JPH01227963A - イムノアッセイのための方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リガンド及びリガンド受容体のごとき免疫反
応性分析対象の決定及び／又は検出のための方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は生理的状態を示す療法剤
、毒性物質、乱用又は誤用の薬物並びにホルモン等のご
とき分析対象の閾値レベルでの存在を決定及び／又は検
出するために価値がある方法に関する。この後者に関し
、１つの特定の観点において、本発明はヒト尿試料中の
黄体形成ホルモン（ＬＨ）並びにプロゲスチン及びエス
トロゲン誘導体のごときホルモンの閾値し　゛ベルでの
存在を検出するための方法に関する。本発明はまた、こ
の様な測定法の実施において使用するための材料のキッ
トに関する。

〔従来の技術〕

高度の感度及び特異性をもって物質を測定することが長
い間必要とされている。特に、臨床医学、法医学、環境
試験、食品々質保証、薬物試験及び他の関連分野におい
て、試験試料中の痕跡物質の存在及び／又は量がしばし
ば非常に重要である。

この様な分野においては、ｐｐｍ未満のオーダーの非常
に低濃度の測定がしばしば必要である。さらに、このよ
うな試験及び測定は一般に、類似するがしかし異る構造
を有する他の分子を感知することなく特定の分子を同定
することが必要である。

感受性で且つ特異的な試験の必要性は過去において、抗
原と該抗原に対する抗体との間の高度に特異的で且つ鋭
敏な相互作用に基く多数のイムノアッセイ法の開発によ
り取り組まれた。抗原及び抗体は最初動物の免疫過程に
関与するものとして認識された。すなわち、抗原である
外来物質が動物に注射された場合、該動物はやがて、侵
入する抗原を認識しそしてそれと密接に結合し、これに
よって抗原の除去又は破壊を促進する蛋白質分子である
抗体を生産することにより応答する。免疫過程は高度に
特異的であり、そして特定の物質の同定のためのイムノ
アッセイ法の使用は大きな成功を収めている。これらの
方法は、いわゆるモノクローナル抗体の調製に関するＮ
ａ乞ｕｒｅ　２５６　：　４９５−４９７、１９７５に
報告された！Ｊｉｌｓｔｅｉｎ及びＫｏｈｌｅｒの重要
な発見によりさらに促進された。この研究の詳細はよく
知られており、同じことをここで繰り返す必要はないが
、しかしながらＭｉｌｓｔｅｉｎ及びＫＯｈｌｅの研究
の結果として、高度に鋭敏で特異的な試薬の開発が特に
促進された。

既知のアッセイ法にはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）　、エンザイム・リ
ンクド・イムノツルバント・アッセイ（［ＥＬＩＳＡ）
　、蛍光アッセイ、ケモルミネッセンスアッセイ、及び
金のゾル粒子のごとき金属粒子が標識として使用される
アッセイが含まれる。これらの従来の方法は、１９８７
年ＩＯ月７日出願の本出願人の係属中の米国特許出願Ｎ
α１０５．２８５に記載されており、この記載内容を引
用によりこの明細書に組み入れる。

既知のアッセイ法の幾つかは競争的免疫反応に基いて機
能する。競争的イムノアッセイの実施においては、（１
）第一免疫反応性物質（未知試料中に含まれる）、（２
）該第一免疫反応性物質に特異的に反応する第二免疫反
応性物質、及び（３）該第一免疫反応性物質の免疫反応
特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有する第三免
疫反応性物質の一定量を混合する。第三物質は検出可能
な標識を担持する。免疫反応の間に、第一物質及び第三
物質が第二物質上の結合部位に関して相互に競争する。

免疫反応の所定の時間の後、第二物質を分離し、そして
それに結合した第三物質の量を決定する。第一物質が最
初に低濃度で存在する場合、第三物質の量、そしてそれ
故に該第三物質を介して第二物質に結合する検出可能な
標識の量が上昇するであろう。他方、第一物質の量が上
昇すれば、第三物質を介して第二物質に結合する検出可
能な標識の量が低下するであろう。従って、すべてのレ
ベルにおいて、第二物質に結合する検出可能な標識の量
は試料中の第一免疫反応性物質の量に逆比例するであろ
う。中間レベルにおいて、第二物質に結合する検出可能
な標識の量は試料中の第一免疫反応性物質のレベルに単
調逆比例するであろう。

競争的イムノアッセイは臨床的実験室において広く普及
した用途を有し、多数の臨床的分析対象の正確な測定を
もたらす。しかしながら、複雑な臨床実験室装置のほか
にあまり好ましくない特徴が競争アッセイ方式には存在
する。第一に、前に検討したごとく、生ずるシグナルは
検出されるべき物質の量に逆比例する。しかし理想的な
場合においては、分析対象の上昇したレベルはシグナル
の上昇したレベルを生成すべきである。すなわち、非装
置的な、例えば視覚的な試験において、生成するシグナ
ルの量は検出される分析対象の量に直接的に比例するで
あろう。第二に、前記の競争的免疫測定方式においては
、検出可能なシグナルの量は試料中の分析対象の量の単
純に低下する関数として変化する。従って、相互に非常
に接近している分析対象レベルについて、シグナル強度
のわずかなシフトのみが生ずる。この様なわずかなシフ
トは、近代的な装置を使用すれば容易に検出可能で□あ
るが、直接視覚試験目的のだめのヒトの目による確実な
検出のためには微細過ぎる。

毒性の及び／又は環境的に不都合な物質に関する場合、
非−災害閾値レベルを基準として選択した後、閾値より
わずかに低いレベルにおいて完全に負の結果をもたらし
、そしてそのレベルが選択された閾値レベルを超える場
合に明瞭な陽性指示を提供する試験を用いるのが有利で
ある。

さらに特定の意味において、月経サイクルの間のヒトの
妊娠可能期間、すなわち生存卵子及び生存精子の両者が
女性の生殖管中に存在する期間を決定するための簡単で
しかも確実な方法の必要性が長い間存在した。種々の理
由により避妊具及び避妊薬は使用のために人手できず、
そしてそれ故に月経サイクルの妊娠可能期間を確かめる
技法が望ましいものとなった。明らかに、月経サイクル
の妊娠可能期間を確かめる技法は妊娠を意図的に回避す
るためにも、妊娠が望ましい場合に受胎を促進するため
にも価値がある。

月経サイクルは女性の腺又は器官からのホルモンの放出
により支配される。このような放出は予測可能でありそ
して排卵と特異的に関連しており、これにより卵巣から
卵子が放出されそして子宮壁が妊娠のために用意され、
そしてホルモン及び／又はその代謝物が尿に出現する。

特異的な生物学的現象は、ヨーロッパ特許庁公報８３／
３３に、１９８３年８月１７日に公表されたヨーロッパ
特許公開Ｎα００８６０９５に詳細且つ明確に記載され
ている。そして、正常な月経サイクルの間、女性の尿中
のエストロン−３−グルクロニド（８１３Ｇ）のレベル
ハ排卵の約６日前に上昇を始め、そして排卵の約１日前
にそのピークに達し、そして排卵中及び排卵後に急速に
下降することは確実である。プレグナンジオール−３−
グルクロニド（Ｐ、Ｇ）は排卵の日に上昇を始め、そし
て排卵の２〜３日後にピークに達し、そして黄体期にわ
たり上昇したままである。

同様に、Ｐ３Ｇレベルと８＋３Ｇレベルとの間の関係が
よく知られており、そして前記のヨーロッパ特許公開Ｎ
ｏ、　００８６０９５から、尿中のエストロゲン対プロ
ゲスチン代謝物の比は月経サイクルの進行をモニターす
るために有用であることが見出されている。

ホルモンの活性を測定することにより月経サイクルを追
跡する上で特に重要なことは、およそ排卵中、尿中のＰ
ＩＧのレベルが４Ｎ／ｒｎＩ！よす高いレベルに揺らぐ
ことである。従って、尿中のＰ３Ｇのこのような閾値量
以上の存在を決定及び／又は検出することができる簡単
で且つ確実な測定法が、排卵が起ったか否かを決定する
上で非常に価値があるであろう。

〔発明の概要〕

本発明の陽性段階（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５ｔｅｐ）イム
ノアッセイ法は従来技術の競争的イムノアッセイに内在
する欠点のそれぞれに対応している。第一に、反応が陽
性であるから、上昇した分析対象レベルの存在下で上昇
したシグナルが現われる。さらに、本発明のイムノアッ
セイの陽性段階関数に従えば、分析対象の濃度の関数と
してシグナルの単調な減少（又は増加）が観察されるの
ではなく、むしろ、シグナルのレベルは予め選択された
閾値において非常にシャープに突然に上昇する。すなわ
ち、選択された閾値よりわずかに低い分析対象レベルが
、低いか又はほとんど検出できないシグナルレベルをも
たらし、他方閾値よりわずかに高い分析対象レベルは、
使用される特定の標識をもって到達できるシグナルの最
高レベルをもたらす。

本発明は、一般にイムノアッセイに関して有用な方法及
び材料のキットを提供する。特に、本発明は免疫反応性
物質の閾値レベルでの存在下でシグナルを生成する陽性
段階測定法を提供する。常用の測定法はその方式に依存
して、標識された免疫反応性物質と非標識免疫反応性物
質との間の競争に基き、本発明の陽性段階測定法はシグ
ナルを逆転せしめ、この結果使用者は試料中の免疫反応
性物質の存在を容易に確かめることができる。従って、
本発明の使用により、尿中のＰ３Ｇ、　Ｅ１３Ｇ及びＬ
Ｈのごときホルモン類のレベルの動揺の検出が容易にな
る。

本発明の陽性段階イムノアッセイ方式は妊娠試験以外の
分野において重要な用途を有する。これに関して、試料
中に存在する物質の実際のレベルの決定が、ある閾値レ
ベルより高又は下の量で物質が存在するか否かよりも重
要でない種々の状況が存在する。明らかな１つの例は制
御された又は乱用もしくは誤用された薬物についての法
医学試験の分野にある。例えば、０．１％より高いアル
コールレベルは中毒の証拠であると考えられるから、血
液中のアルコールレベルの試験において０．１％の閾値
は重要である。同様に、マリヮナ又はＴＨＣについては
、１０ｎｇ／−１又は他の場合には１１００ｎ／−の尿
レベルが物質の乱用又は誤用の証拠であると考えられる
。明らかに、本発明の陽性段階イムノアッセイ方式は閾
値より低い分析対象レベルにおいては発色せず、そして
閾値より高い分析対象レベルにおいて発色が達成され、
このような意味において利用可能である。

本発明の陽性段階イムノアッセイはまた、療法剤モニタ
ーの分野においても有用である。療法的ウィンドウ（ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｗｉｎｄｏｗ）により特徴付け
られる多数の非常に有用な療法剤、例えば少数挙げれば
、セオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）　（抗喘
息剤）、ジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ）　（心臓調整剤
〉、及びアミノグリコシド抗生物質が存在する。療法的
ウィンドウは、特定の薬物の療法的に有効であるための
最低レベルから不所望の又は毒性の反応が生ずるレベル
までの濃度範囲である。明らかに、最低療法閾値を検出
するように調整された１つの測定及び毒性閾値を検出す
るように調整された他の測定から成る二重陽性段階イム
ノアッセイが非常に価値があろう。

本発明に従えば、液体試料中の第一免疫反応性物質の予
め特定された（すなわち、閾値）量以上の最初の存在を
決定するためのイムノアッセイ法が提供される。この方
法は、まず、最初未知量の第一免疫反応性物質を、（１
）該第一物質に対して特異的に免疫反応性である第二免
疫反応性物質の既知量、及び（２）該第一免疫反応性物
質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を
有する第三免疫反応性物質の一定量と混合することによ
り免疫化学的反応相を確立する段階を含んで成る。この
発明に従えば、前記第二物質の前記既知量は、第一物質
の前記予め特定された閾値量と第三免疫反応性物質の前
記の量との合計と免疫化学的に当量（すなわち、免疫特
異的に結合するのにちょうど十分）であるべきである。

従って、液体試Ｚ斗溶液中の第一免疫反応性物質の量が
その予め特定された閾値量を超える場合、未反応の第三
物質が前記反応相における更なる免疫特異的反応のため
に利用可能であろう。次に、こうして確立された反応相
を、前記第二物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な
免疫反応特性を有する第四免疫反応性物質の一定量と反
応せしめる。そして、該第四免疫反応性物質は検出可能
な標識を担持する。従って、試料中の第一物質の予め特
定された閾値を超える最初の存在が、前記検出可能な標
識を含有する特異的免疫反応生成物の存在を検出するこ
とにより決定され得る。

好ましくは、第三免疫反応性物質は、固体支持体に結合
され、これによって第三免疫反応性物質が固定化され（
例えば、該固体支持体が透過性膜である場合）、あるい
は収集可能にされる（例えば、該固体支持体が分散性の
粒状の収集可能な固体材料である場合）。

本発明の好ましい簡様において、第一免疫反応性物質を
含有する液体試料を該第一免疫反応性物質に対して免疫
特異的に反応性である第二免疫反応性物質の既知量と混
合し、これにより第一反応相を生成せしめる。次に、こ
の第一反応相を第三免疫反応性物質の一定量と接触せし
めることにより第二反応相を生成せしめる。この形質に
おいて、本発明はＰ３Ｇ及びＥ、３Ｇのごときハプテン
及び薬物を包含する小分子において測定するために特に
有用である。

液体試料中の第一免疫反応性物質の量を決定するための
本発明の好ましい実際的な形態において、本発明のイム
ノアッセイ法は、最初未知量の第一免疫反応性物質を含
有する液体試料を用意し、そして該試料を複数のアリコ
ート部分に分割する段階を含んで成る。該第一免疫反応
性物質に対して特異的に免疫反応性である第二免疫反応
性物質のそれぞれ異る量を前記複数のアリコート部分に
導入することにより複数の第−反応性相を生成せしめ、
この各反応相がそれぞれ異る既知量の第二物質を含有す
る。次に、該第−反応相を、前記第一免疫反応性物質の
免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有す
る第三免疫反応性物質の一定量と接触せしめる。こうし
て複数の第二反応相が生成され、各反応相は同一量の第
三物質及びそれぞれ異る量の第二物質を含有する。本発
明に従えば、第二反応相中の第二物質のそれぞれの既知
歯は、第三物質の前記の量と前記第一物質の対応するそ
れぞれ予め選択された量との合Ｓ１と免疫特異的に当量
（すなわち、それらと免疫特異的に反応しそしてそれら
をブロックするためにちょうど十分）であるように予め
決定され、これによって、試料中の第一物質の未知量が
その対応するそれぞれの予め選択された量より少いか又
はそれと同じである場合には第二反応相において更なる
免疫特異的反応のために利用可能な未反応の第三物質は
存在しない。そして、試料中の第一物質の未知量がその
対応するそれぞれの予め選択された量より多い場合、未
反応の第三物質が対応する第二反応相における更なる免
疫特異的反応のために利用可能である。次に、これらの
第二反応相を、前記第二物質の免疫反応特性と免疫特異
的に同一の免疫反応特性を有する標識された第四免疫反
応性物質の一定量と接触せしめる。こうして、第二反応
相にそれぞれ対応する複数のそれぞれの検出相が生成　
れ、これによって、試料中の第一物質の量がその前記の
対応するそれぞれの予め選択された（閾１直）量を超え
る第二相に対応する各反応相において、未反応の第三物
質と標識された第四物質との間の特異的免疫反応により
標識された免疫反応生成物が生成するであろう。次に、
標識された免疫反応生成物の存在又は不存在を各反応相
において、試料中の第一物質の対応するそれぞれの予め
選択された単量上の最初の存在の示すものとして検出す
ることができる。

今記載した方法を用いて、液体試料中の第一免疫反応性
物質の量が、種々の反応相に導入される第二免疫反応性
物質のそれぞれの調整された量に依存する特定の狭い範
囲内にあることを決定することができる。すなわち、第
一反応系は、試料中の第一免疫反応性物質の量が１ｎ／
ｍｌより多い場合に対応する反応相が標識された免疫反
応生成物を含有するように調整され；第二反応系は、試
料中の第一免疫反応性物質のレベルが２ｇ／ｍｌより多
い場合に対応する反応相が標識された免疫反応生成物を
含有する様に調整され；第三反応系は、液体試料中の第
一免疫反応性物質の量が３躍／ｍｌを超える場合に対応
する反応相が標識された免疫反応生成物を含有するよう
にｉＱ％　ａＪされる；等々である。そしてこのように
して、検出相中の標識された免疫反応生成物の存在が色
を生成するようにこの方法が設計されれば、第一免疫反
応性物質の決定された量より低いレベルを検出するよう
に予め調整された系の検出相は着色され、他方、第一免
疫反応性物質の決定された量より高いレベルを検出する
ように予め調整された系の検出相は着色されないであろ
う。

本発明の他の重要な観点において、液体試料中の第一免
疫反応性物質の所定量以上の存在を検出するためのイム
ノアッセイ法の実施のための材料のキットが提供される
。このキットは、該第一免疫反応性物質に対して特異的
に免疫反応性である第二免疫反応性物質の既知量、該第
一免疫反応性物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な
免疫反応特性を有する第三免疫反応性物質の既知量、及
び前記第二物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免
疫反応特性を有する標識された第四免疫反応性物質の成
る量、を含んで成る。第三免疫反応性物質は好ましくは
固体支持体に結合され、そしてこの発明の特に好ましい
観点においては該固体支持体は分散性で粒状で収集可能
な固体材料を含んで成る。本発明の他の好ましい観点に
おいて、第四免疫反応性物質は金のゾル粒子、標識を用
いて標識され、この金のゾル粒子標識は該標識を含有す
る材料がフィルター要素上に収集された場合に該フィル
ター要素上に赤色を生じさせることができる。

本発明はあらゆる免疫反応性物質、すなわち特異的結合
蛋白質及び対応する結合性物質に関して有用であるが、
本発明は、月経サイクルの間に女性によって産生される
Ｐ３Ｇ及びＥ、３Ｇ挿びに関連する物質を包含するホル
モン類及びホルモン代謝物類であるハプテン類及び薬物
類し）ごとき小さい単エピトープ性分子と関連して特別
な有用性を有する。

〔発明の具体的な記載〕

上記の本発明のすべての観点において、第一免疫反応性
物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性
を有する第三免疫反応物質は一般に、基本的には第一免
疫反応性物質と同一の物質である。すなわち、その方法
及び／又はキットが液体試料中のＰ、Ｇの最初の存在を
決定するためのものであれば、第三免疫反応性物質は最
も一般的にはＰ３Ｇを含んでなる。同様に、第四免疫反
応性物質は最も一般的には第二免疫反応性物質と同一で
あり、それぞれ前記ホルモンに対する同一の抗体である
。これに関して、第一免疫反応性物質が免疫反応に利用
可能な多数の免疫反応部位を有する場合、第二及び第四
免疫反応性物質は−又は複数の同一部位に対して特異的
に免疫反応性であるべきである。

本発明に従えば、陽性段階アッセイ方式は、液体試料中
のハプテン又は他の免疫反応性物質の珀加するレベルの
存在下で、逆転した競争シグナルを陽性段階（ρｏｓｉ
ｔｉｖｅ　５ｔｅｐ）に変化せしめる。さらに、このア
ッセイ方式は、液体試料中の免疫反応性物質の所定のレ
ベル（例えば、排卵が起ったことを示すＰ３Ｇの閾値レ
ベル）において陽性シグナルを与え、さらに低いレベル
においてシグナルを与えないように設計することができ
る。尿試料中２．５躍／−と５ｆｆ／−との間のＰ、Ｇ
の検出が生理的に重要であるから、２．５ｎ／ｍｌのＰ
３Ｇにおいてシグナルを与えずしかし５ＪＩｇ／ｒｄの
Ｐ３Ｇにおいて最大シグナルを与えるようにアッセイを
構成することができる。

本発明は、水性試料中のリガンド及びリガンド受容体の
ごとき種々の免疫反応性物質対象を決定及び／又は検出
するための測定方法及びキットを提供する。分析対象は
免疫反応性物質、例えばモノ−又はポリ−エピトープ性
リガンド、例えば抗原及びハプテンの両者であるが、本
発明は特に、モノエピトープ性ハプテン、例えばホルモ
ン、及び特に、ｌＥ＋３Ｇ及びＰ３Ｇのごときエストロ
ゲン及びプロゲスチン化合物の代謝物に開運して特に有
用である。本発明が関与する免疫反応性物質の特徴は、
それが他方の免疫反応性物質と免疫特異的に結合するこ
とができることである。ある免疫反応性物質が他方の免
疫反応性物質に対して特異的に免疫反応性である場合、
それらの物質又は分子の一方をリガンドと称し、他方を
受容体又はアンチ−リガンドと称する。これらの分子は
異り、そして一方は他方の特定の空間的及び／又は極性
構造に特異的に結合する領域を表面上又はキャビティー
中に有する。

免疫反応性物質が、それに対して特異的に免疫反応性で
ある免疫反応物質と混合される場合、両者が免疫化学的
反応相を提供し、この相は十分なインキュベーション時
間が与えられれば、これらの２つの物質量の特異的免疫
反応を生じさせ、その結果免疫反応生成物を生じさせる
であろう。

抗原性免疫反応物質は、免疫特異的反応に入ることがで
きる一個又は複数個のエピトープを有することができる
。これらのエピトープは同一である場合もあり又異る場
合もある。しかしながら、同一であるエピトープのみが
所与する結合パートナ−との特異的免疫反応に入ること
ができる。免疫化学的反応相が十分な時間にわたりイン
キユベートされれば、反応は平衡に達し、免疫特異的に
反応性の物質の量が免疫化学的に当量である場合、更な
る部位は免疫特異的反応のために利用されない。この状
態が達成される場合、反応相中に免疫特異的反応のため
に利用可能な未反応免疫反応性物質が存在しないと言わ
れる。そして、特異的免疫反応性物質の一方又は他方が
免疫化学的当量より多く存在すれば、他の免疫反応性物
質はいずれも該反応相において更なる免疫特異的反応の
ために利用されないであろう。従って、このような他の
免疫反応性物質はブロックされていると言われる。

明らかに、ある所与の免疫反応性物質の特異的免疫化学
的当量は正確な数学的に算出し得る数値ではない。むし
ろ、ある所与の免疫反応性物質の、該物質に対して特異
的に免疫反応性である他の免疫反応性に対する特異的免
疫化学的当量関係は一般的に実験的に決定される。本発
明の場合、これは単に、未知物質の異る量を含有する多
数の標準を用意し、そして第一の物質をブロックする他
の物質の量を実験的に決定することにより行うことがで
きる。例えば、この様な決定は、よく知られた方法に従
ってタイトレージョン（ｔ　１ｔｒａｔ　ｉｏｎ　）に
より行うことができる。

本発明によれば、２種類の物質が同一の特異的免疫化学
的反応に入ることができる場合、一方の免疫反応性物質
が他方の物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫
反応特性を有すると言われる。すなわち、これらの物質
は類似の態様で免疫特異的に反応することができる。こ
の現象は例えば、これらの物質の一方が他方の物質の一
部分でありそして同一の特異的エピトープを担持する場
合に生ずる。この現象はまた、これらの物質は基本的に
同一であるが、一方が反応相中を自由に動くことができ
そして他方が収集を促進する固相に固定化されそして／
又は接合している場合に生ずる。この現象はまた、これ
らの物質の一方がその基本的な且つ未反応の形態で存在
し、そして他方が、測定法の一部として同定及び／又は
定量を促進する検出可能な標識により標識されている。

−般的に言って、本発明の場合、反応相中で遊離してい
るハプテン及び固体支持体に接合している同一のハプテ
ンが免疫特異的に同一な免疫反応特性を有する。さらに
、検出可能な標識により標識された抗−ハプテン抗体は
、標識されていない同一の抗−ハプテン抗体の免疫反応
特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有する。これ
らの物質は類似の免疫反応特性を有すると言われる。

本発明によれば、液体試料中の免疫反応性物質の未知量
が予め特定された量又は閾値量を超えれば、その結果標
識された免疫反応生成物が生ずる。

標識された免疫反応生成物は、膜のごとき固体支持体に
結合されることによって固定化されているか、又は最初
分散している分散性の粒状の収集可能な固体材料であっ
て例えばフィルター要素上に収集されたものに結合して
いる免疫反応生成物（又は複合体）の形であることがで
きる。いずれの場合にも、免疫反応生成物は、それ自体
着色する標識、例えば金のゾル粒子、又は酵素的発色の
場合のように発色反応を促進する標識を担持する。

酵素的発色系においては、色生成材料が、免疫反応生成
物の形成による発色条件に置かれる。この様な方法及び
材料はよく知られており、そしてここでさらに詳細に検
討する必要はない。金のゾル粒子標識の結果としての検
出可能な色の生成は、前記の係属中の米国特許出願Ｎα
１０５．２８５に開示されておりそしてクレームされて
いる発明の部分である。金のゾル粒子は免疫反応生成物
の形成により集められそして濃縮され、そしてその集合
により視覚的に観察可能な色が生成される。

以上、要約すれば、生物学的流体中の分析対象リガンド
の閾値レベルの存在を検出及び／又は決定するために特
に価値ある測定法が提供される。

１つの特定の観点において、本発明は人尿中のプレグナ
ンジオール−３−グルクロニド（Ｐ、Ｇ）及びエストロ
ン−３−グルクロニド（８，３Ｇ）のごときホルモン代
謝物の閾値レベルを検出及び／又は決定する方法に向け
られる。この測定法は、分析対象を含有する試料を該分
析対象に対する抗体の既知量、及び固体支持体に接合さ
れた調整された量の分析対象自体と接触せしめることを
含んで成る。

試料中の分析対象のレベルが閾値、例えばＰ３Ｇについ
て５　ｐｇ　／　ｍｌを超える場合、抗体は前記固体支
持体上の対応する分析対象のすべてをブロックするには
十分でない。従って、この測定系への標識された抗体の
添加の際、検出可能な免疫反応生成物が該支持体に付着
し、試料中の分析対象の量が前記閾値を超えることが示
される。他方、試料中の分析対象のレベルが閾値量より
低い場合、遊離抗体は固体支持体上の対応する分析対象
のすべてをブロックするのに十分であり、標識された抗
体が支持体上に検出可能な免疫反応生成物を生成するの
が防止され、そしてそれ故にシグナルが生じないであろ
う。

次に、例により本発明をさらに具体的に説明する。

Ｌ　陽性段階法を用いるプレートｅＬＩｓへアッセイＥ
ｒｌａｎｇｅｒ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２２８．
７１３−７２７（１９５７）により詳細に記載されてい
るようにして、遊離酸形のプレグナンジオール−３−グ
ルクロニド（Ｐ３Ｇ）（シグマ）を混合無水物法により
ゼラチン（シグマ）に共有結合で連結した。この方法に
より、該ステロイドがペプチド結合としてグルクロニド
のカルボン酸を介して該蛋白質のポリペプチド鎖中のり
ジン残基のＥ−アミノ基に連結される。

固体支持体へのゼラチン−Ｐ３Ｇの付加前記のようにし
て調製されたゼラチン−Ｐ３ＧはＰＶＣ９６ウエルーミ
クロタイタープレートに受動的に吸着された。１０ｍＭ
　ＫＰＯ，及び０．１４５Ｍ　ＮａＣｌを含有する溶液
（ｐＨ７，４）　（ＰＢＳ）中０．２５に／ｄのステロ
イドを含有するゼラチン−Ｐ３Ｇ溶液５０１１１を各ウ
ェルに添加し、そしてこの溶液をプレート上ウェル中に
室温（２２℃）にて１時間放置した。

次に、この溶液をウェルからデカントし、そして１％ゼ
ラチンをか有するＰＢＳｌｏ、０２％ＮａＡｚｉｄｅ溶
液（ｐＨ７，２）とプレートとを室温にて１時間接触せ
しめることにより、非特異的結合を防止するためにプレ
ートをブロックした。処理されたウェルを再びデカント
し、そして０．１％トゥイーン２０（Ｖ／Ｖ）を含有す
るＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）により２回洗浄した。

プレートＥＬＩＳＡアッセイ ＰＢＳ中に抗−Ｐ３Ｇ抗体を含有する標準溶液を８種類
の異る濃度、すなわち１．０．２．Ｑ、　４．０゜８、
０　、１６．０．３２．０．６４．０及び１２ｇ、　ｋ
　／ｍｊ！で調製し、そしてＰＢＳ中にＰ３Ｇを含有す
る試料溶液を６種類の異る濃度、すなわち、２．５　、
１．２５　、０．６２５゜０、３１２５　、０．１５６
　、及びＯＲ／ｍｆ！で調製した。１５０ｄの各抗−Ｐ
３Ｇ抗体標準溶液を３０ｄの各Ｐ、Ｇ試料溶液と混合し
て４８個の個別の反応相を調製した。各反応相の２個ず
つの別々の６０ｄ部分をウェルに入れた。

これらの溶液をウェル中で室温にて１５分間インキュベ
ートした。次に、溶液をウェルがらデカントし、そして
プレートをＰＢＳ中に０．１％のトウィーン２０を含有
する洗浄溶液により２回洗浄した。０、ｌ　Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−アセテート　（ｐｉｆ　７．０　）中６２．５ｎｇ
／ｍ１の抗−Ｐ３Ｇ抗体／西洋ワサビパーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）抗合体（Ｎａｋａｎｅ等のよく知られた方法
により調製したもの）を含有する溶液５０ｐ１を各プレ
ートに添加し、そして室温にて１５分間インキニベート
した。次に、ウェルを前記ＰＢＳ／）ウィーン洗浄液に
より５回洗浄して、すべての非特異的に結合したＨＲＰ
を完全に除去した。メタノール中０．１２５％のテトラ
メチルベンジジン３ｒｄ！と、０．１Ｍホスフェート及
び５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ５，０）中０．０３％
過酸化水素７−と、の新鮮な混合物から成る発色基質溶
液５０１１１を各プレートに加え、そして室温にて５分
間反応せしめた。発色の強度をグイナテック（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ）プレートリーダー（グイナテッ々バージニア
）上で６４０ｄｍにて、４９０１ｍの参照波長を用いて
読み取った。この結果を次の第１表に示す。

第１表 １　０．４５１０．５７２０．６０４０．６４９０．６
８８０．０２６１　０．４４００．４８７０．５８７０
．５８９０．５９ｇ　０．０２８２　０．７１４０．７
５７０．７５１０．７４４０．４８１０．０１６２　０
．６８４０．７０３０．７２５０．７０８０．５１４０
．０１８４　０．４６８０．５０３０．５５４０．５７
６０．０３００．０１３４　　　０．５０５　０．５０
３　０．５６４　０．５４９　０．０２２　０゜旧０８
　０．６７８０．６９５０．７４３０．６５９０．０１
６０．０１１８　０．６４１０．７１２０．７５００．
６５４０．０１６０．０１０１６　０．４７８０．５３
７０．４８００．０１１０．００００．０００１６　０
．４６９０．５３７０．５２１０．００８０．００２０
．００２３２　　　０．６１３　０．６１９　０．０１
９　０．０１０　０．００４　０．００６３２　０．６
３３０．５４７０．０２１０．０１１０．００６０．０
１０６４　０．４７？　０．００４０．００４０．００
２０．００２０．０００６４　０．５１１０．００？　
０．００４０．００３０．００００．０００１２８　０
．００９０．００７０．００？　０．００？　０．００
６０．０１１例１のこの試験は、試料溶液中のＰ３Ｇ検
出及び決定、並びに所与の試料溶液中のＰ２Ｏの量が具
体的に知られた予め選択された量を超えるか否かの検出
及び決定のために計画された。試料溶液中のＰ、Ｇを第
一免疫反応性物質と称することができ、そして標準溶液
中の抗−Ｐ３Ｇ抗体を第二免疫反応性物質と称すること
ができる。この第一免疫反応性物質及び第二免疫反応性
物質は相互に特異的に免疫反応性である。ゼラチン連結
によりプレート（固体支持体）に結合したＰ、Ｇは、該
第一免疫反応性物質に類似する第三免疫反応性物質であ
り、そしてそれ故に、第二免疫反応性物質であるＰ２Ｏ
の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有
する。ＨＲＰと接合した抗−Ｐ、Ｇ抗体は該第二免疫反
応性物質と類似する第四免疫反応性物質であり、そして
それ故に該第二物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一
な免疫反応特性を有する。

抗−Ｐ、Ｇ抗体に接合したＨＲＰは、既知の手段及び手
順により検出することができる酵素性標識である。すな
わち、抗−Ｐ、Ｇ抗体／ＨＲＰ接合体は標識された第四
免疫反応性物質である。

例１の例示において、既知量の抗−Ｐ３Ｇ抗体く第二免
疫反応性物質）が予め選択された量のＰ２Ｏ（第一免疫
反応性物質）と接触せしめられる。Ｐ２Ｏは通常は検出
又は決定されるべき分析対象であろうが、この例の目的
のためには、Ｐ、Ｇは既知量で存在する。こうして、一
連の第一反応相が与えられ、それぞれの反応相は異る既
知量の抗−Ｐ３Ｇ抗体を含有する。次に、第一反応相を
、マイクロタイタープレートの各ウェルに結合したＰ、
Ｇ（第三免疫反応性物質）と接触せしめることによりマ
イクロタイタープレートの各ウェル中に第二反応相を生
成せしめる。プレートのウェルは同一条件下で同一のＰ
２Ｏ−ゼラチン溶液と接触したものであり、そしてそれ
故に第二反応相はプレートに結合した同じ量のＰ２Ｏ及
びそれぞれの異る既知量の抗−Ｐ３Ｇ抗体を含有する。

各第二反応相において、抗−Ｐ、Ｇ抗体の合計既知量が
試料中のＰ２Ｏのすべて及び結合したＰ２Ｏのすべてと
免疫特異的に反応するのに十分であれば、結合したＰ２
Ｏは抗体によりブロックされると言われ、そして更なる
免疫反応が防止される。しかしながら、抗−Ｐ３Ｇ抗体
の合計量が第二反応相中のＰ、Ｇの合計と反応するのに
十分でなければ、結合したＰ、Ｇはブロックされないま
まであり、そして更なる免疫特異的反応のために利用可
能である。

従って、第二反応相が洗浄しそして抗−Ｐ３Ｇ抗体／Ｈ
ＲＰ接合体溶液と接触せしめた場合、ブロックされてい
ない結合したＰ２Ｏが存在する（試料中のＰ、Ｇが調整
された量を超える）ウェル中で免疫特異的反応が起こり
、そしてブロックされていないＰ、Ｇと抗体／ＨＲＰ接
合体との間の免疫反応を介してＨＲＰ酵素性発色剤がプ
レートに結合するであろう。明らかに、試料中のＰ２Ｏ
の量が増加するに従って、結合したＰ、Ｇをブロックす
る所与量の抗体の能力は低下する。実験的に決定し得る
点において、試料中のＰ２Ｏのさらなる増加がプレート
上のブロックされていないＰ、Ｇの存在をもたらし、そ
してそれに続き、標識された抗体の導入の際にプレート
へのＨＲＰの結合をもたらす。ＨＲＰがプレートに結合
する場合、ＴＭＢ溶液の添加により色が形成される。

第１表において、試料中にＰ、Ｇが存在しなかったセル
中で色が生成されなかったことがわかる（右側の列）。

（色の増加と共に第１表中の数値が直接増加し、そして
非常に小さい数値はほとんど色が存在しないことを示し
、そして比較的大きな数値は明確な発色を示す。）さら
に、抗−Ｐ３Ｇ抗体の既知濃度が１２８４／ｍｌである
第１表の最下行において、どのセルにおいても色が生成
されない。この量の抗体は、試料中のＰ２Ｏの濃度が２
．５ｔ４！：／ｍｌであった場合でさえすべてのＰ、Ｇ
をブロックするのに十分だったからである。しかしなが
ら、抗体濃度が６４硝／−である場合、試料中のＰ２Ｏ
の濃度が２．５ｇ／−に達した時にプレートの十分な発
色が起こり；抗体濃度が３２ｘ／ｍｊ！である場合、１
．２５Ｍｒ／−〇Ｐ３Ｇ濃度において十分な発色が起こ
り；抗体濃度が１６ｆｆ／ｄである場合、０．６２５ｎ
／ｍｌのＰ３Ｇ濃度において十分な発色が起こり；３　
ｎ　／　ｍｌｉ！の抗体濃度においては、０．３１２５
遁／ｎｉｌ！のＰ、Ｇにおいて飛躍が起こり：そして抗
体濃度が１パ／−又は２河／　ｍｌである場合、０．１
５６埋／−のＰ、Ｇにおいて飛躍が起こる。明らかに、
無色から十分な色への飛曜点は非常に鋭敏であり、そし
て標準溶液中の抗−Ｐ、Ｇ抗体の量及び／又は支持体に
結合したＰ２Ｏの量を単に変えることによって実験的に
調整することができる。

あ（陽性段階法を用いる流過ＥＬＩＳＡアッセイ躾の調
製 この例において、固相固定化反応体を支持するためにミ
クロポーラス状流過膜を用いた。使用した膜は、米国特
許Ｎα４．０６６、５１２明細書に記載されている種類
のＰａ１ｌイムノアフイニテイー膜であった。ＰＢＳ中
に１０ｋ　／ｍＩ！のグルコースオキシダーゼ及び前記
例１に記載したようにして調製したゼラチン−Ｐ２Ｏを
含有する溶液３１１１を膜にスポットすることにより膜
を調製した。ゼラチン−Ｐ２Ｏの異る濃度、すなわち１
０．１　、０．１　、０．０１、及び０、　ｏｏｔｇ　
７ｍ７！を用いて、５セツトのスポットされた膜を調製
した。非特異的結合を防止するため、スポットされた膜
を、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中に０．５％カーネーショ
ン（Ｃａｒｎａｔ　ｉｏｎ　）　　ミルク及び０．０２
％トゥイーンを含有する溶液２ｍｆを用いてブロックし
た。次に、これらの膜を、１９８７年１０月１３日に出
願された本出願人の米国特許出願Ｎｏ、　１０７，２４
０に記載されているタイプの流過装置に装着した。

流過アッセイ ＰＢＳ中３２羅／ｍｌの抗体を含有する抗−Ｐ３Ｇ抗体
標準溶液、並びにＰＢＳ中にそれぞれ２．５゜１．２５
、及び０鱈／−のＰ、Ｇを含有する試料溶液を調製した
。４０１１！の各試料溶液を４００１１１の抗体標準溶
液と混合し、そしてこの混合物を別々に、上記のように
調製されたそれぞれの流過装置の膜上に注ぎ、そしてそ
れを流過せしめた。次に、例１に記載したようにして調
製した抗−Ｐ３Ｇ抗体／ＨＲＰ接合体溶液４００Ｉを冬
服に注いで通し、そしてＰＢＳ中３％イゲパール（Ｉ　
ｇｅｐａ　１）及び１％ドデシル硫酸す）　ＩＪウムを
含有する洗浄液１ｒｄにより膜を洗浄した。次に、０．
０３４Ｍクエン酸塩及び０．０７１Ｍリン酸ナトジナト
リウム中％のデキストロース及び０．０１％のＴＭＢを
含有する溶液７部と３部のメタノールとの混合物から成
る基質溶液０．４−に前記膜を接触せしめた。３〜５分
間後に視覚的に評価した結果はスポット溶液の濃度によ
り変化せず、次の通りであった。

Ｐ２Ｏ（遁／ｍｌ）　　　読み値 ２．５　　　　　　　　＋（青色） １、２５　　　　　　　− 〇　　　　　　　　　− 前記（例１）に記載したようにしてＰ２Ｏをゼラチンに
連結し、そして上記米国特許出願Ｎα１０５．２８５の
例Ｉ［（ａ）に記載されている方法と正確に同一の方法
を用いてこのゼラチン−Ｐ３Ｇ成分をポリビーズ（Ｐｏ
ｌｙｂｅａｄ）カルボキシレート単分散マイクロスフェ
ア−に連結することによりラテックス−ゲルーＰ３Ｇ分
散体を調製した。ＰＢＳ中に０．６２５゜１．２５．２
．５．５．０．１０、及び２Ｏｆｆ／ｉｆのＰ２Ｏをそ
れぞれ含有する一連の試料溶液を、前記例２に記載した
抗体標準溶液３００ｐＩと混合し、次に各前混合した相
に２０ｐＩのラテックス−ゲルーＰ３Ｇ分散体を添加し
た。次に、反応混合物を再生セルロース（１ミクロン）
から作られたフィルターを通して注いでラテックス粒子
を捕捉しそして収集した。

前記係属中の米国特許出願Ｎα１０５．２８５の例ＩＩ
　（ｂ）に記載されているようにして金のゾル粒子で標
識された抗−Ｐ３Ｇ抗体を調製し、そしてこの全標識抗
体を４０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ、　ｌ　１％ＢＳＡ、及び０．
０２％Ｎａアジドを含有する溶液に懸濁した。前記ラテ
ックス粒子が集められているフィルターに該混合物を注
いで通し、そしてこのフィルターを、ＰＢＳ（ｐＨ７，
２）中に１．２３４ｍＭチメロサール（Ｔｈ　ｉｍｅｒ
ｏｓａ　Ｉ）、３％イゲパール（Ｉ　ｇｅｐａ　Ｉ）　
ＣＡ７２０及び１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する
洗浄溶液で洗浄した。

視覚結果は次の通りであった。

Ｐ　３Ｇ　（”　／ｒｄり　　　　Ｈ察Ｔｓ　果０．６
２５　　　　　　　− １．２５　　　　　　　　− ２．５− ５．０　　　　　　　　＋（ピンク色）１０．０　　　
　　　　　＋　　　／／２０．０　　　　　　　　＋　
　　ｔｔすなわち、試料中のＰ３Ｇが２．５ＪＷ／ｍｊ
’を超えた場合、ブロッキング抗体が消費されそしてＰ
、Ｇの少なくとも一部分がブロックされないままのラテ
ックスにカップリングした。ラテックスビーズをフィル
ター上に収集した後、フィルター上のブロックされてい
ないＰ３Ｇラテックスは金のゾル粒子で標識された抗−
Ｐ、Ｇ抗体と反応することができ、そして収集されたラ
テックス−Ｐ３６−抗−Ｐ３Ｇ　−全免疫複合体が形成
された。フィルター上のこの収集された複合体視覚的に
観察可能なピンク色を呈した。他方、試料中のＰ３Ｇが
２．５ｆｆ／ｍｌ！以下の場合、ブロック抗体はすべて
のＰ３Ｇ−ラテックスをブロックするのに利用され、そ
して金でラベルされた抗体は分散体としてそして容易に
フィルターを流過する形で複合体を形成しないままであ
った。

ラテックス粒子の代りに同相としてガラス粒子を用いて
例３の前記の方法を反復し、そして本質的に同じ結果を
得た。

例４゜ 例１〜３の方法と実質的に同じ方法をエストロン−３−
グルクロニド（Ｅ１３Ｇ）の測定のために行った。これ
らの測定において、ハプテンを固体支持体に連結するた
めにゼラチンではなくウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　
（画分５）を用いた。ＢＳＡ連結法はεｒｌａｎｇｅｒ
等（前掲）に記載されている。得られた測定結果は例１
〜３において得られた結果と本質的に同一であった。

実際的環境において、本発明のＰ、Ｇ及び［Ｅ、３Ｇの
測定は将来の排卵を予測し、排卵を確認し、黄体機能を
評価し、妊娠可能期間の始め及び終りを検出して、胞状
期を評価しそして妊娠を診断することができる。測定は
一般に、朝の第−尿（ＦＬＵ）を用いて行われる。

排卵の間及び黄体期の間のＦＭＵ中のＰ３Ｇの増加を測
定Ｐ３Ｇ測定を用いることができ、そしてＰ３Ｇが約４
バ／−の閾値レベルより高く上昇した場合に陽性の色標
示をもたらすように調整することができる。色（４に／
−より高いＰ、Ｇ　レベルを示す）は黄体期を通して残
り、排卵過程の長さ及び適切さが示される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料中の第一免疫反応性物質の予め特定された
   量以上の存在を決定するためのイムノアッセイ法であっ
   て、 最初未知量の該第一免疫反応性物質を含有する液体試料
   を、（１）該第一物質に対して特異的に免疫反応性であ
   る第二免疫反応性物質の既知量及び（２）該第一免疫反
   応性物質の免疫反応特性と免疫反応特異的に同一な免疫
   反応特性を有する第三免疫反応性物質の一定量と混合す
   ることにより免疫化学的反応相を確立し； 前記第二物質の前記既知量は第一物質の前記予め特定さ
   れた量と第三免疫反応性物質の前記一定の量との合計と
   免疫化学的に当量であり、これにより、前記液体試料溶
   液中の前記第一免疫反応性物質の量が前記予め特定され
   た量を超える場合に、未反応の第三物質が前記反応相に
   おける更なる免疫特異的反応のために利用可能であり； こうして確立された反応相を、前記第二物質の免疫反応
   特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有する第四免
   疫反応性物質の一定量と接触せしめ、ここで該第四物質
   は検出可能な標識を有しており；そして 前記検出可能な標識を含有する特異的免疫反応生成物の
   存在を検出することにより前記試料中の第一物質の予め
   特定された量を超える量の最初の存在を決定する； 段階を含んで成る方法。 ２、前記第三物質が固体支持体に結合される、請求項１
   に記載の方法。 ３、前記固体支持体が分散性の粒状の収集可能な固体材
   料を含んで成り、そして前記決定が該収集可能な材料を
   収集しそして該収集可能な材料中の前記検出可能な標識
   の存在を検出する段階を含む、請求項２に記載の方法。 ４、前記収集が、前記収集可能な材料をフィルター要素
   上に捕捉することを含んで成る、請求項３に記載の方法
   。 ５、前記標識が金のゾル粒子を含んで成る、請求項４に
   記載の方法。 ６、前記固体支持体が透過性膜を含んで成り、前記確立
   された反応相を接触せしめる段階が前記第四物質を該膜
   を通して流過せしめる段階を含み、そして前記決定の段
   階が該膜上の前記標識の存在を検出する段階を含んで成
   る、請求項２に記載の方法。 ７、前記標識が金のゾル粒子を含んで成る、請求項６に
   記載の方法。 ８、前記標識が第一酵素性発色成分を含んで成り、前記
   第三物質に隣接する前記膜に結合する対応する第二酵素
   性発色成分が存在し、そして第四物質が該膜上の第三物
   質に免疫特異的に結合する場合はいつでも該第一酵素性
   成分と該第二酵素性成分との間の相互作用が該膜上での
   検出可能な色の生成を惹起する、請求項６に記載の方法
   。 ９、前記第一免疫反応性物質が療法的ウィンドウにより
   特徴付けられる療法剤である、請求項１に記載の方法。 １０、前記第一免疫反応性物質が乱用又は誤用の物質で
   ある、請求項１に記載の方法。 １１、前記第一免疫反応性物質が閾値レベルによって特
   徴付けられる、請求項１に記載の方法。 １２、液体試料溶液中の第一免疫反応性物質の予め特定
   された量以上の存在を決定するためのイムノアッセイ法
   であって、 最初未知量の該第一免疫反応性物質を含有する液体試料
   を用意し； 該試料に既知量の第二免疫反応性物質を添加することに
   より第一反応相を生成せしめ、該第二免疫反応性物質は
   前記第一免疫反応性物質に対して免疫特異的に反応性で
   あり； 前記第一反応相を第三免疫反応性物質と接触せしめるこ
   とにより第二反応相を生成せしめ、該第三免疫反応性物
   質は、前記第一物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一
   な免疫反応特性を有し；前記第二物質の前記既知量は、
   第一物質の前記予め特定された量と第三物質の前記の量
   との合計と免疫化学的に当量であり、これにより、前記
   試料溶液中の第一物質の量が前記予め特定された量より
   大である場合に、未反応の第三免疫反応性物質が前記第
   二反応相での更なる免疫特異的反応のために利用可能で
   あり； 前記第二反応相を或る量の標識された第四免疫反応性物
   質と接触せしめることにより検出相を生成せしめ、該第
   四免疫反応性物質は前記第二物質の免疫反応特性と免疫
   特異的に同一の免疫反応特性を有し、これによって、未
   反応の第三免疫反応性物質が前記第二反応相において免
   疫特異的反応のために利用可能な場合にはいつでも第三
   免疫反応性物質と第四免疫反応性物質との反応により前
   記検出相中に標識された免疫反応生成物が生成し；そし
   て 前記試料中の第一免疫反応性物質の前記予め特定された
   量を超える最初の存在を示すものとして、前記検出相中
   の標識された免疫反応生成物の存在を検出する； 段階を含んで成る方法。 １３、前記第三物質が固体支持体に結合される、請求項
   １２に記載の方法。 １４、前記固体支持体が分散性の収集可能な粒状担体材
   料を含んで成り、前記第四物質が金のゾル粒子標識によ
   り標識されており、そして前記検出段階が前記金のゾル
   標識により標識された免疫反応生成物をフィルター要素
   上に収集しそして該フィルター要素上の金のゾル粒子の
   集合により生ずる該要素の着色を観察する段階を含んで
   成る、請求項１３に記載の方法。 １５、前記第一物質及び第三物質がそれぞれハプテンで
   あり、そして前記第二物質及び第四物質がそれぞれ該ハ
   プテンに対して特異的に免疫反応性である抗−ハプテン
   抗体である、請求項１２に記載の方法。 １６、前記各ハプテンがプレグナンジオール−３−グル
   クロニドである、請求項１５に記載の方法。 １７、前記各ハプテンがエストロン−３−グルクロニド
   である、請求項１５に記載の方法。 １８、前記第一物質及び第二物質のそれぞれがハプテン
   であり、そして前記第二物質及び第四物質のそれぞれが
   該ハプテンに対して特異的な抗−ハプテン抗体である、
   請求項１４に記載の方法。 １９、前記各ハプテンがプレグナンジオール−３−グル
   クロニドである、請求項１８に記載の方法。 ２０、前記各ハプテンがエストロン−３−グルクロニド
   である、請求項１８に記載の方法。 ２１、前記第一免疫反応性物質が療法的ウィンドウによ
   り特徴付けられる療法剤である、請求項１２に記載の方
   法。 ２２、前記第一免疫反応性物質が乱用又は誤用の物質で
   ある、請求項１２に記載の方法。 ２３、前記第一免疫反応性物質が閾値レベルにより特徴
   付けられる、請求項１２に記載の方法。 ２４、前記第一免疫反応性物質が療法的ウィンドウによ
   り特徴付けられる療法剤である、請求項１４に記載の方
   法。 ２５、前記第一免疫反応性物質が乱用又は誤用の物質で
   ある、請求項１４に記載の方法。 ２６、前記第一免疫反応性物質が閾値レベルにより特徴
   付けられる、請求項１４に記載の方法。 ２７、液体試料中の第一免疫反応性物質の量を決定する
   ためのイムノアッセイ法であって、 最初未知量の該第一免疫反応性物質を含有する液体試料
   を用意し； 該試料を複数のアリコート部分に分割し； 前記第一免疫反応性物質に対して特異的に免疫反応性で
   ある第二免疫反応性物質のそれぞれの異る量を前記複数
   のアリコート部分に導入することにより複数の第一反応
   相を生成せしめ、これらの各々が前記第二物質のそれぞ
   れ異る既知量を含有しており； 前記各第一反応相を、前記第一免疫反応性物質の免疫反
   応特性と免疫特異的に同一な免疫反応特性を有する第三
   免疫反応性物質の一定量と接触せしめ、これにより複数
   の第二反応相を生成せしめ、これらの各々が同一量の前
   記第三物質及びそれぞれ異る量の前記第二物質を含有し
   ており； 前記各第二反応相中の前記第二物質のそれぞれの既知量
   が、第三物質の前記の量と第一物質の対応するそれぞれ
   の予め選択された量との合計と免疫化学的に当量である
   ように予め決定され、これにより、前記試料中の未知量
   がその前記のそれぞれ予め決定された量より少ないか又
   は同じである場合には対応する第二反応相における更な
   る免疫特異的反応のために利用できる未反応の第三物質
   が存在せず、そして前記試料中の前記第一物質の未知量
   がその前記のそれぞれ予め決定された量より多い場合に
   は未反応の第三物質が対応する第二反応相における更な
   る免疫特異的反応のために利用可能であり； 前記各第二反応相を、前記第二物質の免疫反応特性と免
   疫特異的に同一な免疫反応特性を有する標識された第四
   免疫反応性物質の一定量と接触せしめ、これにより前記
   第二反応相にそれぞれ対応する複数のそれぞれの検出相
   を生成せしめ、これにより、前記試料中の第一物質の量
   が前記対応するそれぞれの予め選択されたその量を超え
   る第二相に対応する各反応相において、未反応第三物質
   と標識された第四物質との間の特異的免疫反応により標
   識された免疫反応生成物が形成され；そして 前記試料中の第一物質の対応するそれぞれの予め選択さ
   れた量以上の最初の存在を示すものとして、各反応相中
   の標識された免疫反応生成物の存在又は不存在を検出す
   る； 段階を含んで成る方法。 ２８、前記第一免疫反応性物質が療法ウィンドウにより
   特徴付けられる療法剤である、請求項２７に記載の方法
   。 ２９、前記第一免疫反応性物質が乱用又は誤用の物質で
   ある、請求項２７に記載の方法。 ３０、前記第一免疫反応性物質が閾値レベルにより特徴
   付けられる、請求項２７に記載の方法。 ３１、液体試料中の第一免疫反応性物質の予め決定され
   た量以上の存在を検出するイムノアッセイ法を実施する
   ためのキットであって、 該第一物質に対して特異的に免疫反応性である第二免疫
   反応性物質の既知量； 前記第一免疫反応性物質の免疫反応特性と免疫特異的に
   同一な免疫反応特性を有する第三免疫反応性物質の既知
   量；及び 前記第二物質の免疫反応特性と免疫特異的に同一な免疫
   反応特性を有する、標識された第四免疫反応性物質の或
   る量； を含んで成るキット。 ３２、前記第三免疫反応性物質が固体支持体に結合して
   いる、請求項３１に記載のキット。 ３３、前記固体支持体が分散性の粒状の収集可能な固体
   材料を含んで成る、請求項３２に記載のキット。 ３４、前記第四免疫反応性物質が銀のゾル粒子標識を用
   いて標識されている、請求項３１に記載のキット。 ３５、前記試料中のハプテンの存在を検出するためのも
   のであり、前記第二免疫反応性物質及び前記第四免疫反
   応性物質が抗−ハプテン抗体を含んで成り、そして前記
   第三免疫反応性物質が該ハプテンである、請求項３１に
   記載のキット。 ３６、液体試料中のプレグナンジオール−３−グルクロ
   ニドの存在を検出するためのものであり、前記第三免疫
   反応性物質がプレグナンジオール−３−グルクロニドを
   含んで成り、そして前記第二免疫反応性物質及び第四免
   疫反応性物質がそれぞれ抗−プレグナンジオール−３−
   グルクロニド抗体を含んで成る、請求項３５に記載のキ
   ット。 ３７、液体試料中のエストロン−３−グルクロニドの存
   在を検出するためのものであり、前記第三免疫反応性物
   質がエストロン−３−グルクロニドを含んで成り、そし
   て前記第二免疫反応性物質及び第四免疫反応性物質が抗
   −エストロン−３−グルクロニド抗体を含んで成る、請
   求項３５に記載のキット。 ３８、既知量の前記試料を収容しそして存在する免疫反
   応性物質間の免疫反応を容易にするための容器手段を有
   する、請求項３１に記載のキット。 ３９、前記容器手段中で形成された免疫反応生成物を収
   集する手段を有する、請求項３８に記載のキット。 ４０、前記収集手段がフィルター要素を含んで成る、請
   求項３９に記載のキット。 ４１、療法剤の存在を検出するためのものであり、前記
   第二免疫反応性物質及び第四免疫反応性物質のそれぞれ
   が該薬剤に対する抗体を含んで成り、そして前記第三免
   疫反応性物質が前記薬剤を含んで成る、請求項３１に記
   載のキット。 ４２、乱用又は誤用の物質の存在を検出するためのもの
   であり、前記第二免疫反応性物質及び第四免疫反応性物
   質のそれぞれが該乱用又は誤用の物質に対する抗体を含
   んで成り、そして前記第三免疫反応性物質が該乱用又は
   誤用の物質を含んで成る、請求項３１に記載のキット。