JPH01169342A - 蛍光測定法 - Google Patents
蛍光測定法Info
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- JPH01169342A JPH01169342A JP32705087A JP32705087A JPH01169342A JP H01169342 A JPH01169342 A JP H01169342A JP 32705087 A JP32705087 A JP 32705087A JP 32705087 A JP32705087 A JP 32705087A JP H01169342 A JPH01169342 A JP H01169342A
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、蛍光２波長測光に係り、特に、連続的に多数
検体を処理する自動分析装置に用いるのに好適な測定法
に関する。
検体を処理する自動分析装置に用いるのに好適な測定法
に関する。
従来の蛍光直接測光では、キュベツトが異なると全く同
じ溶液を測定したとしても、ばらつきが大きかった。こ
れは、キュベツトの個体差に由来するもので、この個体
差はキュベツト表面のゆがみや肉厚あるいは、キュベツ
ト表面上のわずかな傷によって、生じてしまう。それで
はキュベツトを同一にした場合、つまりフローセルにし
て測光する手段もあるが、この場合フローセル中の各検
体間でのキャリーオーバ、そのキャリーオーバを防ぐた
めの洗浄機構、フローセル中での反応を一定にするため
の恒温槽の設置など、ハードのコストが高価になってし
まう。
じ溶液を測定したとしても、ばらつきが大きかった。こ
れは、キュベツトの個体差に由来するもので、この個体
差はキュベツト表面のゆがみや肉厚あるいは、キュベツ
ト表面上のわずかな傷によって、生じてしまう。それで
はキュベツトを同一にした場合、つまりフローセルにし
て測光する手段もあるが、この場合フローセル中の各検
体間でのキャリーオーバ、そのキャリーオーバを防ぐた
めの洗浄機構、フローセル中での反応を一定にするため
の恒温槽の設置など、ハードのコストが高価になってし
まう。
さらに異なるキュベツトで、連続的に多数の反応キュベ
ツトを測光する自動分析装置においては、反応キュベツ
トの測光ポイントでの停止位置が問題となる。この停止
位置のずれによって起こるばらつきは、同一キュベツト
を用いたとしてもＣ■で３％が限度である。まして異な
るキュベツトを使用して、停止位置のずれによって生ず
るばらつきは問題外であった。
ツトを測光する自動分析装置においては、反応キュベツ
トの測光ポイントでの停止位置が問題となる。この停止
位置のずれによって起こるばらつきは、同一キュベツト
を用いたとしてもＣ■で３％が限度である。まして異な
るキュベツトを使用して、停止位置のずれによって生ず
るばらつきは問題外であった。
直接測光で、上記の問題点を克服している自動分析装置
で、蛍光偏光法と、トップ／トップ測光法がある。偏光
法では、反応量を偏光度合で測光しているため、上記の
問題がないものの、α−フェトプロティンの様な蛋白抗
原を原理的に測定できない。一方、トップ／トップ測光
法では、キュベツト面の側光を光が通過していないため
、キュベツトの個体差は１問題にならない。しかし、液
面のゆらぎによる測光のばらつきが大きい。液面ゆらぎ
を除くためには、多重測光と、反応キュベツトが停止し
たまま２分間反応を測光しなければならない。これでは
反応を連続的に秒単位で、多数検体を測光することはで
きない。
で、蛍光偏光法と、トップ／トップ測光法がある。偏光
法では、反応量を偏光度合で測光しているため、上記の
問題がないものの、α−フェトプロティンの様な蛋白抗
原を原理的に測定できない。一方、トップ／トップ測光
法では、キュベツト面の側光を光が通過していないため
、キュベツトの個体差は１問題にならない。しかし、液
面のゆらぎによる測光のばらつきが大きい。液面ゆらぎ
を除くためには、多重測光と、反応キュベツトが停止し
たまま２分間反応を測光しなければならない。これでは
反応を連続的に秒単位で、多数検体を測光することはで
きない。
また吸光度測定を用いた自動分析装置においても吸光度
の２波長測光で分析を行っている。しかしながら吸光度
測定では、反応キュベツトのゆがみ、あるいは傷の補正
は、水ブランクの測定によって、１波長で行っている。
の２波長測光で分析を行っている。しかしながら吸光度
測定では、反応キュベツトのゆがみ、あるいは傷の補正
は、水ブランクの測定によって、１波長で行っている。
また反応キュベツトの停止位置のずれは、吸光度測定で
は全く問題にならない。２波長測光はビリルビンなどの
サンプル由来の夾雑物の吸収をキャンセルするために、
吸光度測定法で用いられていた。
は全く問題にならない。２波長測光はビリルビンなどの
サンプル由来の夾雑物の吸収をキャンセルするために、
吸光度測定法で用いられていた。
蛍光直接測光において、キュベツト補正を行うのに、水
あるいは他の緩衝液、他の安定な蛍光物質を反応キュベ
ツトに入れ、あらかじめブランク値を測定する方法もあ
る。しかしこの場合水緩衝液では蛍光物質に比べ、蛍光
量が十分でないため、完全な反応キュベツトの補正をす
ることはできない。−力量光物質を一定量入れ、ブラン
ク値を測定する場合は、硫酸キニーネの様な安定な物質
を用いることが考えられる。この硫酸キニーネでは。
あるいは他の緩衝液、他の安定な蛍光物質を反応キュベ
ツトに入れ、あらかじめブランク値を測定する方法もあ
る。しかしこの場合水緩衝液では蛍光物質に比べ、蛍光
量が十分でないため、完全な反応キュベツトの補正をす
ることはできない。−力量光物質を一定量入れ、ブラン
ク値を測定する場合は、硫酸キニーネの様な安定な物質
を用いることが考えられる。この硫酸キニーネでは。
現在の反応キュベツト洗浄機構で完全に残らない様に洗
うのは困難であり、しかも残留した時には、酵素反応あ
るいは、抗原抗体反応に悪影響をおよぼす。さらには蛍
光測定にもプラスの影響を与え、ＨＣＧなどの測定項目
では、妊娠していると誤診されてしまう、他の蛍光物質
でも同様な影響を与えるため、あらかじめブランク値測
定するのは困難である。
うのは困難であり、しかも残留した時には、酵素反応あ
るいは、抗原抗体反応に悪影響をおよぼす。さらには蛍
光測定にもプラスの影響を与え、ＨＣＧなどの測定項目
では、妊娠していると誤診されてしまう、他の蛍光物質
でも同様な影響を与えるため、あらかじめブランク値測
定するのは困難である。
上記従来技術は、多数検体を連続的に、秒単位で処理す
る自動分析装置に蛍光直接測光を採用しようとすると１
反応キュベツトの個体差、キュベツトの傷、キュベツト
の停止位置のずれによって生じるばらつきが大きいとい
う点について、配慮がされておらず、反応キュベツト補
正ができないという問題があった。
る自動分析装置に蛍光直接測光を採用しようとすると１
反応キュベツトの個体差、キュベツトの傷、キュベツト
の停止位置のずれによって生じるばらつきが大きいとい
う点について、配慮がされておらず、反応キュベツト補
正ができないという問題があった。
本発明の目的は、自分折装置に応用が容易な。
蛍光直接測光において、キュベツト補正をし、高い測定
精度を得ることにある。
精度を得ることにある。
上記目的は、蛍光直接測光において、反応生成物の蛍光
量から正確な分析結果を得るために、蛍光側２波長を測
光し、２波長の蛍光量の差をとることにより達成される
。
量から正確な分析結果を得るために、蛍光側２波長を測
光し、２波長の蛍光量の差をとることにより達成される
。
蛍光２波長測光は、蛍光側の分光器のきりわけによって
行なわれる。これは、蛍光２波長間でのみ分光器の移動
が行なわれることにより達成される。
行なわれる。これは、蛍光２波長間でのみ分光器の移動
が行なわれることにより達成される。
また、分光器の部位にフィルターを加えるか、ハーフミ
ラ−を付け、光電素子を２個にして、測光することも可
能である。
ラ−を付け、光電素子を２個にして、測光することも可
能である。
蛍光量を直接反応キュベツトに光を照射して測定する場
合、反応キュベツトの表面のゆがみ、あるいはキュベツ
トの傷などの反応キュベツトの個体差に由来して蛍光強
度がばらつき、反応キュベツトの停止位置のずれによっ
ても蛍光強度はばらつく。
合、反応キュベツトの表面のゆがみ、あるいはキュベツ
トの傷などの反応キュベツトの個体差に由来して蛍光強
度がばらつき、反応キュベツトの停止位置のずれによっ
ても蛍光強度はばらつく。
しかし、同一反応キュベツトで、同一濃度の反応生成物
の蛍光量を測定するならば、蛍光量は一定の値を示すは
ずである。確かに同一濃度の反応生成物を含む溶液を同
じ反応キュベツトで１反応キュベツトを固定させて測光
すると、蛍光量は一定となる。
の蛍光量を測定するならば、蛍光量は一定の値を示すは
ずである。確かに同一濃度の反応生成物を含む溶液を同
じ反応キュベツトで１反応キュベツトを固定させて測光
すると、蛍光量は一定となる。
ここで、ある蛍光波長のＡｎｍの蛍光強度を工＾、別の
蛍光波長Ｂｎｍの蛍光量ＩＢとおく。
蛍光波長Ｂｎｍの蛍光量ＩＢとおく。
また工＾、Ｉｓを測定した時と同一濃度の反応生成物を
含んだ溶液を異なるキュベツトで測定した時の蛍光量を
それぞれ工′＾、Ｉ′Ｂとする。これら蛍光強度工＾１
■Ｂ、 Ｉ′＾、工ＩＢを第１図の蛍光スペクトル
に示す。このときＡとＢの波長が近ければ、反応キュベ
ツトのゆがみ、傷等に由来する影響度合は同じはずであ
る。ゆえに、Ａの波長における工＾、工′＾の蛍光量の
差にと波長已における蛍光量の差に′とは同じになるに
＝に’。
含んだ溶液を異なるキュベツトで測定した時の蛍光量を
それぞれ工′＾、Ｉ′Ｂとする。これら蛍光強度工＾１
■Ｂ、 Ｉ′＾、工ＩＢを第１図の蛍光スペクトル
に示す。このときＡとＢの波長が近ければ、反応キュベ
ツトのゆがみ、傷等に由来する影響度合は同じはずであ
る。ゆえに、Ａの波長における工＾、工′＾の蛍光量の
差にと波長已における蛍光量の差に′とは同じになるに
＝に’。
■＾−工′＾：Ｉａ−Ｉ’ａとなり、Ｉ八−Ｉａ＝Ｉ’
＾−Ｉ’ａが成り立つ。
＾−Ｉ’ａが成り立つ。
ここで、Ｉ＾−Ｉａ＝＝Ｉ’＾−Ｉ’Ｂ＝にとおくと、
ｋは反応生成物の濃度に比例して、増加する。反応生成
物の例として、 ４−＋ｓｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆ
ｅｒｏｎｅ通称ＭＵＢの蛍光量の差と濃度の関係を第２
図に示す。第２図より、反応生成物ＭＵＢの濃度に比例
して蛍光量の差、つまりＩ＾−Ｉａ＝Ｋが増加すること
がわかる。には、同一濃度のＭＵＢの時には一定の値を
示す。つまり蛍光２波長を測光し、蛍光量の差をとるこ
とにより、反応キュベツトの個体差、あるいは反応キュ
ベツトの停止位置のずれによって生ずるばらつきは補正
できる。
ｋは反応生成物の濃度に比例して、増加する。反応生成
物の例として、 ４−＋ｓｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆ
ｅｒｏｎｅ通称ＭＵＢの蛍光量の差と濃度の関係を第２
図に示す。第２図より、反応生成物ＭＵＢの濃度に比例
して蛍光量の差、つまりＩ＾−Ｉａ＝Ｋが増加すること
がわかる。には、同一濃度のＭＵＢの時には一定の値を
示す。つまり蛍光２波長を測光し、蛍光量の差をとるこ
とにより、反応キュベツトの個体差、あるいは反応キュ
ベツトの停止位置のずれによって生ずるばらつきは補正
できる。
実施例（１）
第３図に自動分析装置のキュベツトと測光部を示す０反
応キュベツト３は、同心円上に並び、反応キュベツト３
の下に光源１が有る。蛍光側分光器５と、６光電素子は
キュベツトと同一平面上に有る６蛍光２波長は蛍光側分
器のきりかえによって行う、各反応キュベツトに、ＭＵ
Ｂ濃度０．９Ｘ １０−６Ｍ（７）溶液を５ｏＯμＱず
つ分注り、２０個の反応キュベツトについて、測光を行
った。励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ、４６０ｎｍの
２波長測光とした１表２にその測定結果を示す。蛍光波
長４５０ｎｍでの蛍光強度はキュベツトの個体差、ある
いは、ターンテーブルの停止位置のずれによって起こる
ばらつきの影響をうけ、再現性ＣＶ３．１％である。し
かし、Ｉ ４＋５０ Ｉ ａ６ｏの２波長差をとるこ
とにより、再現性０．３５％ となる。
応キュベツト３は、同心円上に並び、反応キュベツト３
の下に光源１が有る。蛍光側分光器５と、６光電素子は
キュベツトと同一平面上に有る６蛍光２波長は蛍光側分
器のきりかえによって行う、各反応キュベツトに、ＭＵ
Ｂ濃度０．９Ｘ １０−６Ｍ（７）溶液を５ｏＯμＱず
つ分注り、２０個の反応キュベツトについて、測光を行
った。励起３６０ｎｍ、蛍光４５０ｎｍ、４６０ｎｍの
２波長測光とした１表２にその測定結果を示す。蛍光波
長４５０ｎｍでの蛍光強度はキュベツトの個体差、ある
いは、ターンテーブルの停止位置のずれによって起こる
ばらつきの影響をうけ、再現性ＣＶ３．１％である。し
かし、Ｉ ４＋５０ Ｉ ａ６ｏの２波長差をとるこ
とにより、再現性０．３５％ となる。
すなわち、２波長差をとることにより、ＭＵＢの濃度に
対して正確な蛍光強度が得られ、この蛍光量をもとに分
析目的物質の濃度が再現性良く得られることになる。
対して正確な蛍光強度が得られ、この蛍光量をもとに分
析目的物質の濃度が再現性良く得られることになる。
実施例（２）
分析目的物質のＴ４を含むサンプル５０μＱと。
Ｔ４に対する抗体液１００μＱ、酵素液（β−ガラクト
シダーゼ）２００μＱと、基質誘導体（ガラクトース）
で標識したウンベリフェロン、テオフィリン結合体５ｏ
μＱ、およびＢｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８，５）１００
μＱを３７℃、３０分間反応させた。サンプル中のテオ
フィリンと基質誘導体標識ウンベリフェロン、チオフィ
ン結合体が競合して抗体と反応する。抗体に結合できな
かった基質誘導体標識ウンベリフェロン、チオフィン結
合体が、酵素（β−ガラクトシダーゼ）の触媒作用によ
り加水分解した結果生成する蛍光物質の蛍光波長４５０
ｎｍと４６０ｎｍの蛍光量を測定した。テオフィリン濃
度は、あらかじめ測定しておいた標準曲線から求められ
る。測定は励起波長３６０ｎｍを用いた。このときの測
定現性を次に示す。
シダーゼ）２００μＱと、基質誘導体（ガラクトース）
で標識したウンベリフェロン、テオフィリン結合体５ｏ
μＱ、およびＢｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８，５）１００
μＱを３７℃、３０分間反応させた。サンプル中のテオ
フィリンと基質誘導体標識ウンベリフェロン、チオフィ
ン結合体が競合して抗体と反応する。抗体に結合できな
かった基質誘導体標識ウンベリフェロン、チオフィン結
合体が、酵素（β−ガラクトシダーゼ）の触媒作用によ
り加水分解した結果生成する蛍光物質の蛍光波長４５０
ｎｍと４６０ｎｍの蛍光量を測定した。テオフィリン濃
度は、あらかじめ測定しておいた標準曲線から求められ
る。測定は励起波長３６０ｎｍを用いた。このときの測
定現性を次に示す。
表 ２
この結果では、４５０ｎｍの蛍光量の測定の再現性はＣ
Ｖ２．６％であるが、ｌ４５０−４ｅｏの蛍光量の差は
再現性のＣＶｏ、２９％ と良好の結果が得られた。
Ｖ２．６％であるが、ｌ４５０−４ｅｏの蛍光量の差は
再現性のＣＶｏ、２９％ と良好の結果が得られた。
以上の結果から、蛍光２波長差をとりキュベツト補正を
行うことにより、測定の再現性が著しく向上した。
行うことにより、測定の再現性が著しく向上した。
本発明によれば、蛍光側を２波長設定し、測定すること
により、キュベツトの個体差、停止位置のずれによるば
らつきを補正することができ、高い測定精度が得られる
０反応キュベツトから直接蛍光量が測定でき、正確な値
が得られるため、連続的に多数の検体を迅速に処理する
ことができるので、自動分析装置の処理能力が向上する
。
により、キュベツトの個体差、停止位置のずれによるば
らつきを補正することができ、高い測定精度が得られる
０反応キュベツトから直接蛍光量が測定でき、正確な値
が得られるため、連続的に多数の検体を迅速に処理する
ことができるので、自動分析装置の処理能力が向上する
。
第１図は蛍光スペクトルを示す図、第２図はＭＵＢの濃
度と蛍光量の関係を示す図、第３図は実施例（１）、（
２）の測光部を示す図である。 １・・・光源、２・・・励起側分光器、３・・・反応キ
ュベツト、４・・・反応液、５・・・蛍光側分光器、６
・・・光電素子、７・・・ターンテーブル。 躬 １ 図 覚え波長（走り ′８２ 口 Ｍｕｌｆ５壊虐（〕Ｍ）
度と蛍光量の関係を示す図、第３図は実施例（１）、（
２）の測光部を示す図である。 １・・・光源、２・・・励起側分光器、３・・・反応キ
ュベツト、４・・・反応液、５・・・蛍光側分光器、６
・・・光電素子、７・・・ターンテーブル。 躬 １ 図 覚え波長（走り ′８２ 口 Ｍｕｌｆ５壊虐（〕Ｍ）
Claims (1)
- １、反応キユベツト中の反応生成物の蛍光強度を測定し
て分析を行う蛍光直接測光において、蛍光側２波長の蛍
光強度を測光し、各蛍光強度の差をとることにより、キ
ユベツト補正をすることを特徴とする蛍光測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32705087A JPH01169342A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 蛍光測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32705087A JPH01169342A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 蛍光測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01169342A true JPH01169342A (ja) | 1989-07-04 |
Family
ID=18194747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32705087A Pending JPH01169342A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 蛍光測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01169342A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016020845A (ja) * | 2014-07-14 | 2016-02-04 | 株式会社東芝 | 自動分析装置 |
-
1987
- 1987-12-25 JP JP32705087A patent/JPH01169342A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016020845A (ja) * | 2014-07-14 | 2016-02-04 | 株式会社東芝 | 自動分析装置 |
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