JPH01202284A - 変異大腸菌リボヌクレアーゼh - Google Patents

変異大腸菌リボヌクレアーゼh

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JPH01202284A
JPH01202284A JP2626188A JP2626188A JPH01202284A JP H01202284 A JPH01202284 A JP H01202284A JP 2626188 A JP2626188 A JP 2626188A JP 2626188 A JP2626188 A JP 2626188A JP H01202284 A JPH01202284 A JP H01202284A
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plasmid
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茂則 金谷
Junko Obara
淳子 小原
Morio Ikehara
池原 森男
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、酵素活性を改良された変異大腸菌リボヌクレ
アーゼH1該変異酵素をコードしている遺伝子、該遺伝
子を含有し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発
現ベクターを含有している形質転換体および該形質転換
体を用いて変異大腸菌リボヌクレアーゼHを製造する方
法に関するものである。
[従来技術とその問題点] 大腸菌のりポヌクレアーゼ11(以下、本明細書中では
単にリボヌクレアーゼHと称する)は155アミノ酸か
らなる分子置駒17Kdの加水分解酵素であって、DN
A −RNAハイブリッドのRNA鎖のみを特異的にエ
ンド作用で切断するという基質特異性を有する。そのよ
うな基質特異性に基づき、近年その発達の著しい遺伝子
工学において、下記の如き様々な作用を有する酵素とし
て極めて利用価値の高い酵素として注目されている。
1)cDNAのクローニングの際の鋳型mRNAの除去
2)mRNAのポリA領域の除去。
3)  RNAの断片化。
本酵素の重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます増
大すると確信される。該酵素は、大腸菌内での産生量が
極めて低いことから、遺伝子工学によるクローン化酵素
が製造され、既にBRL。
ファルマシアおよび宝酒造等から供給されている。
しかし、これらの市販のクローン化酵素ら、生産性が低
い上、単離、精製工程中の損失および失活等によって収
率が低く、高価なものとなっている。
従って、上記の様々な研究を推し進める上で有用な酵素
活性を有するリボヌクレアーゼ11が入手し易くなるこ
とが強く望まれている。
一般に、酵素の有効量はその量の多少に拘わらず、触媒
活性の高低に基づいて判断される。従って、酵素の比活
性を高めれば、実質上、酵素供給量が増大されたことに
なる。ところで、酵素、抗体等のタンパク質の機能を変
化させるために、それらのタンパク質をコードしている
DNA配列に突然変異を誘発してアミノ酸配列を改変す
る方法がしばしば用いられる。そのような操作の結果、
基質特異性および/または抗原との結合性を改良された
抗体、基質特異性や至適PHの変化した酵素、熱安定性
を改良された酵素等が得られている。
しかしながら触媒活性を増大された酵素が得られたとい
う例は殆んどなく、リボヌクレアーゼ[1についても、
本発明以前にそのような報告はなされていない。
従って、比活性の高められた、変異型のりボヌクレアー
ゼHを得ることができれば、実質上、該酵素の供給量が
増大されたことになる。しかも、変異りボヌクレアーゼ
I(精製標品には、天然型のりボヌクレアーゼHに通常
伴っているヌクレアーゼ等の夾雑タンパク質の混入が少
ないので、酵素試薬としてより高品質の精製標品の調製
が可能になるといえる。即ち、高比活性の酵素を得るこ
とによって、高品質の酵素標品を安価に供給することが
できることになる。
[間麗点を解決するための手段] 本発明者らは、上記の観点から、リボヌクレアーゼト■
の触媒活性を高めることを目的として、該酵素の遺伝子
に部位特異的突然変異を導入して様々なアミノ酸置換を
有する変異体を調製し、その酵素活性への影響を検討し
た結果、第13番目の−Cys(システィン)がS e
t(セリン)で置換されたアミノ酸配列を有する変異り
ボヌクレアーゼト■が、天然型のりボヌクレアーゼ■4
の約2倍の活性を有することを見出し、本発明を完成す
るに至った。
即ち、本発明は、第13番目のシスティンがセリンで置
換されたアミノ酸配列を何する変異りボヌクレアーゼ1
1を提供するものである。
また本発明は、リボヌクレアーゼH構造遺伝子のCys
13をコードしている′I″GTが部位特異的突然変異
によってSetをコードしているTCTに変換されてい
る、変異りボヌクレアーゼl]遺伝子を提供するもので
ある。
また本発明は変異りボヌクレアーゼI4を大腸菌で発現
させるための発現ベクターであって、Lacプロモータ
ーの支配下に上記変異りボヌクレアーゼト【遺伝子を含
有しているベクターを提供するものである。本発明の発
現ベクターは、プラスミドpUcts由来の複製起源を
含有しているので、大腸菌内で複製可能である。
また本発明は、上記の発現ベクターて形質転換された、
変異りボヌクレアーゼ)I産生性の形質転換体を提供す
るものである。
さらに本発明は、該形質転換体を培養することによって
、高いリボヌクレアーゼtl酵素活性を何する変異りボ
ヌクレアーゼ11を製造する方法を提供するものである
本発明の変異りボヌクレアーゼI−Iをコードしている
遺伝子は、以下の行程に従って得られた。
rnh遺伝子は、本発明者等(カナヤおよびクラウチ、
ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、25
8、+276−1281[1983])によって大腸菌
染色体からクローニングされている。このクローン化さ
れたプラスミドpSK750をrnh遺伝子の供給源と
して用い、第1図記載の行程に従ってM 13mpl 
8 RF’DNAにサブクローニングする。
まず、プラスミドpSK750の820bpEc。
R1−PstI断片を切り出し、該断片を市販のプラス
ミドpUc19のEcoRI −Pst I部位に挿入
し、プラスミドpsK820を得る。このプラスミドp
sK820を制限酵素Hg1A 1で切断してrnh遺
伝子を含む801 bpHgiA r断片を得、T4D
NAポリメラーゼ処理によって3′突出部分を平滑末端
化した後、市販のプラスミドpUC18のSma1部位
に挿入する。rnh遺伝子の向きがプラスミドpUc1
BのIacプロモーターと逆向    ・きのものを選
択してプラスミドpKs801と命名し、以後の実験に
用いる。
プラスミドpKs801からrnh遺伝子を含む600
bpEcoRr−Pstl断片を切り出し、市販のMl
 3mpl 81FDNAのEcoRI −Pst 1
部位に挿入してMl 3mpl 8(rnh)RFDN
Aを作成する。Ml 3mpl 8(rnh)RFDN
Aの組み立て模式図を第1図に示す。
2)  rnh遺伝子への部位特異的突然変異の導入上
記のM l 3mp1 B(rnh)RPDNAで大腸
菌TG−1を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
る。その上清から常法に従ってM13mp18(rnh
)環状1本鎖DNAを調製する。このM13mp 18
 (r?Ih)環状1本に′1DNAを、化学合成した
25 mer(1体)のオリゴヌクレオチドと混合し、
エックスタインら(E ckstein)の方法(Ta
ylor、 J 、W、。
Ott、J 、 and Eckstein、F、 (
1985)二ニークレイツク・アシッズ・リサーチ、1
3.8764−8785)を利用した市販のキット(ア
マ−ジャム)を用い、その指示に従って操作し、部位特
異的な点突然変異を導入する。この操作によって、Cy
s13のコドンTGTIJ<SerのコドンTCTで置
き換えられた変異rnh遺伝子を有するM13mp18
(rnh−13S)rtFDNAが得られる(第2図参
照)。以下、この変異rnh遺伝子によってコードされ
ている変異りボヌクレアーゼHを天然型リボヌクレアー
ゼHと区別するためにリボヌクレアーゼH(+39)と
称する。
3) リボヌクレアーゼH(+38)発現ベクターの措
築 前記のプラスミドpKs801から230bpEcoR
I断片を削除し、同時に5allリンカ−を用いてEc
oR1部位を5a11部位に変換してプラスミドpKs
600を得る。次いで、プラスミドpKS600からr
nh遺伝子を含む600bpXbaI −9al+断片
を切り出す。該断片を、大腸菌プロテアーゼ■発現用プ
ラスミドベクター1)DR42S(特許出願番号第62
−218973号)のptr遺伝子を含有する4、 3
kbXbal −9all断片と置換することにより、
天然型リボヌクレアーゼ8発現用プラスミドppnao
oを得る。次いで、このプラスミドpDR600の50
0bpXbal −9stII断片をM l 3mpl
 8(rnh −135)RFDNA由来の500bp
Xbal −9stII断片で置換することにより、本
発明のりボヌクレアーゼトI(13S)発現用プラスミ
ドpDrt601を得る。プラスミドpDR601の組
み立て模式図を第3図に、その制限酵素切断地図を第4
図に示す。
4) リボヌクレアーゼH(13S)の大腸菌内での発
現 上記のプラスミドpDR601を用いて大腸菌に一12
株JM109を形質転換し、得られた形質転換体をアン
ピシリン含有培地で培養する。対数増殖期にイソプロピ
ルβ−D−チオガラクトジッド(IPTG)を添加して
培養することにより、リボヌクレアーゼH(13S)を
発現させる。
次いで、リボヌクレアーゼl−1(13S)産生性形質
転換体の菌体を集菌し、リゾチーム−EDTA処理およ
び超音波処理によって可溶化し、遠心して得られた上清
を透析した後、DEAE−セルロース、P−11セルロ
ースおよびセファクリルS−300(S uper F
 1ne)各カラムクロマトグラフィーに順次かけるこ
とにより、リボヌクレアーゼ1−1(13s)の精製標
品を調製する。このようにして得られたりボヌクレアー
ゼH(+39)は、5DS−PAGEで単一のバンドを
与える程度にまで精製されている。上記の方法における
天然型リボヌクレアーゼ!−1の混入の程度は、大腸菌
に−12株JMI09の通常のりボヌクレアーゼトl産
生吊が極めて低いことから、極く僅かであると考えられ
る。所望の突然変異が導入されていることを、アミノ末
端からのアミノ酸の配列決定によって確認した。
[発明の作用] 本発明の変゛異リボヌクレアーゼ14は、[”P]p。
1y(rA )poly(dT )を基質として測定し
た場合、天然型リボヌクレアーゼ■4の約2倍の酵素活
性を有している。その酵素活性は、前記の様々な遺伝子
工学の分野で、天然型リボヌクレアーゼHと全く同等に
用い得るものである。従って、本発明は、高いリボヌク
レアーゼII活性を有する変異りポリメラ−ゼ0を提供
することによって、該酵素活性の供給を増大するもので
ある。
以下に実施例を挙げ14本発明をさらに詳しく説明する
実施例1  rnh遺伝子のM I 3mpl 8 R
F DNAへのサブクローニング rnh遺伝子源としてpsK750を用いた。プラスミ
ドpSK750(I 08g)を100μQの反応溶液
中、50ユニツトずつのPstlとEconlにより、
37℃で1時間消化した。次いで消化物を1.5%アガ
ロースゲル電気泳動にかけた。rnh遺伝子を含む82
0bp Econ I−Pstl断片をエレクトロエリ
ューション(電気溶出)によりアガロースゲルから抽出
した後、DE−52カラムクロマトグラフイーにより精
製した。エタノール沈澱により回収された8 20bp
 EcoRr−Pstr断片の量は約1μ?であった。
一方、プラスミドベクターpUC19(TOYOBO製
)(2μ9)を50μQの反応溶液中10ユニツトずつ
のPst[とEcoRIにより、37℃で1時間完全に
消化した。
消化物を0.7%アガロースゲル電気泳動にかけ、2.
7kb EcoRI−Pstl断片を820bp断片と
同様に溶出・精製した。回収率はほぼ100%であった
以上のようにして得られた8 2’ Obp及び2.7
kb EcoRI −Pst r断片それぞれo、t7
Bを混合し、20ggの反応溶液中、5ユニツトのT4
DNAリガーゼ(T OY OB O製)と共に16℃
で300分間反応せ、プラスミドの環化を行なった。
次いで環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転
換し、形質転換体よりプラスミドpSK820を得た。
次いで、このプラスミドpsK820(10μ9)を1
00μg反応溶液中、100ユニツトのI(g iAl
により37℃で1時間消化した。フェノール−クロロホ
ルム抽出後エタノール沈澱によりDNAを回収した後、
20μQの反応溶液中、2.5ユニツトのT4  DN
Aポリメラーゼを加え、37°Cで15分間反応させた
。65℃で5分間処理することにより反応を停止した後
、反応溶液を15%アガロースゲル電気泳動にかけ、r
nh遺伝子を含む801 bp IIgiA [断片を
、820bp Ec。
R1−Pstl断片の場合と同様に溶出・精製した。
DNAの回収量は2μ9であった。一方プラスミドベク
ターpUCI 8(TOYOBO製)(2μg)を50
ggの反応溶液中、IOユニットのSmarにより37
℃で1時間完全に消化し、次いで1ユニツトの大腸菌ア
ルカリ性フォスファターゼを加え、更に30分間37℃
で反応させた。フェノール−クロロホルム抽出法により
反応を停止した後、DNAをエタノール沈澱により回収
した。回収率はほぼ100%であった。
以」二のようにして得られた8 01 bp I[gi
A r断片と、SmaIで消化した後、大腸菌アルカリ
性フォスファターゼで処理したpocks、それぞれ0
.1μ9を混合し、20μQの反応溶液中、5ユニット
のT4  DNAリガーゼと共に16℃で30分間反応
させ、プラスミドの環化を行なった。
次いで環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転
換し、形質転換体よりプラスミドpKS80Iを得た。
次いで、このプラスミドpKs801(10μ?)を1
00μaの反応溶液中、50ユニツトのEc。
R1と50ユニツトのPstrにより37℃で1時間、
完全消化し、消化物を15%アガロースゲル電気泳動に
かけた。rnh遺伝子を含む600bpEcoRI −
Pst I断片を、820bp EcoR[−Pstr
断片の場合と同様に溶出・精製した。DNAの回収量は
約1μ9であった。一方、M13mp18r’(FDN
A(タカラ酒造製)2μ9を、20μQの反応溶液中、
10ユニツトのEcoRIとIOユニットのPstlに
より37℃で1時間、完全に消化した。消化物を0.7
%アガロースゲル電気泳動にかけ、7.2kb Eco
RI−PstT断片を820 bp EcoRI −P
st T断片と同様に溶出・精製した。DNAの回収量
は約1.5μ9であった。以上のようにして得られた6
00bp及び7.2kbEconr−PsLr断片それ
ぞれ0.IJt9を混合し、20μgの反応溶液中、5
ユニツトのT4 DNAリガーゼ(’royoBo製)
と共に、16℃で30分間反応させ、RF’ DNAの
環化を行なった。
次いで、環化したRP DNAで大腸菌T(、−1を形
質転換し、形質転換体より、MI3mp18Rr’ 1
)NAにrnh遺伝子が挿入されたM13mp18(r
nh)RF D N Aを得た(第1図参照)。
実施例2  rnh遺伝子への部位特異的突然変異の導
入 実施例1で得たMl 3mpl 8(rnh)RF D
NAで形質転換した大腸菌TG−1の培養」ユ清からの
一本鎖DNAの調製、オリゴヌクレオチドのリン酸化お
よびrnh遺伝子への点突然変異の導入は、いずれも、
アマ−ジャムから市販されているキット(オリゴヌクレ
オチド ブイレフテッド インビトロ ミュータゲネシ
ス システム)を用い、添付の説明書に正確に従って行
なわれた。オリゴヌクレオチドとしては、化学合成した
25merの5°−CCGATGGTTCGTCTCT
GGGCAATCC−3°を用いた。CysI3のコド
ンTGTがSerのコドンTCTに改変された変異りボ
ヌクレアーゼH遺伝子を含有するRFDNAをM 13
’mpl 8 (rnh −13SX第2図参照)と命
名し、以後の実験に用いた。
実施例3 リボヌクレアーゼl−1(13s)発現用プ
ラスミドpDr(601の構築 1、天然型リボヌクレアーゼ14発現用プラスミドpD
R600の構築 実施例1で得たプラスミドpKs801(第1図参照)
2μ9を20μgの反応溶液中、IOユニットのEco
RIにより37℃で1時間完全に消化した。エタノール
沈澱によりDNAを回収した後、20μQの反応溶液中
、2ユニツトのI)NAポリメラーゼ(フレノウ)を加
えて37℃で30分間反応さ仕、次いで、65℃で10
分間処理した。エタノール沈澱により回収したDNAを
20μσの反応溶液中、■ユニットの大腸菌アルカリ性
フォスファターゼを加えて37°Cで30分間処理した
後、反応溶液を0.7%アガロースゲル電気泳動にかけ
た。3.3kbDNA断片を実施例1記載の820bp
 Econ T−Pstl断片の場合と同様に溶出・精
製した。DNAの回収量は約1μりであった。得られた
DNA0.1μ9を5allリンカ−(宝酒造製)0.
01 tt9と混合(モル比1:50)l、、20μg
の反応溶液中、5ユニツトのT4  DNAリガーゼを
加えて16℃で30分間処理した。このようにして環化
したプラスミドで大腸菌JMIO9を形質転換し、形質
転換体よりプラスミドpKS600を得た。
次いで、プラスミドpKS 600(10μ9)を10
0μgの反応溶液中、50ユニツトのXbaIと50ユ
ニツトの5alIを用いて37°Cで1時間完全消化し
、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。600b
p XbaI −Sal !断片を切り出し、実施例1
記載の820bp EcoRI−Pstl断片の場合と
同様に溶出・精製を行なった。エタノール沈澱により回
収されたDNAのmは約1μ9であった。
一方、大腸菌プロテアーゼ■発現用プラスミドベクター
pDR42s(特許出願番号61−218973)5μ
9を100μQの反応溶液中、50ユニツトのXbal
と50ユニツトの5allを用いて37℃で1時間消化
し、0.7%アガロースゲル電気泳動にかけた。3.O
kb Xbal −8al T断片を切り出し、実施例
!記載の820bp EcoRI−Pstl断片の場合
と同様に溶出・精製を行なり、  た。エタノール沈澱
により回収されたDNAの量は約Iμ9であった。
以上のようにして得られた6 00bp Xbal −
5all断片0.1μ9と3.0kb XbaI−8a
ll断片O91μ9とを混合し、20μσの反応溶液中
、5ユニツトのT4  DNAリガーゼにより16°C
で30分間処理し、プラスミドを環化した。環化したプ
ラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体
より天然型リボヌクレアーゼ14発現用プラスミドベク
ターpDR600を得た。
2、リボヌクレアーゼH(13s)発現用プ2スミドp
D11601の構築 1で得たプラスミドpDR600の天然型rnh遺伝子
を、以下のようにして、変異型rnh遺伝子で置換した
。まず、プラスミドpDR600(2μ9)を50μg
の反応溶液中、!0ユニットのXbalとIOユニット
の5stllを用いて37℃で1時間、完全消化し、0
.7%アガロースゲル電気泳動にかけた。3.lkb 
Xbal −9stll断片を切り出し、前記820b
p EcoRI−Pstl断片の場合と同様に溶出・精
製を行なった。エタノール沈澱により回収されたDNA
の量は約1.5μりであった。
一方、実施例2で得たM 13mpl 8 (rnh 
−135)RF’ DNA(5μg)を100μρの反
応溶液中、50ユニツトのXbalおよび50ユニツト
のSst■により37℃で1時間、完全消化し、消化物
を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。500b
p XbaI−8stll断片を切り出し、上記820
 bp’EcoRI −Pst I断片の場合と同様に
溶出・精製を行なった。エタノール沈澱により回収され
たDNAの量は約0.2μ9であった。以上のようにし
て得られた5oobpおよび3 、1 kbのXbaT
−SstU断片、それぞれ0.1μ9を混合し、20μ
gの反応溶液中、5ユニツトのT4  DNAリガーゼ
により16℃で30分間処理し、プラスミドを環化した
。環化したプラスミドで大腸菌JM!09を形質転換し
、形質転換体よりプラスミド1)DR601を得た。
上記のようにして得たりボヌクレアーゼH(13S)発
現用プラスミドpDR601の詳細な制限酵素切断地図
を第4図に示した。形質転換菌ニジエリシア・コリ(灰
、 coli)JMI 09/pDR601は、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工研菌
寄第9708号、寄託日:昭和62年11月14日)。
実施例4 リボヌクレアーゼH(13S)の大腸菌にお
ける生産と精製 1、形質転換体JMI 09/pDR601の培養 形質転換体JMI O9/pDR601を、80μ9の
アンピシリンを含むLB培地+12中、37℃で振盪培
養した。培養液の測度がクレット値で100萌後まで生
育した時点で、I PTGを、最終濃度0.8mMとな
るように添加し、更に5時間振盪を続けた後、集菌した
。この時のクレット値は約120、菌体の湿重量は約1
.59であった。
2、菌体からのりボヌクレアーゼH(13°S)の抽出
・精製 上記lで得た菌体を5村のO,1M NaCf2と25
%シュークロースを含む10mM)リス塩酸緩衝液(p
H8)に懸濁した後、5 、2 mgのりゾチームと0
.1M EDTAを含む0.3M)リス塩酸緩衝液(p
H8)1.33iCを加えた。水中に5分放置した後、
超音波処理により菌を破砕した。15000rpmで3
0分間、4℃で遠心して得た遠心上清(粗抽出液)を、
1mM EDTA、1mMβ−メルカプトエタノール及
び10%グリセリンを含む50mtvlトリス塩酸緩衝
液(pH7,5)に対して透析した。次いで、同緩衝液
で平衡化したDE−52カラム(〜6 tpQ)及びP
−11カラム(〜4肩のにこの順序で通した。この条件
下、リボヌクレアーゼl1(13s)は、DE−52カ
ラムを素通りし、P−11カラムに吸着する。NaC(
2a度を直線的に上昇さ仕ろことによりP−11カラム
からりボヌクレアーゼl13S)を溶出した。最後に、
P=lIカラムからの溶出画分を、1mM DTT。
ImM EDTA、0.08M NaC(!及び10%
グリセリンを含む、l0mMトリス塩酸緩衝液(pH7
,5)で平衡化したセファクリルS−300(スーパー
ファイン)カラム(φ1.6X190cだ)にかけるこ
とにより、リボヌクレアーゼH(+3S)を、5DS−
PAGEで単一バンドを与えるまでに精製した。以上の
全精製操作を通じてのりボヌクレアーゼH(13S)の
回収率は、約60%であった。
精製収量は、約3mg/ρ培養液であり、これは、JM
I 09/pDR600からの天然型リボヌクレアーゼ
■(の精製収量5 mg/ρと比較してそれほど変化な
かった。なお、天然型リボヌクレアーゼI(とりボヌク
レアーゼH(13S)は、上記精製操作では分離しない
ので、リボヌクレアーゼH(139’)精製標品には、
宿主として用いたJMIO9に由来する天然型リボヌク
レアーゼHが混入している。しかし、大腸菌JMi09
からの天然型リボヌクレア・−ゼIIの精製収量は、通
常、約5μ9/12であることから、混入している割合
は、約0゜16%と極めて低い。従って、本精製標品の
性質は、リボヌクレアーゼI−r(13S)の性質を反
映しているとみなすことができる。精製標品の同定は、
アミノ末端からのアミノ酸配列を分析し、13番口のア
ミノ酸がSetに変異していることを確認することによ
り行った。
実施例4で得たりボヌクレアーゼH(+3S)の酵素活
性を以下の実験例の記載の如くにして評価した。
夫に剋 リボヌクレアーゼH(13S)の酵素活性の評
価 天然型リボヌクレアーゼHの酵素活性とりボヌクレアー
ゼI((+3s)の酵素活性を[32P ]poly(
rA)poly(dT)を基質として測定し、比較した
。その結果を表1に示す。表Iから、リボヌクレアーゼ
H(13S)の比活性は天然型′に比べて約2倍に上昇
していることが分る。
・活性は、37℃、15分間にI nmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素量を1ユニツトと定義した。
・タンパク量は、A9a!”−+、oとして計算した。
[発明の効果] 本発明によって得られる変異りボヌクレアーゼHは、そ
の酵素活性が天然型リボヌクレアーゼHの約2倍である
ことから、従来の、酵素試薬よりも少指で同等の触媒作
用を示すこととなる。従って、本発明によって、実質上
、該酵素の供給量が増大されたことになる。また、本発
明方法によれば天然型リボヌクレアーゼHに伴なってい
る夾雑タンパク質の混入を減少し得るので、より高品質
の精製標品を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
第1図はrnh遺伝子のMI3mpRF DNAへのサ
ブクローニングの概略を示す模式図である。第2図は合
成オリゴヌクレオチド(25mer)を用いて天然型リ
ボヌクレアーゼH遺伝子に部位特異的突然変異を導入し
てリボヌクレアーゼH(+3S)遺伝子を得る反応を示
す模式図である。図中、点突然変異導入部位には☆印、
突然変異に該当ずろアミノ酸には下線を付して示した。 第3図はプラスミドpDR601の組立て模式図である
。第4図はプラスミドpDrZ601の制限酵素切断地
図である。 特許出願人 株式会社蛋白工学研究所 代 理 人 弁理士 前出 葆 (ほか1名)第1図−
1 第1図−2 「 第3図−1 第3図−2 L 第4図 NdeI(0,旧]

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、大腸菌リボヌクレアーゼHのアミノ酸配列において
    、第13番目のシステインがセリンで置換されたアミノ
    酸配列を有する変異大腸菌リボヌクレアーゼH。 2、大腸菌リボヌクレアーゼHをコードしている構造遺
    伝子において、第13番目のシステインのTGTコドン
    が部位特異的突然変異によってセリンのTCTコドンに
    変換された変異大腸菌リボヌクレアーゼH構造遺伝子。 3、tacプロモーターの支配下に第2項記載の変異大
    腸菌リボヌクレアーゼH構造遺伝子を含有している、大
    腸菌内で複製および発現可能な発現ベクター。 4、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含有
    している第3項記載の発現ベクター。 5、プラスミドpDR601である第3または4項記載
    の発現ベクター。 6、第3−5項のいずれかに記載の発現ベクターで形質
    転換された形質転換体。 7、大腸菌JM109/pDR601である第6項記載
    の形質転換体。 8、第6または7項記載の形質転換体をリボヌクレアー
    ゼH遺伝子の発現に適した条件下で培養し、得られた培
    養液から変異大腸菌リボヌクレアーゼHを回収すること
    からなる変異大腸菌リボヌクレアーゼHの製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998036076A1 (fr) * 1997-02-14 1998-08-20 Higeta Shoyu Co., Ltd. Proteine antigene modifiee derivant du treponeme pale

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