JPH01202284A - 変異大腸菌リボヌクレアーゼｈ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素活性を改良された変異大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ１該変異酵素をコードしている遺伝子、該遺伝
子を含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発
現ベクターを含有している形質転換体および該形質転換
体を用いて変異大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方
法に関するものである。

［従来技術とその問題点］ 大腸菌のりポヌクレアーゼ１１（以下、本明細書中では
単にリボヌクレアーゼＨと称する）は１５５アミノ酸か
らなる分子置駒１７Ｋｄの加水分解酵素であって、ＤＮ
Ａ　−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。そのよ
うな基質特異性に基づき、近年その発達の著しい遺伝子
工学において、下記の如き様々な作用を有する酵素とし
て極めて利用価値の高い酵素として注目されている。

１）ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型ｍＲＮＡの除去
。

２）ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去。

３）　　ＲＮＡの断片化。

本酵素の重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます増
大すると確信される。該酵素は、大腸菌内での産生量が
極めて低いことから、遺伝子工学によるクローン化酵素
が製造され、既にＢＲＬ。

ファルマシアおよび宝酒造等から供給されている。

しかし、これらの市販のクローン化酵素ら、生産性が低
い上、単離、精製工程中の損失および失活等によって収
率が低く、高価なものとなっている。

従って、上記の様々な研究を推し進める上で有用な酵素
活性を有するリボヌクレアーゼ１１が入手し易くなるこ
とが強く望まれている。

一般に、酵素の有効量はその量の多少に拘わらず、触媒
活性の高低に基づいて判断される。従って、酵素の比活
性を高めれば、実質上、酵素供給量が増大されたことに
なる。ところで、酵素、抗体等のタンパク質の機能を変
化させるために、それらのタンパク質をコードしている
ＤＮＡ配列に突然変異を誘発してアミノ酸配列を改変す
る方法がしばしば用いられる。そのような操作の結果、
基質特異性および／または抗原との結合性を改良された
抗体、基質特異性や至適ＰＨの変化した酵素、熱安定性
を改良された酵素等が得られている。

しかしながら触媒活性を増大された酵素が得られたとい
う例は殆んどなく、リボヌクレアーゼ［１についても、
本発明以前にそのような報告はなされていない。

従って、比活性の高められた、変異型のりボヌクレアー
ゼＨを得ることができれば、実質上、該酵素の供給量が
増大されたことになる。しかも、変異りボヌクレアーゼ
Ｉ（精製標品には、天然型のりボヌクレアーゼＨに通常
伴っているヌクレアーゼ等の夾雑タンパク質の混入が少
ないので、酵素試薬としてより高品質の精製標品の調製
が可能になるといえる。即ち、高比活性の酵素を得るこ
とによって、高品質の酵素標品を安価に供給することが
できることになる。

［間麗点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記の観点から、リボヌクレアーゼト■
の触媒活性を高めることを目的として、該酵素の遺伝子
に部位特異的突然変異を導入して様々なアミノ酸置換を
有する変異体を調製し、その酵素活性への影響を検討し
た結果、第１３番目の−Ｃｙｓ（システィン）がＳ　ｅ
ｔ（セリン）で置換されたアミノ酸配列を有する変異り
ボヌクレアーゼト■が、天然型のりボヌクレアーゼ■４
の約２倍の活性を有することを見出し、本発明を完成す
るに至った。

即ち、本発明は、第１３番目のシスティンがセリンで置
換されたアミノ酸配列を何する変異りボヌクレアーゼ１
１を提供するものである。

また本発明は、リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子のＣｙｓ
１３をコードしている′Ｉ″ＧＴが部位特異的突然変異
によってＳｅｔをコードしているＴＣＴに変換されてい
る、変異りボヌクレアーゼｌ］遺伝子を提供するもので
ある。

また本発明は変異りボヌクレアーゼＩ４を大腸菌で発現
させるための発現ベクターであって、Ｌａｃプロモータ
ーの支配下に上記変異りボヌクレアーゼト【遺伝子を含
有しているベクターを提供するものである。本発明の発
現ベクターは、プラスミドｐＵｃｔｓ由来の複製起源を
含有しているので、大腸菌内で複製可能である。

また本発明は、上記の発現ベクターて形質転換された、
変異りボヌクレアーゼ）Ｉ産生性の形質転換体を提供す
るものである。

さらに本発明は、該形質転換体を培養することによって
、高いリボヌクレアーゼｔｌ酵素活性を何する変異りボ
ヌクレアーゼ１１を製造する方法を提供するものである
。

本発明の変異りボヌクレアーゼＩ−Ｉをコードしている
遺伝子は、以下の行程に従って得られた。

ｒｎｈ遺伝子は、本発明者等（カナヤおよびクラウチ、
ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、２５
８、＋２７６−１２８１［１９８３］）によって大腸菌
染色体からクローニングされている。このクローン化さ
れたプラスミドｐＳＫ７５０をｒｎｈ遺伝子の供給源と
して用い、第１図記載の行程に従ってＭ　１３ｍｐｌ　
８　ＲＦ’ＤＮＡにサブクローニングする。

まず、プラスミドｐＳＫ７５０の８２０ｂｐＥｃ。

Ｒ１−ＰｓｔＩ断片を切り出し、該断片を市販のプラス
ミドｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入
し、プラスミドｐｓＫ８２０を得る。このプラスミドｐ
ｓＫ８２０を制限酵素Ｈｇ１Ａ　１で切断してｒｎｈ遺
伝子を含む８０１　ｂｐＨｇｉＡ　ｒ断片を得、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ処理によって３′突出部分を平滑末端
化した後、市販のプラスミドｐＵＣ１８のＳｍａ１部位
に挿入する。ｒｎｈ遺伝子の向きがプラスミドｐＵｃ１
ＢのＩａｃプロモーターと逆向　　　　・きのものを選
択してプラスミドｐＫｓ８０１と命名し、以後の実験に
用いる。

プラスミドｐＫｓ８０１からｒｎｈ遺伝子を含む６００
ｂｐＥｃｏＲｒ−Ｐｓｔｌ断片を切り出し、市販のＭｌ
　３ｍｐｌ　８１ＦＤＮＡのＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　１
部位に挿入してＭｌ　３ｍｐｌ　８（ｒｎｈ）ＲＦＤＮ
Ａを作成する。Ｍｌ　３ｍｐｌ　８（ｒｎｈ）ＲＦＤＮ
Ａの組み立て模式図を第１図に示す。

２）　　ｒｎｈ遺伝子への部位特異的突然変異の導入上
記のＭ　ｌ　３ｍｐ１　Ｂ（ｒｎｈ）ＲＰＤＮＡで大腸
菌ＴＧ−１を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
る。その上清から常法に従ってＭ１３ｍｐ１８（ｒｎｈ
）環状１本鎖ＤＮＡを調製する。このＭ１３ｍｐ　１８
　（ｒ？Ｉｈ）環状１本に′１ＤＮＡを、化学合成した
２５　ｍｅｒ（１体）のオリゴヌクレオチドと混合し、
エックスタインら（Ｅ　ｃｋｓｔｅｉｎ）の方法（Ｔａ
ｙｌｏｒ、　Ｊ　、Ｗ、。

Ｏｔｔ、Ｊ　、　ａｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ、　（
１９８５）二ニークレイツク・アシッズ・リサーチ、１
３．８７６４−８７８５）を利用した市販のキット（ア
マ−ジャム）を用い、その指示に従って操作し、部位特
異的な点突然変異を導入する。この操作によって、Ｃｙ
ｓ１３のコドンＴＧＴＩＪ＜ＳｅｒのコドンＴＣＴで置
き換えられた変異ｒｎｈ遺伝子を有するＭ１３ｍｐ１８
（ｒｎｈ−１３Ｓ）ｒｔＦＤＮＡが得られる（第２図参
照）。以下、この変異ｒｎｈ遺伝子によってコードされ
ている変異りボヌクレアーゼＨを天然型リボヌクレアー
ゼＨと区別するためにリボヌクレアーゼＨ（＋３９）と
称する。

３）　リボヌクレアーゼＨ（＋３８）発現ベクターの措
築 前記のプラスミドｐＫｓ８０１から２３０ｂｐＥｃｏＲ
Ｉ断片を削除し、同時に５ａｌｌリンカ−を用いてＥｃ
ｏＲ１部位を５ａ１１部位に変換してプラスミドｐＫｓ
６００を得る。次いで、プラスミドｐＫＳ６００からｒ
ｎｈ遺伝子を含む６００ｂｐＸｂａＩ　−９ａｌ＋断片
を切り出す。該断片を、大腸菌プロテアーゼ■発現用プ
ラスミドベクター１）ＤＲ４２Ｓ（特許出願番号第６２
−２１８９７３号）のｐｔｒ遺伝子を含有する４、　３
ｋｂＸｂａｌ　−９ａｌｌ断片と置換することにより、
天然型リボヌクレアーゼ８発現用プラスミドｐｐｎａｏ
ｏを得る。次いで、このプラスミドｐＤＲ６００の５０
０ｂｐＸｂａｌ　−９ｓｔＩＩ断片をＭ　ｌ　３ｍｐｌ
　８（ｒｎｈ　−１３５）ＲＦＤＮＡ由来の５００ｂｐ
Ｘｂａｌ　−９ｓｔＩＩ断片で置換することにより、本
発明のりボヌクレアーゼトＩ（１３Ｓ）発現用プラスミ
ドｐＤｒｔ６０１を得る。プラスミドｐＤＲ６０１の組
み立て模式図を第３図に、その制限酵素切断地図を第４
図に示す。

４）　リボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）の大腸菌内での発
現 上記のプラスミドｐＤＲ６０１を用いて大腸菌に一１２
株ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体をアン
ピシリン含有培地で培養する。対数増殖期にイソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトジッド（ＩＰＴＧ）を添加して
培養することにより、リボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）を
発現させる。

次いで、リボヌクレアーゼｌ−１（１３Ｓ）産生性形質
転換体の菌体を集菌し、リゾチーム−ＥＤＴＡ処理およ
び超音波処理によって可溶化し、遠心して得られた上清
を透析した後、ＤＥＡＥ−セルロース、Ｐ−１１セルロ
ースおよびセファクリルＳ−３００（Ｓ　ｕｐｅｒ　Ｆ
　１ｎｅ）各カラムクロマトグラフィーに順次かけるこ
とにより、リボヌクレアーゼ１−１（１３ｓ）の精製標
品を調製する。このようにして得られたりボヌクレアー
ゼＨ（＋３９）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを
与える程度にまで精製されている。上記の方法における
天然型リボヌクレアーゼ！−１の混入の程度は、大腸菌
に−１２株ＪＭＩ０９の通常のりボヌクレアーゼトｌ産
生吊が極めて低いことから、極く僅かであると考えられ
る。所望の突然変異が導入されていることを、アミノ末
端からのアミノ酸の配列決定によって確認した。

［発明の作用］ 本発明の変゛異リボヌクレアーゼ１４は、［”Ｐ］ｐ。

１ｙ（ｒＡ　）ｐｏｌｙ（ｄＴ　）を基質として測定し
た場合、天然型リボヌクレアーゼ■４の約２倍の酵素活
性を有している。その酵素活性は、前記の様々な遺伝子
工学の分野で、天然型リボヌクレアーゼＨと全く同等に
用い得るものである。従って、本発明は、高いリボヌク
レアーゼＩＩ活性を有する変異りポリメラ−ゼ０を提供
することによって、該酵素活性の供給を増大するもので
ある。

以下に実施例を挙げ１４本発明をさらに詳しく説明する
。

実施例１　　ｒｎｈ遺伝子のＭ　Ｉ　３ｍｐｌ　８　Ｒ
Ｆ　ＤＮＡへのサブクローニング ｒｎｈ遺伝子源としてｐｓＫ７５０を用いた。プラスミ
ドｐＳＫ７５０（Ｉ　０８ｇ）を１００μＱの反応溶液
中、５０ユニツトずつのＰｓｔｌとＥｃｏｎｌにより、
３７℃で１時間消化した。次いで消化物を１．５％アガ
ロースゲル電気泳動にかけた。ｒｎｈ遺伝子を含む８２
０ｂｐ　Ｅｃｏｎ　Ｉ−Ｐｓｔｌ断片をエレクトロエリ
ューション（電気溶出）によりアガロースゲルから抽出
した後、ＤＥ−５２カラムクロマトグラフイーにより精
製した。エタノール沈澱により回収された８　２０ｂｐ
　ＥｃｏＲｒ−Ｐｓｔｒ断片の量は約１μ？であった。

一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＴＯＹＯＢＯ製
）（２μ９）を５０μＱの反応溶液中１０ユニツトずつ
のＰｓｔ［とＥｃｏＲＩにより、３７℃で１時間完全に
消化した。

消化物を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、２．
７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片を８２０ｂｐ断片と
同様に溶出・精製した。回収率はほぼ１００％であった
。

以上のようにして得られた８　２’　Ｏｂｐ及び２．７
ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　ｒ断片それぞれｏ、ｔ７
Ｂを混合し、２０ｇｇの反応溶液中、５ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（Ｔ　ＯＹ　ＯＢ　Ｏ製）と共に１６℃
で３００分間反応せ、プラスミドの環化を行なった。

次いで環化したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体よりプラスミドｐＳＫ８２０を得た。

次いで、このプラスミドｐｓＫ８２０（１０μ９）を１
００μｇ反応溶液中、１００ユニツトのＩ（ｇ　ｉＡｌ
により３７℃で１時間消化した。フェノール−クロロホ
ルム抽出後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した後、
２０μＱの反応溶液中、２．５ユニツトのＴ４　　ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え、３７°Ｃで１５分間反応させた
。６５℃で５分間処理することにより反応を停止した後
、反応溶液を１５％アガロースゲル電気泳動にかけ、ｒ
ｎｈ遺伝子を含む８０１　ｂｐ　ＩＩｇｉＡ　［断片を
、８２０ｂｐ　Ｅｃ。

Ｒ１−Ｐｓｔｌ断片の場合と同様に溶出・精製した。

ＤＮＡの回収量は２μ９であった。一方プラスミドベク
ターｐＵＣＩ　８（ＴＯＹＯＢＯ製）（２μｇ）を５０
ｇｇの反応溶液中、ＩＯユニットのＳｍａｒにより３７
℃で１時間完全に消化し、次いで１ユニツトの大腸菌ア
ルカリ性フォスファターゼを加え、更に３０分間３７℃
で反応させた。フェノール−クロロホルム抽出法により
反応を停止した後、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収
した。回収率はほぼ１００％であった。

以」二のようにして得られた８　０１　ｂｐ　Ｉ［ｇｉ
Ａ　ｒ断片と、ＳｍａＩで消化した後、大腸菌アルカリ
性フォスファターゼで処理したｐｏｃｋｓ、それぞれ０
．１μ９を混合し、２０μＱの反応溶液中、５ユニット
のＴ４　　ＤＮＡリガーゼと共に１６℃で３０分間反応
させ、プラスミドの環化を行なった。

次いで環化したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体よりプラスミドｐＫＳ８０Ｉを得た。

次いで、このプラスミドｐＫｓ８０１（１０μ？）を１
００μａの反応溶液中、５０ユニツトのＥｃ。

Ｒ１と５０ユニツトのＰｓｔｒにより３７℃で１時間、
完全消化し、消化物を１５％アガロースゲル電気泳動に
かけた。ｒｎｈ遺伝子を含む６００ｂｐＥｃｏＲＩ　−
Ｐｓｔ　Ｉ断片を、８２０ｂｐ　ＥｃｏＲ［−Ｐｓｔｒ
断片の場合と同様に溶出・精製した。ＤＮＡの回収量は
約１μ９であった。一方、Ｍ１３ｍｐ１８ｒ’（ＦＤＮ
Ａ（タカラ酒造製）２μ９を、２０μＱの反応溶液中、
１０ユニツトのＥｃｏＲＩとＩＯユニットのＰｓｔｌに
より３７℃で１時間、完全に消化した。消化物を０．７
％アガロースゲル電気泳動にかけ、７．２ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ−ＰｓｔＴ断片を８２０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｔ断片と同様に溶出・精製した。ＤＮＡの回収量
は約１．５μ９であった。以上のようにして得られた６
００ｂｐ及び７．２ｋｂＥｃｏｎｒ−ＰｓＬｒ断片それ
ぞれ０．ＩＪｔ９を混合し、２０μｇの反応溶液中、５
ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（’ｒｏｙｏＢｏ製）
と共に、１６℃で３０分間反応させ、ＲＦ’　ＤＮＡの
環化を行なった。

次いで、環化したＲＰ　ＤＮＡで大腸菌Ｔ（、−１を形
質転換し、形質転換体より、ＭＩ３ｍｐ１８Ｒｒ’　１
）ＮＡにｒｎｈ遺伝子が挿入されたＭ１３ｍｐ１８（ｒ
ｎｈ）ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａを得た（第１図参照）。

実施例２　　ｒｎｈ遺伝子への部位特異的突然変異の導
入 実施例１で得たＭｌ　３ｍｐｌ　８（ｒｎｈ）ＲＦ　Ｄ
ＮＡで形質転換した大腸菌ＴＧ−１の培養」ユ清からの
一本鎖ＤＮＡの調製、オリゴヌクレオチドのリン酸化お
よびｒｎｈ遺伝子への点突然変異の導入は、いずれも、
アマ−ジャムから市販されているキット（オリゴヌクレ
オチド　ブイレフテッド　インビトロ　ミュータゲネシ
ス　システム）を用い、添付の説明書に正確に従って行
なわれた。オリゴヌクレオチドとしては、化学合成した
２５ｍｅｒの５°−ＣＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴ
ＧＧＧＣＡＡＴＣＣ−３°を用いた。ＣｙｓＩ３のコド
ンＴＧＴがＳｅｒのコドンＴＣＴに改変された変異りボ
ヌクレアーゼＨ遺伝子を含有するＲＦＤＮＡをＭ　１３
’ｍｐｌ　８　（ｒｎｈ　−１３ＳＸ第２図参照）と命
名し、以後の実験に用いた。

実施例３　リボヌクレアーゼｌ−１（１３ｓ）発現用プ
ラスミドｐＤｒ（６０１の構築 １、天然型リボヌクレアーゼ１４発現用プラスミドｐＤ
Ｒ６００の構築 実施例１で得たプラスミドｐＫｓ８０１（第１図参照）
２μ９を２０μｇの反応溶液中、ＩＯユニットのＥｃｏ
ＲＩにより３７℃で１時間完全に消化した。エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収した後、２０μＱの反応溶液中
、２ユニツトのＩ）ＮＡポリメラーゼ（フレノウ）を加
えて３７℃で３０分間反応さ仕、次いで、６５℃で１０
分間処理した。エタノール沈澱により回収したＤＮＡを
２０μσの反応溶液中、■ユニットの大腸菌アルカリ性
フォスファターゼを加えて３７°Ｃで３０分間処理した
後、反応溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ
た。３．３ｋｂＤＮＡ断片を実施例１記載の８２０ｂｐ
　Ｅｃｏｎ　Ｔ−Ｐｓｔｌ断片の場合と同様に溶出・精
製した。ＤＮＡの回収量は約１μりであった。得られた
ＤＮＡ０．１μ９を５ａｌｌリンカ−（宝酒造製）０．
０１　ｔｔ９と混合（モル比１：５０）ｌ、、２０μｇ
の反応溶液中、５ユニツトのＴ４　　ＤＮＡリガーゼを
加えて１６℃で３０分間処理した。このようにして環化
したプラスミドで大腸菌ＪＭＩＯ９を形質転換し、形質
転換体よりプラスミドｐＫＳ６００を得た。

次いで、プラスミドｐＫＳ　６００（１０μ９）を１０
０μｇの反応溶液中、５０ユニツトのＸｂａＩと５０ユ
ニツトの５ａｌＩを用いて３７°Ｃで１時間完全消化し
、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。６００ｂ
ｐ　ＸｂａＩ　−Ｓａｌ　！断片を切り出し、実施例１
記載の８２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片の場合と
同様に溶出・精製を行なった。エタノール沈澱により回
収されたＤＮＡのｍは約１μ９であった。

一方、大腸菌プロテアーゼ■発現用プラスミドベクター
ｐＤＲ４２ｓ（特許出願番号６１−２１８９７３）５μ
９を１００μＱの反応溶液中、５０ユニツトのＸｂａｌ
と５０ユニツトの５ａｌｌを用いて３７℃で１時間消化
し、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。３．Ｏ
ｋｂ　Ｘｂａｌ　−８ａｌ　Ｔ断片を切り出し、実施例
！記載の８２０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片の場合
と同様に溶出・精製を行なり、　　た。エタノール沈澱
により回収されたＤＮＡの量は約Ｉμ９であった。

以上のようにして得られた６　００ｂｐ　Ｘｂａｌ　−
５ａｌｌ断片０．１μ９と３．０ｋｂ　ＸｂａＩ−８ａ
ｌｌ断片Ｏ９１μ９とを混合し、２０μσの反応溶液中
、５ユニツトのＴ４　　ＤＮＡリガーゼにより１６°Ｃ
で３０分間処理し、プラスミドを環化した。環化したプ
ラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体
より天然型リボヌクレアーゼ１４発現用プラスミドベク
ターｐＤＲ６００を得た。

２、リボヌクレアーゼＨ（１３ｓ）発現用プ２スミドｐ
Ｄ１１６０１の構築 １で得たプラスミドｐＤＲ６００の天然型ｒｎｈ遺伝子
を、以下のようにして、変異型ｒｎｈ遺伝子で置換した
。まず、プラスミドｐＤＲ６００（２μ９）を５０μｇ
の反応溶液中、！０ユニットのＸｂａｌとＩＯユニット
の５ｓｔｌｌを用いて３７℃で１時間、完全消化し、０
．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。３．ｌｋｂ　
Ｘｂａｌ　−９ｓｔｌｌ断片を切り出し、前記８２０ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ断片の場合と同様に溶出・精
製を行なった。エタノール沈澱により回収されたＤＮＡ
の量は約１．５μりであった。

一方、実施例２で得たＭ　１３ｍｐｌ　８　（ｒｎｈ　
−１３５）ＲＦ’　ＤＮＡ（５μｇ）を１００μρの反
応溶液中、５０ユニツトのＸｂａｌおよび５０ユニツト
のＳｓｔ■により３７℃で１時間、完全消化し、消化物
を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。５００ｂ
ｐ　ＸｂａＩ−８ｓｔｌｌ断片を切り出し、上記８２０
　ｂｐ’ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片の場合と同様に
溶出・精製を行なった。エタノール沈澱により回収され
たＤＮＡの量は約０．２μ９であった。以上のようにし
て得られた５ｏｏｂｐおよび３　、１　ｋｂのＸｂａＴ
−ＳｓｔＵ断片、それぞれ０．１μ９を混合し、２０μ
ｇの反応溶液中、５ユニツトのＴ４　　ＤＮＡリガーゼ
により１６℃で３０分間処理し、プラスミドを環化した
。環化したプラスミドで大腸菌ＪＭ！０９を形質転換し
、形質転換体よりプラスミド１）ＤＲ６０１を得た。

上記のようにして得たりボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）発
現用プラスミドｐＤＲ６０１の詳細な制限酵素切断地図
を第４図に示した。形質転換菌ニジエリシア・コリ（灰
、　ｃｏｌｉ）ＪＭＩ　０９／ｐＤＲ６０１は、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研菌
寄第９７０８号、寄託日：昭和６２年１１月１４日）。

実施例４　リボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）の大腸菌にお
ける生産と精製 １、形質転換体ＪＭＩ　０９／ｐＤＲ６０１の培養 形質転換体ＪＭＩ　Ｏ９／ｐＤＲ６０１を、８０μ９の
アンピシリンを含むＬＢ培地＋１２中、３７℃で振盪培
養した。培養液の測度がクレット値で１００萌後まで生
育した時点で、Ｉ　ＰＴＧを、最終濃度０．８ｍＭとな
るように添加し、更に５時間振盪を続けた後、集菌した
。この時のクレット値は約１２０、菌体の湿重量は約１
．５９であった。

２、菌体からのりボヌクレアーゼＨ（１３°Ｓ）の抽出
・精製 上記ｌで得た菌体を５村のＯ，１Ｍ　ＮａＣｆ２と２５
％シュークロースを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８）に懸濁した後、５　、２　ｍｇのりゾチームと０
．１Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．３Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８）１．３３ｉＣを加えた。水中に５分放置した後、
超音波処理により菌を破砕した。１５０００ｒｐｍで３
０分間、４℃で遠心して得た遠心上清（粗抽出液）を、
１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール及
び１０％グリセリンを含む５０ｍｔｖｌトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）に対して透析した。次いで、同緩衝液
で平衡化したＤＥ−５２カラム（〜６　ｔｐＱ）及びＰ
−１１カラム（〜４肩のにこの順序で通した。この条件
下、リボヌクレアーゼｌ１（１３ｓ）は、ＤＥ−５２カ
ラムを素通りし、Ｐ−１１カラムに吸着する。ＮａＣ（
２ａ度を直線的に上昇さ仕ろことによりＰ−１１カラム
からりボヌクレアーゼｌ１３Ｓ）を溶出した。最後に、
Ｐ＝ｌＩカラムからの溶出画分を、１ｍＭ　ＤＴＴ。

ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０８Ｍ　ＮａＣ（！及び１０％
グリセリンを含む、ｌ０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）で平衡化したセファクリルＳ−３００（スーパー
ファイン）カラム（φ１．６Ｘ１９０ｃだ）にかけるこ
とにより、リボヌクレアーゼＨ（＋３Ｓ）を、５ＤＳ−
ＰＡＧＥで単一バンドを与えるまでに精製した。以上の
全精製操作を通じてのりボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）の
回収率は、約６０％であった。

精製収量は、約３ｍｇ／ρ培養液であり、これは、ＪＭ
Ｉ　０９／ｐＤＲ６００からの天然型リボヌクレアーゼ
■（の精製収量５　ｍｇ／ρと比較してそれほど変化な
かった。なお、天然型リボヌクレアーゼＩ（とりボヌク
レアーゼＨ（１３Ｓ）は、上記精製操作では分離しない
ので、リボヌクレアーゼＨ（１３９’）精製標品には、
宿主として用いたＪＭＩＯ９に由来する天然型リボヌク
レアーゼＨが混入している。しかし、大腸菌ＪＭｉ０９
からの天然型リボヌクレア・−ゼＩＩの精製収量は、通
常、約５μ９／１２であることから、混入している割合
は、約０゜１６％と極めて低い。従って、本精製標品の
性質は、リボヌクレアーゼＩ−ｒ（１３Ｓ）の性質を反
映しているとみなすことができる。精製標品の同定は、
アミノ末端からのアミノ酸配列を分析し、１３番口のア
ミノ酸がＳｅｔに変異していることを確認することによ
り行った。

実施例４で得たりボヌクレアーゼＨ（＋３Ｓ）の酵素活
性を以下の実験例の記載の如くにして評価した。

夫に剋　リボヌクレアーゼＨ（１３Ｓ）の酵素活性の評
価 天然型リボヌクレアーゼＨの酵素活性とりボヌクレアー
ゼＩ（（＋３ｓ）の酵素活性を［３２Ｐ　］ｐｏｌｙ（
ｒＡ）ｐｏｌｙ（ｄＴ）を基質として測定し、比較した
。その結果を表１に示す。表Ｉから、リボヌクレアーゼ
Ｈ（１３Ｓ）の比活性は天然型′に比べて約２倍に上昇
していることが分る。

・活性は、３７℃、１５分間にＩ　ｎｍｏｌの酸可溶性
物質を遊離する酵素量を１ユニツトと定義した。

・タンパク量は、Ａ９ａ！”−＋、ｏとして計算した。

［発明の効果］ 本発明によって得られる変異りボヌクレアーゼＨは、そ
の酵素活性が天然型リボヌクレアーゼＨの約２倍である
ことから、従来の、酵素試薬よりも少指で同等の触媒作
用を示すこととなる。従って、本発明によって、実質上
、該酵素の供給量が増大されたことになる。また、本発
明方法によれば天然型リボヌクレアーゼＨに伴なってい
る夾雑タンパク質の混入を減少し得るので、より高品質
の精製標品を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｒｎｈ遺伝子のＭＩ３ｍｐＲＦ　ＤＮＡへのサ
ブクローニングの概略を示す模式図である。第２図は合
成オリゴヌクレオチド（２５ｍｅｒ）を用いて天然型リ
ボヌクレアーゼＨ遺伝子に部位特異的突然変異を導入し
てリボヌクレアーゼＨ（＋３Ｓ）遺伝子を得る反応を示
す模式図である。図中、点突然変異導入部位には☆印、
突然変異に該当ずろアミノ酸には下線を付して示した。 第３図はプラスミドｐＤＲ６０１の組立て模式図である
。第４図はプラスミドｐＤｒＺ６０１の制限酵素切断地
図である。 特許出願人　株式会社蛋白工学研究所 代　理　人　弁理士　前出　葆　（ほか１名）第１図−
１ 第１図−２ 「 第３図−１ 第３図−２ Ｌ 第４図 ＮｄｅＩ（０，旧］

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列において
   、第１３番目のシステインがセリンで置換されたアミノ
   酸配列を有する変異大腸菌リボヌクレアーゼＨ。 ２、大腸菌リボヌクレアーゼＨをコードしている構造遺
   伝子において、第１３番目のシステインのＴＧＴコドン
   が部位特異的突然変異によってセリンのＴＣＴコドンに
   変換された変異大腸菌リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子。 ３、ｔａｃプロモーターの支配下に第２項記載の変異大
   腸菌リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を含有している、大
   腸菌内で複製および発現可能な発現ベクター。 ４、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含有
   している第３項記載の発現ベクター。 ５、プラスミドｐＤＲ６０１である第３または４項記載
   の発現ベクター。 ６、第３−５項のいずれかに記載の発現ベクターで形質
   転換された形質転換体。 ７、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＤＲ６０１である第６項記載
   の形質転換体。 ８、第６または７項記載の形質転換体をリボヌクレアー
   ゼＨ遺伝子の発現に適した条件下で培養し、得られた培
   養液から変異大腸菌リボヌクレアーゼＨを回収すること
   からなる変異大腸菌リボヌクレアーゼＨの製造方法。