JPH08503547A - 液中プロゲステロンの光学的測定のための迅速な免疫学的テスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ELISA原理に基く生物学的液体中のプロゲステロンの定量的/半定量的測定のための提案された方法は以下の段階を含んで成る。検査されるべき数滴の液体を採取し、それを水性サンプル希釈溶液により希釈し、この混合物を特異的抗体によりコートされた表面と接触させ、そしてプロゲステロン-酵素結合体溶液を添加し、これを好ましくは表面上に固定された抗体の未だ遊離の結合部分と反応させる。インキュベーション混合物及び非結合反応パートナーをその表面を洗浄することにより除去し、そして結合した酵素を呈色反応により検出する。顕色は検査されるべき液体のプロゲステロン含量の尺度である。本発明の方法は、受精及び懐妊の簡単且つ信頼性のある検出並びに家畜の妊娠の監視のための迅速なテストにおいて特に好適である。それにより、第一に、発情及び妊娠期間と低プロゲステロン濃度の中間期との間を区別し、そして従来技術の方法により一般的に行われる多くの偽りの診断及び解釈を広く避けることを非常な信頼性をもって可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 液中プロゲステロンの光学的測定のための迅速な免疫学的テスト 本発明は、請求項１に従うELISAの原理に基く液中のプロゲステロンの定量的 ／半定量的な測定方法に関する。本発明は、さらに本法を行うためのテスト・パ ックに関する。 黄体ホルモン（corpus luteum hormone）プロゲステロン（progesterone）の 測定は、獣医薬及び繁殖制御における動物飼養、例えば、月経状態、受精時、及 び初期妊娠のテストにおいて重要な役割を演じている。プロゲステロン測定によ り、黄体作用の存在又は非存在を測定することができ、そしてこれにより、様々 な哺乳動物種、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、バッ ファロー及びラクダにおける、卵巣サイクル、発情期（=妊娠の機会）、妊娠又 は繁殖失調の存在について結論を出すことができる。 プロゲステロンについての最初に使用可能な酵素イムノアッセイの開発のため に、特定のプロゲステロン・テストがいわゆる”ストール・テスト（Stall test ）”又は”ストール・パッセージ・テスト（stall paassage test）”として農 場において動物の所有者によってさえ行われることができるという目的をもって その取扱いを簡単にし、そしてその作用時間を短縮する試みが行われてきた。こ の目的のために、以下のテスト・キットが開発され、そしてその市場に置かれ又 は導入されてきた。 様々なテスト法がそれらについての期待を達成することができなかった場合で さえ、それらは、しかしながら、上記目的をもつプロゲステロンについての甚大 な必要性の存在を示している。これは、 従う新規の試験管テストにより注目された。これらは、上述の方法に比べて、部 分的な改良を担持しているが原理においての改良は全く担持していない。 しかしながら、本発明の発明者は、これらの公知の方法が、実施において決定 的である欠点により影響されることを発見した。公知 の方法においては、プロゲステロン含量におけるかなりの差異が、実際に光学的 に容易に差異を示されることができる。なぜなら、動物の生理学に関しては、そ れらは、例えば、中期及び妊娠期に比ベて発情期において生じるからである。” 中間レンジ（intermediaterange）”といわれる低及び中程度のプロゲステロン 濃度レンジにおける差異は、しかしながら、検出が困難であり又は全く検出する ことができない。公知の迅速なプロゲステロン・テストからの結論を引き出すこ のような限定された能力の結果として、それらの使用は、プロゲステロン・テス トが特に必要である場合において、すなわち、不明確な発情挙動、例えば、”静 発情（silent estrus）”、”近発情（near estrus）”、”中期卵胞（mid-cycl e follicle）”を呈し又は部分的に黄体形成したシストをもつ動物において、偽 結論の高いリスクをもって正確に影響される（Arnstadt，K.-I．and A．Sobiraj ，top agar 2.87（1987）R24-R26）。 従って、例えば、約２-６ng/mlのプロゲステロン中間レンジにおけるウシは、 乳サンプルのための迅速なテストとして知られている先のものを使用して黄体作 用の非存在状態（偽陰性結果）がしばしば間違って指定される。ウシにおいては 、これは、現実には既に終了しているか、他方においては、数日内に始まる”発 情の存在の徴候”を意味する。これは、その発情及び繁殖の偽りの終了をもたら し、又はこの手段により誤診断された繁殖失調における動物の非好適な処理を誘 発する（図１参照）。 不十分な精度の現在のテスト方法を使用して同様に得られる偽陽性結果は、首 尾よい繁殖を偽ることができる。動物飼育者又は獣医がこのような誤情報から導 き出すことができる論理学的結論は、問題を含み、そしてしばしば、その動物の 所有者にとっての経済的な欠点と関係する。 それ故、本発明は、”中間レンジ”、すなわち、低いが現存するプロゲルテロ ン濃度レベルを明確に示し、そしてそれにより、先に可能であったよりも再現性 事件についてより確かな結論を得る迅速なテストによるプロゲステロンの測定に おける目的に基く。 この目的は、液中のプロゲステロンの定量的/半定量的測定のためのELISA原理 に基く方法であって、 ａ）検査されるべき液の数滴を採取し、 ｂ）これらを、抗体によりコートされた表面に接触させ、 ｃ）この液を水性サンプル希釈溶液と混合し、 ｄ）プロゲステロン-酵素結合体溶液を添加し、これを好ましくは上記固定化 抗体の未だ遊離した結合性部位と反応させ、 ｅ）この溶液の混合物、すなわち、抗体により結合されていない物質を除去し 、 ｆ）結合酵素を呈色反応により検出し、そして得られた色の強度を使用して、 検査されるべき液のプロゲステロン含量を測定する、 ような方法により本発明に従って達成される。 段階ｂ）とｃ）を逆の順番で又は同時に行うこともできる。 好ましい態様に従って、乳及び血液中のプロゲステロン含量を測定する。 他の態様においては、膜を使用する。ここで、その反応は、抗体を使用して調 製された漏斗装置の濾過膜上で進行し、検査されるベき液（乳、血液血漿又は血 清及び試薬）を連続的に取り出す。 さらなる態様に従えば、サンプル希釈溶液は、１以上のバッファー塩を含む。 このプロゲステロンの測定は、そのサンプル希釈溶液がさらに乳化剤を含む場合 に特に信頼性をもって行われることができる。使用される乳化剤は、有利には、 洗剤又は他の（ステロイド）ホルモン又は脂質-仲介性添加物、例えば、Tween 2 0^R、タンパク 質、リポタンパク質、免疫グロブリン又はさらにゼラチンであることができる。 このような乳化剤のそのサンプル希釈溶液への添加は、とりわけ、検査されるべ き液中の親油性プロゲステロンがその表面に接着した抗体とより容易に且つ信頼 性をもって反応するという効果をもつ。 本発明に従って、ペルオキシダーゼが酵素としてプロゲステロン-酵素結合体 において使用される場合、公知の基質反応、例えば青色の着色を生じさせる３， ３’，５，５’-テトラメチルベンジジン（TMB）との反応を、使用することがで きる。 有利には、酵素の光学的検出を、ペルオキシダーゼ（HRP）の場合には、基質 、例えば、H₂O₂を既に含む基質バッファー溶液を使用して行い、そしてそれに、 色形成性の第二の基質を速い開始反応、すなわち、第二段階において添加する。 好ましい態様に従えば、本発明に係る方法を、ELISA試験管を使用して行うこ とができる。これは、抗体によりコートされるべき表面の担体としてその反応容 器がハンディーなサイズをもつという利点をもつ。 本発明に従ってテスト・パックを使用して行われることができる方法は、光学 的又は視覚的な迅速なテストを使用して従来ほとんど検出できなかった低プロゲ ステロン含量をもっての、前発情、発情、中期、妊娠及び特に近発情の中間レン ジについての速く且つ信頼性の高い定量的及び半定量的な結論を与える。それに より、後者は、そのまま認識されることができ、そしてその動物は、妊娠してお らず又は発情にもないという重要な結論を生み出す。 本発明に従えば、発情レンジは、公知のテスト・パックとくらベて中間レンジ からより良好に又は反対に描写され、そして誤った評価”黄体-不活性”は、弱 い場合にかなりの程度回避されるが、存 在するいずれかの割合において、発情前のサイクル終わりにおける又は排卵後の サイクルの開始における黄体活性が既に生じている。 さらなる利点は、それが乳を使用して行われる場合に乳脂肪含量に対する、又 はそれが高脂肪症血清を使用して行われなければならない場合にその脂質含量に 対する、その提案された迅速テストの低い依存性である。 公知テストと比較したさらなる利点は、その結果の高い再現性である。 標準サンプル”発情”そ使用して、そしてまた対照サンプル”妊娠”を使用し て行われる比較管により本テストにおいて得られる管（単数又は複数）の色を比 較することにより、その結果が明確な評価を許容する。 好ましい態様に従えば、本発明に係るテスト・パックは、それ故、さらに、 ｅ）標準サンプル”発情（ESTRUS）”（=プロゲステロン-不含標準）及び ｆ）その繁殖事件のプロゲステロン-優勢期の間の対照サンプル”黄体-活性” 又は”妊娠（PREGNANT）”（プロゲステロン-含有対照）、のためのそれぞれの 容器を含む。 テスト用途に依存して、保存剤、例えば、重クロム酸カリウム又はアジ化ナト リウムが添加されている乳、血液（血漿又は血清）又は唾液が、標準及び対照サ ンプルのベース（マトリックス）である。 さらなる態様に従えば、本テスト・パックは、公知のやり方で、多数の使い捨 てピペット及び管ラックを含み、これにより本テストを実施するための全ての支 援物が直ぐに取り扱えるように存在する。 試験管の内壁が、好ましくは抗体によりコートされた表面として使用される。 試験管の代わりに、他の反応容器を使用することもで きる。この目的のためには、例えば、マイクロタイター・プレート又はマイクロ タイター・ストリップの空隙（中空）の内壁あるいはプラスチック又は紙のステ ィック又はストリップの表面を使用することもできる。有利には、漏斗、流れ又 は吸引装置の透過膜をこのために使用することもできる。 サンプル希釈溶液ｂ）は、例えば、以下の物質：0.01〜0.3モル濃度における バッファー塩であって5.0〜8.5のpHを保証するもの； 量%の濃度レンジにおけるそれ自体又は互いの組み合わせにおけるゼラチン又は 他のもの、を含む。 プロゲステロン-酵素結合体溶液ｃ）は、それ自体公知であり、そして例えば 、0.01〜0.5ng/mlのプロゲステロン-ペルオキシダーゼ結合体を含む。 基質ｄ）は、例えば、基質バッファー溶液及び発色団溶液を含むことができる 。基質バッファー溶液は、従来技術に対応する。それは、例えば、0.1モルのク エン酸塩バッファー，pH 4.7及び0.01〜0.20モル%の過酸化水素を含む。この発 色団溶液も公知であり、そして好ましくは希塩酸又はクエン酸塩バッファー中に TMB（３，３’，５，５’-テトラーメチルベンジジン・ヒドロクロリド）を含む 。 図中、 図１は、サイクル及び妊娠の間のウシにおけるプロゲステロンの経過を示し、 一方 図２は、提案された迅速テストの結果を示す。 本発明に係るテスト・パックを使用して本迅速テストを行うとき、乳、血液又 は唾液サンプルの（例えば、ドロッピング・ピペットによる）測定量を、その試 験管内で所定量のバッファー溶液（”サンプル希釈剤”）により希釈する。この 前インキュベーションの間に、 そのサンプルの脂質構成成分が乳化し、それにより、測定されるベきプロゲステ ロンがより容易にアクセス可能になり、そして免疫原-（又は抗原-）抗体反応が 既に始まっている。本テスト混合物に滴下されたプロゲステロン-酵素結合体は 、その試験管上に固定化された抗体と、好ましくはプロゲステロンにより未だ占 有されていない結合性部位と第二反応段階においてのみ反応する。このテスト混 合物を注ぎ出し、そしてその管を洗浄した後、それによりそのテスト混合物が過 剰の非結合の結合体と共に除去され、基質溶液の添加の後に顕色が生じ、その強 度は、結合ホルモン-又はハプテン-（ここではプロゲステロン-）酵素結合体の 量に直接的に、そしてそのサンプルのプゲステロン含量に反比例して依存する。 この場合における酵素-ホルモン-酵素橋を介して管に結合した酵素は、公知のEL ISA原理に従って反応する。この発色の評価及び測定結果の解釈は、有利には、 所定の参照サンプル、プロゲステロン-不含標準サンプル（=発情）及びプロゲス テロン-含有対照サンプル（=妊娠）を使用して行うことができ、これらは、さら にその対応テスト混合物中でランする。所望により、さらなる参照サンプル”中 間値”を例えば、２：１の比で混合することによりこれらの参照サンプルから得 ることができ、これは、単離された場合にそのテストの解釈の安全性を増加させ ることができる。 本法が、例えば、視覚検査後に実験室装置（光度計）を使用して獣医により実 験室内で行われるとき、その酵素反応は、停止溶液、例えば、希硫酸を使用して 停止され、そしてその呈色が、例えば、定量的光度計的測定により記録される。 この手段により、テスト評価の精度がさらに増加される。この目的のために、本 発明に係るテスト・パックは、停止溶液を含むさらなる容器を含むことができる 。 前インキュベーションを伴う試験管内の希釈段階を導入すること により従来の迅速管テストと比較しての本発明に係る迅速テストに関連する追加 の努力は、全体として約３-５分間〜10-15分間程のテスト期間又はインキュベー ション時間を延長させる。純粋に競合的な迅速管及びマイクロタイター・プレー ト・テストと比べてこの欠点は、しかしながら、一般的により信頼性の高いテス ト精度及び特に本発明に係る迅速テストの援助により区別されることができるテ ストの結論”中間レンジ”の両方の利点と比べて、重要ではない。 実施例１-３ 乳プロゲステロン 本テストを、室温において、好ましくは18-25℃において行う。 １以上の乳サンプル（全乳又は残乳）を採取する。それぞれのテスト・ランにお いては、参照呈色が必要であるので、１以上の標準をさらに測定する。これらは 、標準乳ボトル”発情”及び対照乳”妊娠”から採られる。追加の対照”中間レ ンジ”を適宜、２部の標準”発情”及び１部の対照乳”妊娠”から混合する。 ３滴の標準又はサンプル乳（実施例２：５滴、実施例３：３滴）を特定管の低 セクションに添加する。５滴のサンプル希釈物（実施例２：３滴、実施例３：５ 滴）を管当たりに滴下する。これらの管を10秒間素早く混合し、そして３分間（ 実施例２及び３：５分間）放置する。３滴のプロゲステロン-酵素結合体（実施 例２：３滴、実施例３：２滴）を次に管毎に添加し、そしてそれらの管を10秒間 混合し、そして３分間放置する。これらの管の内容物を空にし、そしてその管を 冷水により５回濯ぐ。６〜10滴の基質バッファーを次にテスト・ランのすべての 管内に等重点高さまで添加する。酵素反応を１滴の発色団（実施例２：１滴、実 施例３：２滴）の添加により開始させる。３-５分間、そのサンプルの呈色を標 準及び対照と比較する。評価のために、 以下の間で区別を行う（図２参照）： １）強い呈色-プロゲステロン含量低 外部の発情徴候がさらに見られる場合に発情又は近発情を表 すことができる。明確な結論：ウシは妊娠していない。 ２）中程度の呈色-中間レンジ内のプロゲステロン値 近発情を表すことができる。この場合においては、ウシは、 発情の２〜３日前又は３〜４日後である。明確な結論：ウシ は発情にはなく、又は妊娠もしていない。 ３）弱い呈色-プロゲステロン含量高 妊娠、例えば、繁殖の19-23日後、又はそのウシがそのサイ クル内にあることを表すことができる。明確な結論：ウシは 発情にはない。 実施例４及び５ 血液サンプルのための迅速テスト 血液サンプルのために使用するサンプル材料は、血漿、血清又は非遠心分離全 血であることができる。本テストを、室温、好ましくは18-25℃において行う。 ５滴の全血（血清、血漿又は全血）をそれぞれの管に添加する。３滴のサンプル 希釈物を添加する。これらの管を10秒間振とうし、そして３分間放置する。それ らを空にし、そして冷水道水により５回洗浄し、そして遠心分離する。（非遠心 分離血液：７〜８回洗浄する。）６〜10滴の基質バッファーを管に添加する。次 に反応を１又は２滴の発色団使用してそれぞれ素早く開始させる。約３-５分間 、サンプルの呈色を標準及び対照と比較して評価する。評価を実施例１-３と同 様に行う。 実施例６及び７ マイクロタイター・プレート及びストリップ上の迅速テスト 使用するサンプル材料は乳（実施例６）及び血液サンプル（実施例 ７）である。本テストを以下のように実施例１-５と同様に行う。１滴の乳（実 施例７：２滴の血液）を空隙当たりにピペットで添加し、１滴の希釈剤を添加し 、そしてそれを10秒間激しく混合し、そして５分間室温においてインキュベート する。２滴のプロゲステロン-酵素結合体を添加した後、マイクロタイター・プ レート又はストリップを３-５分間インキュベートし、空隙を洗浄し、そして結 合した酵素活性を４滴の基質バッファー及び１滴の発色団を使用して検出する。 評価を実施例１-３と同様に行う。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ELISA原理に基く乳（全乳）又は血液中のプロゲステロンの定量的／半定 量的測定のための迅速な試験法であって、 ａ）検査されるべき数滴の上記液を採取し、 ｂ）これらを、特異的抗体によりコートされた表面に接触させ、 ｃ）この液を水性サンプル希釈溶液と混合し、 ｄ）プロゲステロン-酵素結合体溶液を添加し、これを好ましくは上記固定化 抗体の未だ遊離した結合性部位と反応させ、 ｅ）この溶液の混合物、すなわち、上記抗体により結合されていない物質を除 去し、 ｆ）その結合酵素を呈色反応により検出し、そして得られた色の視覚的に評価 された強度を使用して、検査されるべき上記液のプロゲステロン含量を測定する 、 段階ｂ）とｃ）を逆の順番で又は同時に行うこともできる、 を特徴とする試験法。 ２．サンプル希釈溶液が、１以上のバッファー塩を含む、請求項１に記載の迅 速な試験法。 ３．サンプル希釈溶液が乳化剤を含む、請求項２に記載の迅速な試験法。 ４．使用される乳化剤が、洗剤又は他のホルモン-仲介性添加物、例えば、Twe en 20（商標）、リポタンパク質、免疫グロブリン、タンパク質又はゼラチンで ある、請求項３に記載の迅速な試験法。 ５．使用されるプロゲステロン-酵素結合体がプロゲステロン-ペルオキシダー ゼ結合体である請求項１〜４の中の１項に記載の迅速な試験法。 ６．既に基質を含んでいる基質バッファー溶液を、酵素の光学的 検出のために使用し、そしてこれに、発色団溶液を第二基質として添加する、請 求項５に記載の迅速な試験法。 ７．使用される抗体によりコートされた表面が試験管の内壁である、請求項１ 〜６の中の１項に記載の迅速な試験法。 ８．ELISA原理に基く液中のプロゲステロンの定量的/ 半定量的な迅速な試験 法のためのテスト・パックであって、 ａ）抗-プロゲステロン抗体又は抗-プロゲステロンIgGによりコートされた表 面をもつ容器、並びに ｂ）サンプル希釈溶液、及び ｃ）プロゲステロン-酵素結合体溶液、及びまた ｄ）呈色反応による酵素の光学的検出のための少なくとも１の基質又は基質混 合物、 のそれぞれのための少なくとも１の容器、 を含むテスト・パック。 ９．検出されるべき化合物の既知含量をもつ１以上の標準又は対照、例えば、 ｅ）プロゲステロン-不含又はプロゲステロン-不含に近い標準サンプル； ｆ）プロゲステロン-含有対照サンプル、 を含んで成る、請求項８に記載のテスト・パック。 １０．呈色反応を終了させ、そしてその色を固定するための停止溶液を含んで 成る、請求項８及び/又は９に記載のテスト・パック。