JPH01101453A - 被分析物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、電気的に（例、電気泳動９等電点電気泳動に
より）分離されている被分析物質又は被分析成分（以下
、アナライトということがある）の検出方法又は定量方
法に間するも・のである。また。

本発明は、電気的に分離されているアナライトの像又は
パターンの顕出方法又は増幅方法に間するものである。

［従来の技術］ 電場を適用して薄層状又はシート状支持媒質中で分子荷
電を有する複数のアナライトを相互に分離（例、電気泳
動）させて、アナライトの少なくとも１種を検出又は定
量する方法は、生体成分を分離分析する生化学や臨床検
査分野で広〈実施されている。特に、電気泳動用の薄層
状又はシート状支持媒質（以下、電気泳動支持体という
）にアナライトを含む試料を付着させ電気伝導性のｐＨ
緩衝剤水溶液で電気泳動支持体を湿潤させて試料を電気
泳動した後、湿潤状態の電気泳動支持体中のアナライト
を検出する方法としては、検出目的のアナライトと反応
して発色する試薬（組成物）溶液又はアナライトを選択
的又は非選択的に染色する色素溶液（両者を含めて呈色
液という）に電気泳動支持体を浸漬する。呈色液を電気
泳動支持体の表面に噴霧する。あるいは呈色液を濾紙等
の多孔質シートに含浸させて電気泳動支持体の表面に接
触させて、電気泳動支持体中のアナライトと反応させて
発色（呈色）させる、あるいはアナライトを染色し。

生じた色像又は色パターンを検出する方法が実施されて
いる。これらの検出方法はいずれも液体を用いて発色又
は染色する工程を含んでいて、操作に手間がかかる方法
である。さらに、アナライトが呈色液の中に拡散してく
るので９色像又は色パターンがボケたり９色濃度が低く
なったり９色像又は色パターンの再現性が良くなく、結
果として検出又は定量精度が良くないことが問題とされ
ている。

操作をより簡単にするために９例えば、水溶性バインダ
ー中に分散させた水溶性呈色試薬からなる転写（Ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ）！置を用いて電気泳動支持体に呈色試薬を
転写する方法が知られている。この転写装置を電気泳動
支持体表面に置くと、バインダーが溶解し、水溶性呈色
試薬が電気泳動支持体中に拡散していき９分離されてい
るアナライトと反応して発色するか、又はアナライトを
染色する。

・微多孔性ポリアミド（ナイロン）膜を用いてアナライ
トとして９例えば核酸を電気吸収法（Ｅｌｅｃｔｒｏ−
ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により水性溶
媒による湿潤状態で電気泳動支持体から微多孔性膜へ転
写して検出する方法も知られている。この方法に用いら
れる微多孔性膜は非選択性であるので、すべてのアナラ
イトが微多孔性膜に転写される。ついで呈色液で微多孔
性膜を処理して、微多孔性膜中の転写されたアナライト
と反応させて発色（呈色）させる、あるいはアナライト
を染色し、生じた色像又は色パターンを検出する。この
方法に用いられる微多孔性膜には検出試薬は含有されて
いない。

ｒＪ、旧５ｔｏｃｈｅｎ＋、Ｃｙｔｏｃｈｅ＋ｍ、Ｊ３
２，１２６５−１２７４（１９８４）には、水溶性の蛍
光物質を含浸させたセルロースエステル系微多孔性膜を
水性溶媒による湿潤状態で電気泳動分離されたイソ酵素
を含む電気泳動支持体に一様に接触させて電気泳動支持
体中のイソ酵素の同定に用いる方法が記載されている。

これらの操作がより簡便な検出方法はいずれも検出試薬
を含む微多孔性膜を水性溶媒による湿潤状態で電気泳動
分離されたアナライトを含む電気泳動支持体に接触させ
るので、電気泳動支持体の泳動像又は泳動パターンがボ
ケたり９色濃度が低くなったり９色像又は色パターンの
再現性が良くなく、結果として検出又は定量精度が良く
ないという問題点は未解決のままである。

特開昭６２−１５６５５２には、透明支持体の上に水不
溶性バインダーポリマー中に、非拡散性で呈色。

蛍光発生等により検出可能な化学種を生成する検出試薬
が分散含有されている検出試薬層が積層されている検出
用要素を電気泳動分離されたアナライトを含む電気泳動
支持体にほとんど水分の存在しない状態で一様に接触さ
せ９次いでその検出用要素を電気泳動支持体から取りさ
り、検出用要素中の試薬とアナライトとの相互作用によ
り生じた検出用要素中の発色等を検出する方法が記載さ
れている。この方法は、電気泳動支持体と検出用要素と
の接触がほとんど水分の存在しない状態でなされるので
、アナライトと検出試薬を接触させ相互反応させるのに
比較例的長時間加温（約り７℃〜約４５℃、インクベー
タ中で接触させる）を要する。

電気泳動支持体と検出用要素との全面にわたる−様な接
触がなされ難いので泳動像やパターンにムラ（色訓度の
非一様性）が生じやすい等の問題点があることが明らか
になった。

［発明の目的］ 本発明の目的は、電気力により移動して相互に分離され
ている複数のアナライトを含み、水性溶媒により湿潤し
ているシート状物（電気泳動支持゛　体等）中のアナラ
イトの分離像又はパターンを短時間の簡便な操作で精度
良く′検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、電気力により移動して相−互に分
離されている複数のアナライトを含み、水性溶媒により
湿潤しているシート状物（電気泳動支持体等）中のアナ
ライトの分離像又はパターンを短時間の簡便な操作で、
精度の良い、鮮明な、乱れのない、かつ高色濃度の像又
はパターンとして顕出させる方法又は増幅する方法を提
供することである。

［発明の構成］ 本発明は。

■電気力により移動して相互に分離されている複数の被
分析物質を含み、水性溶媒によ゛り湿潤しているシート
状物と。

前記被分析物質の少なくとも１種により検出可能な変化
を生じ、かつ前記水性溶媒の存在下で移動可能な検出試
薬組成物を自身の内部に含有する微多孔性層を有する検
出用要素とを実質的に乾燥している状態で実質的に一様
に接触させ。

■前記シート状物に生じた前記検出可能な変化を検出す
る 工程を含んでなる電気的に分離された被分析物質の検出
方法である。

［発明の構成の詳細な説明］ 本発明の方法において被分析物質（アナライト）は１分
子電荷に基づいて、電界の作用により水性媒質中を通っ
て移動することができ、移動により池の物質から、又は
移動の経過中に他のアナライトから分離させうる物質で
ある。アナライトの例として、生物学的液体９例えば血
液、リンパ液、唾液。

尿中の各種の酵素、イソ酵素、抗原、抗体、諸種の蛋白
、ペプチド、ホルモン、核酸、その他の細胞成分。

酵素標識された抗原又は抗体がある。本発明の方法は、
各種蛋白（例、血清蛋白、リボ蛋白、糖蛋白、ゲロプリ
ン）、酵素（例゛、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ、
ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
アデニレートキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラ
ーゼ、コリンエステラーゼ）、イソ酵素（例、アミラー
ゼ、クレアチンキナ−看、ラクテートデヒドロゲナーゼ
、アルカリ性ホスファターゼ）の分離、検出、同定、定
量に特に有効である。

本発明の方法に用いられるシート状物としては電気泳動
支持体（電気泳動用媒体シート又は膜、以下９両者を総
称してシートという）、及び等電点（エレクトロフォー
カシング）電気泳動媒体シートが含まれる。本発明の方
法に用いることができる電気泳動媒体シートとしては、
多数の市販の電気泳動媒体シート、及び諸□文獣、諸特
許明細書りこ記載の電気泳動媒体シートがある。電気泳
動媒体シートの具体例として、特公昭５５−３１４１８
．特願昭６２−９７０９３、特願昭６２−９７０９４等
に記載のメンブランフィルタ−からなる電気泳動媒体シ
ート、特開昭６２−２７００６等に記載のポリスルホン
メンブランフィルタ−からなる電気泳動媒体シート、青
水、永井共著「最新電気泳動法」（広角書店、　１９７
８年）３７０−４１５頁；　ｒＥｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏ
ｒｅｓｉｓＪλ、２１３−２１９．同誌２．２２０−２
２８：米国特許４４１５４２８　；米国特許４１８０３
７０　：特開昭５９−１２６２３６等に記載のポリアク
リルアミド系水性ゲルからなる電気泳動媒体シート又は
膜；「最新電気泳動法」（広角書店、　１９７８年）等
に記載のアガロース水性ゲル電気泳動媒体膜；寒天水性
ゲル電気泳動媒体膜；澱粉水性ゲル電気泳動媒体膜等が
ある。これらのうちでメンブランフィルタ−から゛なる
電気泳動媒体シートが好ましい。以下では、シート状物
をプレートということがある。

検出用要素（以下、要素ということが菖る）はアナライ
トの少なくとも１種により検出可能な変化を生じ、かつ
水性溶媒の存在下で移動可能な検出試薬組成物を自身の
内部に含有する微多孔性層からなるシート状物又は膜状
物、又は支持体の表面に前記の検出試薬組成物を自身の
内部に含有する微多孔性層が積層接着されているシート
状物又はｌｌ！吠物である。　′ 微多孔性層としては、非繊維質機−孔性層と繊維質微多
孔性層のいずれも用いることができる。

非繊維質多孔性シートとして米国特許１４２１３４１゜
特□公昭５３−２１６７７、米国特許３９９２１５８等
に記載のセルロースアセテート等のセルロースエステル
。

ナイロン−６、ナイロン−６６等のポリアミド、ビスフ
ェノールＡのポリカルボネート等からなるメンブランフ
ィルタ（プラッシュポリマー１）、第９回プラスチック
フィルム研究会講座講演要旨集（高分子学会、１９８４
年２月２２発行）＋　Ｍｅｎ＋ｂｒａｎａ、Ｉｎｃ、カ
タログ（１９８２年７月発行）等に記載のポリエチレン
微多孔性膜、ポリプロピレン微多孔性層等のポリオレフ
ィン微多孔性膜、特開昭６２−２７００６等に記載のポ
リスルホンメンブランフィルタ−からなる微多孔性膜、
特開昭５５−９０８５９に記載のポリマーミクロビーズ
がポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空
隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊
維質等方的多孔性層等を用いることができる。

非繊維質多孔性層の空隙サイズは約５０ｒｕｓから約５
０１ｍ、好ましくは約１００止から約５１ｍの範囲、空
隙率は２０％から約９０％、好ましくは約４０％から約
８５％の範囲、厚さは約１０ｕｍから約５００１ＪＩＴ
＋、好ましくは約２０−から約３ｓｏｕｍの範囲である
。

繊維質多孔性層として２ｗ４物布地、Ｗ物布地、有機ポ
リマーＩｍ維バルブ含有抄造紙及び−紙、ガラス繊維バ
ルブ含有抄造紙及び濾紙、繊維質不織布等を用いること
ができる。

織物布地としては、特開昭５５−１６４３５０．特開昭
６０−２２２７７０等に記載の紡績糸（加捻糸）製の平
織物が好ましく、平織物のうちではブロード布地、ボブ
リン布地が好ましい。織物布地の糸の太さは綿紡績糸番
手で表して約２Ｏ９から約１５０５．好ましくは約４Ｏ
５から約１２０３相当の範囲、又は絹糸デニールで表し
て約３５Ｄから約３００Ｄ、好ましくは約４５Ｄから約
１３０Ｄの範囲、織物布地の厚さは約５０ｐｍから約５
００１ｆｆ＋１．好ましくは約８０ｕｍから約３５０１
１１１の範囲、織物布地の空隙率は約４０％から約９０
％、好ましくは約５０％から約８５％の範囲である。

編物布地としては、特開昭ＧＯ−２２２７６９．特開昭
６０−２２２７７０等に記載の紡績糸（加捻糸）ｉｌの
経（たて）メリヤス編布地が好ましく、経メリヤス膳布
地のうちではトリコット編布地、ラッシェル編布地、ミ
ラニーズ編布地、ダブルトリコット扁布地が好ましい。

編物布地の糸の太さは、綿紡績糸番手で表して約４Ｏ９
から約１５０９．好ましくは約６Ｏ８から約１２０Ｓ相
当の範囲、又は絹糸デニールで表して約３５Ｄから約１
３０Ｄ、好ましくは約４５Ｄから約９０Ｄの範囲９編物
布地の編成・工程時のゲージ数としては約２０から約５
０の範囲９編物布地の厚さは約５０−から約５００ｐ、
好ましくは約８０Ｌｆｆｌｌから約３５０ｕｍの範囲９
編物布地の空隙率は約４０％から約９０％、好ましくは
約５０％から約８５％の範囲である。

有機ポリマー繊維バルブ含有抄造紙としては。

特開昭５７−１４８２５０等に記載のポリエチレン繊維
だけのバルブからの抄造紙、及びポリエチレン繊維（３
０〜７０％）とセルロース繊維等の天然ｌｉ維、の混合
バルブからの抄造紙が好ましい。紙の厚さは約５０−か
ら約５００ｕ＋ｎｅ好ましくは約８０１ｍから約３５０
Ｉｊ１１の範囲９紙の空隙率は約２０％から約８０％、
好ましくは約５０％から約７０％の範囲である。

繊維質多孔性シートのうち織物布地および編物布地は水
洗等の脱脂処理により少なくとも糸製造時又は布地製造
時に供給又は付着した油脂類を実質的に除去した布地を
用いる。

微多孔性層には公知の界面活性剤、　ｐＨ緩衝剤組成物
等を含浸保持させることができる。界面活性剤の含浸保
持により、プレートから要素への水性溶媒の移動浸入が
一様になり、また要、素中の検出試薬組成物のプレート
への移動浸透が一様になる。

界面活性剤としてはノニオン性界面活性剤が好ましい。

微多孔性層は支持体の表面に積層接着された多層構造物
とすことができる。支持体は透明、半透明、不透明いず
れのものも用いることができる。

透明支持体としては従来公知の水不透過性支持体を用い
ることができる。その具体例として、ポリエチレンテレ
フタレート、ビスフェノールへのポリカルボネート、ポ
リスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジア
セテート、セルローストリアセテ−、ト、セルロースア
セテートピロビオネート）のポリマーからなる平滑表面
を有するフィルム状（シート状）又は平板状物がある。

半透明支持体の具体例として、前記の透明支持体と同じ
ポリマーに二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子等
を少量分散含有させて半透明ないしは半孔白色にした平
滑表面を有するフィルム状（シート状）又は平板状物が
ある。

不透明支持体の具体例として、前記の透明支持体と同じ
ポリマーに二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子等
を分散含有させて不透明で光反射性又は乳白色にした平
滑表面を有するフィルム状（シート状）又は平板状物、
前記の透明ポリマー支特休に用いられるのと同様なポリ
マーを含浸又は表面にコーティングした紙、セラミック
スシート。

乳白色ガラスシート等がある。これらのうちで前記の透
明ポリマーに二酸化チタン微粒子又は硫酸バリウム微粒
子等を分散含有させた不透明で光反射性又は乳白色の支
持体が好ましい。

支持体の厚さは透明、半透明、不透明のいずれも約５０
ｕｍから約１ｍｍ、好ましくは約８ＯＬＩｍから約３０
０ｕｍの範囲である。支持体の表面には必要に応じて公
知の下塗層又は接着層を設けて支持体の上に積層接着さ
れる微多孔性層支持体との接着を調節する（多くの場合
、接着力増大させる）ことができる。

検出試薬組成物は、水性溶媒の存在下で移動可能であり
、かつアナライトの少なくとも１種と相互反応して検出
可能な変化を生じるか、又はアナライトの少なくとも１
種に作用して検出可能な変化を生じさせることができる
試薬組成物である。

検出試薬組成物として、■色原体とカプラーを含み、ペ
ルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカ
プラーが酸化カプリングしてキノンイミン染料を形成し
て発色する組成物、■水溶性ロイコ色素または自己酸化
発色性色原体でペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素
により酸化されて色素になり発色する化合物、■テトラ
ゾリウム塩化合物含有発色試薬組成物、■検出可能な化
合物（色素等）を結合した水溶性酵素基質、■第３の化
合物と反応して検出可能な化合物（色素等）を生成しろ
るを化合物又は原子団を結合した水溶性酵素基質、■水
溶性染料、■その他の公知の検出試薬組成物がある。

■色原体とカプラーを含む組成物の例：色原体として＋
ｒＡｎｎ、ＣＩ　ｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、Ｊ、６．２
４−２７（１９６９）に記載の４−アミノアンチピリン
（別名４−アミノフエナゾン１体系名称ｌ−フェニル−
２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン）又はその塩酸塩；特開昭５９−５４９６２等に記
載の１−（２，４，６−トリクロロフエニル）・２，３
−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン又
はその塩酸塩等のトリ置換−４−アミノ−３−ピラゾリ
ン−５−オン又はその塩酸塩等の４−アミノアンチピリ
ン類似体又はその塩がある。

カプラーとして、ｒＡｎｎ、ｃＩ　ｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｊ＋Ｌ２４−２７（１９６９）　、特公昭５５−２
５８４０　、特公昭５８−４５５９９　。

特開昭５５−１６４３５６．特開昭５６−１５５８５２
等に記載のフェノール；２−ヒドロキシートベンゼンス
ルホン酸等のフェノールスルホン酸くアルカリ金属塩、
アルカリ土類金属塩を含む）；ｌ−ナフトール；２−ナ
フトール；ｌ、７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒド
ロキシナフタレン；１−ヒドロキシ−２−ナフタレンス
ルホン酸等のナフトールスルホン酸くアルカリ金属塩、
アルカリ土類金属塩を含む）；その他のフェノールまた
はナフトール誘導体がある。

■水溶性ロイコ色素： ロイコ色素の例として、特公昭５７−５５１９に記載の
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４゜５−ビス［ト（ジメチルアミノ）フェニルコイミ
ダゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素又は
その酢酸塩；特開昭５９−１９３３５２に記載の２−（
３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネチル
イミダゾール等のジアリールイミダゾールロイコ色素又
はその酢酸塩：特開昭６１−４９６０に記載の２−（２
−フェニル−３−インドリル）−４，５−ジ［４−（ジ
メチルアミノ）フェニルコイミダゾール等のジアリール
インドリルイミダゾール、ロイコ色素又はその塩等があ
る。

■テトラゾリウム塩含有発色試薬組成物ニアナライトに
対応するデヒドロゲナーゼ、少なくとも１種の酸化型補
酵素、少なくとも１種の色素前駆物質及び少なくとも１
種の電子伝達物質を含む発色試薬組成物がある。この発
色試薬組成物を用いる場合には、電子伝達剤と色素前駆
物質とを別異の２層に分離して（他の成分はこれら２成
分のいずれか一方とともに、あるいは適宜に別異の層に
分離して）検出用要素中に含有保持させることにより試
薬組成物の経時劣化の減少と測定感度の増大があり好ま
しい場合が多い。

■検出可能な化合物（色素等）を結合した水溶性又は水
分散性酵素基質の例として、ブルースターチ等の色素結
合澱粉がある。

■第３の化合物と反応して検出可能な化合物（色素等）
を生成しうるを化合物又は原子団を結合した水溶性又は
水分散性酵素基質の例として、特公昭５７−３００００
等に記載のＮ−メチルアニリノ基が結合した澱粉誘導体
等のカプラー結合澱粉がある。

■水溶性染料の例として、河合、鈴木共著「セルロース
アセテート電気泳動法による血清蛋白分画」等に記載の
ブロムクレゾールグリーン、ブロムクレゾールパープル
、ブロムフェノールブルー、ボンソー３Ｒ，ファストブ
ルーＰＲ等がある。

■その他の公知の検出試薬組成物の例として、ニンヒド
リン発色試ＭＭｉ成物、５ｃｈｉｆｆ染色組成物等があ
る。

いずれの種類の検出試薬組成物においても、検出試薬組
成物とともに公知のｐＨ緩衝剤組成物を含有させて、ア
ナライトに適した。又は検出試薬組成物に含有される酵
素反応及び／又は発色反応に適した範囲のｐＨ値に調整
維持することができる。

ｐＨ緩衝剤組成物としては、電気泳動及び臨床化学分析
、生理学等の諸分野で公知のｐＨｍ衝剤組成物を用いる
ことができる。さらに、必要に応じて界面活性剤（好ま
しい例、ノニオン性界面活性剤）、その他の成分を添加
することができる。

前記の検出試薬組成物は、ｙ＆多多孔性化公知の方法（
例、検出試薬組成物の水溶液に微多孔性層を浸漬し、液
から取りだして乾燥する方法、微多孔性層に検出試薬組
成物の水溶液を噴霧し乾燥する方法、微多孔性層に検出
試薬組成物の水溶液を塗布し乾燥する方法等の公知の方
法により含有させることができる。微多孔性層を支持体
に積層接着する方法としては、特公昭６２−１７７０６
．特開昭５６−９７８７２等に記載のように支持体の表
面に親水性ポリマー層又は接着層を介して微多孔性層を
積層接着する方法等の公知の方法によることができる。

また、２Ｍ以上の微多孔性層をｆＪ！Ｆｊ接着して支持
体の上に設ける方法としては、特開昭６１−４９５９゜
特開昭６２−１３８７５６等に記載の多孔性接着の方法
によることができる。検出用要素には、所望により接着
層、光反射層、輻射線遮蔽層、中ＩＬ’ＴＦｆ、濾過層
。

バリアー層等の一体型多層分析要素の技術において公知
の層を設けることができる。また、支持体にプレートの
位置合せのためのマーク、泳動像又は泳動パターンの目
安等のための長さ目盛等を設けることもできる。

次に本発明のアナライトの像又はパターンの検出方法又
は顕出方法の操作手順を説明する。

被分析物質（アナライト）を含む液体試料をシート状物
（以下、プレートということがある）に付着させた後に
、プレートに適当な電界（又は電流）を作用させ、アナ
ライトの分子移動及びアナライト相互の分離を行わせる
。電気泳動の場合にはアナライトに一定のｐ１直及びイ
オン強度の電場を作用させる。等電点電気泳動の場合に
は分子個々の等電点に基づいて分子にｐ１勾配を作用さ
せて分子相互を分離させる。電気泳動及び等電点電気泳
動いずれの場合にも、プレートを水性溶媒で湿潤させた
状態でアナライト分子を電気泳動分離させる。

アナライト分子の分離が適−当な程度まで進行させた後
、水性溶媒で湿”潤しているプレート表面と検出試薬組
成物を自身の内部に含有する微多孔性層を有する検出用
要素とを、要素が実質的に乾燥している状態で一様に接
触させる。プレートと要素との接触は、プレートの上に
要素を重ねることにより実施されるが、逆１こ要素の上
にプレートを重ねることもできる。接触しているプレー
、トの表面と要素の表面との界面から要素の表面に、ざ
らに内部にプレートの水性溶媒が移動し浸入する。

この水性溶媒により検出用要素中の検出試薬組成物が移
動可能になり、要素からプレートの表面又はさらに内部
に移動する。ア゛ナライトと検出試薬組成物との相互反
応又は検出試薬組成物のアナライトに対する作用が充分
に進行し検出可能′な変化２が充分に生じるまで要素と
プレートの接触を保つ。

この間に、移動した検出試薬組成物はプレートの表面又
は内部でアナライトの少なくとも１種の分離像又は分離
パターンに対応する検出可能な変化（呈色又は染色）を
生じさせる。又はアナライトの分離像又は分離パターン
を顕出させる。プレートと要素の接触時間は、アナライ
ト、用いる検出試薬組成物、又はアナライトと検出試薬
組成物の濃度に依存して変化する。一般的に約２５℃−
約４５℃。

好ましくは約り０℃〜約４０℃の温度範囲で約２０秒〜
約３０分、好ましくは約３０秒〜約２０分の時間範囲に
わたって接触を保つ、ついでプレートから検出用要素を
取り去る。水性溶媒が存在するのでプレートから要素を
取り去るのは容易であり、かつプレートを破壊する恐れ
はほとんどない。検出用要素が実質的に透明であれば、
プレートから要素を取り去ることは必須ではな′＜、プ
レートと要素を接触させた状態のままで検出可能な変化
を検出することも可能である。しかし、プレートから要
素を取り去ってから検出可能な変化を検出するのが一般
に好ましい、　　　　　　− 接触している間に水性溶媒により、乾燥していた検出用
要素の内部まで湿潤するので、アナライトのプレートか
ら要素への拡散及び横方向（要素の表面に沿う方向）へ
の拡散が生じる可能性があるので泳動像又は泳動パター
ンのボケや色濃度の低下、さらには像又はパターンの再
現性の不良化が心配されたが、意外なことに、乾燥して
いる検出用要素を接触させる本発明の方法においては。

これらの問題は実質的に生じないことが見出された。

プレートに生じた検出可能な変化は、一般に光学的測定
法又は分光光度法により検出てきる変化が好ましい。こ
の変化として２例えば、適宜な分光光度検出装置と方法
で検出可能な色、蛍光、化学又は生化学ルミネッセンス
、燐光があり、変化の測定方法として２例えば、光学濃
度測定法（比色法）、総光量測定法、像又はパターン認
ｒａ（又は識別）法がある。プレートが実質的に透明又
は半透明であれば検出可能な変化を透過測光法又は反射
測光法により、プレートが不透明であれば反射測光法に
より検出可能な変化を測定する。

回工歪亘 実施例１ ［検出用要素の調８！］ 厚さ２００μｍの無色透明平滑表面のポリエチレンテレ
フタレートフィルム（支持体）の表面に厚さ約５μｍの
ポリビニルアルコール層を水溶液を用いて塗布し乾燥し
た。ついでポリビニルアルコール層を水でほぼ一様に湿
潤させ、その上に微多孔性層として公称孔径１．２μｍ
、空隙率７０％、厚さ５０μ１１のセルロースアセテー
トメンブランフィルタを積層して接着させた。ついで微
多孔性層の上からブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）
　０．１％水溶液（ｐＨ７，０）を塗布し、８０℃で１
０分乾燥して検出用要素を調製した。

［試料の電気泳動］ サイズ１１０ｍｍ　Ｘ　６０ｍｍ　、厚さ１４０μｍの
長方形のセルロースアセテート微多孔性膜電気泳動支持
体く富士写真フィルム（株）［セパラックス［商品名コ
）をｐＨ８，６，濃度６０ｍＭのベロナール緩衝液に浸
漬して湿潤させ、アプリケータで人血清試料０．８μＬ
を１０ｍｍ幅（間隔５＋ｍｓ）で膜に塗布した。

血清試料を塗布した電気泳動支持体に常法に従イ＃Ｍｌ
ＯＩｎＩＩ＋当り０．８ｍＡ（Ｄ定電流を印加し、４０
分電気泳動じた。

［泳動パターンの可視化と評価］ 電気泳動を終えた電気泳動支持体に直ちに上記の検出用
要素の微多孔性層を気泡が入らないようにして静かに重
ねあわせ、室温（約２３℃）で１０分静置した。この間
に公卿された血清蛋白中のアルブミンとグロブリンの泳
動パターンは検出用！素のＢＣＧにより染色された。

染色された血清蛋白パターンを従来の染色液法での染色
結果と比較例したところ、パターンはシャープで９分画
パターンの乱れは発生せず、パターンの精度は良好であ
った。

この実験から９本発明の検出方法は電気泳動パターンの
検出が簡便な操作で精度よ〈実施できることが明らかに
なった。　　　　　′ 実施例２ ［検出用要素の調製］ 厚さ２００μＩの無色゛透明平滑表面のポリエチレンテ
レフタレートフィルムの表面に厚さ約５μｌのポリビニ
ルアルコール層を水溶液を用いて塗布し乾燥した。つい
てポリビニルアルコール層・を水でほぼ一様に湿潤させ
、その上に微多孔性層として公称孔径１．０μｍ、空隙
率７５％、厚さ３０μｍのポリスルホンメンブランフィ
ルタを積層して接着させた。

ついで微多孔性層の上から下記の成分被覆量になるよう
にして検出試薬組成物水溶液を塗布し、３７゜Ｃで１０
分乾°燥して検出用要素を調製した。

検出Ｉ薬組成物の被覆量（ｌｌ１１２当り）ニコチンア
ミド−アデニン−ジヌクレオチド５１０＋ａＭ フェナジンメトスルフェート　　　　　　９ｎ＋Ｍ３−
（４’、５’−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−
ジフェニルテトラゾリウム・プロミド　１３５ｎ＋Ｍ乳
酸リチウム　　　　　　　　　　　　１０．８ｍＭｐＨ
７，４の７０ａ＋Ｍ−Ｔｒｉｓ緩衝液５００ｍＬに上記
成分を溶解［試料の電気泳動］　　　　　゛ サイズ２２０＋＋ｕ＋＋Ｘ６０ｏ＋ａ＋、厚さ１４０μ
ｍの長方形のセルロースアセテート微多孔性膜電気泳動
支持体（富士写真フィルム（株）！！セパラ・シクス［
商品名］）を　。

ｐＨ８，６＋１１度６０！ｉのベロナール緩衝液に４責
して湿潤させ、アプリケ−１夕で人血清試料０．８μＬ
を１０ｍｎ＋幅（間隔２ｍｇ＋）で膜に塗布した。

血清試ｉ１−塗布した電気泳動支持体に常法に従　　゛
い幅１０＋＋ｕｗ当り０．８ｎ＋Ａ′のｉ電流を印加し
、４５分電気泳動じた。

［泳動パターンの可視化と評価］ 電気泳動を終えた電気泳動支持体に直ちに上記の検出用
要素の微多孔性層を気泡が入らないようにして静かに重
ねあわせ、暗室内で乾燥を防ぎながら３７℃で２０分静
置した。この間に分画された血清蛋白中の乳酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＬＤＩＩ）の泳動パターンは、検出用要素に
含まれるＬｏｌｌの基質である乳酸リチウムから一連の
酵素共役反応により生成したフォルマザン色素により発
色した。

発色したＬ口■パターンを従来法である試薬組成物水溶
液処理による発色法と比較例したところ。

パターンはシャープで色濃度は従来法より大きく。

分画パターンの乱れは発生せず、パターンの精度は良好
であった。

この実験から９本発明の検出方法は電気泳動パターンの
検出が簡便な操作で精度よ〈実施できることが明らかに
なった。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書く自
発） 昭和６３年１２月２１日 り

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］電気力により移動して相互に分離されてい
   る複数の被分析物質を含み、水性溶媒により湿潤してい
   るシート状物と、 前記被分析物質の少なくとも１種により検出可能な変化
   を生じ、かつ前記水性溶媒の存在下で移動可能な検出試
   薬組成物を自身の内部に含有する微多孔性層を有する検
   出用要素とを実質的に乾燥している状態で実質的に一様
   に接触させ、 ［２］前記シート状物に生じた前記検出可能な変化を検
   出する 工程を含んでなる電気的に分離された被分析物質の検出
   方法。
2. （２）前記検出可能な変化が呈色（発色又は染色）であ
   り、前記検出試薬組成物が呈色（発色又は染色）試薬組
   成物である特許請求の範囲第１項に記載の検出方法。
3. （３）前記検出要素が検出試薬組成物を自身の内部に含
   有する微多孔性層が水不透過性耐水性支持体の表面に接
   着積層されているものである特許請求の範囲第１項又は
   第２項に記載の検出方法。
4. （４）前記［１］と［２］の工程の間に前記シート状物
   から前記要素を取り去る工程が含まれる特許請求の範囲
   第１項ないし第３項のいずれかに記載の検出方法。
5. （５）前記［２］の工程が前記シート状物と前記要素と
   を接触させた状態で行われる特許請求の範囲第１項ない
   し第３項のいずれかに記載の検出方法。