DE202008003273U1

DE202008003273U1 - Testkit zum immunologischen Ermitteln des Progesterongehalts einer Probe und Vorrichtung hierfür

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Publication number: DE202008003273U1
Application number: DE202008003273U
Authority: DE
Original assignee: SENSION GmbH; FRIMTEC GmbH
Current assignee: SENSION GmbH; FRIMTEC GmbH
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2018-01-31

Abstract

Testkit zum immunologischen Ermitteln des Progesterongehalts von zu untersuchenden Proben (6), insbesondere geeignet zur Verwendung mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei das Testkit aufweist:
zumindest eine Testplatte mit einer Vielzahl von Behältern (2), insbesondere membranfreien Behältern, zur Aufnahme von zu untersuchenden Proben (6), wobei die Innenflächen der Vielzahl der Behälter (2) zumindest teilweise mit Progesteron-Antikörpern (4) beschichtet sind,
zumindest ein Progesteron-Enzym-Konjugat,
zumindest ein präzipitierendes Enzymsubstrat (10), und
zumindest eine Standardlösung mit bekanntem Progesterongehalt.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Testkit und eine Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehaltes, insbesondere des Progesterongehaltes, einer oder einer Vielzahl von zu untersuchenden Proben.
Die Bestimmung von Progesteron in Milch, Vollblut oder Serum spielt in der Landwirtschaft und Tierzucht, insbesondere im Rahmen des Reproduktionsmanagements, eine bedeutende Rolle, um den optimalen Zeitpunkt einer Besamung verlässlich ermitteln zu können. Da eine erfolgreiche Besamung nur in einem recht kurzen Zeitfenster erfolgen kann, sind rasche und unkomplizierte Messungen vor Ort erforderlich.
DE 197 05 163 C1 und EP 0 671 006 B1 beschreiben verschiedene Kits für ELISA Schnelltests. Des Weiteren beschreibt die DE 101 19 696 B4 eine Dosiervorrichtung und ein Dosierverfahren, wie sie auch teilweise bei der Erfindung zum Einsatz kommen können.
Es ist Aufgabe der Erfindung ein leicht handzuhabendes Testkit und eine ebensolche Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehaltes, insbesondere des Progesterongehaltes, von zu untersuchenden Proben bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruchs 1, 9 bzw. 11 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Im Rahmen der Erfindung ist auch ein immunologisches Verfahren zum Ermitteln des Progesterongehalts von zu untersuchenden Proben vorgesehen. Dabei wird in einem ersten Schritt zumindest ein Behälter vorgesehen, dessen Innenfläche zumindest teilweise mit Progesteron-Antikörpern beschichtet ist. Dem zumindest einen Behälter werden eine zu untersuchende Probe und ein Progesteron-Enzym-Konjugat zugegeben. Das Progesteron der zu untersuchenden Probe und das Enzym-markierte Progesteron-Konjugat konkurrieren um die Bindungsstellen der Progesteron-Antikörper an der Innenfläche des zumindest einen Behälters. Nach einer vorbestimmten Einwirkzeit wird das Gemisch aus Probe und Progesteron-Enzym-Konjugat aus dem zumindest einen Behälter entfernt bzw. der Behälter wird geleert. Die Bindungsstellen der Progesteron-Antikörper sind nun entweder mit dem Progesteron der Probe oder mit dem Enzymmarkierten Progesteron-Konjugat besetzt. In einem weiteren Schritt wird ein präzipitierendes Enzymsubstrat bzw. eine präzipitierende Enzymsubstratlösung in den zumindest einen Behälter gegeben. Das Enzymsubstrat reagiert mit dem Enzym des Progesteron-Konjugats und es entsteht ein Präzipitat bzw. es findet eine Ausfällung statt. In einem weiteren Schritt wird der Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe der Innenfläche des zumindest einen Behälters erfasst, der oder die sich aufgrund des entstehenden bzw. entstandenen Präzipitats verändert.
Vorzugsweise weist das präzipitierende Enzymsubstrat ein präzipitierendes Chromogen auf. Aufgrund der Reaktion des präzipitierenden Enzymsubstrats mit dem Enzym des Progesteron-Enzym-Konjugats bzw. aufgrund des dabei entstehenden (chromogenen) Präzipitats wird der Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe im Inneren des zumindest einen Behälters verändert und ist daher ein Maß für den Progesterongehalt der untersuchten Probe. Da im erfindungsgemäßen Verfahren das Progesteron der zu untersuchenden Probe und das Enzym-markierte Progesteron des Konjugats um die Bindungsstellen der Progesteron-Antikörper-Beschichtung konkurrieren, entspricht ein hoher erfasster Wert, beispielsweise ein hoher Farbsättigungswert, des Behälters einem niedrigen Progesterongehalt der untersuchten Probe. Umgekehrt entspricht ein niedriger erfasster Wert, beispielsweise eine niedrige Farbsättigung bzw. ein hoher Weißwert bei Verwendung eines weißen Behälters, einem hohen Progesterongehalt der untersuchten Probe.
Vorzugsweise wird der erfasste Wert in einen Wert für den Progesterongehalt der zu untersuchenden Probe umgewandelt oder umgerechnet. Das heißt, dass beispielsweise die erfasste Graustufe in einen spezifischen Wert eines Progesterongehalts bzw. einer Progesteronkonzentration der Probe umgerechnet wird.
Bevorzugt wird zur Umwandlung oder Umrechnung ein chargenabhängiger Kalibrierungswert berücksichtigt. Dabei bedeutet Charge bzw. Lot oder Los, dass die verwendeten Reagenzien einer Charge die gleichen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise weil sie jeweils in einem zusammenhängenden Produktionsprozeß hergestellt wurden. D. h. eine Messung einer Probe mittels Reagenzien einer Charge erzeugt (bei gleichen äußeren Bedingungen) immer das gleiche Meßergebnis. Demnach kann mittels einer einzigen Kalibrierungsmessung ein Kalibrierungswert für eine gesamte Charge bestimmt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann demnach mittels des chargenabhängigen Kalibrierungswerts die Reaktivität bzw. Aktivität der verschiedenen Reagenzien einer Charge, beispielsweise der Antikörper-Beschichtung und des Konjugats, bei der Umrechnung des erfassten Werts in einen Wert für den Progesterongehalt berücksichtigt werden.
Vorzugsweise erfolgt das Erfassen nach und zusätzlich oder alternative während der Reaktion des präzipitierenden Enzymsubstrats bzw. des präzipitierenden Chromogens mit dem Enzym des Progesteron-Konjugats. Vorzugsweise wird beispielsweise der Grauwert im Behälter kontinuierlich, zeitweise und/oder punktuell während der Reaktion erfasst. Auf diese Weise kann beispielsweise der Verlauf der Änderung des erfassten Werts, z. B. des Grauwerts, während der Reaktion erfasst werden. Beispielsweise um einen geeigneten Zeitpunkt für einen Abbruch der Reaktion oder den optimalen Messzeitpunkt zu bestimmen.
Besonders bevorzugt wird vor Zugabe einer zu untersuchenden Probe in dem zumindest einen Behälter der Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe der Innenfläche als Nullpunktmessung erfasst. Ein ermittelter Nullpunkt kann dann zur Kalibrierung des erfassten Werts dienen. Insbesondere wird der Wert einer Nullpunktmessung für einen Behälter von dem erfassten Wert für diesen Behälter abgezogen bzw. die Differenz gebildet. Durch diese Kalibrierung bzw. Nullpunktmessung wird eine Verfälschung des Meßergebnisses bzw. des erfassten Werts für den Behälter verhindert, beispielsweise werden dadurch Verunreinigungen im Behälter vor Zugabe der Probe oder Farbschwankungen des Materials des Behälters berücksichtigt.
Vorzugsweise ist mittels zumindest eines zweiten Behälters eine Standardmessung mit einer Standardlösung mit bekanntem Progesterongehalt vorgesehen. Alternativ sind zumindest zwei Behälter vorgesehen, die mit unterschiedlichen Standards befüllt werden. Diese Standardmessungen dienen zur Funktionskontrolle der Progesteron-Antikörper-Beschichtung und der verwendeten Reagenzien bzw. des ordnungsgemäßen Ablaufs des Tests überhaupt. Das heißt, dass auf diese Weise eine Funktionsunfähigkeit bzw. eingeschränkte Funktionsfähigkeit des Verfahrens beispielsweise aufgrund der Alterung der Reagenzien berücksichtigt wird. Alternativ oder zusätzlich erfasst die Standardmessung den Einfluss externer Variablen auf die Ermittlung des Progesterongehalts, beispielsweise den Einfluss der äußeren Temperatur oder Luftfeuchtigkeit auf die Ermittlung.
Vorzugsweise ist die Standardlösung oder einer der Standards ein Nullstandard, d. h. die Lösung ist frei von Progesteron. Alternativ ist ein vorgegebener Progesterongehalt ungleich null. Bei Verwendung eines Nullstandards ergibt sich im erfindungsgemäßen kompetitiven Verfahren ein maximaler erfasster Wert, beispielsweise ein maximaler Grauwert bzw. ein minimaler Weißwert. Ergibt die Standardmessung keinen maximalen Grauwert bzw. keine Änderung des Grauwerts im Behälter, so ist eine der Reagenzien oder die Beschichtung nicht funktionsfähig oder ein Anwendungsfehler liegt vor, beispielsweise wurde ein Reagenz nicht zugegeben. Zusätzlich kann durch den erfassten, maximalen Wert der Standardmessung ein erfasster Wert einer untersuchten Probe kalibriert werden. Beispielsweise kann der durch den Nullstandard erzeugte maximale Wert zum Festlegen eines maximal erzeugbaren Meßwerts mit den verwendeten Reagenzien unter den vorliegenden äußeren Bedingungen (z. B. Umgebungstemperatur, Luftfeuchte) verwendet werden.
Vorzugsweise ist die vorbestimmte Einwirkzeit der Standardlösung und des Konjugats oder der zu untersuchenden Probe und des Konjugats weniger als 10 Minuten oder weniger als 8 Minuten. Besonders bevorzugt beträgt die vorbestimmte Einwirkzeit mindestens 10 Sekunden.
Besonders bevorzugt ist ein Mengenverhältnis zwischen der zugegebenen Probe und dem zugegebenen Progesteron-Enzym-Konjugat kleiner gleich eins. Besonders bevorzugt ist das Verhältnis kleiner gleich 1:2, bevorzugt 1:3 und mindestens 1:10. Beispielsweise kann ein Tropfen einer Probe und drei Tropfen eines Konjugats zugegeben werden. Insbesondere wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Probe nicht verdünnt und wird ohne Vorbehandlung zugegeben.
Vorzugsweise werden die zu untersuchende Probe und das Progesteron-Enzym-Konjugat gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig, vorgemischt oder nacheinander zugegeben. Das Verfahren bietet so eine flexible Zugabe einer Probe und des Konjugats.
Besonders bevorzugt ist nach Entfernen einer Standardlösung und des Konjugats oder einer Probe und des Konjugats aus einem Behälter ein Waschschritt mit einer Waschlösung, insbesondere einer Waschpufferlösung, vorgesehen. Auf diese Weise werden ungebundene Reagenzien aus dem Behälter bzw. von der Innenfläche des Behälters entfernt und es liegt im Behälter im Wesentlichen nur noch das an die Beschichtung gebundene Progesteron vor.
Besonders bevorzugt wird die präzipitierende
Enzymsubstratlösung/Chromogenmischung bzw. das überschüssige Substrat nach einer vorbestimmten Einwirkzeit aus dem zumindest einen Behälter entfernt, wobei ein entstandenes Präzipitat zumindest teilweise im Behälter verbleibt. Insbesondere lagert sich das Präzipitat zumindest teilweise an den Innenflächen des Behälters an und ergibt beispielsweise eine Farbänderung der Innenfläche des Behälters, die auf die zuvor beschriebene Weise als Maß für den Progesterongehalt der untersuchten Probe dient.
Durch das Entfernen des Enzymsubstrates wird die Reaktion des Substrates mit dem gebundenen Enzym-markierten Progesteron des Konjugats beendet.
Vorzugsweise ist die vorbestimmte Einwirkzeit des präzipitierenden Enzymsubstrates weniger als 5 Minuten oder weniger als 3 Minuten, besonders bevorzugt mindestens 10 Sekunden. Aufgrund der kurzen Einwirkzeiten für Probe, Konjugat bzw. Enzymsubstrat bietet das erfindungsgemäße Verfahren einen schnellen Test zum Ermitteln des Progesterongehalts einer Probe.
Besonders bevorzugt wird vor dem Vorsehen der Progesteron-Antikörper-Beschichtung des zumindest einen Behälters der Behälter zumindest teilweise mit zumindest einem weiteren Antikörper beschichtet. Die weiteren Antikörper ordnen sich auf der Innenfläche des Behälters in beliebiger Orientierung an, d. h. zumindest ein Teil ordnet sich auf eine Weise an, so dass die Bindungsstellen dieser weiteren Antikörper in das Innere des Behälters weisen. Bei Vorsehen der Progesteron-Antikörper-Beschichtung lagern sich nun die Progesteron-Antikörper nur an diejenigen der weiteren Antikörper an, deren Bindungsstellen in das freie Volumen des Behälters zeigen. Eine optimale Ausrichtung der Progesteron-Antikörper, d. h. ihrer Bindungsstellen weisen in das Innere des Behälters, wird somit gewährleistet. Nahezu alle Progesteron-Antikörper der Beschichtung bieten auf diese Weise Bindungsstellen für das Progesteron einer zugegebenen Probe bzw. das Enzym-markierte Progesteron eines zugegebenen Konjugats.
Besonders bevorzugt ist die zu untersuchende Probe unbehandelt, insbesondere unverdünnt, vorzugsweise Rohmilch, Urin, Speichel, Vollblut, Blutserum oder Blutplasma.
Gemäß Anspruch 1 ist ein Testkit zum immunologischen Ermitteln des Progesterongehalts von zu untersuchenden Proben bereitgestellt. Das Testkit weist auf: zumindest eine Testplatte mit einer Vielzahl von Behältern, vorzugsweise membranfreien Behältern, zur Aufnahme von zu untersuchenden Proben, wobei die Innenflächen der Behälter zumindest teilweise mit Progesteron-Antikörpern beschichtet sind. Des Weiteren weist das Testkit zumindest ein Progesteron-Enzym-Konjugat, zumindest ein präzipitierendes Enzymsubstrat bzw. eine präzipitierende Enzymsubstratlösung und zumindest eine Standardlösung mit bekanntem Progesterongehalt auf.
Bevorzugt kann das Testkit auch ohne Standardlösung vorgesehen sein. Vorzugsweise weist das präzipitierende Enzymsubstrat ein präzipitierendes Chromogen auf. Weiter bevorzugt kann das Testkit für ein zuvor beschriebene Verfahren zum Ermitteln eines Progesterongehalts einer Probe verwendet werden.
Vorzugsweise wird zumindest einer der Vielzahl der Behälter des Testkits als Standard für eine Kontrollmessung verwendet, besonders bevorzugt nur einer der Behälter der Testplatte oder nur je ein Behälter eines Streifens der Testplatte. Beispielsweise ist der Standard ein Nullstandard und ergibt einen maximalen Messwert wie zuvor in Bezug auf das Verfahren beschrieben.
Vorzugsweise wird mittels des Standards die Funktionsfähigkeit des Testkits und zusätzlich oder alternativ der Einfluss externer Variablen, wie Temperatur oder Luftfeuchtigkeit, auf eine Messung bzw. auf eine Ermittlung erfasst.
Bevorzugt umfasst das Testkit einen Kalibrierungscode oder -wert oder eine Kalibrierungskurve zur chargenabhängigen Kalibrierung für eine Umwandlung oder Umrechnung des Farbtons, der Farbsättigung des Weißwerts und/oder der Graustufe in einem jeweiligen Wert des Progesterongehalts einer Probe. Das heißt, im Kalibrierungscode des Testkits ist beispielsweise die Reaktivität der in der Charge verwendeten Reagenzien (z. B. der Antikörper-Beschichtung) berücksichtigt und kann daher für eine Umrechnung eines erfassten Werts in den tatsächlichen Wert des Progesterongehalts herangezogen werden, d. h. je Charge, wobei eine Charge mehrere Testkits umfassen kann, wird werkseitig oder herstellerseitig nur eine Standardmessung durchgeführt, um einen Kalibrierungswert für alle Testkits der Charge zu ermitteln. Zusätzlich oder alternativ können werksseitig mehrere Standardmessungen einer Charge durchgeführt werden deren Mittelwert zum Ermitteln eines Kalibrierungswerts oder -codes für Testkits dieser Charge herangezogen wird. Vorzugsweise umfasst der Kalibrierungscode bzw. die Kalibrierungskurve eine Kalibrierung des gesamten Messbereichs des Testkits. Somit bietet das Testkit eine Kalibierung für jeden erfassten Wert einer untersuchten Probe.
Vorzugsweise ist das Behältermaterial transparent, zusätzlich oder alternativ einfarbig, insbesondere weiß. Beispielsweise bietet ein weißer Behälter eine gute Kontrastwirkung gegen ein Präzipitat, das bei der Reaktion des präzipitierenden Enzymsubstrats bzw. des präzipitierenden Chromogens mit dem Enzym-markierten Progesteron des Konjugats entsteht.
Bevorzugt weist das Testkit eine Waschlösung, insbesondere eine Waschpufferlösung, auf, um beispielsweise nach Entfernen einer Probe Konjugatmischungen und überschüssiges Material aus der Vielzahl von Behältern auszuwaschen, so dass im Wesentlichen in den Behältern die Antikörper-Beschichtung und daran gebundenes Progesteron einer Probe oder des Konjugats in einem spezifischen Verhältnis zueinander zurückbleibt.
Besonders bevorzugt ist die Platte eine Mikrotiterplatte, insbesondere eine Testplatte mit einer Vielzahl von Mikrotiterplatten-Strips oder individueller Kavitäten.
Bezüglich einzelner Merkmale und/oder Merkmalskombinationen der nachfolgend beschriebenen Vorrichtung(en) wird auf die Deutsche Patentschrift DE 101 19 696 B4 voll inhaltlich verwiesen. Die nachfolgende Vorrichtung ist eine Weiterentwicklung der Vorrichtung dieser Patentschrift. Eine, mehrere oder alle Einzelmerkmale der DE 101 19 696 B4 können bei der hier beschriebenen und beanspruchten Vorrichtung zum Einsatz kommen.
Gemäß Anspruch 9 ist eine Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehalts, insbesondere des Progesterongehalts, einer zu untersuchenden Probe bereitgestellt. Die Vorrichtung weist eine Aufnahme für zumindest einen Behälter, insbesondere für zumindest einen Reaktionsbehälter, auf. Des Weiteren zumindest eine Dosiereinheit zur Abgabe einer vorbestimmten Menge von Reagenzien, zusätzlich oder alternativ von zu untersuchenden Proben in den zumindest einen Behälter. Weiterhin weist die Vorrichtung zumindest eine Absaugeinheit zum Entfernen, insbesondere zum Absaugen von Reagenzien und/oder zu untersuchenden oder untersuchten Proben aus dem zumindest einem Behälter auf. Zusätzlich weist die Vorrichtung zumindest einen Sensor zum Erzeugen zumindest eines Sensorsignals als Maß für einen Farbton, eine Farbsättigung, einen Weißwert und/oder eine Graustufe der Innenfläche des zumindest einen Behälters auf.
Vorzugsweise ist die Vorrichtung geeignet zur Verwendung mit einem wie zuvor beschriebenen Testkit, und zusätzlich oder alternativ geeignet zur Verwendung eines wie zuvor beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung des Progesterongehalts einer Probe.
Vorzugsweise weist die Vorrichtung eine Steuer-Auswerte-Einheit auf, die vorzugsweise eine Eingabeeinrichtung zur Eingabe zumindest eines individuellen Kalibrierungscodes oder -werts und/oder einer individuellen Kalibrierungskurve aufweist. Dabei ist mittels der Steuer-Auswert-Einheit unter Verwendung der eingegebenen Kalibrierungswerte, aus dem zumindest einen erfassten Sensorsignal einen Wert eines Substanzgehalts generierbar oder berechenbar. Generierbar bedeutet in diesem Zusammenhang z. B. das Umwandeln eines erfassten Sensorsignals, beispielsweise eines Grauwerts, in einen tatsächlichen Wert eines Substanzgehalts bzw. einer Substanzkonzentration einer untersuchten Probe.
Gemäß Anspruch 11 ist eine Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehalts zumindest einer zu untersuchenden Probe vorgesehen, die eine wie zuvor beschriebene Aufnahme, Steuer-Auswerte-Einheit mit einer Eingabeeinrichtung, Dosiereinheit und Sensor aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Vorrichtung, weist sie zumindest eine Absaugeinheit zum Entfernen von Reagenzien zu untersuchender Proben oder untersuchter Proben aus dem zumindest einem Behälter auf.
Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist ein Absaugelement, insbesondere ein Absaugrüssel, an der Dosiereinheit angeordnet. Mittels des Absaugelements kann eine in dem zumindest einen Behälter vorliegende Lösung bzw. Probe oder Reagenz abgesaugt werden, vorzugsweise in einen Abfallbehälter. Vorzugsweise ist die Absaugeinheit mit einer Antriebseinheit verbunden oder an dieser angeordnet, mit der die Absaugeinheit unter der Steuerung der Steuer-/Auswerteeinheit in einen Probenbehälter einfahrbar ist, beispielsweise durch Absenken der Dosiereinheit und/oder der Absaugeinheit.
Vorzugsweise ist mittels der Eingabeeinheit ein chargenabhängiger Kalibrierungscode oder -wert eingebbar, insbesondere ein Kalibrierungscode, wie zuvor in Zusammenhang mit dem Testkit beschrieben.
Vorzugsweise ist mittels des zumindest einen Sensors vor Zugabe einer zu untersuchenden Probe das zumindest eine Sensorsignal der Innenfläche als Nullpunktmessung der Innenfläche des Behälters erfassbar, wobei mittels der Auswerte-Steuer-Einheit die Nullpunktmessung zum Kalibrieren des erfassten, zumindest einen Sensorsignals des Behälters berücksichtigbar ist, insbesondere auf die zuvor in Bezug auf Verfahren und Testkit beschriebene Weise.
Vorzugsweise sind mittels der Aufnahme zumindest zwei Behälter aufnehmbar, wobei einer der Behälter ein Standardbehälter für eine Standardmessung ist, und mindestens einer der Behälter ein Probenbehälter ist. Mittels der Steuer-Auswerte-Einheit ist der Wert zumindest einer Standardmessung, insbesondere nur einer einzigen Standardmessung mit zumindest einer Standardlösung mit bekanntem Substanzgehalt zum Kalibrieren berücksichtigbar, vorzugsweise zur Funktionskontrolle verwendeter Reagenzien oder zum Berücksichtigen externen Variablen auf die Ermittlung des Substanzgehalts mittels der Vorrichtung.
Besonders bevorzugt ist mittels des zumindest einen Sensors das zumindest eine Sensorsignal nach, und zusätzlich oder alternativ während, der Reaktion erfassbar, insbesondere kontinuierlich, zeitweise und/oder punktuell während der Reaktion erfassbar. Mittels des kontinuierlichen Erfassens des Sensorsignals kann ein zeitlicher Verlauf einer Reaktion in dem zumindest einen Behälter erfasst werden.
Vorzugsweise ist der zumindest eine Sensor ein Kontrastsensor, insbesondere ein Weißlicht-Kontrastsensor, mit dem vorzugsweise bis zu 1000 Graustufen messbar sind. Alternativ ist der zumindest eine Sensor ein Photometer, der mittels einer Durchlichtmessung durch den Behälter beispielsweise eine Farbänderung erfasst. In diesem Fall ist die Verwendung von transparenten Behältern bevorzugt.
Bevorzugt weist die Vorrichtung einen Temperatursensor zum Detektieren der Umgebungstemperatur auf. Beispielsweise kann bei Detektion einer zu hohen bzw. zu niedrigen Temperatur für eine gewünschte Reaktion ein Ermittlungsvorgang der Vorrichtung abgebrochen werden, da ansonsten eventuell verfälschte bzw. unbrauchbare Messwerte ermittelt werden.
Besonders bevorzugt weist die Vorrichtung zumindest eine Heizeinheit auf, mittels derer die Aufnahme für den zumindest einen Behälter und/oder die zumindest zwei Behälter temperierbar ist. Mittels der Heizeinheit kann ein optimaler Temperaturbereich für eine in den Behältern ablaufende Reaktion erzeugt werden. Alternativ oder zusätzlich weist die Vorrichtung eine Kühleinheit auf, um bei zu hohen Umgebungstemperaturen ebenfalls eine optimale Temperatur für eine Reaktion in den Behältern zu erzeugen.
Anhand von Figuren werden Ausführungsbeispiele der Erfindung erläutert. Es zeigen:
1A einen Progesteron-Antikörper beschichteten Behälter im Querschnitt,
1B–1F einzelne Verfahrensschritte des Nachweisverfahrens,
2 eine Vorrichtung im Teilschnitt zum Bestimmen eines Substanzgehaltes einer Probe (vgl. DE 101 19 696 B4 ), und
2A ein Blockschaltbild der Grundeinheiten der Dosiervorrichtung.
Die 1A bis 1F zeigen Schritte des Verfahrens zum Bestimmen des Progesterongehaltes von zu untersuchenden Proben, beispielsweise von Milch. Das Verfahren kann bei einem erfindungsgemäßen Testkit (nicht dargestellt) und bei der Vorrichtung (2) zum Einsatz kommen.
1A zeigt einen Behälter 2 im Querschnitt, beispielsweise die Vertiefung einer Mikrotiterplatte oder eines Mikrotiterplatten-Strips, der mit Progesteron-Antikörpern 4 beschichtet ist. Vorzugsweise wird vor dem Vorsehen der Progesteron-Antikörper-Beschichtung auf der Innenfläche des Behälters 2 ein weiterer Antikörper (nicht dargestellt) auf die Innenfläche des Behälters 2 aufgebracht. Da die nachfolgend aufgebrachten Progesteron-Antikörper 4 sich nur an freie (ins Innere des Behälters 2 weisende) Bindungsstellen des weiteren, zuerst aufgebrachten Antikörpers binden, ist gewährleistet, dass sich während des Beschichtens nahezu alle dem Behälter zugegebenen Progesteron-Antikörper 4 so anordnen, dass ihre Bindungsstellen ins Innere des Behälters weisen. Bei der Herstellung der Progesteron-Antikörper 4 Beschichtung wird auf diese Weise die Schwankungsbreite der bereitgestellten Bindungsstellen der Beschichtung erniedrigt bzw. die Reproduzierbarkeit eines Tests erhöht.
1B zeigt den Behälter von 1A nach Zugabe von Rohmilch 6, die eine bestimmte Menge an Progesteron P enthält.
1C zeigt ein Gemisch aus der bereits zugegebenen Rohmilch 6 und zusätzlich zugegebenem Progesteron-Enzym-Konjugat 7 im Behälter 2, wobei das Enzymmarkierte Progesteron des Konjugats mit P* gekennzeichnet ist. Bevorzugt ist ein Mengenverhältnis zwischen Milch 6 und Konjugat 1:3. Beispielsweise wird ein Tropfen Milch 6 in den Behälter 2 gegeben und drei Tropfen des Konjugats 7. Das Progesteron P der Milch 6 und das Enzym-markierte Progesteron P* des Konjugats konkurrieren um Bindungsstellen der Progesteron-Antikörper 4 an der Innenfläche des Behälters 2.
Nach einer vorbestimmten Einwirkzeit bzw. Inkubation des Milch-Konjugat-Gemisches in dem Behälter 2 wird dieses Gemisch aus dem Behälter 2 entfernt.
In 1D ist ein Waschschritt dargestellt, bei dem mittels einer Waschlösung 8 ungebundene Reagenzien, d. h. Milch 6 und Konjugat 7, ausgewaschen werden. Wie in 1D gezeigt, liegt nach dem Waschschritt nur noch das gebundene Progesteron P der Milch bzw. das Enzym-markierte Progesteron P* des Konjugats an den Antikörpern 4 gebunden vor. Das Verhältnis des "Milchprogesterons" P und Enzym-markierten Progesterons P*, die an die Progesteron-Antikörper-Beschichtung gebunden sind, entspricht dem ursprünglichen Konzentrationsverhältnis des Progesterons der Milch 6 zum Konjugat, wobei die Progesteron-Konzentration des Konjugats bekannt ist. Auf diese Weise kann aus dem Verhältnis des gebundenen Milch-Progesterons P zu Progesteron P* des Konjugats auf den ursprünglichen Progesterongehalt P der Probe geschlossen werden, bzw. bildet Maß hierfür.
Nach Entfernen der Waschlösung 8 wird dem Behälter in 1E eine präzipitierende Enzymsubstratlösung 10 mit präzipitierendem Chromogen zugegeben. Der zunächst farblose Bestandteil C bzw. das Chromogen der Enzymsubstratlösung 10 wird durch das Enzym des Enzym-markierten Progesterons P* des Konjugats in einen präzipitierenden, farbigen Bestandteil C⁺ umgewandelt. Das Enzym katalysiert die Reaktion. Diese farbigen Bestandteile C⁺ bilden ein Präzipitat 12, d. h. sie werden ausgefällt oder abgeschieden und sind nicht löslich. Die Menge des erzeugten Präzipitats 12 ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Progesterons P bzw. dem Progesterongehalt der Milch. Das heißt, bei Zugabe eines Nullstandards (Progesteron-frei) anstelle von Milch wird ein maximaler Wert bzw. eine maximale Menge an Präzipitat 12 erzeugt. Die Menge des erzeugten Präzipitats 12 ist demnach ein Maß für die ursprüngliche Konzentration des Progesterons P in der Milch 6. Beispielsweise kann durch Erfassen der Änderung des Weißwerts oder der Grauwerts oder -stufe im Inneren des Behälters auf die ursprüngliche Progesteron-Konzentration der Milch 6 geschlossen werden.
Bevorzugt wird die Reaktion der präzipitierenden Enzymsubstratlösung 10 mit dem Enzym des Progesteron-Konjugats durch Entfernen der Enzymsubstratlösung 10 aus dem Behälter 2 abgebrochen. Das entstandene Präzipitat 12 lagert sich dabei zumindest teilweise an der Innenfläche des Behälters 2 an und erzeugt eine Änderung des Farbtons, der Farbsättigung, des Weißwerts oder der Graustufe der Innenfläche des Behälters 2 im Vergleich zu einem Wert, beispielsweise Weißwert, des Behälters 2 vor Zugabe der Probe (siehe 1A). Diese Änderung, beispielsweise des Weißwerts, ist ein Maß für die Progesteron-Konzentration der Milch 6.
Die vorstehend in Bezug auf 1A bis 1F beschriebenen Merkmale und Reagenzien sind Teil eines erfindungsgemäßen Testkits (nicht gezeigt) zur Bestimmung des Progesterongehalts von Proben. Das Testkit weist dabei eine Vielzahl der zuvor beschriebenen Progesteron-Antikörper-beschichteten Behälter 2 und Reagenzien, wie z. B. Konjugat 7 und Enzymsubstratlösung 10, auf. Bei der Herstellung solcher Testkits wird für jede Charge (gleiche Progesteron-Antikörper und Reagenzien) durch den Hersteller eine Standardmessung durchgeführt, um die Reaktionsfähigkeit bzw. die Qualität eines Tests zu bestimmen. Diese Standardmessung wird in einen Kalibrierungscode oder -wert oder eine Kalibrierungskurve umgewandelt, der oder die mit dem Testkit an den Anwender abgegeben werden.
2 zeigt eine Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehalts, insbesondere des Progesterongehalts einer oder mehrerer zu untersuchender Proben. 2 basiert auf der in DE 101 19 696 B4 offenbarten Dosiervorrichtung und stellt eine Weiterentwicklung bezüglich der Absaugung und Auswertung dar. In einer Aufnahme 16 sind sieben Probenbehälter 2 und ein Standardbehälter 2' in Form eines Mikrotiterplatten-Strips 14 angeordnet. Über den Behälter 2, nach links versetzt, ist die Dosiereinheit 18 im Teilschnitt dargestellt. Die Dosiereinheit 18 weist mehrere Aufnahmevolumen 19 auf, die durch Ankoppeln an einen Kopplungsblock 24 bzw. dessen Ansaugstutzen 26 bestimmte Mengen verschiedener Reagenzien aufnehmen können. Die Ansaugstutzen 26 sind vorzugsweise mit entsprechenden Vorratsbehältern (nicht gezeigt) für die Reagenzien verbunden. Mittels einer Auswerte-/Steuereinheit (30, 2A) kann die Dosiereinheit 18 bzw. der Behälter 2 oder die Aufnahme 16, z. B. mittels Schrittmotoren (nicht dargestellt), entsprechend verfahren werden, so dass die bestimmten Mengen der Reagenzien in jeweilige Behälter 2 abgegeben werden können, vorzugsweise um das zuvor beschriebene Verfahren durchzuführen. Des Weiteren weist die Vorrichtung einen Kontrastsensor 22 auf, um nach einer Reaktion oder während einer Reaktion einen Hell-Dunkel-Wert bzw. einen Grauwert der Behälter 2 zu erfassen, bzw. ein entsprechendes Sensorsignal, das von der Steuer-/Auswerteeinheit 30 verarbeitet wird. Zudem weist die Vorrichtung eine Absaugeinheit (nur teilweise dargestellt) auf, deren Absaugleitung 21 an der Dosiereinheit 18 angeordnet ist, wobei ein Absaugrüssel 20 in Richtung der Behälter 2, 2' vorsteht. Mit diesem Absaugrüssel 20 können überschüssige oder nicht mehr benötigte Reagenzien bzw. Proben aus jeweiligen Behältern 2, 2' abgesaugt werden, vorzugsweise in einem Abfallbehälter (nicht dargestellt) zum fachgerechten Entsorgen der Reagenzien- und Probenreste. Mittels einer Eingabeeinheit 32 der Steuer-/Auswerteeinheit 30 werden verschiedene Daten eingegeben, z. B. Kalibrierungswerte oder Herkunftsbezeichnungen untersuchter Proben (Milch von Kuh xy, Datum, Betrieb etc.).
Nachfolgend wird beispielhaft eine Verwendung der Vorrichtung zur Bestimmung des Progesterongehalts für eine Vielzahl von Proben bei Verwendung des zuvor beschrieben Testkits beschrieben. Zunächst wird der individuelle (Chargen-spezifische) Kalibrierungscode des Testkits in die Eingabeeinheit 32 der Vorrichtung eingegeben. Auf diese Weise kann ein später erfasster Messwert an die Chargen-spezifische Reaktionsfähigkeit bzw. Qualität der Reagenzien des Testkits angepasst werden. Vorzugsweise wird vor Zugabe von Proben in die Behälter 2 (siehe 1A) der Weißwert jedes Behälters gemessen, um einen Null-Standard für eine nachfolgende Kontrastmessung zu bilden. Auf diese Weise werden beispielsweise herstellungstechnisch bedingte Farbunterschiede der verwendeten Titerplatten-Strips 14 berücksichtigt. Nachfolgend werden in die verschiedenen Behälter 2 des Strips 14 zu untersuchende Proben (Milch) zugegeben, wobei einer der Behälter 2 für eine Standardmessung frei bleibt. Vorzugsweise wird ein Tropfen einer Probe in jeweils einen Behälter 2 gegeben. Danach wird der Messvorgang aktiviert und die Dosiereinheit 18 gibt entsprechende Mengen von Reagenzien (z. B. Konjugat) in die jeweiligen Behälter. Mittels des Absaugrüssels 20 werden die Behälter 2 geleert bzw. deren Inhalt abgesaugt. Direkt nach der Zugabe der präziptierenden Enzymsubstratlösung 10 kann die ablaufende Reaktion in den Behältern mittels des Kontrastsensors 22 erfasst werden. Vorzugsweise wird nach einer vorbestimmten Einwirkzeit des Enzymsubstrats 10 dieses aus den Behältern 2 abgesaugt um die Reaktion in den Behältern zu beenden. In den speziell vorgesehenen Behälter 2' zur Standardmessung wird ein Nullstandard zugegeben, so dass sich in diesem Behälter 2' eine maximale Menge des Präzipitats 12 bildet. Auf diese Weise wird ein einfacher Funktionstest einerseits des Testkits und andererseits der Vorrichtung zur Verfügung gestellt, wie zuvor beschrieben. Zudem kann auf diese Weise mittels der Auswerte-/Steuereinheit 30 der Einfluss äußerer Variablen (z. B. Temperatur Luftfeuchte) auf eine Messung erfasst bzw. berücksichtigt werden, da der Nullstandard den maximal möglichen Messwert bei den zum Meßzeitpunkt vorliegenden Bedingungen anzeigt. Nach Entfernen der Enzymsubstratlösung 10 wird mittels des Kontrastsensors 22 der Hell-Dunkel- bzw. Grauwert oder Weißwert jedes Behälters 2 erfasst und ein entsprechendes Sensorsignal von der Steuer-/Auswerte-Einheit verarbeitet. Unter Berücksichtigung des Kalibrierungscodes, der Nullpunktmessung und der Standardmessung wird ein Wert eines Progesterongehalts einer Probe im jeweiligen Behälter 2 von der Steuer-/Auswerteeinheit 30 generiert bzw. berechnet und dem Nutzer über eine Ausgabeeinheit bzw. Anzeige 34 zu Verfügung gestellt. Vorzugsweise können diese berechneten Werte probenspezifisch bzw. individuell für einen Probanden, z. B. eine Kuh, abgespeichert werden, um den zeitlichen Verlauf des Progesteronspiegels dieser Kuh zu erfassen.
Beispiele der Analyse werden weiter beschrieben:
Der hier beschriebene ELISA-Test beruht in seiner Grundkonzeption zunächst auf Technologien, wie sie zur Progesteronbestimmung beispielsweise von H. Meyer (1989) beschrieben sind. ELISA-Mikrotiterplatten werden direkt oder mit der Doppelantikörpermethode mit Anti-Progesteron-Antikörpern beschichtet. Bei der Testdurchführung zur Progesteronbestimmung wird Probe- bzw. Standardlösung und Progesteron-Enzym-Konjugat zugegeben. Freies Progesteron aus Standard oder Probe kompetitieren mit dem Progesteron-Enzym-Konjugat um die freien Bindungsstellen der Antikörper. Nach einem Waschschritt zur Entfernung ungebundener Reagenzien erfolgt die Zugabe des chromogenen Enzymsubstrats. Die Farbreaktion, die umgekehrt proportional zur Progesteronkonzentration ist, ist ein Maß für die Progesteronkonzentration der gemessenen Probe. Die Methodik wie sie in Meyer (1989) wiedergegeben ist, ist mit geringfügigen Modifikationen auch in EP 0 671 006 B1 (1992) beschrieben.
Die hier beschriebene Erfindung beschreibt die Konzeption eines ELISA-Test-Kit und dessen Anwendung in Instrumenten wie "eProCheck". Der Test beruht auf Mikrotiterplatten bzw. Mikrotiterplattenstreifen, die mit Anti-Progesteron-Antikörpern beschichtet sind. Das freie Progesteron aus der Probe oder dem Standard konkurriert mit einer konstanten Menge Progesteron-Enzym-Konjugat.
Die Konzeption des ELISAs ist so ausgerichtet, dass sie ideal an eProCheck angepasst ist. Dementsprechend wurde der Test so eingestellt, dass der Messbereich (0,5–10 ng/mL) in idealer Weise erzielt wird, ohne dass es der Zugabe von Probenverdünnungslösung bedarf. Eine Inkubationszeit von Probe (Standardlösung) und Konjugatlösung (Progesteron-Enzym-Konjugat) von nur acht Minuten sind zur Testdurchführung ausreichend. Die TMB Enzymsubstratlösung muß ebenfalls nur 3 Minuten inkubiert werden, um eine ausreichende Farbentwicklung zu erzielen. Die Volumina der einzelnen Reagenzien sind jeweils so eingestellt, dass die Dosierung von Probe- bzw. Standardlösungen, die Konjugatlösung, die Waschlösung und die Substratlösung dosiert durch ein Düsensystem, wie es beispielsweise in "eProCheck" vorliegt, zugegeben werden können.
Die Messung der Farbintensität kann prinzipiell auf 2 Wegen erfolgen, die sich zwei unterschiedlicher Messzellen bedienen. In der ersten Option erfolgt die Bestimmung des "Hell-Dunkel-Grades" der zu bestimmenden Lösung. Um Störeffekte durch unerwünschte Reflexionen zu vermeiden, werden hier keine transparenten Mikrotiter-Teststrips sondern vorzugsweise weiß eingefärbte Test-Strips eingesetzt. In einer weiteren Option findet die Bestimmung auf konventionellem photometrischen Weg statt.
Das Gesamtsystem des hier beschriebenen Strip-Tests auf Basis der ELISA-Technologie mit einem Dosier- und Messinstrument, wie beispielsweise "eProCheck^®" ( DE 101 19 696 B4 ) bilden ein ideales Gesamtsystem einer Progesteron-Analytik "on the Farm".
Die vorliegende Erfindung wird durch Beispiele eingehender beschrieben, doch beschränken sich diese Erfindung und deren Ansprüche nicht auf die nachfolgenden Beispiele.
Beispiel 1
Bestimmung von Progesteron in boviner Rohmilch auf der Grundlage von eProCheck: Gesamtsystem mit geplanter Dosierung wird beschrieben:
Grundlage stellen weiß eingefärbte Mikrotiterplatten-Strips dar, die entsprechend mit Anti-Progesteronantikörpern beschichtet und mit Methoden nach dem Stand der Technik blockiert sind. Die Wells der Strips können individuell modulär eingesetzt werden (Lockwell System der Firma NUNC GmbH).
Der Anwender befüllt das Well mit 3 Tropfen Rohmilch (entsprechend ca. 90 μL) (Vorgemelk, Hauptgemelk oder Nachgemelk). Zwei weitere beschichtete Wells werden ohne Probe mit hinzugegeben. Dann werden die Wells zur Testdurchführung mit "eProCheck" gestartet. Der Automat pipettiert (dosiert) die Reagenzien wie folgt und hält dabei die angegebenen Inkubationszeiten ein.
Zugabe von jeweils 3 Tropfen (ca. 90 μL) der Standardlösungen mit den Konzentrationen 0,5 ng/mL und 10 ng/mL in die beiden weiteren Wells, die mit der Probe bzw. den Proben parallel zur Kalibrierung mitbestimmt werden. Unmittelbar folgend werden in jedes Well 80 μL verdünntes Progesteron-Peroxidase-Konjugat in einer stabilisierenden Lösung zugegeben. Es folgt eine Inkubationszeit von 8 Minuten. Dann werden die Wells mit einer Waschpufferlösung (170 μL) 2 mal in eProCheck gewaschen.
Es folgt die Zugabe von jeweils 140 μL der chromogenen Substratlösung (Ready to use). Nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten wird die Farbintensität der Lösung reflektometrisch bestimmt und ausgewertet. Der Anwender erhält die Informationen bezüglich des reproduktiven Status der Kuh anhand des bestimmten Progesterongehaltes.
Beispiel 2
Bestimmung von Progesteron in Schweineserum mit eProCheck. Das Gesamtsystem und die Dosierung erfolgt in enger Anlehnung an Beispiel 1, wobei anstatt Rohmilch Schweineserum verwendet wird.
Beispiel 3
Bestimmung von Progesteron in Rohmilch wie in Beispiel 1, wobei anstatt weiß eingefärbter Strips transparente Break apart Strips (NUNC Maxisorp) verwendet werden und die Messung auf photometrischem Wege in eProCheck erfolgt.
Die beiliegende vorveröffentlichte DE 101 19 696 B4 ist Teil der vorliegenden Offenbarung.
Im Rahmen der Erfindung kann auch folgendes Verfahren vorgesehen sein:
Immunologisches Verfahren zum Ermitteln des Progesterongehalts von zu untersuchenden Proben, das aufweist: Vorsehen zumindest eines Behälters mit einer zumindest teilweise mit Progesteron-Antikörpern beschichteten Innenfläche, Zugeben einer zu untersuchenden Probe und eines Progesteron-Enzym-Konjugats in den zumindest einen Behälter, Entfernen des Probe/Progesteron-Enzym-Konjugat Gemisches nach einer vorbestimmten Einwirkzeit, Zugeben eines präzipitierenden Enzymsubstrats in den zumindest einen Behälter, und Erfassen des Farbtons, der Farbsättigung, des Weißwerts und/oder der Graustufe der Innenfläche des zumindest einen Behälters.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung wird der erfasste Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe in einen Wert für den Progesterongehalt der zu untersuchenden Probe umgewandelt oder umgerechnet.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird zur Umwandlung oder Umrechnung ein Chargen-abhängiger Kalibrierungswert berücksichtigt. Vorzugsweise erfolgt das Erfassen nach und/oder während der Reaktion, insbesondere kontinuierlich, zeitweise, und/oder punktuell während der Reaktion.
Bevorzugt wird vor Zugabe einer zu untersuchenden Probe der Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe des zumindest einen Behälters als Nullpunktmessung erfasst.
Besonders bevorzugt wird ein ermittelter Nullpunkt der Nullpunktmessung zur Kalibrierung des erfassten Werts für Farbton, Farbsättigung, Weißwert und/oder Graustufe verwendet.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung ist mittels zumindest eines zweiten Behälters eine Standardmessung mit einer Standardlösung mit bekanntem Progesterongehalt vorgesehen oder die zumindest zwei Behälter sind mit unterschiedlichen Standards befüllbar zur Funktionskontrolle der Progesteron-Antikörperbeschichtung und der Reagenzien und/oder zum Erfassen des Einflusses externer Variablen auf die Ermittelung des Progesterongehalts.
Weiter bevorzugt weist die Standardlösung oder einer der Standards ein Nullstandard (Progesteron-frei) ist oder einen vorgegebenen Progesterongehalt ungleich Null auf.
Vorzugsweise liegt die vorbestimmte Einwirkzeit der Standardlösung oder der zu untersuchenden Probe und des Progesteron-Enzym-Konjugats unter 10 Minuten, vorzugsweise unter 8 Minuten, besonders bevorzugt zwischen 6 Minuten und 1 Minute.
Weiter bevorzugt ist ein Mengenverhältnis zwischen der zuzugebenden Probe und dem zuzugebenden Progesteron-Enzym-Konjugat kleiner gleich 1, vorzugsweise 1:3.
Besonders bevorzugt wird die zu untersuchenden Probe und das Progesteron-Enzym-Konjugat gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig, vorgemischt oder nacheinander zugegeben.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung ist nach Entfernen einer Standardlösung oder der zu untersuchenden Probe und des Progesteron-Enzym-Konjugats ein Waschschritt mit einer Waschlösung vorgesehen.
Vorzugsweise wird das präzipitierende Enzymsubstrats nach einer vorbestimmten Einwirkzeit aus dem zumindest einen Behälter entfernt, wobei ein entstandenes Präzipitat zumindest teilweise in dem zumindest einen Behälter verbleibt.
Bevorzugt liegt die vorbestimmte Einwirkzeit des präzipitierenden Enzymsubstrats unter 5 Minuten, vorzugsweise unter 3 Minuten, besonders bevorzugt zwischen 2 Minuten und 30 Sekunden.
Besonders bevorzugt wird vor dem Vorsehen der Progesteron-Antikörper Beschichtung die Innenfläche des Behälters zumindest teilweise mit zumindest einem weiteren Antikörper beschichtet.
Vorzugsweise ist die zu untersuchende Probe unbehandelt, insbesondere Rohmilch, Urin, Speichel, Vollblut, Blutplasma, oder Blutserum.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung wird das Verfahren mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, insbesondere mit einem Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, durchgeführt.

2, 2': Behälter
4: Progesteron-Antikörper
6: Milch
7: Konjugat
8: Waschlösung
10: Enzymsubstratlösung
12: Präzipitat
14: Titerplatten-Strip
16: Aufnahme
18: Dosier-/Pump-einheit
19: Aufnahmevolumen
20: Absaugrüssel
21: Absaugleitung
22: Kontrastsensor
24: Kopplungsblock
26, 26': Ansaugstutzen
30: Auswerte-/Steuereinheit
32: Eingabeeinheit
34: Ausgabe-/Anzeigeeinheit
P: Progesteron
P*: Enzym-markiertes Progesteron
C: farbloser Bestandteil eines chromogenen Enzymsubstrats
C⁺: präzipitierter Bestandteil eines chromogenen Enzymsubstrats

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 19705163 C1 [0003]
- EP 0671006 B1 [0003, 0062]
- DE 10119696 B4 [0003, 0032, 0032, 0049, 0060, 0066, 0074]

Claims

Testkit zum immunologischen Ermitteln des Progesterongehalts von zu untersuchenden Proben (6), insbesondere geeignet zur Verwendung mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, wobei das Testkit aufweist: zumindest eine Testplatte mit einer Vielzahl von Behältern (2), insbesondere membranfreien Behältern, zur Aufnahme von zu untersuchenden Proben (6), wobei die Innenflächen der Vielzahl der Behälter (2) zumindest teilweise mit Progesteron-Antikörpern (4) beschichtet sind, zumindest ein Progesteron-Enzym-Konjugat, zumindest ein präzipitierendes Enzymsubstrat (10), und zumindest eine Standardlösung mit bekanntem Progesterongehalt.
Testkit nach Anspruch 1, wobei bei Verwendung des Testkits zum Ermitteln des Progesterongehalts einer zu untersuchenden Probe (6) der Farbton, die Farbsättigung, der Weißwert und/oder die Graustufe eines Behälters (2) dem die zu untersuchende Probe (6) zugegeben wurde ein Maß für den Progesterongehalt der Probe (6) ist.
Testkit nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest einer der Vielzahl der Behälter (2) als Standard für eine Kontrollmessung verwendet wird, insbesondere nur einer der Behälter (2) der Testplatte oder nur je ein Behälter (2) eines Streifens der Testplatte.
Testkit nach Anspruch 3, wobei mittels des Standard die Funktionsfähigkeit des Testkits und/oder der Einfluss externer Variablen, insbesondere Temperatur und/oder Luftfeuchtigkeit, auf eine Ermittlung, erfasst wird.
Testkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Testkit einen Kalibrierungscode oder -wert oder eine Kalibrierungskurve umfasst zur Chargenabhängigen Kalibrierung für die Umwandlung oder Umrechnung des Farbtons, der Farbsättigung, des Weißwerts und/oder der Graustufe in einen jeweiligen Wert des Progesterongehalts.
Testkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein die Behälter ausbildendes Material transparent und/oder einfarbig, insbesondere weiß, ist.
Testkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Testkit eine Waschlösung (8), insbesondere eine Waschpufferlösung, aufweist.
Testkit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Testplatte eine Mikrotiterplatte ist, insbesondere eine Testplatte mit einer Vielzahl von Mikrotiterplatten-Strips oder einzelner Kavitäten.
Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehalts, insbesondere des Progesterongehalts, zumindest einer zu untersuchenden Probe (6), insbesondere zur Verwendung mit einem Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Vorrichtung aufweist: eine Aufnahme (16) für zumindest einen Behälter (2), insbesondere für zumindest einen Reaktionsbehälter, zumindest eine Dosiereinheit (18) zur Abgabe einer vorbestimmten Menge von Reagenzien und/oder von zu untersuchenden Proben (6) in den zumindest einen Behälter (2), zumindest eine Absaugeinheit (20, 21) zum Entfernen, insbesondere Absaugen, von Reagenzien und/oder zu untersuchenden oder untersuchten Proben (6) aus dem zumindest einen Behälter (2), und zumindest einen Sensor (22) zum Erzeugen mindestens eines Sensorsignals als Maß für einen Farbton, eine Farbsättigung, einen Weißwert und/oder einer Graustufe der Innenfläche des zumindest einen Behälters (2).
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei eine Steuer-/Auswerteeinheit (30) der Vorrichtung eine Eingabeeinrichtung (32) zur Eingabe zumindest eines individuellen Kalibrierungscodes oder -werts oder einer Kalibrierungskurve aufweist, und wobei mittels der Steuer-/Auswerteeinheit (30) unter Verwendung des oder der eingegebenen Kalibrierungswert(e) und/oder Kalibrierungskurve(n) aus dem zumindest einen erfassten Sensorsignal ein Wert eines Substanzgehalts generierbar oder berechenbar ist.
Vorrichtung zum Ermitteln des Substanzgehalts, insbesondere des Progesterongehalts, zumindest einer zu untersuchenden Probe (6), insbesondere zur Verwendung mit einem Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Vorrichtung aufweist: eine Aufnahme (16) für zumindest einen Behälter (2), insbesondere für zumindest einen Reaktionsbehälter, zumindest eine Dosiereinheit (18) zur Abgabe einer vorbestimmten Menge von Reagenzien und/oder von zu untersuchenden Proben (6) in den zumindest einen Behälter (2), zumindest einen Sensor (22) zum Erzeugen mindestens eines Sensorsignals als Maß für einen Farbton, eine Farbsättigung, einen Weißwert und/oder eine Graustufe der Innenfläche des zumindest einen Behälters (2), und eine Steuer-/Auswerteeinheit (30), wobei die Steuer-/Auswerteeinheit (30) eine Eingabeeinrichtung (32) zur Eingabe zumindest eines individuellen Kalibrierungscodes oder -werts oder einer Kalibrierungskurve aufweist, und wobei mittels der Steuer-/Auswerteeinheit (30) unter Verwendung des oder der eingegebenen Kalibrierungswert(e) und/oder Kalibrierungskurve(n) aus dem zumindest einen erfassten Sensorsignal ein Wert eines Substanzgehalts generierbar oder berechenbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Vorrichtung zumindest eine Absaugeinheit (20, 21) zum Entfernen, insbesondere Absaugen, von Reagenzien und/oder zu untersuchenden oder untersuchten Proben aus dem zumindest einen Behälter (2).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9, 10 oder 12, wobei ein Absaugelement (20), insbesondere ein Absaugrüssel, der Absaugeinheit an der Dosiereinheit angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei mittels der Eingabeeinheit (32) ein Chargen-abhängiger Kalibrierungscode oder -wert eingebbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei mittels des zumindest einen Sensors (22) vor Zugabe einer zu untersuchenden Probe (6) zumindest ein Sensorsignal der Innenfläche des zumindest einen Behälters (2) als Nullpunktmessung des Behälters (2) erfaßbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei mittels der Auswerte-/Steuereinheit (30) die Nullpunktsmessung zum Kalibrieren des erfassten, zumindest einen Sensorsignals des Behälters (2) berücksichtigbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei mittels der Aufnahme (16) zumindest zwei Behälter (2) aufnehmbar sind, wobei einer ein Standardbehälter und mindestens einer eine Probenbehälter ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei mittel der Steuer-/Auswerteeinheit (30) der Wert zumindest einer Standardmessung, insbesondere nur einer Standardmessung, mit zumindest einer Standardlösung mit bekanntem Substanzgehalt zum Kalibrieren berücksichtigbar ist, insbesondere zur Funktionskontrolle verwendeter Reagenzien und/oder zum Berücksichtigen externer Variablen auf die Ermittlung des Substanzgehalts.
Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die zumindest eine Standardlösung ein Nullstandard (Progesteron-frei) ist oder einen vorgegebenen Progesterongehalt ungleich Null aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei mittels des zumindest einen Sensors (22) das zumindest eine Sensorsignal nach und/oder während der Reaktion erfaßbar ist, insbesondere kontinuierlich, zeitweise, und/oder punktuell während der Reaktion erfaßbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, wobei der zumindest eine Sensor (22) ein Kontrastsensor, insbesondere ein Weißlicht-Kontrastsensor, oder ein Photometer ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 21, wobei die Vorrichtung einen Temperatursensor zum Detektieren der Umgebungstemperatur aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 22, wobei die Vorrichtung zumindest eine Heizeinheit und/oder eine Kühleinheit aufweist, insbesondere um eine gewünschte Reaktionstemperatur in dem zumindest einen Behälter bereitzustellen.
Testkit oder Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym des Progesteron-Enzym-Konjugats ausgewählt wird aus Peroxidase oder Alkalischer Phosphatase.
Testkit oder Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zumindest eine präzipitierende Enzymsubstrat (10) für Peroxidase ausgewählt wird aus: TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), DAB (3,3-diaminobenzidine), 4-CN (4-chloro-1-naphtol) und AEC (3-amino-9-ethylcarbazole).
Testkit oder Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zumindest eine präzipitierende Enzymsubstrat (10) für alkalische Phosphatase ausgewählt wird aus: BCIP (5-brom-4-chlor-3-indoxylphosphat), NBT (Nitro Blue Tetrazolium Chlorid) und INT (Iodonitrotetrazolium Chlorid).
Testkit oder Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Messbereich des Testkits und/oder der Vorrichtung zwischen 0,1–100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,5–10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,5–5 ng/ml liegt.