응은, 각각 N-벤조일-2'-데옥시시티딘(1c) 및 N-벤조일-2'-데옥시아데노신(1e)를 제공하였다. 몇개의 반응 조건을 시도하였으나, 위치선택성이 없는 공정이 발생되었다. CAL-B의 활성 부위는 보호되지 않은 상대와 동일한 방식으로 N-보호된 아데노신 및 시토신을 제공하지 않는 것으로 보인다. 특정한 이론에 구속되기를 원하지 않지만, 페닐기가 결합 부위 내에서 일부 입체적 접촉을 가질 수 있고, 이는 바람직하지 못한 결과를 가져올 수 있다.
2'-치환된 뉴클레오시드는 5'-O-레불리닐 위치에서 성공적으로 선택적 탈보호된다. 도 3을 참조하면, 모든 4개의 뉴클레오시드, 즉 2'-메톡시-3',5'-디-O-레불리닐아데노신(6a), 2'-메톡시에톡시-3',5'-디-O-레불리닐아데노신(6b), 2'-메톡시-3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시시토신(6c) 및 2'-메톡시에톡시-3',5'-디-O-레불리닐-5-메틸 시토신(6d)이 CAL-B로 선택적으로 가수분해되어 7a 내지 7d를 고 수율로 제공하였다. 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 시간 및 조건은 여기에 기재된 것으로 한정되지 않는다. 에스테르를 가수분해하기 위해 여러 시간 및 조건이 효과적이며, 이는 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 5'-O-레불리닐 위치에서 가수분해를 일으키지 않으면서 3'-O-레불리닐 위치에서 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소, 예를들어 리파제를 선택하고, 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 이보호된 뉴클레오시드를 가수분해효소 (예, 리파제)와 접촉시킴으로써, 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 위치선택적으로 탈보호된다. 일부 구현양태에서, 이보호된 뉴클레오시드는 하기 화학식 중의 하나를 갖는다:
상기 식에서,
R6은 -H, 또는 -OH이고;
R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
G는 N 또는 CH이고;
Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
예를들어, 도 2를 참조하면, 0.15M 포스페이트 완충액 중에서 60℃에서 2를 고정화 슈도모나스 세파시아 리파제 (PSL-C, 1:3 w/w 의 비율 (2/PSL-C)]와 반응시킴으로써 3'-O-선택적 가수분해를 달성하여, 5'-O-레불리닐 유도체를 수득한다. 칸디다 안타르티카 리파제A (CAL-A)는 3'-O-레불리닐 위치에 대해 뛰어난 선택성을나타내었으며, PSL-C에 비해 더 낮은 반응 온도 (60℃ 대신에 40℃), 더 짧은 반응 시간, 및 더 낮은 비율의 효소/출발 물질 (도 4 참조)을 필요로 한다는 장점을 갖는다. 즉, 5'-O-레불리닐티미딘(4a), N-벤조일-5'-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘 (4c) 및 N-벤조일-5'-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신(4e)이 고 수율 (70-85%)로 수득되었다. 조 반응 혼합물의 TLC 또는1H-NMR에 의해서는 3'-레불리닐 위치이성질체가 검출되지 않았다. TLC는 미량의 모 뉴클레오티드 1을 나타내었다.
N-이소부티릴-3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신(2g)은 CAL-A로 선택적 가수분해되지 않았다. 그러나, PSL-C로의 처리는 N-이소부티릴-5'-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신 (4g)을 제공하고, 이것은 60℃에서 28시간 후에 93% 수율로 단리되었다 (표 1, 표제번호 8). N-벤조일-디-레불리닐 유도체 (2c) 및 (2e)는 모두 리파제 PSL-C 및 CAL-A 양쪽 모두에 대해 적절한 기질이다.
도 3에 나타낸 바와 같이 2'-OR 뉴클레오시드를 PSL-C 또는 CAL-A로 처리하면, 비보호된 2'-O 및 2'-데옥시뉴클레오시드에서 증명되어진 선택성을 갖지 않는 3'-O-레불리닐 및 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드의 혼합물이 수득되었다. 특정한 이론에 구속되기를 원하지 않지만, 이것은 2'-O-R 기에 의해 유발된 입체 장해의 결과일 수 있고, 3'-O-레불리닐 기를 상기 리파제들의 어느 하나에 의한 선택적 가수분해에 이용할 수 없게 된다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 도 5에 나타낸 것과 같이 효소적 아실화를 수행할 수 있다. 질소 하에서 무수 THF(1mL) 중의 1(0.2밀리몰), 옥심 에스테르(0.6밀리몰) 및 리파제의 현탁액을 표 3에 나타낸 온도에서 나타낸 시간동안 250rpm에서 교반하였다 (도 8). TLC (10% MeOH/CH2Cl2)에 의해 반응을 검사하였다. 효소를 여과해 내고, CH2Cl2로 세척하고, 진공하에 용매를 증류하고, NaHCO3(수성)중에 잔류물을 취하고, CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르에서 침전시켜 여과 후에 모노레불리닐 뉴클레오시드 3 또는 4를 수득하였다. 표제번호 10 및 11에서 미량의 기타 아실 유도체를 분리하는 것 이외에는 추가의 정제가 필요하지 않았다.
나타낸 바와 같이, 아실화 방법은 가수분해 공정 이외의 단계를 거의 필요로 하지 않으며, 따라서 훨씬 더 용이하다. 출발 물질은 모 뉴클레오티드이고, 디레불리닐 유도체를 먼저 형성할 필요가 없다. 가수분해 방법은 2개의 단계를 필요로 하지만, 아실화 방법은 단지 1개의 단계만을 요구한다. 옥심 에스테르를 1단계로 제조하고 간단한 여과에 의해 정제한다. 아실화 공정에서 플래시 크로마토그래피를 피할 수 있다. CAL-B의 존재하에 아실화 반응을 수행함으로써, 5'-O-Lev-T, 5'-O-Lev-dCBz, 5'-O-Lev-dABz및 5'-O-Lev-dGiBu를 수득할 수 있다. 다른 한편, PSL-C를 사용하여 3'-O-Lev-T, 3'-O-Lev-dCBz및 3'-O-Lev-dABz(그러나, 3'-O-Lev-dGiBu는 제외)가 수득되었다. 3'-O-Lev-dGiBu를 제조하기 위해 효소 가수분해 반응이 필요하다. 표 3에서 반응의 규모 증가(도 6)는 수율을 증가시키고, 효소 여과 후에 플래시 크로마토그래피를 수행하여도 (즉, 추출 및 침전을 회피하여도) 더 높은수율이 얻어진다.
본 발명의 일부 구현양태에서, 화학식 XVI-XX에 기재된 것과 같은 아실화 방법을 리보뉴클레오시드에 적용할 수 있다. 리보뉴클레오시드를 아실화하기 위해 일반적인 아실화 방법을 도 7에 나타내고, 그것에 포함된 데이타를 표 4에 기재한다 (도 8). 2'-알킬리보뉴클레오시드의 모노레불리닐 유도체를 에테르에 용해시켰으며, 침전에 의해 나머지 옥심 에스테르로부터 분리하는 것은 가능하지 않다. 따라서, 효소 여과 후에, 잔류물을 플래시 크로마토그래피 (구배 용출액 5-20% MeOH/CH2Cl2)에 의해 정제하였다.
CAL-B를 사용하는 아실화 방법을 사용하여, 5'-O-Lev-2'-OMOE-T, 5'-O-Lev-2'-O-MOE-5-Me-C, 5'-O-Lev-2'-O-MOE-5-Me-CBz, 5'-O-Lev-2'-O-MOE-A, 5'-O-Lev-2'-O-MOE-ABz, 5'-O-Lev-2'-O-Me-A, 및 5'-O-Lev-2'-O-MOE-GiBu를 수득할 수 있다. 다른 한편, PSL-C를 사용하여 3'-O-Lev-2'-O-MOE-5-Me-CBz, 3'-O-Lev-2'-O-MOE-ABz, 및 3'-O-Lev-2'-O-Me-ABz를 수득하였다. 상응하는 3'-Lev-T 및 3'-Lev-GiBu유도체를 제조하기 위해서는 가수분해 반응이 필요하다.
본 발명을 수행하는데 유용한 핵산은 천연 및 비-천연 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 단량체 단위로 한정되는 것이 아니라, 디뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위한 다수의 연결된 단량체 단위를 또한 함유할 수 있으며, 천연 및 비-천연 뉴클레오염기, 당 및 주쇄를 포함한다.
리보스의 것과 유사한 1차 및 2차 알콜 기를 가진 대안적인 구조로 당 잔기를 대체함으로써, 비-천연 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 비-천연 당 및 뉴클레오시드 염기는 전형적으로 구조적으로 구별되지만, 천연 당 (예를들어, 리보스 및 데옥시리보스) 및 뉴클레오시드 염기 (예, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민)와 기능적으로 상호교환가능하다. 따라서, 비-천연 뉴클레오염기 및 당은, 천연 종의 구조 및/또는 기능을 모방하고 표적에 올리고뉴클레오티드의 결합을 도울 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드의 성질에 유리하게 기여할 수 있는 모든 구조를 포함한다.
주쇄 변형은 뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시키기 위해 포스페이트 주쇄에 대한 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트와 같은 결합의 사용 뿐만 아니라, 비-인 결합, 펩티드 핵산 (PNAs) 및 2'-5' 결합과 같은 뉴클레오티드간 결합의 성질을 극적으로 변화시키는 변형도 포함한다.
본 발명에 이용가능한 헤테로고리 염기 잔기 (종종, 당 기술분야에서 간단히 "염기" 또는 "뉴클레오염기"라 일컬어짐)는 천연 및 비-천연 뉴클레오염기를 둘다 포함한다. 염기의 하나 이상의 작용기가 보호기를 포함하도록 헤테로고리 염기 잔기가 더욱 보호될 수도 있다. 여기에서 사용된 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오염기는, 퓨린 염기 아데닌 및 구아닌과, 피리미딘 염기 티민, 시토신 및 우라실을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 다른 합성 및 천연 뉴클레오염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 뉴클레오염기는 미국 특허 3,687,808호에 개시된 것, 문헌 [Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, 858-859면, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌 [Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613]에 개시된 것, 및 문헌 [Sanghvi, Y.S., 15장, Antisense Research and Applications, 289-302면, Crooke, S.T. 및 Lebleu,B., ed., CRC Press, 1993]에 기재된 것을 포함한다.
본 발명에 따른 일부 구현양태에서, 본 발명의 방법들은 이른바 C-뉴클레오시드 (즉, 천연 C-N 결합과는 달리, 뉴클레오염기가 C-C 결합을 통해 뉴클레오시드 고리에 연결된 뉴클레오시드)에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 구현양태에서, 뉴클레오시드 고리는 α-배위 (천연 β-배위와는 반대), L-배위 (천연 D-배위와는 반대) 또는 양쪽 모두 (즉, α-L-배위)이다.
본 발명의 올리고머 화합물의 상보성 표적에 대한 결합 친화성을 증가시키기위하여, 특정한 헤테로고리 염기 잔기가 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중 안정성을 0.6 내지 1.2℃로 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 (상기 문헌, 276-278면), 더욱 특별하게는 2'-메톡시에틸기와 같은 선택된 2'-당 변형과 조합될 때 바람직한 염기 치환이다.
헤테로고리 염기 잔기(변형된 뉴클레오염기)의 제조를 나타내는 대표적인 미국 특허들은, 미국 특허 3,687,808호; 4,845,205호; 5,130,302호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587, 469호; 5,594,121호, 5,596,091호; 5,614,617호; 및 5,681,941호 (이들은 공동 소유되며, 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된다); 및 공동 소유된 미국 특허 출원 08/762,587호 (1996년 12월 10일 출원됨) (본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용가능한 2'-치환기의 대표적인 목록은, C1-C20알킬, C1-C20알케닐, C1-C20알키닐, C5-C20아릴, O-알킬, O-알케닐, O-알키닐, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸, S-알케닐, S-알키닐, NH-알킬, NH-알케닐, NH-알키닐, N-디알킬, O-아릴, S-아릴, NH-아릴, O-아르알킬, S-아르알킬, NH-아르알킬, N-프탈이미도, 할로겐 (특히, 플루오로), 케토, 카르복실, 니트로,니트로소, 니트릴, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 이미다졸, 아지도, 히드라지노, 히드록실아미노, 이소시아네이토, 술폭시드, 술폰, 술피드, 디술피드, 실릴, 헤테로고리, 탄소고리, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 및 화학식 (O-알킬)m의 폴리에테르 (식중, m은 1 내지 약 10이다)를 포함한다. 이들 중에서, 바람직한 폴리에테르는 선형 및 고리형 폴리에틸렌 글리콜(PEGs) 및 (PEG)-함유 기, 예컨대 크라운 에테르 및 문헌 [Ouchi 등, Drug Design and Discovery 1992, 9, 93), [Ravasio 등, J.Org.Chem. 1991, 56, 4329] 및 [Delgardo 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249] (이들 각각은 그 전체 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다)에 기재된 것들을 포함한다. 추가의 당 변형은 문헌 [Cook, P.D., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585-607]에 개시되어 있다. 플루오로, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬 이미다졸, O-알킬아미노알킬 및 알킬 아미노 치환은 미국 특허 출원 08/398,901호 (1995년 3월 6일 출원, 발명의 명칭 "2' 및 5' 치환을 가진 피리미딘 뉴클레오티드(들)를 가진 올리고머 화합물) (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 발명에 사용가능한 추가의 치환기는 -SR 및 -NR2기 (각각의 R은 독립적으로 수소, 보호기 또는 치환되거나 비치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다)를 포함한다. 2'-SR 뉴클레오시드는 미국 특허 5,670,633호 (1997년 9월 23일 특허부여) (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다. 2'-SR 단량체신톤의 혼입은 문헌 [Hamm 등, J.Org.Chem., 1997, 62, 3415-3420]에 개시되어 있다. 2'-NR2뉴클레오시드는 문헌 [Goettingen, M.,J.Org.Chem., 1996, 61, 73-6281] 및 [Polushin 등, Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230]에 개시되어 있다.
추가의 치환기는 하기 화학식 XXI 또는 XXII의 하나를 갖는다.
상기 식에서,
Z0은 O, S 또는 NH이고;
J는 단일 결합, O 또는 C(=O)이고;
E는 C1-C10알킬, N(R1)(R2), N(R1)(R5), N=C(R1)(R2), N=C(R1)(R5) 이거나 또한 하기 화학식 XXIII 또는 XXIV의 하나를 갖는다.
각각의 R6, R7, R8, R9및 R10은 독립적으로 수소, C(O)R11, 치환되거나 비치환된 C1-C10알킬, 치환되거나 비치환된 C2-C10알케닐, 치환되거나 비치환된 C2-C10알키닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 화학 작용기 또는 공액 기이고, 여기에서 치환기들은 히드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택되거나; 또는
임의로 R7및 R8은 이들이 결합된 질소 원자와 함께 프탈이미도 잔기를 형성하거나; 또는
임의로 R9및 R10은 이들이 결합된 질소 원자와 함께 프탈이미도 잔기를 형성하고;
R11및 R12은 각각 독립적으로 치환되거나 비치환된 C1-C10알킬, 트리플루오로메틸, 시아노에틸옥시, 메톡시, 에톡시, t-부톡시, 알릴옥시, 9-플루오레닐메톡시, 2-(트리메틸실릴)-에톡시, 2,2,2-트리클로로에톡시, 벤질옥시, 부티릴, 이소-부티릴, 페닐 또는 아릴이고;
R5은 T-L이고;
T는 결합 또는 연결 잔기이고;
L은 화학 작용기, 공액 기 또는 고체 지지체 물질이고;
각각의 R1및 R2은 독립적으로 H, 질소 보호기, 치환되거나 비치환된 C1-C10알킬, 치환되거나 비치환된 C2-C10알케닐, 치환되거나 비치환된 C2-C10알키닐이고, 상기 치환은 OR3, SR3, NH3 +, N(R3)(R4), 구아니디노 또는 아실 (여기에서, 상기 아실은 산 아미드 또는 에스테르이다)이거나; 또는
R1및 R2는 함께 질소 보호기이거나, 또는 임의로 N 및 O로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 포함한 고리 구조로 결합되거나; 또는
R1, T 및 L이 함께 화학 작용기이고;
각각의 R3및 R4은 독립적으로 H, C1-C10알킬, 질소 보호기이거나, 또는 R3및 R4가 함께 질소 보호기이거나; 또는
R3및 R4가 임의로 N 및 O로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 포함하는 고리 구조로 연결되고;
Z4는 OX, SX 또는 N(X)2이고;
각각의 X는 독립적으로, H, C1-C8알킬, C1-C8할로알킬, C(=NH)N(H)R5, C(=O)N(H)R5또는 OC(=O)N(H)R5이고;
R5은 H 또는 C1-C8알킬이고;
Z1, Z2및 Z3은 4 내지 7개 탄소 원자를 갖거나 또는 약 3 내지 약 6개 탄소 원자 및 1 또는 2개 헤테로 원자를 가진 고리 계를 포함하고, 상기 헤테로 원자는 산소, 질소 및 황으로부터 선택되며, 상기 고리 계는 지방족, 불포화 지방족, 방향족, 또는 포화 또는 불포화 헤테로고리이고;
Z5는 1 내지 약 10개 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 할로알킬, 2 내지 약 10개 탄소 원자를 갖는 알케닐, 2 내지 약 10개 탄소 원자를 갖는 알키닐, 6 내지 약 14개 탄소 원자를 갖는 아릴, N(R1)(R2)OR1, 할로, SR1또는 CN이고;
각각의 q1은 독립적으로 1 내지 10의 정수이고;
각각의 q2는 독립적으로 0 또는 1이고;
q3는 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
q4는 1 내지 10의 정수이고;
q5는 0, 1 또는 2이며,
단, q3가 0일 때, q4는 1보다 크다.
화학식 I의 대표적인 치환기는 미국 특허 출원 일련번호 09/130,973호 (1998년 8월 7일 출원, 발명의 명칭 "캡형성된 2'-옥시에톡시 올리고뉴클레오티드", 그 전체내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
화학식 II의 대표적인 고리형 치환기는 미국 특허 출원 09/123,108호 (1998년 7월 27일 출원, 발명의 명칭 "형태적으로 미리조직화된 RNA 표적화 2'-변형 올리고뉴클레오티드", 그 전체내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
특히 바람직한 치환기는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)mOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(식중, n 및 m은 1 내지 약 10이다), C1내지 C10저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노 및 치환된 실릴을 포함한다. 다른 특히 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3또는 2'-MOE, Martin 등, Helv.Chim. Acta, 1995, 78, 486)를 포함한다. 다른 바람직한 치환기는 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2기 (2'-DMAOE로 공지됨)이다. 대표적인 아미노옥시 치환기는 공동 소유된 미국 특허 출원 일련번호 09/344,260호 (1999년 6월 25일 출원, 발명의 명칭 "아미노옥시-작용기화 올리고머") 및 미국 특허 출원 일련번호 09/370,541호 (1999년 8월 9일 출원, 대리인 서류 번호 ISIS-3993으로 확인됨, 발명의 명칭 "아미노옥시-작용기화 올리고머 및 그의 제조 방법; 여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 올리고머 위의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오시드 위에 있는 당의 3' 위치에서, 또는 2',5'-연결된 올리고머와 같이 2'-위치로부터의 연결을 가진 뉴클레오시드의 3' 위치 및 5'-말단의 5'-위치에서 유사한 변형이 형성될 수도 있다. 올리고머는 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 잔기와 같은 당 모방물을 가질 수도 있다. 변형된 당 구조의 제조를 설명하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 4,981,957호; 5,118,800호; 5,319,080호; 5,359,044호; 5,393,878호; 5,446,137호; 5,466,786호; 5,514,785호; 5,519,134호; 5,567,811호; 5,576,427호; 5,591,722호; 5,597,909호; 5,610,300호; 5,627,053호; 5,639,873호; 5,646,265호; 5,658,873호; 5,670,633호 및 5,700,920호(이들의 일부는 공동 소유되고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다); 및 공동 소유된 미국 특허 5,859,221호 (모두 여기에서 참고문헌으로 인용된다)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
화학식 III 및 IV에 나타낸 대표적인 구아니디노 치환기는 공동 소유된 미국 특허 출원 09/349,040호 (발명의 명칭"작용기화 올리고머", 1999년 7월 7일 출원, 본 명세서에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
대표적인 아세트아미도 치환기는 미국 특허 출원 09/378,568호 (발명의 명칭 "2'-O-아세트아미도 변형된 단량체 및 올리고머", 1999년 8월 19일 출원, 대리인 서류 번호 ISIS-4071로 분류됨, 본 명세서에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
대표적인 디메틸아미노에틸옥시에틸 치환기는 국제 특허 출원 PCT/US99/17895호 (발명의 명칭: "2'-O-디메틸아미노에틸옥시-에틸-변형된 올리고뉴클레오티드, 1999년 8월 6일 출원, 대리인 서류 번호 ISIS-4045로 분류됨, 본 명세서에서 그 전체내용이 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.
본 발명의 방법은 합성 동안에 다양한 작용 잔기를 보호하기 위해 불안정한 보호기를 사용한다. 보호기는 여러 상이한 종류의 작용기를 보호하기 위한 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에서 도처에서 사용된다. 일반적으로, 보호기는 특정한 반응 조건에 불활성인 화학 작용기를 제공하고, 분자의 나머지 부분을 실질적으로 손상시키지 않으면서 분자의 작용기에 첨가되거나 작용기로부터 제거될 수 있다. 예를들어 문헌 [Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 제2판, John Wiley & Sons, New York, 1991] 참조. 합성 동안에 뉴클레오티드를 보호하기 위해 유용한 대표적인 보호기는 염기 불안정성 보호기 및 산 불안정성 보호기를 포함한다. 헤테로고리 뉴클레오염기의 고리외 아미노기를 보호하기 위하여, 염기 불안정성 보호기가 사용된다. 이러한 유형의 보호는 일반적으로 아실화에 의해 달성된다. 이 목적을 위해 2개의 통상적으로 사용되는 아실화 기는 벤조일 클로라이드 및 이소부티릴 클로라이드이다. 이러한 보호기는 올리고뉴클레오티드 합성 동안에 사용되는 반응 조건에 안정하고, 합성의 마지막 단계에서 염기 처리 동안에 거의 동일한 비율로 분열된다.
올리고뉴클레오티드 합성에서 전형적으로 사용되는 히드록실 보호기는 화학식 -C(R1)(R2)(R3)을 가진 기로 표시될 수 있다 (식중에서, 각각의 R1, R2및 R3은 비치환되거나, 또는 페닐, 나프틸, 안트라실, 및 퀴놀릴, 푸릴 및 티에닐을 포함하여 N, O 및 S로부터 선택되는 하나의 헤테로원자 또는 2개의 N 헤테로 원자를 갖는 5원 또는 6원 헤테로고리로부터 선택되는 일-치환된 아릴 또는 헤테로알릴이고; 여기에서 치환기는 할로(즉, F, Cl, Br 및 I), 니트로, C1-C4알킬 또는 알콕시, 및 10개 이하의 탄소 원자를 함유하는 아릴, 아르알킬 및 시클로알킬로부터 선택되고; R2및 R3은 각각 C1-C4알킬 또는 10개 이하의 탄소 원자를 함유하는 아르알킬 또는 시클로알킬일 수도 있다).
본 명세서에서, 레불리닐 기를 도입하기 위한 아실화 제는 활성 기, 예컨대 히드록실과 반응하여 아실화된 기를 형성할 수 있는 아실화 제이고, 이때 아실 부위는 상기 정의된 것과 같은 레불리닐 기이다. 이러한 아실화제는 레불린산 뿐만 아니라 그의 안히드라이드, 에스테르, 옥심 및 할로겐산 유도체를 포함한 레불린산의 활성화 형태를 포함한다. 레불린산은 레불리닐 기를 도입하기 위해 바람직한 아실화 제이다.
본 발명은 뉴클레오시드 또는 변형된 뉴클레오시드의 탈보호 또는 아실화에 영향을 미치기 위해 리파제와 같은 가수분해효소의 사용을 포함한다. 가수분해효소의 여러 군이 자연에 존재한다. 이러한 가수분해효소 군의 2가지가 비-천연 매질에서 널리 사용되고 있다: 리파제 및 프로테아제. 화학적 관점에서, 유기 용매 중의 리파제 및 프로테아제는 특유의 카르복실레이트를 활성화할 수 있고 그것을다수의 친핵기에 전달할 수 있는 온화하고 선택적인 시약으로서 보여질 수 있다. 본 발명은 아실화 (레불리닐기를 뉴클레오시드에 도입하기 위해) 또는 탈보호 (즉, 보호된 뉴클레오시드로부터 레불리닐기의 제거)에서 가수분해효소의 사용을 포함한다. 용어 가수분해효소는 리파제, 프로테아제, 및 뉴클레오시드의 아실화 또는 아실화된 뉴클레오시드의 탈보호를 위치선택적으로 유도할 수 있는 유사한 가수분해효소를 포함한다.
인식되는 바와 같이, 하기 실시예를 참조하면 본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규 특징이 당업자에게 명백해질 것이고, 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실험
개요.칸디다 안타르티카 리파제B (CAL-B)는 노보 노르디스크 컴퍼니(Novo Nordisk Co.)로부터 주어진 것이다. 칸디다 안타르티카 리파제A(CAL-A) 및 고정화된 슈도모나스 세파시아 리파제(PSL-C)는 각각 로쉐 다이아그노스틱스 에스.엘.(Roche Diagnostics S.L.) 및 아마노 파마슈티칼스(Amano Pharmaceuticals)로부터 구입되었다. PS-카르보디이미드는 아르고노트 테크놀로지스(Argonaut Technologies) (캘리포니아주 샌 카를로스,EE.UU.)로 부터 구입되었다. 모든 다른 시약들은 알드리치(Aldrich) 또는 플루카(Fluka)로부터 구입되었다. 용매를 질소 하에 있는 적절한 데시칸트 위에서 증류시켰다.
3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시뉴클레오시드 (2)
방법 A: 질소 하에서 1,4-디옥산(20mL)중의 1 (2밀리몰) 및 Et3N (1.7mL, 12밀리몰)의 교반된 혼합물에, 레불린산 (1.21g, 10.4밀리몰), DCC (2.14g, 10.4밀리몰) 및 DMAP (20mg, 0.16밀리몰)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 삼보호된 시티딘 유도체의 형성을 최소화하기 위하여, 6밀리몰의 LevOH 및 DCC, 및 5밀리몰의 Et3N을 1b를 위해 사용하였다. 불용성 물질을 여과에 의해 수집하고, 여액을 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 NaHCO3(수성)에 취하고, CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na2SO4상에서 건조시키고 증발시켰다. 냉 Et2O를 첨가하고, 결정화가 일어날 때까지 슬러리를 모았다. 고체를 여과하고, 냉 Et2O로 세척한 다음, EtOAc에 부었다 (2f의 경우에 MeOH). 불용성 물질을 여과하고, 여액을 농축하여 표제 화합물을 수득하였다. 얻어진 물질은 효소 가수분해 단계에 직접적으로 수행하기에 충분히 순수하였다. 플래시 크로마토그래피(EtOAc)에 의해 추가로 정제하여, 순수한 3',5'-디-O-레불리닐뉴클레오시드 2a-g를 수득하였다.
방법 B: 질소 하에서 1,4-디옥산 (5mL)중의 1(0.4밀리몰) 및 Et3N (0.15mL, 1밀리몰)의 교반된 혼합물에 레불린산 (0.14g, 1.2밀리몰), PS-카르보디이미드 (1.05g, 1.2밀리몰), DMAP (4mg, 0.032밀리몰) 및 DMAP·HCl (3mg, 0.02밀리몰)을 첨가하였다. 반응을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 불용성 물질을 여과에 의해 수집하고, 여액을 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 NaHCO3(수성)에 취하고 CH2Cl2로추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na2SO4위에서 건조시키고, 증발시켰다. 고형물을 냉 Et2O로 세척하여 3',5'-디-O-레불리닐뉴클레오시드 2a 및 2d를 수득하였다.
3',5'-디-O-레불리닐티미딘 (2a).
3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘 (2b).
N-벤조일-3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘 (2c).
3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신 (2d).
N-벤조일-3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신 (2e).
3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신 (2f).
N-이소부티릴-3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신 (2g).
3',5'-디-O-레불리닐-2'-데옥시뉴클레오시드의 효소적 가수분해를 위한 일반적 절차: 1,4-디옥산 (0.35mL)중의 2 (0.2밀리몰)의 용액에 0.15M 포스페이트 완충액 pH=7 (1.65mL) 및 상응하는 리파제를 첨가하였다 [2:효소의 비율은 CAL-A 또는 CAL-B에 대해 1:1(w/w)이고, PSL-C에 대해 1:3(w/w)이다]. 혼합물을 표 1에 나타낸 온도에서 나타낸 시간동안 250rpm에서 반응시켰다. TLC (10% MeOH/CH2Cl2)에 의해 반응을 검사하였다. 효소를 여과해 내고, CH2Cl2로 세척하고, 용매를 진공하에 증류하고, 잔류물을 NaHCO3(수성)에 취하고, CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4위에서 건조시키고, 증발시켜 모노아실뉴클레오시드 3 또는 4를 수득하였다. 3b의 경우에, 추출 대신에 플래시 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하였다.
3'-O-레불리닐티미딘 (3a).
3'-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘 (3b).
3'-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신 (3d).
N-이소부티릴-3'-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신 (3g).
5'-O-레불리닐티미딘 (4a).
N-벤조일-5'-O-레불리닐-2'-데옥시시티딘 (4c).
N-벤조일-5'-O-레불리닐-2'-데옥시아데노신 (4e).
N-이소부티릴-3'-O-레불리닐-2'-데옥시구아노신 (4g).
각각의 3'-O 및 5'-O 말단 위치에서 레불리닐 보호기를 갖는 티미딘 사량체의 효소적 가수분해의 일반적 절차: 1,4-디옥산중의 이보호된 사량체 용액에 0.15M 포스페이트 완충액 pH=7 및 상응하는 리파제를 첨가하였다 [사량체:효소의 비율은 CAL-A 또는 CAL-B에 대해 1:1(w/w)이고, PSL-C에 대해 1:3(w/w)이다]. 혼합물을 40℃에서 62시간동안 250rpm에서 반응시켰다. TLC (10% MeOH/CH2Cl2)에 의해 반응을 검사하였다. 효소를 여과해 내고, CH2Cl2로 세척하고, 용매를 진공하에 증류하고, 잔류물을 NaHCO3(수성)에 취하고, CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4위에서 건조시키고, 증발시켜 모노아실폴리뉴클레오티드를 수득하였다.
2'-데옥시뉴클레오시드의 위치선택적 효소 아실화를 위한 일반적 절차:2'-데옥시뉴클레오시드의 효소적 아실화를 위한 일반적 절차를 도 5에 나타낸다. 무수 THF (1mL)중의 1 (0.2밀리몰), 옥심 에스테르 (0.6밀리몰) 및 리파제의 현탁액을 질소하에 표 3에 나타낸 온도에서 나타낸 시간동안 250rpm으로 교반하였다. TLC (10% MeOH/CH2Cl2)에 의해 반응을 검사하였다. 효소를 여과해내고, CH2Cl2로 세척하고, 진공하에 용매를 증류하고, 잔류물을 NaHCO3(수성)에 취하고, CH2Cl2로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르에 침전시키고, 여과후에 모노레불리닐 뉴클레오시드 3 또는 4를 수득하였다. 표제번호 10 및 11에서 미량의 다른 아실 유도체들을 분리하는 것 이외에는 추가의 정제가 필요하지 않았다.
2'-변형 리보뉴클레오시드의 위치선택적 효소 아실화를 위한 일반적 절차.2'-변형된 리보뉴클레오시드의 효소 아실화를 위한 일반적 절차를 도 7에 나타낸다. 2'-변형된 리보뉴클레오시드 5를 리파제 (CAL-B 또는 PSL-C)의 존재하에서 THF중에서 옥심 레불리닐 에스테르와 반응시켰다. 얻어진 생성물 8 (CAL-B)을 5'-위치에서 아실화시키고, 9 (PSL-C)를 3'-위치에서 아실화시켰다.
이상에서, 본 발명이 뉴클레오시드 및/또는 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드 전구체로부터 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드 및 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 선택적으로 제조하기 위해 용이한 방법을 제공한다는 것을 알 수 있다. 본 발명은 보호된 뉴클레오시드의 대규모 제조에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물은 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 다양한 방법에서 유용하다.
현재 바람직할 수 있는 특정한 구현양태를 참조로 하여 본 발명을 예증하였으나, 여기에 개시된 방법들은 일반적인 것이고, 각종 기질, 특히 그 위에 히드록실 기를 가진 기질에 적용될 수 있다. 따라서, 당업자라면 여기에 일반적으로 기재된 바와 같이 다른 구현양태들도 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에서 특정한 구현양태에 관한 언급이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
여기에 인용된 모든 참고문헌들은 명백하게 그 전체 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로서 포함된 것이다.

Claims (98)

  1. a) 뉴클레오시드의 레불리닐 위치들 중 하나의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고;
    b) 상응하는 3'-O-레불리닐 및 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 상기 가수분해효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A, CAL-B, PSL-C, 돼지 췌장 리파제, 크로모박테리아움 비스코숨 리파제, 뮤코르 미에헤이 리파제, 휴미콜라 라누기노사 리파제, 페니실리움 카멤베르티 리파제, 또는 칸디다 루고사 리파제인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  7. 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 상기 가수분해효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 탈보호 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  10. 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 가수분해를 유도하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 상기 가수분해효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  14. 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 상기 가수분해효소와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 하기 화학식들의 하나를 갖는 것인, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실, 또는 2'-치환기이고;
    R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 아데노신, 시토신, 티미딘 또는 N-이소부틸 구아노신인 방법.
  18. 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 상기 가수분해효소와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 하기 화학식들의 하나를 갖는 것인, 3'-O-레불리닐위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -OH이고;
    R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  19. 제18항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 3',5'-디-O-레불리닐 티미딘, 3',5'-디-O-레불리닐 시토신, 또는 3',5'-디-O-레불리닐 N-벤조일 아데노신인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 N-이소부틸구아노신인 방법.
  24. 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 CAL-B와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 5'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
    R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실, 또는 2'-치환기이고;
    R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  25. 제24항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐뉴클레오시드가 아데노신, 시토신, 티미딘, 또는 N-이소부틸 구아노신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  26. 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 PSL-C와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -히드록실이고;
    R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  27. 제26항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 N-이소부틸구아노신 잔기를 포함하는 방법.
  28. 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 가수분해하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드를 CAL-A과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 3'-O-레불리닐 위치에서 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드의 선택적 탈보호 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -OH이고;
    R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  29. 제28항에 있어서, 상기 3',5'-디-O-레불리닐 뉴클레오시드가 티미딘, 시토신, 또는 N-벤조일 아데노신 잔기를 포함하는 방법.
  30. 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치에서 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 핵산을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 2'-O, 3'-O 또는 5'-O 위치의 적어도 하나에서 핵산의 히드록실 잔기를 보호하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 핵산이 뉴클레오시드인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌인 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  36. 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 탄수화물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 탄수화물의 적어도 하나의 히드록실 잔기를 아실화하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 지지체인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리에틸렌 글리콜 지지체인 방법.
  41. 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에 효과적인 시간동안 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에서 스테로이드 분자를 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 스테로이드 분자의 적어도 하나의 히드록실 잔기를 아실화하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 지지체인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리에틸렌 글리콜 지지체인 방법.
  46. 히드록실 잔기와 레불리닐 기 사이에서 에스테르를 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 고체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에 화합물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식을 가진 화합물 상의 히드록실 잔기를 보호하는 방법.
    상기 식에서,
    Bx가 뉴클레오염기이고;
    T1및 T2가 독립적으로 OH, 히드록실 보호기, 활성화 포스페이트 기, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드이고;
    R은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2'-치환기이고;
    단, 적어도 하나의 T1, T2또는 R이 -OH이다.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 지지체인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리에틸렌글리콜 지지체인 방법.
  51. 하기 화학식:
    (상기 식에서, Lev는 -레불리닐이다)
    을 갖는 화합물을 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 고체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에 화합물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는,하기 화학식을 가진 화합물의 3'-O 및 5'-O 위치를 보호하는 방법.
    상기 식에서, Bx는 뉴클레오염기이고;
    R은 -H, 또는 2'-치환기이다.
  52. 제51항에 있어서, 중합체 지지체에 부착된 상기 결합제가 중합체 지지체에 부착된 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 중합체 지지체인 방법.
  54. 하기 화학식:
    (상기 식에서, Lev는 -레불리닐이다)
    을 갖는 화합물을 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 폴리스티렌 중합체 지지체에 부착된 시클로헥실카르보디이미드의 존재하에서 화합물을 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식을 가진 화합물의 3'-O 및 5'-O 위치를 보호하는 방법.
    상기 식에서, Bx는 뉴클레오염기이고;
    R은 -H, 또는 2'-치환기이다.
  55. 에스테르를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안, 중합체 지지체에 부착된 결합제의 존재하에 히드록실 잔기를 레불린산과 반응시키는 것을 포함하는 히드록실 잔기를 아실화하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 결합제가 카르보디이미드인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 카르보디이미드가 시클로헥실카르보디이미드인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌인 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  60. 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 수득하기에 효과적인조건하에서 효과적인 시간동안, 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체를 유기 용매 중에서 탈수제와 반응시키는 것을 포함하는, 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체로부터 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 생성하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 탈수제가 POCl3인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 탈수제가 토실 클로라이드인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 유기 용매가 CH2Cl2, CHCl3, 헥산 또는 피리딘인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 중합체 지지체인 방법.
  65. a. 염을 형성하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 유기 용매 중에서 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체를 탈수제와 반응시키고,
    b. 상기 염을 수용액과 접촉시켜 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 형성하는 단계를 포함하는, 시클로헥실우레아 유도체화 중합체 지지체로부터 시클로헥실카르보디이미드 유도체화 중합체 지지체를 생성하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 탈수제가 POCl3인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 탈수제가 토실 클로라이드인 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 유기 용매가 CH2Cl2, CHCl3, 헥산 또는 피리딘인 방법.
  69. 제65항에 있어서, 상기 중합체 지지체가 폴리스티렌 중합체 지지체인 방법.
  70. a. 뉴클레오시드의 5'- 또는 3'-히드록실 위치 중 하나의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고;
    b. 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드 및 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드로부터 선택된 아실화된 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 가수분해효소의 존재하에 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A, CAL-B, PSL-C, 돼지 췌장 리파제, 크로모박테리아움 비스코숨 리파제, 뮤코르 미에헤이 리파제, 휴미콜라 라누기노사 리파제, 페니실리움 카멤베르티 리파제, 또는 칸디다 루고사 리파제인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  75. 제72항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  76. 5'-위치에서 뉴클레오시드의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 가수분해효소의 존재하에 상기 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 5'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  79. 3'-위치에서 뉴클레오시드의 위치선택적 가수분해를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 가수분해효소의 존재하에 상기 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 3'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  82. 제80항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  83. 5'-위치에서 뉴클레오시드의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 5'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 가수분해효소의 존재하에 상기 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 뉴클레오시드가 하기 화학식 중의 하나를갖는 것인, 5'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2'-치환기이고;
    R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이다.
  84. 제83항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-B인 방법.
  86. 제83항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 아데노신, 시토신, 티미딘 또는 N-이소부틸 구아노신인 방법.
  87. 3'-위치에서 뉴클레오시드의 위치선택적 아실화를 유발하기에 효과적인 가수분해효소를 선택하고, 3'-O-레불리닐 뉴클레오시드를 수득하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 가수분해효소의 존재하에 상기 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 뉴클레오시드가 하기 화학식 중의 하나를 갖는 것인, 3'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -OH이고;
    R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  88. 제87항에 있어서, 상기 가수분해효소가 리파제인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 리파제가 CAL-A인 방법.
  90. 제88항에 있어서, 상기 리파제가 PSL-C인 방법.
  91. 제87항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 티미딘, 시토신 또는 N-벤조일 아데노신인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 N-이소부틸구아노신인 방법.
  93. 5'-위치에서 뉴클레오시드를 아실화하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 뉴클레오시드를 아실화제 및 CAL-B와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 5'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
    R1은 -H, -히드록실, 보호된 히드록실 또는 2'-치환기이고;
    R2및 R3은 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이다.
  94. 제93항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 아데노신, 시토신, 티미딘 또는 N-이소부틸 구아노신 잔기를 포함하는 방법.
  95. 3'-위치에서 뉴클레오시드를 아실화하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 PSL-C의 존재하에 상기 뉴클레오시드를 아실화제와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 3'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -히드록실이고;
    R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이고;
    Lev는 -C(O)-(CH2)2-C(O)-CH3이다.
  96. 제95항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 N-이소부틸구아노신 잔기를 포함하는 방법.
  97. 3'-위치에서 뉴클레오시드를 아실화하기에 효과적인 조건하에서 효과적인 시간동안 상기 뉴클레오시드를 CAL-A와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 뉴클레오시드가 하기 화학식들 중의 하나를 갖는 것인, 3'-위치에서 뉴클레오시드의 선택적 아실화 방법.
    상기 식에서,
    R6은 -H 또는 -OH이고;
    R2, R3, R4및 R5은 각각 독립적으로 -H 또는 아미노 보호기이고;
    G는 N 또는 CH이다.
  98. 제97항에 있어서, 상기 뉴클레오시드가 티미딘, 시토신 또는 N-벤조일 아데노신 잔기를 포함하는 방법.
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