JPH01137980A - 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子を導入した新規な組換え微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺
伝子を導入した新規な組換え微生物に関するものである
。

トリプトファン合成酵素はインドールとセリンより必須
アミノ酸であるトリプトファンを合成する酵素である。

トリプトファンは医薬品や健康食品のほか飼料添加物と
しても使われているが、工業的に安価な製造法はまだ開
発されていない。トリプトファンの製造法はいくつかあ
るが、その中でもトリプトファン合成酵素を利用する酵
素法がコスト的に有利と考えられている。

（ロ）従来の技術 酵素法による１−リプトファンの製造は大腸菌の菌体あ
るいは遺伝子操作によりトリプトファン合成酵素活性が
増強された大腸菌の菌体が酵素源として使われている。

酵素法、によるトリプトファンの生産では、用いる酵素
の安定性が製造コストに大きく影響してくるが、大腸菌
本来のトリプトファン合成酵素は安定性があまり高くな
い。大腸菌のものよりも安定性の高い他の微生物等の酵
素の遺伝子が分離されればＤＮＡ組換えで活性を増強し
た菌体を用いることにより製造コストを下げることがで
きる。安定性の高い酵素としては高度好熱菌由来の耐熱
性酵素が考えられるが、これまでその酵素蛋白も遺伝子
も単離されていなかった。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 そこで１本発明者らは耐熱性酵素を産生ずる高度好熱菌
サーマス属細菌について研究を行った結果、サーマス・
サーモフィラスＨ８２７株よりその耐熱性トリプトファ
ン合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡ断片を取り出すこと
に初めて成功し、またこのＤＮＡ断片を組み込んだ組換
えベクターを導入させた新規な大腸菌を創成するに至っ
たものである。

すなわち１本発明は高度好熱菌サーマス・サーモフィラ
スＨ８２７株の耐熱性トリプトファン合成酵素の遺伝情
報を有し２図１に示されるような制限酵素切断地図によ
り特徴付けられる３、１Ｋｂの長さのＤＮＡ断片及びそ
れを組み込んだベクターが導入された新規な大腸菌に関
するものである。

（ニ）問題点を解決するための手段 トリプトファン合成酵素遺伝子は大腸菌ではエエ且Ａ。

Ｂの２つの遺伝子よりなり長さが約２Ｋｂで染色体上で
並んで存在していることがわかっており、その編成のさ
れかたはすべての原核生物において共通であると考えら
れている。

サーマス属細菌のトリプトファン合成酵素遺伝子をクロ
ーニングするには、大腸菌のトリプトファン合成酵素遺
伝子変異株を利用する方法が考えられるが、サーマス属
細菌の遺伝子はＳＤ配列、プロモーターの構造の違いや
高いＧ’Ｃ含量のために一般に大腸菌中での発現が抑え
られるという傾向があり、クローンが分離できない可能
性がある。

そこで先ず大腸菌においてＧｅｎｅ　　Ｌｉｂｒａｒｙ
を作成し、サーマス属細菌が通常の培養状態のままで寒
天培地上においてもＤＮＡを取り込み形質転換できると
いう性質を利用して、サーマス属細菌のトリプトファン
合成酵素遺伝子変異株を相補できるかを指標にしてクロ
ーンを選択する系を用いる。

サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）ＨＢ２７株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
７５０２）より染色体ＤＮＡはフェノール法などの常法
により分離精製することができる。

ＨＢ２７株を培養集菌後、リゾチーム溶液を加え一定時
間保温する。ＳＤＳ溶液を加え溶菌させた後、フェノー
ルを加えＤＮＡ４’ｉ出する。ＤＮＡをエタノール沈殿
により回収した後、ＲＮａｓｅで処理し、染色体ＤＮＡ
を得る。

染色体ＤＮＡは制限酵素ＭｂＯ■で部分消化した後。

その４〜１０ＫｂのＤＮＡ断片を泳動溶出により分離す
る。これを制限酵素ＢａｒｎＨＩで消化したベクタープ
ラスミドＤＮＡにＴ４リガーゼを用いて連結する。

上記の方法で得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＭＣ
１００９株を０℃で塩化カルシウム処理することにより
形質転換する。アンピシリンを含む寒天栄養培地に塗布
し形質転換体のコロニーをつくらせる。

次にこれとは別にサーマス・サーモフィラスＨ８２７株
をＮＴＧ処理することにより得られたトリプトファン合
成酵素遺伝子変異株サーマス・サーモフィラスＨＢ２７
Ｔｒｐ”−（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７５０７）の培養液をサ
ーマス属細菌のトリプトファンを含まない最小寒天培地
のプレートに塗布しておく。そしてこのプレートに上記
の大腸菌のコロニーをビロード布を用いてレプリカし７
０℃で培養する。レプリカされた大腸菌は７０℃では死
滅するが、この際にＨＢ２７株の染色体ＤＮＡがランダ
ムにクローニングされているプラスミドが溶出する。プ
ラスミドに）リブトファン合晟酵素゛遺伝子がクローニ
ングされていれば、あらかじめ塗布してあったサーマス
の変異株はプラスミドＤＮＡを取り込み、染色体ＤＮＡ
上の変異部位と組換えを起こして形質転換し、コロニー
類似のフォーカスをつくる。そのフォーカスに対応する
マスタープレート上の大腸菌のコロニーが目的のＨＢ２
７株のトリプトファン合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドを保持している。

上記のようにして得られたエシェリシア・コリＭＣｌ０
０９　（ｐＫＡ２）株を微生物工業技術研究所に寄託し
た（受託番号　ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６８６）。この株よ
り常法によりプラスミドＤＮＡを調製して解析すると、
第２図の制限酵素地図により表わされる５、５Ｋｂの挿
入ＤＮＡを持つプラスミドｐＫＡ２を保持していた。ｐ
ＫＡ２プラスミド上にトリプトファン合成酵素遺伝子が
存在していることは、前記のトリプトファン合成酵素遺
伝子変異株サーマス・サーモフィラスＨＢ２７Ｔｒｐ−
株を塗布したサーマスの最小寒天培地のプレートに、’
ｐＫＡ２プラスミドＤＮＡ溶液をスポットして７０℃で
培養するとスポットした場所にトリプトファンを要求し
なくなった形質転換体が現われることにより確認された
。

前述したようにトリプトファン合成酵素遺伝子本体は約
２Ｋｂ程度の大きさと考えられるので、ｐＫＡ２より余
分なりＮＡを取り除くためにサブクローニングを行った
。ｐＫＡ２の挿入ＤＮＡのＢｇｌｌＩサイトより左の３
゜１Ｋｂの長さのＤＮＡ断片を制限酵素で切り出し、　
　ｐｔＪＣ１８プラスミドにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ連結
後、大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。上記のようにし
て得られたエシェリシア・コリＪＭ８３　（ｐＫＡ２１
）株を微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号　Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−９６８５）。この株よりｐＫＡ２１プラ
スミドＤＮＡを常法により調製した。

ｐＫＡ２１プラスミドはｐＵｃ１８ベクターに対する挿
入ＤＮＡの向きがｐＫＡ２とは逆になっている。

ｐＫＡ２１の挿入ＤＮＡについて、さらに詳しい制限酵
素解析の結果、第１図の制限酵素地図によって示され。

ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＣＩａＩ、ＨｐａＩ、Ｍ］ｕＩ、ＮｃｏＩ、Ｐ
ｖｕｌ、５ｃａＩ、５ａｉｌの制限酵素で切断されない
３゜１Ｋｂの長さのＤＮＡ断片であることが明らかにな
った。

ｐＫＡ２１はｐＫＡ２と同様にＨＢ２７Ｔｒｐ−株をト
リプトファン非要求性に形質転換し、遺伝子の存在が確
８召された。

ｐＫＡ２１プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ８３　（ｐ
ＫＡ２１）株を培養集菌後緩衝液に懸濁し、超音波処理
により菌を破壊した。遠心分離後の上清をさらに８０℃
で熱処理して大腸菌由来の酵素を失活させ、その遠心分
離上清を分取した。この上清を粗酵素液としてＹａｎ。

ｆｓｋｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ５．Ｐ７９４　　（１９６２）
に記載されている）により７０℃という高い温度でのト
リプトファン合成酵素活性を測定した。その結果、高い
温度での活性が検出され、ｐＫＡ２１プラスミドの挿入
ＤＮＡ上にトリプトファン合成酵素遺伝子がのっており
、かつ大腸菌において耐熱性のサーマスのトリプトファ
ン合成酵素が産生されていることが確認された。

以下９本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例 （１）サーマス・サーモフィラスＨ８２７株の染色体Ｄ
ＮＡの調製と制限酵素による切断 ザーマス・ザーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
丁ｍｏ　　ｈｉｌｕｓ）Ｈ８２７株（微生物工業技術研
究所寄託菌株　ＦＥＲＭ　　Ｐ−７５０２）を２！のサ
ーマス培地（デイフコ・イーストエキストラクト２ｇ、
ポリペプトン（大五栄養）４ｇ、ＮａＣ１１ｇを純水１
１に含み、ｐＨを７．５に調整したもの）に接種し、対
数増殖期の終わり近くで集菌し、約６ｇの湿菌体を得る
。これをリゾチーム１２ｍｇを溶かした６　ｍ　１２の
０．１５ＭＮａＣ１−０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８
）に懸濁し、３７℃で２０分間保温後、エタノール・ド
ライアイスの冷媒中に入れてすみやかに凍らせる。５０
ｍ１の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）−１％５Ｄ
Ｓ−０，１ＭＮａＣ］を加え、攪拌後、上記緩衝液で飽
和させたフェノールを５６ｍ４加え、４℃で振盪後、遠
心し、上層を分取する。これに２容の冷エタノールを加
えて核酸画分を糸状沈殿として回収し、２０ｍｆｆのＯ
，ｌＸ５ＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１−０，０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）に溶かしたあと２ｍｊ２のｌ０Ｘ
ＳＳＣを加え、粗ＤＮＡ溶液を得る。次にＲＮａｓｅ　
　Ａ（シグマ社製）。

ＲＮａｓｅ　　Ｔｌ　　（シグマ社製）をそれぞれ５０
μｇ／ｍ１１．３（ｌμｇ／ｍＡになるように加え、３
７℃で３０分間保温し、ＲＮＡを分解した後、上記フェ
ノール処理を繰り返し、染色体ＤＮＡ溶液を得る。

次にこの染色体ＤＮＡ１００μｇに対し、１０ｕｎｉｔ
のＭｂｏＩ制限酵素を加え、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｃ
Ｉ　　（ｐＨ７，４）　−５０ｍＭ　　ＮａＣ１−１０
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　の反応液Ｑ、５ｍＡ中で、２４℃
にて１時間反応を行わせ部分消化した後、フェノール処
理、エーテル抽出により制限酵素を失活させる。次いで
これを０．７％アガロース−１００ｒｎＭ　　Ｔｒｉｓ
−はう酸−２ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，３）中で電気泳
動を行い、その約４〜１０Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ画分
を泳動溶出により取得し、フェノール処理、クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿を行った後、０．１ｍｊ２のＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ、　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　ｐＨ７，５）に溶解させる。

（２）ベクターＤＮＡへの染色体ＤＮＡ断片の挿入大腸
菌ベクタープラスミドｐＵｃ１３を制限酵素ＢａｒｎＨ
Ｉで消化後フォスファターゼ処理したＤＮＡ　（ファル
マシア社より購入、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ　　３３．Ｐ２Ｏ
３（１９８５）に記載されている）０．１μｇと（１）
で得られた染色体ＤＮＡ断片１μｇを混合し、５０ｍＭ
Ｔｒｊｓ−ＣＩ　　（ｐＨ７，５）−５ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２−１０ｍＭ　　ＤＴＴ−０，４ｍＭ　　ＡＴＰの反
応液３０μ！中で、　　１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガー
ゼにより１６℃で１２時間反応させ、ベクターと染色体
ＤＮＡ断片を連結させた。

（３）組換えプラスミドの大腸菌への導入（形質転換）
エシェリシア・コリＭＣ１００９株（ファルマシア社販
売株、スウェーデン生化学関連試薬販売会社）を１０ｍ
１ｌの２ＴＹ培地（トリプトン１．６％、酵母エキス１
％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７）に接種し３７℃で培養
し、培養液の６６０ｎｍの吸光度が０．　３になったら
集菌する。５　ｍ　Ｉｔの５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　　
に懸濁し、０℃で１時間放置後、遠心集菌し、１ｍｊ２
の５０ｍＭＣａｃ１２　に再び懸濁する。この液０．２
ｍｊ！に（２）で得たＤＮＡ溶液３０μｌを加え、０℃
で１時間放置後。

５ｍｌの２ＴＹ培地を加え、３７℃で１時間培養する。

これを７７ピシリ：／　（５０ｇｇ／ｍｊりとＸｇａｌ
（５０ｇｇ／ｍｌ）を含むＨ寒天培地（トリプトン１％
、ＮａｃＩｏ、８％、ｐＨ７，寒天１．５％）に塗布し
。

３７℃で１５時間培養し、アンピシリン耐性の大腸菌形
質転換体を得る。

（４）トリプトファン合成酵素遺伝子をクローニングし
た組換え体大腸菌の選択 ｒｍｏｐｈ　ｉ　１　ｕｓ）ＨＢ２７Ｔｒｐ−株（微生
物工業技術研究所寄託菌株　ＦＥＲＭ　　Ｐ−７５０７
）はサーマス・サーモフィラスＨ８２７株をＮＴＧ処理
することにより得られたトリプトファン要求株の中から
、インドールをトリプトファンの代わりに利用できない
という形質を示す株を選択することにより分離されたト
リプトファン合成酵素遺伝子変異株である。この株をサ
ーマス培地に接種し７０℃で培養後遠心集菌し生理食塩
水（０，９％ＮａＣ１）に懸濁した。この懸濁液０．　
１ｒｒ＋ｊ！をサーマス属細菌の最小合成寒天培地（蔗
糖５ｇ、に２ＨＰＯ４０、５ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４０，２
５ｇ、　ＮａＣ１２ｇ。

（ＮＨ４）２ＳＯ４２，５ｇ、ビオチン　１００μｇ、
塩酸チアミン　１ｍｇ、　ＭｇＣ１２・６）Ｌ！０　０
．　１２５ｇ。

ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２５ｍｇ、　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ
ｏ　　６ｍｇ。

ＣｏＣｌ２・６）Ｌ）０　０．　８ｍｇ、　ＮｉＣｌ２
・６Ｈ２０２０ｇｇ、ＮａＭｏ○２−２）Ｌ！０　１．
　２ｍｇ、　ＶＯ３Ｏ４・３Ｈ２００、１ｍｇ、　Ｍｎ
ＣＩ２・４Ｈ２００，５ｍｇ、　　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２０６Ｑμｇ、　　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０１５／ｊｇお
よび寒天（牛丼化学）１５ｇを純水１１に含みｐＨ７゜
２に調整したもの）に塗布した。

このプレートに（１）で得られたアンピシリン耐性の大
腸菌のコロニーをビロード布でレプリカし７０℃で２日
間培養した。大腸菌よりもれ出てきたプラスミドにより
形質転換し、トリプトファンを要求しなくなったサーマ
ス菌のフォーカスが１つ現われた。このフォーカスに対
するマスタープレート上の大腸菌のコロニーを純化し。

得られた株をエシェリシア・コリＭＣ１００９（ｐＫＡ
２）株として微生物工業技術研究所に寄託した（受託番
号ＦＥＲＭ　Ｐ−９６８６）。

（５）組換えプラスミドの分離と解析 （４）で得られたエシェリシア・コリＭＣ１００９（ｐ
ＫＡ２）株をアンピシリン（１００１１ｇ７ｍ１ｌ）を
含む２ＴＹ培地２００ｍＩ２中で３７℃で培養後集菌し
。

２５ｒｎＭ　　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　　（ｐＨ８）−１０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ−５０ｍＭグルコース−０，５％リゾチ
ームの溶液を４ｍＲに懸濁し、３７℃で５分間放置した
。これに１０ｍ１の０．２Ｎ　　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳ
を加え、０℃で１０分間放置した後、　　７．　５ｍｊ
！の５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を加え、０℃で
１０分間放置後、遠心分離し、上清を得た。上清にＰＥ
Ｇ６０００を終濃度１０％になるように加え、０℃で２
時間放置後、遠心してＤＮＡを沈殿させた。これを５　
ｍ　１２のＴＥ緩衝液に溶かした後、エチジウムブロマ
イド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけプラスミド
ＤＮＡを得た。

得られたｐＫＡ２プラスミドを種々の制限酵素で切断し
、制限酵素切断地図を作成した。その結果を第２図に示
す。挿入ＤＮＡの長さは５．５Ｋｂであり、ＥｃｏＲＩ
、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、Ｃ
１ａ１．ＨｐａＩ、Ｍｌｕｌ、ＰｖｕＩ、５ｃａＩ、５
ａＩＩの制限酵素で切断されない。この挿入ＤＮＡ断片
は本発明者らによって初めて分離されたＤＮＡ断片であ
る。

また（４）と同様にサーマス・サーモフィラスＨＢ２７
Ｔｒｐ−株を塗布したサーマスの最小寒天培地のプレー
トにｐ、ＫＡ２プラスミド溶液を１０μｌスポツトして
７０℃で培養すると、スポットした場所にトリプトファ
ンを要求しなくなった形質転換体が生育してきた。

上記のことよりｐＫＡ２プラスミド上にサーマス・サー
モフィラスＨ８２７株のトリプトファン合成酵素遺伝子
がクローニングされていることが確認された。

（６）ｐＫＡ２プラスミドよりサブクローンプラスミド
の作成 ｐＫＡ２プラスミドＤＮＡ１１１ｇに制限酵素Ｓ’ａｌ
ＩおよびＢｇｌＩＩをそれぞれ１０ｕｎｉｔづつ加え５
０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　　５−ＣＩ　　（ｐＨ７，５）−
１００ｍＭ　　ＮａＣＩ−１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ＋２の
反応液５０μβ中で３７℃１時間反応させた。これを８
９ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−８９ｍＭはう酸−２，５ｍＭ　　
Ｎａ２ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，３）　−０、７％アガロー
ス中で電気泳動し、　　ｐＫＡ２プラスミドの挿入ＤＮ
ＡのＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片のみを泳動溶出により取
得し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノ
ール沈殿して５μｌの水に溶かした。これと制限酵素５
ａｌＩとＢａｍＨＩで同様に切断したｐＵＣ１８プラス
ミドＤＮＡ　（宝酒造製）５０ｎｇとを混合し。

５０ｍＭ　　Ｔｒ　１ｓ−ＣＩ　　（ｐＨ７，５）−５
ｍＭ　　ＭｇＣ＋２−１０ｍＭ　　ＤＴＴ−０，４ｍＭ
　　ＡＴＰの反応液３ＣＪｔｔｌｌ中で、１ｕｎｉｔの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で１２時間反応させ、
ベクターとＤＮＡ断片を連結させた。これを用いて（３
）と同様の方法で大腸菌ＪＭ８３株（ＢＲＬ社販売株、
米国生化学関連試薬販売会社）を形質転換した。

上記のようにして得られた株をエシェリシア・コリＪＭ
８３　（ｐＫＡ２１）株と名付け、微生物工業技術研究
所に寄託した（受託番号　ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６８５）
。

ｐＫＡ２１はｐＫＡ２の挿入ＤＮＡのうちＢｇｌＩ［よ
り左側の部分３．１ＫｂのＤＮＡを挿入ＤＮＡとして持
つが、ベクターに対する挿入ＤＮＡの向きがｐＫＡ２と
は逆になっている（第２図）。

ｐＫＡ２１プラスミドＤＮＡを（５）と同様の方法で取
得し、その挿入ＤＮＡのさらに詳細な制限酵素地図を作
成した。その結果を第１図に示す。なお挿入ＤＮＡは３
、１Ｋｂの長さであり、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、Ｈｉｎｄｕ、Ｋｐｎｌ、ＣＩａＩ、ＨｐａＩ、ＭＩ
ｕｌ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、ＳｃａＩ、ＳａＩＩの制限
酵素で切断されない。

ｐＫＡ２１もｐＫＡ２と同様にサーマス・サーモフィラ
スＨＢ２７Ｔｒｐ−株を塗布したサーマスの最小寒天培
地のプレートにプラスミドＤＮＡ溶液を１０μｌスポツ
トして７０℃で培養すると、スポットした場所にトリプ
トファンを要求しなくなった形質転換体が現われ、トリ
プトフ、アン合成酵素遺伝子がクローニングされている
ことがｍ、δ忍された。

（７）ｐＫＡ２１プラスミドを保持する大腸菌の耐熱性
トリプトファン合成酵素活性 ｐＫＡ２１プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ８３（ｐＫ
Ａ２１）株を２ＴＹ培地に接種し定常期まで３７℃で培
養し、集菌後、　　１００ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＣＩ
　　（ｐＨ７゜８）緩衝液に懸濁し、超音波処理により
菌を破壊した。

遠心分離後の上清をさらに８０℃で熱処理して大腸菌由
来の酵素を失活させ、その遠心分離上清を分取し、これ
を酵素液とした。

酵素液１０μｌに１ｍｌの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒ
ｉ　ｓ　−ＣＩ　　（ｐＨ７，８）　　−０，４ｍＭイ
ンドール−８０ｍＭＤＬセリンー１８０ｍＭ　　ＮａＣ
１−０，０３ｍＭピリドキサルリン酸）を加え７０℃で
２０分間反応させた後、０．１ｍＡのＯ，ＩＮ　　Ｎａ
ＯＨを加え反応を停止させる。次にトルエン４　ｍ　ｌ
を加え、インドールを抽出した後、その１　ｍ　Ｉｌに
２　ｍ　１２の呈色液（９ｇのｐ−ジメチルベンズアル
デヒドを２００ｍＩ２のエタノールに溶かした後、４５
ｍＡの濃塩酸を加え、さらにエタノールで２５０ｍｊｌ
！にフィルアップしたもの）と４ｍＡの９５％エタノー
ルを加え２０分間放置後、５４０ｎｍの吸光度を比色定
量した。この方法により反応後のインドールの残量を求
め、トリプトファン合成酵素活性を調べた。

その結果、コントロールであるｐＵｃ１８ベクターのみ
を保持する大腸菌の酵素液と比べｐＫＡ２１を保持する
大腸菌の酵素液は顕著な耐熱性トリプトファン合成酵素
活性を示した。

このことよりｐＫＡ２１プラスミドの挿入ＤＮＡ上にト
リプトファン合成酵素遺伝子がのっており、かつｐＫＡ
２１を保持する大腸菌において耐熱性のサーマスのトリ
プトファン合成酵素が産生されていることが確認された
。

（ホ）発明の効果 分離された耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子を今後
強力なプロモーターと連結するなどのＤＮＡ組換え操作
により耐熱性トリプトファン合成酵素を多量に大腸菌よ
り取得することが可能になると考えられる。

【図面の簡単な説明】

図１はｐＫＡ２１プラスミドにクローニングされている
挿入ＤＮＡ　（３，１Ｋｂ）の制限酵素地図。 図２はｐＫＡ２プラスミドの制限酵素地図とｐＫＡ２１
プラスミドにサブクローニングされたＤＮＡの関係。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）高度好熱菌サーマス・サーモフィラスＨＢ２７株由
   来の耐熱性トリプトファン合成酵素の遺伝情報を担い、
   第１図の制限酵素地図によって特徴付けられ、ＥｃｏＲ
   Ｉ、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、Ｃ
   ＩａＩ、ＨｐａＩ、ＭＩｕＩ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、Ｓ
   ｃａＩ、ＳａＩＩの制限酵素で切断されない３．１Ｋｂ
   の長さを有するＤＮＡ断片 ２）高度好熱菌サーマス・サーモフィラスＨＢ２７株由
   来の耐熱性トリプトファン合成酵素の遺伝情報を担い、
   第１図の制限酵素地図によって特徴付けられ、ＥｃｏＲ
   Ｉ、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、ＫｐｎＩ、Ｃ
   ＩａＩ、ＨｐａＩ、ＭＩｕＩ、ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、Ｓ
   ｃａＩ、ＳａＩＩの制限酵素で切断されない３．１Ｋｂ
   の長さを有するＤＮＡ断片を導入した新規なエシェリシ
   ア・コリＪＭ８３（ｐＫＡ２１）株