JPH01141354A - 免疫反応性多孔性担持材料、その製法及びイムノアツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、免疫反応性多孔性担持材料及びその製法に関
する。

従来の技術 免疫反応性多孔性担持材料は種々の技術分野でＩｋ要な
役割りを果している。例えば、免疫反応の一方の成分を
不溶性担体に固定さセて使用する分析法及びｖ１４ＩＩ
Ａ法にこの種の材料は必要である。免疫反応成分の不溶
性担体への固定は化学的又は物理的力で行なうことがで
きる。それ故、長い間、固体担持材料とそれに結合させ
るべき化学物質、例えば特に生物学的にも活性な蛋白質
との間に共有結合全作る方法が公知である。一般に、こ
の方法の欠点は、それが生物学的に活性な物質の化学的
変化をもたらし、この変化が多くの場合に生物学的活性
の変化ももたらすという点にある。

他の公知方法は、この種の生物学的に活性な物質の！接
１合（ＩｉｎｓｏｈｌｕＪ３ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉ
ｏｎ）である。この場合、分子はそのままで通常未変化
のｔをｃ６ｐ、それ故その生物学的有効作用も変らずに
保持される。しかじ液相中に存在する免疫反応の他の成
分の接近容易性は著しく制限されている。

それ故、共有結合の欠点も包接重合の欠点も持たない第
６の公知方法、即ち可溶性物質を好適な担持材料に吸着
固定させる方法が利用された。しかしこの方法も、固体
相体への結合が両刀の前記の方法よシも弱いといり欠点
を有している。

多孔性担持材料を適用する場合に、吸着結合の付着強度
には考別な問題が生じ九。米自特許第３　８８８　６２
９号明ｍ１ｉからは、担持材料の孔中での固定ｔ、免疫
反応の両方の成分、即ち抗体と抗ふ又はハプテンとの間
の沈降反応を進行させることにより実施して前記の問題
を低減する方法が公知である。該方法では、その都度の
免疫反応成分の両方の溶液を迅速に混合しその後直ちに
多孔性担持材料をそれで含浸する。

国際公開第８２１０２６０１号には、この方法の別法が
記載されている。多孔性担持材料を免疫反応の第一成分
の溶液で含浸し、かつその後で免疫反応の第二成分の溶
液で処理し、それ故免疫及応自体を、多孔性担持材料中
で所望の免疫反応性紙の永久的な固定下に、化学的な変
化もなくあるいは他の反応成分の接近容易性についての
欠点もなく進行させることができる。

多孔性担持材料上に免疫戊応物５ｉｔを結合させるこの
方法は前記の問題を低減するが、担持材料上に固定され
る免疫反応性紙が不均一に分布されるという他の欠点を
有する。この欠点は、免疫反応性多孔性担持材料を例え
は低濃度のノ・ブテン又は蛋白質の定量分析に使用しよ
うとする場合には特に、重大である。抗原−抗体−網構
造の安定性及び測定すべきノ１ブテン及び蛋白質の濃度
に対して免疫複合体からの免疫反応成分の低い平衡−解
離−濃度についての要求は、使用した抗体がそれぞれの
抗原に対して高い親和性を有する場合にだけ達成される
。経紗的に、このように免疫反応性の成分を混合する際
に沈殿形成が自動的に開始する。多孔性担持材料を直前
に混合した免疫反応性成分の溶液で含浸することによフ
免疫反応性多孔性担持材料を工業的量で製造する際に、
担持材料上で時間的にがつ空間的に制御することのでき
ない沈殿形成が起る。

イムノソルベントの定塁的配全は、免疫反応性紙では一
定面積の紙を切断することにより、あるいは球状多孔性
担持材料では一定数の粒子の選択によシあるいは一定量
の免疫反応性担持材料の計量により行なうと有利である
。しかし固定された免疫反応性物質の不均一な分布では
このような簡単な配量法は問題外である。

公知の免疫沈降法の他の欠点は、非常に高度にｎ製した
抗原を必要とし、このことは免疫吸着による前ｎ裂、そ
れ故経費のかかる製法を必要とする点にある。

担持材料に訃ける免疫複合体沈降物の均一な分布は、西
ドイツ国特許公開第３４４６６６６号明細書に記載され
ている１均一（ｈｏｍｏｇｅｎ　）’法によシ達成され
る。それによると、多孔性担持材料全１沈降を回避する
ために阻害剤を加えた、免疫反応の両成分の溶液で含浸
する。阻害剤を除去することによシ、例えば含浸７リー
スの乾燥によシ沈降を開始する。免疫成分が、住成し九
混濁が最大になるノ１イデルペルク最大値（Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇｅｒ　Ｍａｘｉｍｕｍ　）の比で組合セられ
なかった場合には、免疫成分の一力の過剰分を担持材料
の洗浄によって洗い出す。その際に、強固に吸着され工
いない免疫複合体並びに簡単に解離する免疫複合体も担
持材料から洗い出される。ハイデルベルク最大値の免疫
成分を沈降に使用する場合は、−力の免疫成分の過剰分
全除去するために付加的な洗浄工程はもはや必要では表
い。その際に、強固に結合していない免疫複合体韮びに
簡単に解離する免疫複合体は多孔性担持材料上に残留し
、妨害をもたらすことがある。例えは、前記のように製
造した免疫尺応性担持材料七免投及応性桧分析物の定量
測定に使用する場合、試験において被分析物に関して測
定した濃度値に誤差が生じる。それというのも測定に又
は測定ｆｆｌにとって重要な成分の洗出によって測定媒
体中に測定のための盲検値が生じるからである。このこ
とは、測定法に応じて、測定すべき被分析物濃度に関し
て非常に高いか又は非常に低い数値ｔもたらす。

発明が解決しようとする課題 本発明の！Ｊｌ！題は、これらの欠点を回避する、特に
免疫複合体が強固に担持材料に付着する免＆及応性多孔
性担持材料を開示することであった。

免疫複合体を多孔性担持材料上に沈降させることにより
免疫反応性多孔性担持材料を裂製造る方法も本発明の目
的であル、これは多孔性担持材料を湿潤増強剤（ＮａＢ
ｆｓａｔｍｉｔｔ＠ｌ）　１　ｍ以上で処理し、引続い
てその上に免疫複合体を沈降させることｔ包含する。

課題を解決するための手段 この課題は、多孔性担持材料が湿潤増強剤１掴以上で処
理されていること’に％像とする、多孔性担持材料とそ
の上べ沈降させた免疫複合体とより成る免疫戊応性多孔
性担持材料によシ解決される。

湿潤増強剤１種以上ｔ１所望の場合には繊維スラリに添
加することができ、引続いて多孔性担持材料を乾燥さセ
、かつ免疫複合体をその上に沈降させる。

本発明の基本的Ｉ＃ｉ徴は、加工の終点で水に不溶性で
あるかあるいは極く僅かに可溶性でちる、本来の担持材
料である繊維を包囲する物質の使用である。このような
物質は、特に場合によっては製紙業で使われる湿潤増強
剤である。

それは、紙の機械的耐荷重性を改良するために使われる
。一般には乾燥強度に比べて低い湿潤強度がそれによっ
て高められる。（＠Ｚｅ４１ａｔｏｆｆ。

Ｐａｐｉ＊ｒ　’、第５版、２５５〜２５５頁、ＶＩＥ
ｙａａｈｂｕａｈｖｅｒ１ａｇ出版１ライノチツヒ在（
１９７９年〕〕。勿論一般には乾燥強度も未処珈の紙に
比べたら鳥められる。

湿潤増強剤の使用が、それを用い′ＣＩＡ造した免疫及
応性多孔性担持材料の顕著な利点をもたらすことは驚異
的である。

湿潤増強剤で処理された担持材料の製造に当っては、特
に記載のない限り、紙の製造で常用の方法及び装置が使
われる。

本発明では、温潤増強剤で処理され友担持材料をｉ造す
るための繊維状原料としては穏々の由来と性状のセルロ
ース繊維、殊に亜（ｉ１ｃ酸パルプ、再生セルロース、
ステーノルファイバー又はリンターと合成１合体、殊に
一般に常用のポリエステル、ポリアミド及びポリアクリ
ルニトリルの繊維との混合物が好適である。これらの合
成樹脂繊維の全物質に対する量的割合はその加工性によ
りｖａ定される。常用の抄紙機音用いて、例えは合成樹
脂繊維割合９５１量％まで、殊に６０′Ｍ量％までの担
持材料を製造することができる。残りは前記のａｌ類の
セルロース繊維である。

繊維の長さは不発明にとって重要ではない。

しかし長石１〜６鵡の繊維が有利であることが明らかＫ
なった。

製紙で常用の方法で繊維から、場合によｐ細砕後に繊維
を所望の長さで含有するｍ維スラリを調製する。この線
維スラリに湿潤増強剤１櫛以上を添加する。常用の湿潤
増強剤はエピクロルヒドリン樹脂、メラミンホルムアル
デヒド樹脂、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリエチレン
イミン及び特別なカルボキシメチルセルロースである。

これらを本発明方法で使用することができる。本発明で
は、それ自体で優れ九湿潤強度特性を有してはいないが
、その類似した栴造状の峙性によｐ本発明の意味で類縁
作用を有している前記の物質群の物質も使用するのに好
適である。

市販製品のルレシン（Ｌｕｒｅｓｉｎ町、チロース（Ｔ
ｙｌＯｓｅ＠）、ｉドリト（Ｍａｄｕｒｉｔ’　）、エ
タドリン（！［ｆｔａｄｕｒｉｎ＠）及びクレ；ル（Ｕ
ｒｅａａｌｌ■〕が特に優れていることが明らかになっ
た。ルレシンとはポリアミドアミン−エビクロルヒトリ
ン１１ＮＭ、チローストハカルボキシメチルセルロ−ス
、マドリドとはメラミンホルムアルデヒド樹脂、エタド
リンとはポリアギドアイン−エピクロルヒドリン樹脂及
びウレコル（３人８Ｆ　、ＡＧ社）とは尿素−ホルムア
ルデヒド樹脂である。本発明では前記種類の湿潤増強剤
の混合物あるいは等価の化合物上使用することもできる
。

繊維スラリ中の湿潤増強剤の割合はその都度使用する湿
潤増強剤に左右されるが、セルロース繊維材料の使用量
に対して有利には０．０５〜６１量％、殊に２〜４ｆｌ
ｆｔ％である。勿論より多（の湿潤増強剤を添加するこ
ともできるが、本発明では明瞭な改良はもたらさない。

場合により、例えは促進剤、結合剤、団結剤、顔料又は
ニカワのような他の助剤を繊維スラリに導入することも
できる。

抄紙機中のこＯ繊維スラリから多孔性担持材料を常法で
衾造する。そや際に、液体の流出速度は生成する多孔性
担持材料の密度に影響を与える。後圧縮成形によシ担持
材料の密度を更に高めることができる。

高められた温度で実施する次の乾燥工程では、湿潤増強
剤で処理した多孔性担持材料が場合によっては老化する
。例えは水溶性初期縮合物として市販されているメラミ
ンホルムアルデヒド樹脂の場合には、縮合の継続もしく
は終結が該当する。

記載の方法により生成し、湿潤増強剤で処理した、多孔
性担持材料は密度０．２〜０．５　ｇ／＝ｍ３．０．６
〜０．４９　／−を有するようにする。そうでなければ
、湿潤増強剤に処理した乾燥多孔性担持材料を圧延する
。前記のような密度を有するすべての担持材料はそれを
構成する繊維間に空１！Ａを有し、それ放炎孔性である
。

湿潤増強剤で処理された担持材料の製造は他の方法で行
なうこともできる。他の優れた実施法は、湿潤増強剤を
繊維スラリに添加するのではなく、それを添加せずに抄
紙機中で製造した担持材料を例えは湿潤増強剤の溶液を
含有する含浸機中で含浸することである。その際に、清
液中の湿潤増強剤の濃度は０．０１〜０．６１ｍ　ｉｔ
％、殊に０．３５〜０．４５重量％である。引銃いて、
湿潤増強剤で処理した多孔性担持材料を温度湿 ５０〜１５０℃、殊に８０〜１００℃で残留滅度２〜６
１量％まで、殊に３１量％まで乾燥する。

当業者にとって、湿潤増強剤で処理された担持材料ｔＭ
造する他の好適な可能性は周知である（例えば乾燥フリ
ース〕。

湿潤増強剤で処理した担持材料はセルロース繊維材料の
使用量に対して湿潤増強剤を殊に約０．０５〜６１量％
、特に２〜４．ｉ！ｉ量％で含有する。

湿潤増強剤で処理して、このように製造した多孔性担持
材料上に免疫複合体を免疫沈降によて シ吸着させ１１免疫及応性多孔性担持材料を製造する。

免疫ｙ応性担持材料とは、その上に沈降させた免疫複合
体を介して、免疫学的ムシの免役成分として作用し得る
担持材料である。これは、次の免疫複合体の部分構造を
介し１行なわれるニー免疫複合体の抗体及び／又は抗原
の他の免疫及応性抗原決定基を介して、 一免疫複合体の抗体の遊離している他の抗原結合部位會
介して、 一他の物質に対して、特異的な非免疫学的結合相互作用
を有する基を介して、例えはこれには酵素−基質−１酵
累−補酵素−スは酵紮−阻害剤−相互作用が挙げられる
。

本発明方法の範囲に訃ける免疫沈降成分とは一刀は抗原
、例えばハプテン又は蛋白質であり、他方は抗体である
。抗原は勿論それ自体抗体でもＩｈり得る。それは七ツ
ク四ナール抗体でもポリクロナール抗体でもよい。抗体
は完全抗体でも、またそのフラグメント、例えはｔａｂ
　＊　ｔａｂ’もしくは（ｙａ１／）ｇフラグメントで
もある。

沈降する抗−抗体を沈殿に使用する場合、相応して選択
しなけれはならない。抗−抗体はポリクロナール又はモ
ノクロナールあるいはその（Ｆａｌ？）ａ−７ラグメン
トであってよい。抗−抗（１１％ノクロナール抗体ある
いはそのフラグメントである場合、有利にそれは抗原の
２つの異なるエピトープを認識すべきである。しかしな
がら、唯一種のエピトープが抗原に少なくとも２個存在
する場合にはそのエピトープだけを細織する（これは頻
繁であるンそノクロナール抗体もしくはその（Ｐａｔ／
）ｇ　−’ラグメントを使用することもてきる。モノク
ロナール抗体の混合物七免灰沈降の抗−抗体フラクシ日
ンとして使用することもできる。

殊に、沈降させるべき免疫及応性物質としてはハプテン
又は抗原が結合している蛋白５に七使用することもでき
る。この場合には、沈降性抗体を蛋白質に対して作用す
る免疫反応の第２の成分として使用すると有利である。

他の実施形では、沈降性抗体にハプテン又は抗原が結合
していてよい。その際に、免＆ムシの他の成分は未標識
であるか又は同−又は他のバッテン又は抗体と結合して
いてよい。場合によシ、沈降させるべ１！蛋白質は抗−
抗体により沈降する特異的抗体である。東に、沈降させ
るべき抗体にはハプテン又は抗原が結合していてよい。

沈降性抗体は抗体に対し、て、抗体の一部に対しである
いはそれに結合しているハプテン又は抗原に対して作用
し得る。

抗体、抗原もしくはハプテンには、免疫反応の沈降する
もしくは沈降させるべき成分の結合部位と共に、他の免
疫反応又は例えば酵素−基質−１酵索−袖酵累一又は酵
素−阻害剤−相互作用のような特異的な相互作用を利用
する他の反応の成分の丸めの結合部位少なくとも１つを
有する物質も包含される。

免疫成分を担持材料上に沈降嘔せるにはいくつかの可能
性がある。当業名は国際公開第８２１０２６０１号明細
書又は米国將許 第３　８８８　６２９号明細書に記載されているような
不均一系方法と均−差力法とを区別する。

沈降させるための不均一系方法も均−系：７５法も本発
明方法に適用するのにｔｋｉ適である。西ドイツ１脣軒
公開第５　４４６　６３６号明細書による均−系−工程
法及び均−第二工程法が特に好適である。第一の方法で
は、湿潤増強剤で処理した担持材料を、免疫成分をノ・
イデルベルク最大値の比で含有しかつ好適な阻害物質少
なくとも１１１１を含有する溶液で含浸する。その後で
、一定の張角湿度、例えば６重量％まで乾燥する。

第二の方法では、湿潤増強剤で処理した担持材料を初め
に阻害性を停止する物質（例えば塩化ナトリウム）の溶
液で含浸し、その後乾燥し、次いでハイデルベルク最大
値の比の免疫成分及び好適な沈降阻害剤少なくとも１種
を含有する溶液で含浸する。湿潤増強剤で処理した担持
材料の表面への沈降及び吸着は次の乾燥工程の間に行な
う。

本発明による免疫反応性多孔性担持材料の製法の大きな
利点は、経費がかがシ、かつ更に免疫複合体による免疫
反応性多孔性担持材料の異面の禎覆にシいてずクロなか
つマクロな不均質性を生成する洗浄工程を排除すること
ができることである。これによって、均一な免疫反応性
多孔性担持材料が形成される。

更に、本発明方法により、免疫複合体が強固に吸着され
ていて、免疫学的試験の間に流出することのない免疫反
応性多孔性担持材料が開示される。それに伴なって住じ
る測定の盲検値は回避される。これは簡単な試験実施ｆ
：ｉ！味する。

不発明により装造した免疫反応性担持材料は、１回以上
の洗浄工程を方法条件的危由から排除することのできな
い試験及び分離法にも好適である。免疫複合体が担持材
料の表面に非常に強固に付着していることによシ、試験
もしくは分離法の前又はその間に免疫複合体が一緒に洗
出することは少なく、それ故その損失は低減する。

それ故、試験又は分離法に、免疫反応性担持材料の免疫
性能が同一である場合には少量の免疫複合体を使用する
ことができる。

本発明によシ非常に均一な免疫反応性多孔性担持材料を
製造できるといり可能性によシ、担持材料の形状及び大
きさと関係なくそれ全使用することができる。湿潤増強
剤で処理された担持材料は記載されているような紙状形
はかシでなく、例えば他の幾何学的形状でも、例えばカ
ラム形又はブロック形でも成形することができる。

他の異なる幾何学的形状を有する、湿潤増強剤で処理し
た担持材料ｔｍ造するためにも、湿潤増強剤を繊維スラ
リに添加することができるはかりでなく、初めに担持材
料に任意の幾何学的形状を与え、かつ引続いて湿潤増強
剤の浴液で前記のように含浸させかつ乾燥することもで
きる。

特に、本発明によシ製造した免５２反応性多孔性担持材
料は、不均一系イムノアッセイの範囲で被分析物（例え
ばハプテン、抗原、抗体）の定性又は定量測定に利用す
ることができる０例えば、緩衝溶液、血清、血しよう、
尿、培養上澄み等のような試料中に含まれているハプテ
ン（Ｈｐ　）又は抗原（Ａｇ）もしくは抗体（ムｋ）に
標識した結合成分（Ｂ）　！加える。これにはとシわけ
特異的にハシテン又は抗原と反応する抗体、抗体７ラグ
メント盗びに配位子、もしくはハプテン又は抗原が該当
する。例えば、標識としては、！！＊累、けい光標識又
は放射性同位体を使用することができる。添加される結
合成分の量は試験法に応じて、試料中に存在するハプテ
ン、抗原又は抗体に対して過剰のモル量でかつまた過少
のモル量で存在してよい。

これらの混合物ヲ、妙合体Ｈｐ−Ｂ％Ａｇ−Ｂもしくは
ムに−Ｂが形成する一定時間恒温保持する。

この時間の経過後に、反応混合物中には３ｖＡ類のもの
、即ちハプテン、抗原もしくは抗体と結合成分とからの
複合体（Ｈｐ−Ｂ　、　Ａｇ−Ｂ％Ａｋ−Ｂ）、遊離の
ハプテン又は抗原もしくは抗体（Ｈｐ％ムｇｓＡｋ）及
び遊離結合成分ＣＢ）か存在する。

これらを第二工程で免疫吸着により分離する。

そのために、この混合物上、選択した免疫学的測定法に
応じて検出すべきハプテンもしくは抗Ｊ又はこれに対し
て作用する抗体が沈降している本発明により製造した免
疫戊応性多孔性和持材料上に施す。

免疫学的測定法として、ハプテンの測定には特に所謂Ｉ
ＩＩｉＭＡ法が好適であるニー沈降ハプテンを含有する
免疫及応性担持材料は、ハプテンで飽和された結合成分
ではなくて、遊離結合成分を結合する。従って、上澄み
もしくは固相の溶出液が試料のハプテンで飽和された結
合成分を含有する。ハプテンの定量測定を結合成分の標
ａｔ介して行なう。

抗原の測定に関しては所謂サンドウィッチ法が優れてい
るニ ーこのためには測定すべき抗Ｊに対して作用する抗体全
沈降させた免疫及応性担持材料を使用する。抗体は抗原
と結合成分とからの複合体と結合し、遊離結合成分では
ない。残シの遊離結合成分は洗浄除去する。抗原の定量
的検出は結合成分の標識を介して行なう。

更に、競合的免疫試験が適用されるニ ー本発明により製造した免疫反応性担持材料は、被分析
物（へブテン、抗原又は抗体）を含有する試料に一定量
の標識した被分析物を加えて使用する。例えは、標＃！
は酵素、けい光標識、放射性同位体等であってよい。前
記混合物を免疫及応性担持材料上に施す。この材料上に
は被分析物に対して作用する免疫学的成分が沈降してい
る。免疫反応性担持材料上の混合物を一定時間恒温保持
する。この際、被分析物それ自体及び標識した被分析物
は免疫及応性担持材料上の免疫学的成分の結合部位金め
ぐって競合する。

試料中によシ多くの被分析物が存在する程、標識した被
分析物の免疫及応性担持材料への結合量は少なく、また
その逆も該当する。恒温保持工程の終結時に、液体を多
孔性免疫及応性担持材料から遠心分離によシ除去する。

その後、遊離相中の標識した被分析物の量か又は固相に
結合した標ｍ被分析物の量を測定する。

−本発明によシ装造し次免疫反応性担持材料の別の適用
法は、被分析物（ハプテン、抗原又は抗体）にこの被分
析物に対して作用する既知量の標識した免疫学的成分全
顎えて行なうことができる。可能な標識法は既に記載し
た。この混合物を一定時間恒温保持し、その後で多孔性
免疫反応性担持材料上に加えるかあるいは混合直後に多
孔性免疫汐応性担持材料上に加える。

被分析物がノ・ブテンである場合、免疫及応性担持材料
は検出すべきハシテン又はその誘導体を同様に沈降形で
含有する。最初の混合物を担持材料上に施す前に恒温保
持した場合は、遊離の標識した免疫学的成分が免疫及応
性多孔性担持材料に結合する。混合物を直ちに免疫及応
性担持材料上に添加した場合、試料からの被分析物と、
免疫及応性担持材料に固定した被分析物とが標識した免
疫学的成分の結合部位に関して競合する。恒温保持工程
の終結時に試料液体を免疫及応性多孔性担持材料から分
離しかつ液相中か又は免疫及応性多孔性担持材料上の標
識した免疫学的成分の量を測定する。

本発明方法により製造した免疫反応性多孔性担持材料は
免疫試験のマトリックスフリースとして使用することが
できる。

例えば、次のものが挙げられる： １、　ヨーロッパ公開特許第０　１６７　１７１号明細
書又はヨーロッパ特許第０　０７３　５１３号明細書に
よる挿入部材での使用（例えば第１図）、 ２、　免疫試験片での使用、 この際に、被分析物が溶解している液体はフリースの毛
管作用力により初めに搬送される。

簡単な試験片の構造は第２図に図示されているＯ 試験片１は担持層２とその上に固定されているフリース
３．４．５及び６よシ成る。液体をフリース３上に施す
と、フリース４から必要な試薬、例えば標識した抗原、
ノ・ブテン又は抗体が溶は出す。フリース５は本発明に
よる免疫及応性多孔性担持材料である。最後に、フリー
ス６中で標識の分光測定上行なう。標１ｉｉｉ！を適当
に選択する際に、例えば色の貧化を視覚的に評価するこ
ともできる。このような免役試験片は自動的な試験法の
範囲でも使用することができる。

実施例 次に本発明を実施例により詳説する。

例１ 繊維スラリに湿潤増強剤を添加することによ広ａ）出発
物質として次の成分を使用する：水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１０００Ｊポリエステｓｉ　
（ｉ、７　Ａｔ＠Ｘ　ｅ長さ６　ｓａｍ　。

無水乾燥’、　８ｏｈｖａｒＭｖｉｉｅｒ　Ｔｅｚｔ１
１Ｗｅｒｋｅ社）　　　　　　　　　　２．４　ｋｇ亜
硫酸パルプＣＦＷ型、無水乾燥； Ｂａｙｅｒｉｓｏｈｅ　ＺｓｌｌｓｔＯｆｆ　ＧｍｂＥ
社）　　０．６に９＠ ルレシン（Ｌｕｒｅｓｉｎ　　、　ＢＡＢＹ　ＡＧ社。

亜硫酸パルプに対して３Ｍ量％）０．０１８ｋｌＦ抄紙
機として市販の傾剰漉網機（８ａｈｒｉｇｅｉ”ｅｂｍ
ａｓａｈｉｎｓ　）　を使用する。繊維材料を裂砕、叩
解し、かつ水及び湿潤増強剤で膨潤させる。

生成した繊維スラリを仲劇漉網上にポンプ流送する。液
体が流出する際に繊維は漉網上に残留し、これを乾燥機
に運指する。乾燥を、湿度１．４〜２．４重量％になる
まで１２５℃で行なう。

吸引速度及び搬送速度は、密度０．５５１１７−’及び
厚さ０．６１１１の材料が得られるように選択する。

ｂ）例１　ａ）と同様にして担持材料を次の出発物質か
ら製造する： 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｉ
　ｏｏｏｌ亜硫酸パルプ（ＩＦＷ型、無水乾燥； Ｂａｙｅｒｉｅｏｈｅ　Ｚｅｌｌａｔｏｆｆ　ＧｍｂＨ
社＞　　　１ｋｇステーブルファイバー〇ビスコース （ＤＡＢ　７型、無水乾燥；　１．７　ｄｔｅｘ＋切片
長さ６ｍ　；　Ｒｏｈｔｅｘ　ＴｅｘｔｉＩＧｍｂＨ社
）　　　　　　　　　　　０．５　ｋｉ９ポリアミド（
無水乾燥ｍ　２．２６ｔｒｅｘ　＋切片長さ４　ｗｓ　
；　８ａｈｗａｒｇｗｉｌａｅｒＴｅｘｔｉｌ　Ｗｅｒ
ｋｅ　）　　　　　　　　　　　１ｋｇポリエステル（
Ｓ水乾燥＊　１．５　ａｔｅｘ。

切片長さ６ｍｂ　、ｅ　８ａｈｗａｒｚｗ籠１ａｅｒＴ
ｅｚｔｉｌ　Ｗｅｒｋｅ　）　　　　　　　　　　　ｉ
　ｋｇポリアクリルニトリル（無水乾燥。

３．３４ｔｅｘ　、切片長さ４騙； Ｂａｈｗａｒｚｗｉｉｌｄａｒ　Ｔｅｘｔｉｌ　Ｗａｒ
ｋｅ　）　　　１．５　ｋｇエタドリ：ＡＤ　Ｎ　７６
−溶液（ムに１！０Ｏｈａｍｉｅ社、エタドリー１；１
７６　１２．５重量％、これは乾燥エタドリン０．０３
ゆ゛に相当ｌ亜硫酸パルプに対して３重量％）０．２４
に９ Ｃ）例１　ａ）と同様にして次の出発物質から７リース
を製造する： 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０００１ポリエステル（１，７ｄｔ４１Ｋｍ切片長さ
６謡、無水乾燥；　８０ｈＷａｒｇＷａｌｌｌ１８ｒＴ
ｅｘｔｉｌ　Ｗｏｒｋｓ　）　　　　　　　　　　　３
　ｋ＆リンク−（鋒水乾燥、１４７１／９４１型＊　Ｐ
ｅｔｅｒ　Ｔａｎｎｉｎｇ　ＧｍｂＨ社２　　　２ｋｌ
？エタドリ−Ｎ７６−溶液（乾燥エ タドリン０．０６１ＱＦに相当するエタドリ：／＠Ｎ　
２６　１２．！ｌｉｆ＆％−リンターに対して３重量％
）　　　０．４８に９例２ 担持材料を湿潤増強剤で含浸することにより、湿潤増強
剤で処珈された担持材料の製造出発物質として、ポリエ
ステル６０％及び亜硫酸パルプ（ｙｗ　Ｗ　、無水乾燥
；　ＢａｙｅｒｉｓａｈｅＺｅｌｌａｔｏｆｆ　Ｇｍｂ
Ｈ社ン４０％よシ成る担持材料（＠度０．３＃／ａｍ３
、液体吸収ｆ１６００Ｗｄ／ｍ２、面積重量２００９／
が、厚さ０．６鵡）を使う。

この担持材料を亜硫酸パルプに対して３重−ｉ％に相当
するエタドリーＮ７６　４９／ｌの水溶液によｐ含浸機
によｐ含浸させ、引続いて残留湿度５．ｆｉｔ％まで１
００℃で局囲臣気で乾燥する。

例３ 免疫及応性多孔性担持材料の製造及び試ｌｉ１．実施の
ための仲の出発物質の取得 Ａ）ウサギエｇＧ及びそれに結合しているＴ３もしくは
Ｔ４より成るポリハプテンの製造ボリン・ダテンの製造
は技術水準に包含される。

例えは反応性不斉ジカルボン酸エステル／活性ハシテン
エステル及びキャリア蛋白質へのその結合′を介してジ
ノキシン−ポリハプテンが得られる。

例えば、Ｔ３もしくはＴ４−ポリ／”１ブテンの製造は
ホルモン及び蛋白質のＮＨ２−基のビス−イミデートに
よる直接結合によシ（ヨーロッパ公開特許第０　０７８
　９５２４９８Ａ細書）又はカルボシイζド戊応により
〔ムｈｅｒｎｅ及びその他共著、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、０１ｉ
ｎ、Ｐｈａｒｍ、”　ｓ　３巻％　５６頁（１９７６年
）〕又は１混１重ンヒドリド１及応によ’）　ＣＥｒｘ
ａｎｇｅｒ及びその他共著、＠Ｍ＠ｔｈｏｄｊ！１ｎ工
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ工ｍｍｕｎｏｏｈｅｍｉａ
ｔｒｙ　’　、　１４９貞以下、Ｗｉｌｌｉａｍａ　ａ
ｎｄ　０ｈａａｅ　ｌｉ、ムｏａｄ、Ｐｒｅｓｓ出版に
ューヨーク在）、（１９６７年）〕行なう。場合により
第一工程でＴ３又はＴ４のＮＨ，−官能基ヲアセチル−
、トリフルオルアセチル−１をデトキシカルポニルー又
はベンジル−オキシカルざニルｉＫよシ保護することが
できる。引続い工、カルボキシル官能基を活性エステル
、例えＦｉＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールエステルに変換する。

キャリア蛋白質の選択には、相応する１沈ｔｉｌｌ’抗
体が手に入るかあるいは製造することができさえすれば
制限はない。

Ｂ）ウサギＩｇＧのＩｔ’ｃフラグメントに対する抗体
の製造 クサヤの屠殺血清を硫酸アンモエクム沈殿にもたらした
。ＤＥＡＩ！ｆセルロース七通し、パパイン分解しく　
Ｒ，Ｒｊ’ｏｒｔｅｒ著、＠ＢｉＯｏｈｅｍ、Ｊ、’、
７３巻、１１９〜１２６頁（１９５９年）〕、セファデ
ックスＧ１００を介してゲル濾過し、！１１！１Ａ１ｎ
セルロースを介してイオン又摸クロマトグラフィする（
　Ｋ、Ｍａｌｉｎｏｗｇｋｉ及びＷ、Ｍａｎｓｋ１共著
、”　ＭｅｔｈＯａｓ　ｉｎ　Ｉｌｌｎｇｙｍｔｈｇｙ
　”　、　　ｖｏ１．７３　％４１Ｂ−４５９頁、Ｊ、
、Ｔ、ＬａｎｇＯｎｓ及びＨ，ｖａｎＶｕｎａｋｉｓ　
ｍ　（１９Ｂ　１年）〕ことによシクサヤＩｇＧの１！
′ｏフラグメントが免疫原として得られた。この免疫原
で羊を免疫して相応する抗血清を得た。

ウサＡ’　ＸｇＧ　（Ｄ　’！！ａ　７ラグメントに対
する抗血清をＩｇＧ画分に対する硫酸アンモニウム沈殿
及びＤＩＡＩＩＩセルロースの通ｉを介して精製した。

引続いて、抗血ｒｌＶｔ免疫＠Ｍ精製するためへ相体と
して”　！ｌ！和性微性吸着剤ルタルジアルデヒド活性
化（ＡｆｆｌｎｉｔＫｔａａｄｓｏｒ’ｂｅｒｓ　、　
Ｇｌｕｔａｒ”ｄｉａｌｌ＠ｈｙＬ　ａｋｔｉｖｉｅｒ
ｔ　）　’　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
社、注文Ｎｏ、　６６５５２５　）　を使用した。免疫
吸着の実施は親和性吸海剤に関する使用便覧に記載され
ているよりに行なった。

０）Ｔ４に対する抗体とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとか
らの接合体の製造 Ｔ４に対する抗体をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに結合さ
せた（　Ｔ、Ｋｉｔａｗａｇａ著、”　Ｉｌｌｎｓａｙ
ｍｅＩｍｍｕｎｏａａｓａｙ　’　、　８１−８９　］
！ｊｓ　Ｉａｈｉｋ＆Ｗ！Ｌ　＊Ｋａｗａｉ及びＭｉｇ
ａｉ　Ｈｋ　ｓ医学書院出版（東京／二ニーヨーク在）
（１９８１年）〕。

例４ 免疫及応性多孔性担持材料の製造（均−系）工程法） ウサイエｇＧとそれに結合しているＴ５とから成るポリ
ハシテン２００％及びウサｐＩｇＧの？Ｏフラクメント
に対する抗体７００■（ハイデルベルク最大値）を別々
に酢酸０．０５モル及び塩化ナトリウム０．５％からの
溶液それぞれ１１中に取ろ。３０分後に溶液を合つする
。例１　ａ）によル湿潤増強剤で処理した担持材料をこ
の溶液で含浸しかつ残留湿度３重量％まで７０℃で乾燥
させる。

例５ 免疫及応性多孔性担持材料の製造 ａ）例１＆）により湿潤増強剤で処理した担持材料を０
，５重量％−塩化ナトリウム溶液で含浸しかつ残留湿度
５　％　ｔて７０℃で乾燥する。

ｂ）クサイＩｇＧとそれに結合し九Ｔ４とから成るポリ
ハプテン２００ダ及びクサイＩｇＧのＩＦ（１７ラグメ
ントに対する抗体７００■（ハイデルベルク最大ｆｌｌ
　）　を０，０５モル酢酸溶液それぞれ１１中に溶解す
る。３０分後、溶液を合つする。湿潤増強剤で処理した
担持材料をこの溶液で含浸しかり残仙湿度３″重量％１
で７０℃で乾燥する。

例６ 免疫及応性多孔性担持材料の製造 （アルジミンを用いて） アルジミン１００ｍ９及びアルジミンに対するポリクロ
ナール抗体３５０１ｎ９ｔそれぞれ別々に酢＠　０．０
５モルと塩化ナトリウム０．５％とからの溶液１１中に
増る。３０分後、溶液を合りする。湿潤増強剤で処理し
た担持材料をこの溶液で含浸しかつ残価湿度３重ｉ％ま
で７０℃で乾燥する。

例７ マトリックス結合Ｍ（結合強度）の副定例１　ａ）によ
シ３種の担持材料を裂製造る。

その際に、湿潤増強剤としてエタドリ−Ｎ７６（Ａｋ２
０　０ｈ＠ｍｉｅ　）　（７リース１）、”トリット＠
（ＭＷ　１５０　ｆＪＩ％Ｈｏｅｃｈａｔ　ＡＧ社）（
７リーヌ２）及びチロース［Ｆ］（ＯＢＲ２００型、Ｈ
ｏｅｏｈａｔ　ａＧ社）（フリース３）を亜硫酸パルプ
に対して３重値％の証で使用する。比較として、製造の
際に湿潤増強剤を使用しなかった例１　ａ）による担持
材料を使用する（フリース４）。

それぞれこれらの担持材料から、例４によシ沈降及び乾
燥により免疫反応性多孔性担持材料を製造する。

それぞれの免疫反応性相体上の免疫複合体の結合強度を
第１図による挿入部材中で冒−ロツバ公開特許第１３２
５１０号明細書による遠心分離分析器の使用下に測定す
る。類縁構造の挿入部材は田−ロツバ特許第００７５５
１５号明細書に記載されている。このために、４重１ｍ
の免疫反応性多孔性担持材料から挿入部材の要件に相当
する同じ大きさのそれぞれ１個のマトリックスフリース
（フリース１〜４）を切断する。

第１図による挿入部材の装着 ！　！Ｌ　＃　’ｂ　Ｉ　Ｐ　、　Ｋ　、　ＶＫｉ　、
　ＶＨ２、７に３　：空嘗Ｏ：免疫孜応性多孔性担持材
料からのマトリックス７リース ｇａ：基質フリース（クロルフェノールレッド−β−Ｄ
−ガラクトシド（ＯＰＲ−Ｇ）　２０ミリモル／ｌ、　
Ｈ］１ｌｉＰＫ８５０　ｔリモルノｌ、ｐｋ−１７，５
で含浸し九フリース） 試験の実施： １、リン酸塩緩衝液５０ンリモル／１％ｐ）１７．５〔
クロティン（ｃｒｏｔｅｉｎ　）　Ｏ（登録商標）０．
５％、ツイーン２０（登録商標）０．５％を含有〕中の
標識とじ１のβ−ｐ−ガラクトシダーゼとＴ４に対する
抗体とからの接合体２００Ｕ／ｊの溶液５０μｌ　’ｆ
ｃ’Ｎ　ｏ中にピペット装入する。

２．５分間恒温保持する。その際に、フサヤニｇＧとそ
れに結合しているＴ４とから成るポリハプテンと、フサ
ヤニｇＧのＩＰａフラグメントに対する抗体との、抗原
として作用する免疫複合体Ｘから、Ｔ４に対する抗体と
標識としてのβ−ｐ−ガラクトシダーゼとからの、抗体
として作用する接合体を用いて免疫複合体Ｙが生じる。

３、　Ｂ−ロツパ公開特許第０　１！１２　５１０号明
Ｍ５書による遠心分析器中で２０秒間遠心する。

その際に相体に強固に結合していない免疫複合体ＹＶｉ
室Ｏからの溶液と一緒に室ｄ中に輸送される。マトリッ
クスへの結合が低いためにｇａから流出するすべての複
合体Ｙは前記の第２工程の恒温保持のためにβ−ザック
トシダーぜ活性を有する。その際に液体は室ｄ中に存在
する試薬を溶解しかつそれｌ穿ＶＫ３中に随伴する。

４、遠心処理が終結すると直ちに溶液は室ＶＫ３から流
出する。

５、次に行なう遠心処理の際に、溶液はキュベツトＸ中
に流入する。キュベツト中で溶液中のβ−がラクトシダ
ーゼ活性人（１７分）を基質０ＰＲ−Ｇから形成された
生成物の濃度の変化を吸収分光分析測定により５７６　
ｎｍで測定する。

測定した酵素活性は、不十分な結合強度のために免疫反
応性多孔性相体から分離した免疫複合体ＹＯｉに関する
尺度である。酵素活性が測定されない場合（Ａ　−Ｏｍ
Ｋ　７分）８、マトリックスへの免疫複合体Ｙの結合は
完全である（盲検値Ｌ　−Ｑ　％　）。

この試験法によシ、それぞれの序Ｃにマトリックスフリ
ース１．２．５又は４が充填されている４つの挿入部材
について酵素活性を測定する。

ゼロ値Ｋｏとは、室Ｃ中に免疫及応性多孔性担持材料を
装入しないことを除い工は同じ試験を行なった際に得ら
れる酵素活性人の測定結果である。免疫複合体Ｙが形成
されず、それ故マトリックスへの結合が行なわれないの
で、ゼロ値は盲検値ｒ、＋−Ｉ　００％に相当する。

盲検値１００％でのゼロ値は、接合体を吸着しないかあ
るいは僅かに吸着するだけの、湿潤増強剤で処理した担
持材料ｋＷｏ中匡中入装入ことによっても測定される。

フリースの盲検値Ｌ（％）は次式によｐ計算する： Ｌ−−＠ｉｏ。

腕 マトリックスフリース１〜４について得られた数値を次
の表１に総括する。

ｐｌ　： 盲検値は本発明による免疫及応性多孔性担持材料の使用
によって明らかに低下させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による免疫及応性多孔性担持材料を適用
した免疫試験用挿入部材の断面図、第２図は免疫試験片
の断面図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔性担持材料とその上に沈降させた免疫複合体と
   より成る免疫反応性多孔性担持材料において、多孔性担
   持材料が湿潤増強剤１種以上により処理されていること
   を特徴とする免疫反応性多孔性担持材料。 ２、多孔性担持材料上に免疫複合体を沈降させることに
   より免疫反応性多孔性担持材料を製造する方法において
   、多孔性担持材料を湿潤増強剤１種以上により処理し、
   引続いて免疫複合体をその上に沈降させることを特徴と
   する免疫反応性多孔性担持材料の製法。 ３、不均一系イムノアツセイ法において、請求項１記載
   の免疫反応性多孔性担持材料を使用することを特徴とす
   るイムノアツセイ法。