JPH01160988A - ドコサヘキサエノイルジアシルグリセロールの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は癌細胞に対して強い分化Ｒ’ｆＨａ活性を示す
ドコサヘキサエン酸を含有するジアシルグリセロールの
製造法に関し、更に詳細にはＳｎ−２位にドコサヘキサ
エン酸を結合しているＳｎ−Ｌ２−ジアシルグリセロー
ルを水産動物の卵から分画したホスファチジルコリンか
ら製造する方法に関する。

（従来の技術） ω−３系高度不飽和脂肪酸の１つであるドコサヘキサエ
ン酸はエイコサペンタエン酸同様、血中のコレステロー
ルやトリグリセリド濃度を低下させ血小板凝集を抑制す
る作用が知られている。−方、細胞膜を構成する脂質二
重層の流動性は、脂質の構成脂肪酸に支配されている。

そのため、ドコサヘキサエン酸の様な高度不飽和脂肪酸
の取込みは、細胞膜脂質の流動性を変化させ、細胞膜の
修飾を経て細胞内に情報を伝達させるために利用されて
いる。

特に細胞のホルモン作用発現機構とリン脂質代謝の関係
から細胞膜中のホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン、およびジアシルグリセロールに存在
するドコサヘキサエン酸は細胞膜脂質中に立体規則的に
分布していることが知られており、ドコサヘキサエン酸
は細胞機能の発現に大きく関与していると思われる。

本発明者らはＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸を有する
ホスファチジルコリンにフレンド白血病細胞、マウス骨
髄性白血病細胞、マウス奇形腫細胞を正常細胞へ分化誘
導する作用を先に見出した（特開昭５９−４６２２６号
）。一方、アール・カンナギら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　７１２　
ｒ　１６１〜１６８．１’９８２）はネズミ骨髄性白血
病細胞の分化誘導前後に細胞膜リン脂質のホスファチジ
ルコリンのドコサヘキサエン酸含量が１／１０に減少す
ることを報告している。さらに本発明者らはＳｎ−２位
にドコサヘキサエン酸を有するホスファチジルコリンを
強力な発生および分化の場となる受精卵に含まれる分化
誘導物質として見出した際に、このホスファチジルコリ
ン以外の脂質にも分化誘導活性を認めた。その活性物質
はパルミチン酸−ドコサヘキサエン酸およびオレイン酸
−ドコサヘキサエン酸のジアシルグリセロールの混合物
であった（日本農芸化学会、昭和５８年度大会講演要旨
集、１１８頁、２Ｈ−１特開昭６０−５８９１７号）。

以上の如くドコサヘキサエン酸を含むジアシルグリセロ
ールの生化学的な重要性が発見されるようになったが、
これらの製造に関してはこれまで開発されていないのが
現状である。

（発明が解決しようとする問題点） ドコサヘキサエン酸は水産動物の脂肪組織中ではトリア
ジルグリセロールとして存在し、動物の生体組織中では
細胞膜構成成分の極性脂質中に見出される。特に動物に
おいてドコサヘキサエン酸に富む部位は脳の髄鞘、視神
経の枠体および肝臓等が知られているが、主としてリン
脂質に局在している。また比較的入手が容易な血球や卵
黄のリン脂質や、水産動物のリン脂質にもドコサヘキサ
エン酸は豊富である。

グリセロールのＳｎ−１位とＳｎ−２位に特定脂肪酸を
組み込んでＳｎ−１，２−ジアシルグリセロールを合成
する方法は既に知られている。これらの合成法では合成
過程においてＳｎ−１，２−ジアシルグリセロールが非
常に高い比率でＳｎ−１，３−ジアシルグリセロールに
マイグレーション（転移）する。そのためＳ　ｎ　−１
＋　２位に異なる脂肪酸を組み込む事は難しい。化学合
成法ではＳｎ−１位とＳｎ−３位を区別して反応する事
は非常に難しく、さらにＳｎ−１，２−ジアシルグリセ
ロールとＳｎ−２，３−ジアシルグリセロールの分離が
困難である。

グリセロールのＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸を結合
させた混酸基ジアシルグリセロールの合成を従来法で実
施すると、α−モノクロルヒドリンの一級水酸基にドコ
サヘキサエン酸以外の脂肪酸クロライドでアシル化し、
さらにドコサヘキサエン酸クロライドでＳｎ−２位をア
シル化し、硝酸銀処理、希酸処理と複雑な工程を経由す
ることになる。

この従来法では、■脱りロライドで生成する水酸基がＳ
ｎ−２位に転位し、多量のＳ　ｎ　−Ｌ　３−ジアシル
グリセロールを生成する、■合成物にＳｎ−１１２−ジ
アシルグリセロールとＳｎ−２，３−ジアシルグリセロ
ールが混在すると両者を識別出来ない、■ドコサヘキサ
エン酸のクロライド化の際、二重結合のマイグレーショ
ンが生じ易い等の欠点を有している。

そのため得られるジアシルグリセロールは細胞レベルの
実験で、厳しい立体構造の識別を行う酵素やレセプター
に対して正確に認識されない。例えばビー・ジエー・ホ
ルダらは血小板に対してその酵素反応系を活性化するジ
アシルグリセロールは、イノシトールリン脂質の加水分
解物と同一の立体構造を示すＳｎ−２位に高度不飽和脂
肪酸を有スるＳｎ−１，２−型ジアシルグリセロールで
ある事を証明している（Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　
１１．５５８〜５６４、１９８１）。

上述のように現在まで、Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン
酸を有するジアシルグリセロールを天然原料から直接分
取したり、化学合成のみで製造する事は非常に困難であ
った。

従って、本発明の目的は、経済的、且つ高収率にて、出
来るだけ簡単な工程によりＳｎ−２位にドコサヘキサエ
ン酸を有するジアシルグリセロールを製造することにあ
る。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、水産動物の卵を原料としてホスファチジルコ
リンを分離し、次いで逆相分配カラムクロマト処理した
後にホスホリパーゼＣで加水分解することを特徴とする
。本発明方法を行うことによりＳｎ−１位に飽和酸又は
モノエン酸を結合し、Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸
を結合したＳｎ−１，２−ジアシルグリセロールが容易
に得られる。

以下本発明につき更に詳細に説明する。

本発明者らは、先に低毒性で制癌性を有する物質を動物
、植物、微生物界の広い生物範囲から探索し、その結果
、強力な発生および分化の場となる受精卵について、水
産動物の一種であるニジマス（Ｓａｌｍａ　ｇａｉｒｄ
ｎｅｒｉ）の胚を用いて、この胚中の総脂質中に活性が
あることを示した（旭健−：癌細胞の分化誘導と制癌（
穂積本男、高久史麿編）、２６１〜２７８頁、ソフトサ
イエンス社、東京、１９８５）。

これらの物質は未分化培養癌細胞に対する分化誘導能を
指標として検索された。このバイオアッセイで見出され
たコリン含有リン脂質は、動物の腫瘍細胞に対して分化
誘導活性を有する他に、著しく低毒性で優れた制癌活性
を持っていた。コリン含有リン脂質にはスフィンゴリン
脂質とグリセロリン脂質の二つの大群が知られているが
、前者に属するスフィンゴミエリンのアミド結合が見出
されないことから後者に属することが推定された。

後者にはモノアシルモノエーテル型、ジアシルエステル
型、モノアシル−１−モノアルケニルエーテル（プラズ
マロゲン）型、モノアシル（リゾ）型が存在するが、質
量分析より求めた分子ＩＭ、ホスホリパーゼＡ、（Ｓｎ
−１位のエステル結合を特異的に加水分解する）、ホス
ホリパーゼＡ２（Ｓｎ−２位のエステル結合を特異的に
加水分解する）の加水分解によって脂肪酸が別々に得ら
れることからジアシルエステル型のグリセロリン脂質、
即ちホスファチジルコリンと判断した。

さらに単離されたホスファチジルコリンを逆相分配カラ
ムを装着した高速液体クロマトグラフィーで各分子種ご
とに分画して、個々の分画をバイオアッセイで検討した
ところ特定の分子種のみに分化誘導活性が認められた。

活性が認められた分子種は高速液体クロマトグラフィー
で求められたクロマトグラム上の大部分を占めるメイン
ビークであった。メインビークから回収されたホスファ
チジルコリンの分子種を決定するため、このホスファチ
ジルコリンを三弗化ホウ素メタノール法で脂肪酸をメチ
ルエステル化した。脂肪酸メチルの同定はキャピラリー
カラムガスクロマトグラフィー（液相：カーボワックス
２０Ｍ、２５ｍ）における標準体との保持時間の同一性
で行った。

その結果、Ｃ２□、６ω３（即ちドコサヘキサエン酸）
が主成分で、その他に０１６．。（バルミチン酸）　、
Ｃ＋ａ＋ｏ　（ステアリン酸）、ＣＩ８．１（オクタデ
セン酸）が同定された。同定された脂肪酸のホスファチ
ジルコリンのＳｎ位置を決定するため前述のホスホリパ
ーゼで測定した。メインビークから回収されたホスファ
チジルコリンをホスホリパーゼＡＩにより加水分解し、
三弗化ホウ素メタノール法で脂肪酸をメチルエステル化
した。ガスクロマトグラフィーで分析した結果、Ｃ１６
，。とＣＩ［ｌ１１が主成分でその他にＣｌ８１０が同
定された。

次に、このホスファチジルコリンをホスホリパーゼＡｔ
により加水分解し、三弗化ホウ素メタノール法で脂肪酸
をメチルエステル化した。ガスクロマトグラフィーで分
析した結果、ドコサヘキサエン酸がメイン成分として同
定された。このホスファチジルコリンの推定される分子
種を分析するため質量分析計Ｆ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓ　（
Ｐｏｓ、）への直接導入法による分子イオンに相当する
質量スペクトルｍＨｚを測定した。その結果、ｍ／ｚ　
８０６（Ｃ＋６＋。−ドコサヘキサエノイルホスファチ
ジルコリンに相当）　、ｍ／Ｚ　８３２（Ｃ＋ａ＋＋　
　）”：ｊ　サヘキサ！／　イル＃スファチジルコリン
に相当）　、ｍ／ｚ　８３４（Ｃ＋ｓ＋ｏ−ドコサヘキ
サエノイルホスファチジルコリンに相当）に高い強度を
示した。

このホスファチジルコリンは水産動物の卵から下記の様
に高収率で得られる。卵生の総脂質は約１割でその半分
はリン脂質である。詳細には、総脂質に対するホスファ
チジルコリン量は３０％でリン脂質に対してホスファチ
ジルコリン量は７０％である。しかも、分化誘導活性を
示すＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸を結合するホスフ
ァチジルコリンは卵ホスファチジルコリンの主成分であ
る。

また、ドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルコリンは
逆相分配クロマトグラフィーにおいては最初に溶離する
成分であり、使用する溶離液もメタノール単独で十分で
ある点から分取しやすい材料である。

水産動物の卵から得られる総脂質中のホスファチジルコ
リンは上述したように３０％以上もあり、さらに活性を
示す分子種はクロマトグラム上のメインビークである点
から、活性を示す分子種のジアシルグリセロールを分取
する原料に適している。

また、ドコサヘキサエン酸は、植物性原料からは見出し
難（、動物性原料でも陸上動物よりも水産動物から見出
されるので、これらの動物の卵が原料として好ましい。

天然原料にはシャケやニシン等の水産動物の卵が入手容
易であり、また、養殖が盛んなハマチ、コイ、ウナギ、
ニジマス、クルマエビ等の卵も原料として好ましい。

これらの原料は、可能な限り新鮮であることが望ましく
、採卵後直ちに冷凍、凍結乾燥または真空乾燥処理した
原料を使用すると、原料中の酸価の上昇、得られる目的
物の過酸化物価の上昇による品質低下を避けることがで
き、良質な目的物を得ることができる。

従って、本発明では、まず、水産動物の卵を原料として
ホスファチジルコリンを分離する。ホスファチジルコリ
ンの分離は、常法により例えば溶剤抽出後に行うことが
できる。その際、材料に対して例えば蒸留水およびメタ
ノール−クロロホルム系溶媒、アセトン、エーテル、ヘ
キサン等の溶剤を加え、必要に応じて、その混合物をロ
ウルデス・ホモジナイザー、ツルバール・オムニミキサ
ー、ワーリングブレンダー、ボッター・エルベージエム
・ガラスホモミキサー等によってホモジナイズする。無
酸素状態下として、例えば真空下、窒素気流下および二
酸化炭素気流下に、０℃〜６０℃、１０〜１８０分溶剤
抽出することができる。溶剤は魚卵１部に対して１〜５
部添加するのがｔ通である。

溶剤抽出した総脂質からホスファチジルコリンを分離す
る方法としては、例えば次のような方法がある。総脂質
を冷アセトン処理してリン脂質を分画してからカラムク
ロマト法で分離する方法、総脂質を直接シリカゲルクロ
マトグラフィーに付し、ヘキサン→クロロホルム→メタ
ノールと溶媒の混合比率を無損性溶媒から極性へ変化さ
せながら分離する方法等である。

次に、総脂質中のホスファチジルコリンより逆相分配カ
ラム、例えば高速液体クロマトグラフィー、好ましくは
全自動分取型高性能液体クロマトグラフィーによって分
取し、次いで活性を示す分子種のホスファチジルコリン
を、ホスホリパーゼＣで処理する。ホスファチジルコリ
ンをホスホリパーゼＣで処理すると目的のジアシルグリ
セロールとコリンホスフェートに加水分解される。

本発明に用いることができるホスホリパーゼＣは、一種
のホスホジェステラーゼで、グリセロリン脂質やスフィ
ンゴミエリンのリン酸ジエステル結合を加水分解し、ジ
アシルグリセロールやセラミドとリン酸モノエステルを
生成する一群の酵素の総称である。ホスホリパーゼＣは
、クロストリジウム属の細菌やバチルス・セレウス等の
培養濾液から得られるものを用いることができる。反応
生成物は、エチルエーテル等の溶媒で抽出して分析する
ことができる。

反応生成物のジアシルグリセロールの立体特異性を測定
するには、例えばシリカゲル薄層クロマトグラフィーに
付し、クロロホルム／アセトン／メタノール（９０／　
９　／　１　、　ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）を展開溶媒
とし、未蒸留モノグリセリドを標準物質として展開し、
ヨウ素蒸気で発色させる。その結果、この反応生成物は
Ｓｎ−１位、２位ジアシルグリセロールであると同定さ
れる。また、この反応生成物の推定される分子種を分析
するには、例えばＦＡ　Ｂ　−Ｍ　Ｓ　（Ｐｏｓ、）へ
の直接導入法により分子イオンに相当するｍ／ｚを測定
する。その結果ｍ／ｚ　６６３（Ｍ＋　ｐＪ　ａ　ｉ　
ＣＩｂ：ｏ−ドコサヘキサエン酸・ジアシルグリセロー
ルに相当）　、ｍ／ｚ　６８９（Ｍ　＋　Ｎ　ａ　；Ｃ
，、、、−ドコサヘキサエン酸・ジアシルグリセロール
に相当）　、ｍ／ｚ　６７ＨＭ　＋　Ｎ　ａ　；　Ｃ＋
ｅ：＊−ドコサヘキサエン酸・ジアシルグリセロールに
相当）に高い強度が見られる。

このホスファチジルコリンから得られたジアシルグリセ
ロールは原料ホスファチジルコリンのホスホリパーゼＡ
２の加水分解によりＳｎ−２位にドコサヘキサエン酸が
結合していたことは証明されている。即ち、この反応生
成物はドコサヘキサエン酸をＳｎ−２位に結合している
Ｓｎ−１位、２位ジアシルグリセロールである。このジ
アシルグリセロールは総脂質中のジアシルグリセロール
から分取された活性を示す分子種群のジアシルグリセロ
ールと同等の分化誘導活性を示す。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、水産動物の卵を原料として精製
処理することにより、植物細胞、受精卵および癌細胞、
例えば奇形腫細胞、白血病細胞等の如き未分化細胞を正
常細胞に分化誘導する作用（腫瘍細胞や癌細胞に対して
は制癌作用）を有するドコサヘキサエン酸をＳｎ−２位
に結合しているジアシルグリセロールを、簡単な方法で
、しかも天然の立体特異性を維持したまま、高収率で得
ることが出来る。

（実施例） 以下、本発明を実施例および試験例によって更に詳細に
説明する。

２旅■土 採卵後直ちに冷凍したニジマスの受精卵を窒素気流下で
解凍した。この原料１３００　ｇをアセトン２１に入れ
、窒素気流下、Ｔｉｔ、ホモミキサー（特殊機工工業類
）で荒くホモゲナイズしてからエクセル・オート・ホモ
ゲナイザ−（日本精器製作所製）で水冷状態下３０分ホ
モゲナイズした。

懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と湿ケーキに分
けた。濾液からアセトン抽出物１０ｇを得た。乳灰色の
湿ケーキ８３０ｇをエチルエーテル３１に入れ、スリー
ワンモータータイプ６００ＧＭ（新来科学製）で２０Ｏ
ｒｐｍで回転し、なから３０分間抽出した。懸濁液をブ
ッフナー漏斗で濾過し、濾液と湿ケーキに分けた。濾液
からエチルエーテル抽出物４８ｇを得た。乳灰色の湿ケ
ーキ７７０ｇをクロロホルム−メタノール（１／１．　
ｖｏｌ／ｖｏｌ）混液１１！で２回、分液漏斗中で抽出
した。懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と乳灰色
の湿ケーキに分けた。

濾液からクロロホルム−メタノール抽出物５５ｇを得た
。乳灰色の湿ケーキ６９０ｇにクロロホルム−メタノー
ル（２／　１．　ｖｏｌ／ｖｏｌ）混液１．５　Ａで２
回、分液漏斗中で抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗で
濾過し、濾液と湿ケーキに分けた。濾液からクロロホル
ム−メタノール抽出物を５ｇ得た。各脂質抽出物を一緒
にした。総脂質ｆｆ１１１８ｇであった（対原料収率９
．１％）。

総脂質の全量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（
シリカ６０、和光純薬製：８φＸ４Ｑｃｍカラムに２Ｎ
）に付した後、ヘキサン中にクロロホルムの比率を上げ
ていく溶離液系で中性脂質を除去した。中性脂質の回収
ｆｆ１６９ｇで、組成は薄層クロマトグラフィー（展開
溶媒：ヘキサン−エチルエーテル−酢酸５０１５０／１
．　ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）分析でトリアジルグリセ
ロールが主体であった。

中性脂質を除いたカラムに、クロロホルム中にメタノー
ルの比率を上げていく溶離液系を流した。

クロロホルム対メタノールの比率が３５　：　６５〜２
５ニア５の範囲にホスファチジルコリンを主成分とする
区分が溶出し、脱溶媒後、２８ｇのホスファチジルコリ
ンを得た。ホスファチジルコリン区分の判定は、薄層ク
ロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−メタノー
ル−水６５　／２５／４．　ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）
で行った。この分画の内、薄層クロマトグラフィーでＲ
ｆ値０．２０〜０．３０　（ホスファチジルコリン）に
シングルスポットのみが認められる分画を集めて、窒素
気流下で脱溶媒を行い、純ホスファチジルコリンを１６
．７　ｇ得た。

次いで、得られたホスファチジルコリンを１６７−のベ
ンゼンに溶解してクロマトグラフィー用サンプル溶液と
した。サンプル溶液は、全自動分取型液体クロマトグラ
フィー（東洋曹達工業製、■］Ｌ　Ｃ−８３７）にＯＤ
Ｓ　（オクタデシルシリル基を化学結合させたシリカゲ
ル）充填カラム（ＯＤ　Ｓ　−１２０Ｔ、φ５５ｍｍ　
Ｘ　６０ｃｍ）を装着し、溶離液としてメタノールを４
０ｍＪ！／ｍｉｎの速度で流しながら、６−を自動注入
し、目的物のメインピーク部を連続２８回分取した。分
取区分を窒素気流下で脱溶媒して目的物のホスファチジ
ルコリンを１２．２　ｇ得た。

分取されたホスファチジルコリンを三弗化ホウ素メタノ
ール法でメチルエステル化し、キャピラリーカラムガス
クロマトグラフィー（液相：力−ポワックス−２０Ｍ、
２５ｍ、　１７０℃）で脂肪酸組成を測定した。その結
果、ドコサヘキサエン酸は４１％で、パルミチン酸、ス
テアリン酸、オレイン酸が各約１０％を占めていた。

このホスファチジルコリンをホスホリパーゼＡ２で加水
分解し、三弗化ホウ素メタノール法でメチルエステル化
し、キャピラリーカラムガスクロマトグラフィーでＳｎ
−２位の脂肪酸組成を測定した。その結果、ドコサヘキ
サエン酸は８２％であり、その他に数本の微小ピークが
認られた。

また、ホスファチジルコリンの過酸化脂質量は、電位差
滴定法（自動滴定装置ＧＴ−０５、三菱化成工業■製）
で測定した結果、２７．５ｍｅｑ、／ｋｇであった。

分取されたホスファチジルコリンの一部５００ｍｇを６
００μｌのメタノールに？８解し、ホスホリパーゼＣ（
シグマ社製、Ｎｏ、　Ｅ　Ｃ３，１，４，３；バチルス
・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）起源）
を３００ｕｎｉｔ。

０．２Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｔ（７，４）を５−
１０．０５Ｍ塩化カルシウムを３ｗ＋１．エチルエーテ
ルを３　ｍｌ加えた。反応混合物をスクリューキャップ
付２０ｍｆの試験管中にテフロンスターターバーと共に
加えて、３５℃で１時間激しく攪拌しながらインキユベ
ーシッンした。

反応混合物にエチルエーテルｌ　Ｑ　ｍｌを加えてから
分液漏斗に移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。

エチルエーテルで抽出された反応混合物中の未反応のホ
スファチジルコリンを除去するため、アセトンをｌ　ｄ
加え、ホスファチジルコリンを沈澱させた。エチルエー
テル層を硫酸ナトリウムで脱水し、さらに、窒素気流下
で脱溶媒して目的のコリン基が切除されたジアシルグリ
セロールが４２０ｍｇ得られた。

得られたジアシルグリセロールは油状であり、クロロホ
ルム、ヘキサンに可溶で水に不溶であった。

薄層クロマトグラフィーのクロロホルム／メタノール／
水系（６５／　２５／　４．　ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ
）展開溶媒で反応前後の成分を測定した。

反応後の成分のＲｆ値は、反応前の０．３から０．８に
変化し、ドラーゲンドルフ試薬とディトマー・レスター
試薬に対する発色が陽性から陰性に変化した。クロロホ
ルム／アセトン／メタノール系（９０／　９　／１．　
ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）展開溶媒で標準体として未蒸
留モノグリセリドと共に反応後の成分を測定した。

反応後の成分はＲｆ値が０．６５で、標準体のＳｎ−１
位、２位ジアシルグリセロールの位置に相当していた。

本成分はＦＡＢ−ＭＳによって、分子量６４０（ＣＭ　
＋　Ｎ　ａ　）　６６３）、分子１ｔ６６６（ＣＭ　＋
　Ｎ　ａ　）６８９）および分子量６６８（（Ｍ　＋　
Ｎ　ａ　）　６９１）が認められた（第１図）。

大施１ 採卵後直ちに冷凍したニジマスの受精卵を窒素気流下で
解凍した。この原料１５００　ｇをクロロホルム／メタ
ノール（２／１．　ｖｏｌ／ｖｏｌ）混液６１に入れ、
窒素気流下、Ｔ、１１．ホモミキサー（特殊機工工業製
）で高速で剪断抽出しながら水冷状態下３０分間ホモゲ
ナイズした。

懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と乳灰色の湿ケ
ーキに分けた。乳灰色の湿ケーキ９１０ｇを上記溶媒２
１に入れ、上記と同一の条件で処理した。同様に懸濁液
から濾液と湿ケーキに分けた。

乳灰色の湿ケーキ７８０ｇを上記溶媒２１に入れ同一条
件で処理した。さらに３回目の懸濁液から濾液と湿ケー
キの濾別を行った。全濾液を集めて遠心分離し、上澄液
にクロロホルム３Ｎと蒸留水３βを加えて、よく水洗し
た後、遠心分離で二層に分離した。

下層のクロロホルム層を集めて、窒素気流下、ロータリ
ーエバポレーターを用い、３０℃で濃縮し、溶媒留去の
最後にベンゼン１００　ｍｌを加えて脱水を行いながら
脱溶媒した。溶媒を留去した抽出物を真空デシケータ−
で−昼夜乾燥して得られた全脂質の重量は、１２７ｇ　
（対原料収率８．５％）であった。

得られた全脂質を水冷アセトン１．３　Ｉ！中に入れ、
窒素気流下、スリーワンモータータイプ６００ＣＭ（新
来科学製）で２０Ｏｒｐｍで回転しながら１０分間抽出
した。アセトン懸濁液を冷却したブッフナー漏斗で濾過
し、沈澱を回収した。この沈澱に、上記同様の冷アセト
ン処理を４回繰り返して、完全に中性脂質を除いたリン
脂質分画５７ｇ（総脂質中４５．２％）を得た。リン脂
質全量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士ゲ
ルＣＧ−３、水戸化学製、５ψＸ　４０ｃｍカラムに７
００ｃｃ）に付した後、クロロホルム−メタノール（４
／　１．　ｖｏｌ／ｖｏｌ）混液の溶離液系でホスファ
チジルコリン以前に溶出するホスファチジルエタノール
アミン等のリン脂質を除去した。

さらに純粋なホスファチジルコリンを分画するためクロ
ロホルム−メタノール（３／２．　ｖｏｌ／ｖｏｌ）混
液の溶離液系で溶出させた。溶離液５００−ずつ分画し
、各分画を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロ
ホルム−メタノール−水６５　／２５／４、　ｖｏｌ／
ｖｏｌ／ｖｏｌ）で測定した。薄層クロマトグラフィー
上ノＲｆ４ｅＬ０．２０〜０．３０（ホスファチジルコ
リン）にシングルスポットのみが認められる分画を集め
て、窒素気流下で脱溶媒を行い、純ホスファチジルコリ
ンを１９ｇ得た。

次いで、得られたホスファチジルコリンを１９０−のベ
ンゼンに溶解してクロマトグラフィー用サンプル溶液と
した。サンプル溶液は、全自動分取型液体クロマトグラ
フィー（東洋曹達工業製、ＨＬ　Ｃ−８３７）にＯＤＳ
充填カラム（ＯＤ　Ｓ　−１２０Ｔ。

φ５５ｍｍ　Ｘ　６０ｃｍ）を装着し、溶離液としてメ
タノールを４０ｄ／ｍｉｎの速度で流しながら、５　ａ
ｌｌを自動注入し、目的物のメインピーク部を連Ｖｔ３
２回分取した。分取区分を窒素気流下で脱溶媒して目的
物のホスファチジルコリンを１３．９　ｇ得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を４０％
含有しており、またホスホリパーゼＡ２で加水分解して
得たＳｎ−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸を
８３％含有していた。また、過酸化脂質量は、２３．８
ｍｅｑ、／ｋｇであった。

分取されたホスファチジルコリンの一部７００ｍｇを８
００μｌのメタノールに溶解し、ホスホリパーゼＣ（シ
グマ社製、Ｎｏ、　Ｅ　Ｃ３，１，４，３；クロスト記
リジウム・ベルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）起源）を４００ｕｎｉｔ、　
０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を６１１
１４！、　０．０５Ｍ塩化カルシウムを３．５−、エチ
ルエーテルを４　ｍｌ加えた。反応混合物をスクリュー
キャップ付２０−の試験管中にテフロンスターターバー
と共に加えて、３５℃で１時間激しく攪拌しながらイン
キュベーションした。

反応混合物にエチルエーテル１２ψＸを加えてから分液
漏斗に移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。

エチルエーテルで抽出された反応混合物中の未反応のホ
スファチジルコリンを除去するため、水冷アセトンをｌ
　ｍｌ加え、ホスファチジルコリンを沈澱させた。エチ
ルエーテル層を硫酸ナトリウムで脱水し、さらに、窒素
気流下で脱溶媒して目的のジアシルグリセロールが５９
８ｍｇ得られた。

得られたジアシルグリセロールは油状であり、クロロホ
ルム、ヘキサンに可溶で水に不溶であった。

薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム／メ
タノール／水系（６５／　２５／　４．　ｖｏｌ／ｖｏ
ｌ／ｖｏｌ））で反応前後の成分を測定した。

反応後の成分のＲｆ値は、反応前の０．３から０．８に
変化し、ドラーゲンドルフ試薬とディトマー・レスター
試薬に対する発色が陽性から陰性に変化した。さらに、
薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／ア
セトン／メタノール系（９０／　９　／　１．　ｖｏｌ
／ｖｏｌ／ｖｏｌ）で標準体として未蒸留モノグリセリ
ドと共に反応後の成分を測定した。

反応後の成分はＲｆ値が０．６５で、標準体のＳｎ−１
位、２位ジアシルグリセロール（−船名β−ジアシルグ
リセロール）の位置に相当していた。本成分は、ＦＡＢ
−ＭＳによって分子量６４０（ＣＭ＋分子１ｆｔ６６８
（（Ｍ　＋　Ｎ　ａ　）　６９１）が認められた。

大施炭ユ タラの卵５００ｇを実施例１と同様に溶剤処理して、脂
！１４ｇ（対原料収率２．８％）を得た。この脂質の全
量を実施例１と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーに付して同様に処理し、薄層クロマトグラフィーで
Ｒｆ値０．２０〜０．３５のシングルスポットを示す純
ホスファチジルコリン分画４．８ｇを得た。

次いで、この純ホスファチジルコリンを実施例１と同様
に全自動大量分取液体クロマトグラフィーに付して、連
続１４回自動分取を繰り返し、メインビークを分取して
、目的のホスファチジルコリン３．３ｇを得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を４０％
含有しており、また、ホスホリパーゼＡ２で加水分解し
て得たＳｎ−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸
を８２％含有していた。

また、過酸化脂質量は１５．６ｍｅｑ、／ｋｇであった
。

次いで、分取されたホスファチジルコリンの一部５００
ｍｇを、実施例１と同じホスホリパーゼＣを用いて同様
に処理し、コリン基が切断された目的のジアシルグリセ
ロール３７０ｍｇを得た。このジアシルグリセロールは
、実施例１と同じ試験をした結果、同様の性状と特性値
を示したので、Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸を含有
するドコサヘキサエニルジアシルグリセロールであると
認められた。

去新１１上 ニシンの卵５００ｇを実施例１と同様に溶剤処理して、
脂質１３．５ｇ（対原料収率２．７％）を得た。この脂
質の全量を実施例２と同様にシリカゲルカラムクロマト
グラフィーに付して同様に処理し、薄層クロマトグラフ
詩−でＲｆ値０．２０〜０．３５のシングルスポットを
示す純ホスファチジルコリン分画５．３ｇを得た。

次いで、この純ホスファチジルコリンを実施例１と同様
に全自動大量分取液体クロマトグラフィーに付して、連
続１１回自動分取を繰り返し、メインビークを分取して
、目的のホスファチジルコリン３．９ｇを得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を４２％
含有しており、また、ホスホリパーゼＡ２で加水分解し
て得たＳｎ−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸
を８５％含有していた。

また、過酸化脂質量は９．８ｍｅｑ、／ｋｇであった。

次いで、分取されたホスファチジルコリンの一部７００
ｍｇを、実施例２と同じホスホリパーゼＣを用いて同様
に処理し、コリン基が切断された目的のジアシルグリセ
ロール５１２ｍｇを得た。このジアシルグリセロールは
、実施例１と同じ試験をした結果、同様の性状と特性値
を示したので、Ｓｎ−２位にドコサヘキサエン酸を含有
するドコサヘキサエニルジアシルグリセロールであると
認められた。

試験例 実施例で得られた化合物を用いて、フレンド白血病細胞
（マウス赤芽球性白血病細胞、Ｂ８細胞）に対する制癌
活性を確認した。ＲＡ　ＭのＦ−１２培地（ＧＩＢＣＯ
製）に、１５％の牛胎児血清および６０ｍｇ／Ｉｔのカ
ナマイシンを加えたものに、２５　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ
／−となるようにＢ８細胞を接種し、これに各実施例で
得られた化合物を２５０ＩＩｇ加えた。この際、最終容
量は５　ｍｌであった。

８．０％炭酸ガス中、３７℃で７日間培養した後、オル
キンのベンチジン染色法により染色し、染色された細胞
数、即ち、赤血球への分化によりヘモグロビンを産生ず
るようになった細胞数を測定し、全細胞数に対する染色
された細胞数の百分率から、分化誘導率（％）を求めた
。実施例で得られた化合物は、両者とも５０躍／−の濃
度で８０％の分化誘導率があった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１で得られたジアシルグリセ
ロールの質量分析計Ｆ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓ　（Ｐｏｓ、
）による質量スペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　ドコサヘキサエン酸をＳｎ−２位に結合しているＳｎ
   −１，２−ジアシルグリセロールの製造にあたり、水産
   動物の卵を原料としてホスファチジルコリンを分離し、
   次いで逆相分配カラムクロマト処理した後にホスホリパ
   ーゼＣで加水分解することを特徴とするドコサヘキサエ
   ノイルジアシルグリセロールの製造法。