JP7818959B2 - 超音波造影剤およびそれを使用する方法 - Google Patents

Description

本開示は、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージングおよび診断の分野に関し、特にｉｎ ｖｉｖｏで即時使用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する前に長期保存に耐えることができる超音波造影剤を対象とする。本開示はさらに、超音波造影剤を調製する方法、および臨床現場で超音波造影剤を使用する方法に関する。

ペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルをベースとする超音波造影剤は、当技術分野でよく知られている（例えば、Wheatley et al, J. Drug Del. Sci. Technol., 23(1), 57-72, 2013を参照されたい）。単一のマイクロバブルは、安定化用リン脂質分子の層のシェルまたは膜にカプセル封入された、約２～１０μｍのサイズであり得る気体コアからなる。圧縮性である気体のコアは、超音波に供されると膨張および収縮することができる。超音波に曝露されたときのマイクロバブルの膨張および収縮は、音波の後方散乱を生じ、それが画像診断目的に使用される。マイクロバブルの表面は、超音波適用時にマイクロバブルの破裂および／または空洞形成が起こったときに放出される標的薬物部分でさらに機能化することができ、そのような超音波造影剤はそれによって治療用途にも使用することができる（Upadhyay et al, RSC Adv., 6, 15016-15026, 2016）。

Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）は、ペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルをベースとする超音波造影剤の例である。より詳細には、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）は、水素添加卵黄ホスファチジルセリンの膜によって安定化されたペルフルオロブタンのマイクロバブルを封入した凍結乾燥スクロースからなる粉末として製剤化され、ペルフルオロブタンのヘッドスペース下で保存される。Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）は、ペルフルオロブタン（ＰＦＢ）を水素添加卵黄ホスファチジルセリン（ＨＥＰＳ）の水性分散体中で連続的に均質化することによって無菌的に製造される。最初のマイクロバブルの生成後、マイクロバブルの濃度および粒度分布は、制御された一連の分離工程によって調整される。再構成された製品中に１ｍｌ当たり８μｌのマイクロバブルをもたらすことを目標とした最終分散体は、スクロースの添加によって等張性にされる。２ｍｌの分散体が１０ｍｌのガラスバイアル中に充填され、凍結乾燥される。凍結乾燥後、施栓の前にバイアルのヘッドスペースにペルフルオロブタンがバックフィルされる。言い換えれば、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）はフリーズドライ製品であり、使用する前に水で再構成しなければならない。より詳細には、対象への投与の前に、製品は、供給されるベント付きフィルタ（５μｍ）スパイク（Ｃｏｄａｎ Ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔ（登録商標）Ｓｐｉｋｅ、Ｃｏｄａｎ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、ドイツ）によって２ｍｌの注射用滅菌水を添加することによって再構成され、その後１分間手で混合される。再構成後、製品は乳白色の均質な分散体として見える。分散体は不透明であるため、異質な粒子の目視検査は困難である。そのような粒子がないことを保証するために、投与前にフィルタスパイクを通して製品をシリンジに吸引する。再構成後に、撹拌せずにいると、微小球が浮遊によって分離し始め、液相の上部にクリーム状の層を形成する。再構成直後に使用するのでなければ、製品は、使用前に手で１０秒間混合することによって再び均質化するべきである（Sontum, Ultrasound Med. & Biol., 34(5), 824-833, 2008）。

超音波造影剤の有効要素は、化学物質ではなく物理的状態（マイクロバブル）であるために、２つのタイプの安定性、すなわち、物理的安定性および化学的安定性を考慮しなければならない。言い換えれば、構成成分の化学組成だけでなく、マイクロバブルの濃度および粒度分布をどのように制御および維持するかに焦点を合わせなければならない。マイクロバブルは一般に、熱力学的に不安定な系であり、調製中および保存中に物理的変化を起こすことがある（例えば、国際公開第２０１５１５０３５４（Ａ１）号パンフレット；Segers et al, Langmuir, 33, 10329-10339, 2017; Borden et al, Advances in Colloid and Interface Science 262, 39-49, 2018を参照されたい）。加えて、マイクロバブルを安定化するリン脂質の膜は、溶液中で加水分解を起こし、最終製品中に不純物を生じることがある。リン脂質は、酸性およびアルカリ性媒体中で容易に加水開裂を起こす。リン脂質が十分安定なのは、ｐＨ７のときだけである。何故なら、この条件下ではエステル結合の加水分解はたいして進行しないからである（Phospholipids Handbook, 1993, edited by Gregor Cevc; Chapter 9 “Chemical stability”, Evstigneeva, pp. 323-324を参照されたい）。温度およびｐＨは、加水分解の反応速度に大きく影響する（Phospholipids Handbook, 1993, edited by Gregor Cevc; Chapter 9 “Chemical stability”, Crommelin et al, pp. 338-339を参照されたい）。さらに、一旦加水分解が低ｐＨで開始されると、ｐＨが低下し、分解が加速することになることが知られている。したがって、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）の初期開発中の主要な課題は、どのようにして許容可能な貯蔵寿命を有する製品を得るかであった。フリーズドライ粉末の形態のＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）製剤をもたらす凍結乾燥は、そのような製品を得る唯一の方法と今までみなされてきた。

凍結乾燥は、優れた貯蔵寿命安定性および品質を有する製品をもたらすことができるが、それは時間および資源集約的でもあるので、製造コストを相当に増加させ、最終使用者（典型的には医療従事者）の「使いやすさ」を低減させる。よって、当技術分野には、高い保存安定性と使いやすさを兼ね備えた、ペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルをベースとする改善された超音波造影剤に対する必要性が存在する。

高い保存安定性と使いやすさを兼ね備えた超音波造影剤を提供するという上の目的は、本開示によって達成される。本開示は、驚くべきことに使用前に長期保存に耐えることができ、かつ即時使用可能な、すなわち対象に即時注射可能な、分散体の形態の安定で即時使用可能な超音波造影剤製剤に関する。

より詳細には、本開示は、
（ａ）リン脂質の膜によって安定化された、ペルフルオロカーボンのマイクロバブル；および
（ｂ）緩衝剤；
を含み、約７．５以上、好ましくは約８．５以上のバルクｐＨを有する、
超音波造影剤を対象とする。

本開示はまた、
（ｉ）リン脂質の滅菌水性分散体中でペルフルオロカーボンを連続的に均質化して、水性分散体中に分散したペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルを生成するステップ；
（ｉｉ）水性分散体中のマイクロバブルの粒度分布を、１～６μｍ、好ましくは２～５μｍの範囲内のメジアン径に調整するステップ；
（ｉｉｉ）任意選択により、等張化剤を水性分散体に添加するステップ；
（ｉｖ）緩衝剤を水性分散体に添加して、水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上、好ましくは約８．５以上のｐＨに調整するステップ；
（ｖ）水性分散体中のマイクロバブルの濃度を調整して、約６～１０μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するステップ；
（ｖｉ）水性分散体をバイアルに分注し、バイアルのヘッドスペースをペルフルオロカーボンでフラッシュするステップ；
を含む、超音波造影剤を調製する方法を対象とする。

さらに、本開示は、対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法、対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法、および対象を診断する方法を対象とし、これらの方法は、上記の通りの超音波造影剤を対象に注射することを含む。

本開示はまた、本明細書に記載する通りの方法に使用するための超音波造影剤に関する。

さらに、本開示は、本明細書に開示する通りの方法に使用するための医薬品を製造するための、本明細書に開示する通りの超音波造影剤の使用に関する。

本開示の好ましい態様は、以降に、詳細な説明および従属請求項において記載する。

凍結乾燥前に採取し、非緩衝水性分散体として調製し、５℃で８か月間保存したＳｏｎａｚｏｉｄバルク製品の化学的安定性を示す図である。 ５℃で６か月間保存されたＳｏｎａｚｏｉｄのフリーズドライ粉末であって、非緩衝水性分散体として調製されたもの、緩衝剤を含み、室温でバルクｐＨ７を有する緩衝水性分散体として調製されたもの、および緩衝剤を含み、室温でバルクｐＨ８を有する緩衝水性分散体として調製されたものの化学的安定性をそれぞれ示す図である。 ５℃で６か月間保存されたＳｏｎａｚｏｉｄのフリーズドライ粉末であって、非緩衝水性分散体として調製されたもの、緩衝剤を含み、室温でバルクｐＨ７を有する緩衝水性分散体として調製されたもの、および緩衝剤を含み、室温でバルクｐＨ８を有する緩衝水性分散体として調製されたものの物理的安定性をそれぞれ示す図である。

本開示は、保存安定性で即時使用可能な液体超音波造影剤を提供する。ｐＨを上げ、製品中に緩衝剤を含むことによって、ここで特許請求する製品を使用する前に粉末の再構成が不要となったために、従来より公知のＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）のフリーズドライ粉末と比較して最終使用者にとって扱いやすい液体製剤が達成された。ここで、ペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルをベースとする超音波造影剤に緩衝剤を添加すると、電解質（例えば、緩衝剤中に存在するもの）が分散体の構成を変化させる可能性があるため、機能的な超音波造影剤になるのかどうか当業者にはわからないことを指摘しておきたい。それにもかかわらず、本発明の発明者らは、驚くべきことに、マイクロバブルの体積濃度および分布を所望のレベルに保つことに何とか成功した。すなわち、従来より公知の再構成したＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）のフリーズドライ粉末の分散体の物理的安定性および化学的安定性とそれぞれ比較して、製品の化学的安定性を改善しながら物理的安定性を維持することに何とか成功した。したがって、ここで特許請求する製品の保存安定性は、従来より公知の製品と比較して改善されている。

製剤中に緩衝剤を含むことによって、本開示による超音波造影剤は、５℃の温度でアルカリ性の範囲にあるバルクｐＨを有する。以降の実施例でさらに示すように、アルカリ性のｐＨは、超音波造影剤に存在するリン脂質の加水分解の速度を有意に減少させ、これによってはるかに長い期間化学的に安定な状態にする。リン脂質の膜はマイクロバブルを安定化するために、リン脂質の化学的安定性は、さらにマイクロバブルの物理的安定性に影響を与える。

より詳細には、本開示は、
（ａ）マイクロバブルがリン脂質の膜によって安定化された、ペルフルオロカーボンのマイクロバブル；および
（ｂ）緩衝剤；
を含み、約７．５以上、好ましくは約８．５以上のバルクｐＨを有する、
超音波造影剤を提供することによって、ペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルをベースとする既存の超音波造影剤に伴う問題を解決するまたは少なくとも軽減する。

「造影剤」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ医用イメージングの分野におけるその従来の意味を有し、哺乳動物への投与に適した形態の作用剤であって、哺乳動物対象のイメージング単体で得られるより鮮明な関心領域または器官における画像を提供することを支援する作用剤を指す。「対象」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでのインタクトな哺乳動物の身体、より好ましくは生きているヒト対象を意味する。「哺乳動物への投与に適した形態」という語句は、滅菌され、発熱性物質不含で、有毒または有害作用を生じる化合物がなく、生体適合性ｐＨ（およそｐＨ４．０～１０．５）で製剤化された組成物を意味する。そのような組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで塞栓を引き起こす危険性があり得る微粒子を含まず、体液（例えば、血液）との接触時に沈殿が起こらないように製剤化される。そのような組成物はまた、生物学的に適合性がある賦形剤のみを含有し、好ましくは等張性である。

他のｉｎ ｖｉｖｏイメージング剤と同様に、造影剤は、イメージングしようとする哺乳動物対象に最小限の薬理効果を及ぼすように設計される。好ましくは、造影剤は、最小限に侵襲的な方式で、すなわち、専門家の医学的専門知識の下で実施されたときに哺乳動物対象に実質的な健康上の危険性を有することなく哺乳動物の身体に投与することができる。そのような最小限に侵襲的な投与は、好ましくは、局所または全身麻酔の必要がない、前記対象の末梢静脈内への静脈内投与である。

「マイクロバブル」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ超音波イメージングの分野でのその従来の意味を有し、０．１～１０μｍ、典型的には０．５～５μｍの間の内径を有する気体マイクロバブルを指す。そのようなマイクロバブルは、赤血球とサイズが類似しており、それによってマイクロバブルは、哺乳動物の全身の微小血管および毛細管で類似の特性を示すことができる（Sirsi et al, Bubble Sci. Eng. Technol, 1(1-2), 3-17, 2009）。本明細書では、「マイクロバブル」および「微小球」という用語は、相互に交換可能に使用される場合がある。

「ペルフルオロカーボン」という用語は、その従来の化学的意味を有し、式Ｃ_ｘＦ_ｙを有する（すなわち、炭素およびフッ素のみを含有する）有機フッ素化合物の群の総称である（IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed., 1997（２００６～はオンライン修正バージョン）を参照されたい）。接頭語ペルフルオロを有する化合物は、すべてのＣ－Ｈ結合がＣ－Ｆ結合に置き換えられた、ヘテロ原子を有するものを含めた炭化水素である。ペルフルオロカーボンには、ペルフルオロアルカン、フルオロアルケン、フルオロアルキン、およびペルフルオロ芳香族化合物が含まれる。「ペルフルオロカーボン」および「フルオロカーボン」という用語は、相互に交換可能に使用される場合がある。本開示による適切なペルフルオロカーボンには、ペルフルオロアルカン、例えば、ペルフルオロブタン、ペルフルオロプロパン、およびペルフルオロペンタンが含まれる。本開示の現在好ましいペルフルオロカーボンは、その標準的な化学的意味を有し、医学的用途の文脈ではペルフルブタンとも呼ばれる、ペルフルオロブタン（「ＰＦＢ」）である。ペルフルオロ－ｎ－ブタンの化学式はＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_３またはＣ_４Ｆ_１０であり、－２．２℃の沸点を有する。市販のペルフルオロ－ｎ－ブタンは、少量の（典型的には２～４％）のペルフルオロ－イソ－ブタン異性体、すなわちＣ_４ＨＦ_９を含有する。

本開示による適切なマイクロバブルには、例えばSontum（上記）およびSirsi et al（上記）に記載されるような、リン脂質の膜によって安定化されたペルフルオロカーボンのマイクロバブルが含まれる。本開示による適切なリン脂質の膜（またはシェルもしくはコーティング）は、実効負電荷を有する。現在好ましいリン脂質は、水素添加卵黄ホスファチジルセリン（ＨＥＰＳ）に存在するリン脂質、すなわち、主にホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸である（Hvattum et al, J. Pharm. Biomed. Anal., 42(4), 506-512, 2006）。リン脂質の膜は、典型的には１０～１００ｎｍの厚さを有する。

本明細書では、「緩衝剤」という用語は緩衝液を指し、緩衝液とは、弱酸およびその塩または弱塩基およびその塩のいずれかを含有し、ｐＨが変化しにくい溶液である。言い換えれば、緩衝液は、弱酸およびその共役塩基または弱塩基およびその共役酸のいずれかの水溶液である。緩衝剤は、少量の追加の酸または塩基を中和することができるため、溶液（または懸濁液もしくは分散体）における安定なｐＨを維持するのに使用される。緩衝剤は、生理学的に適合性があり、対象へのｉｎ ｖｉｖｏでの注射に適した、任意の緩衝剤から選択される。本開示による適切な緩衝剤の例は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（略称トリス）、リン酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、および炭酸ナトリウムである。

現在好ましい緩衝剤はトリスである。トリスのｐＨは温度依存性である。低温では、トリスのｐＨは高温のときより高い。例えば、トリス緩衝液が５℃で８．２６のｐＨを有するならば、トリス緩衝液のｐＨは、２５℃で７．７、３７℃で７．４になる。超音波造影剤の保存は、好ましくは、超音波造影剤の物理的および化学的安定性の維持に役立つ冷蔵空間、すなわち、およそ３～６℃の温度で行われる。本明細書の他の箇所で説明および示すように、アルカリ性のｐＨも超音波造影剤の化学的安定性および物理的安定性の維持に役立つ。それと共に、超音波造影剤は、対象にｉｎ ｖｉｖｏで注射されるときに、好ましくは、７．４である生理的ｐＨに近いｐＨを有するべきである。よって、トリスのｐＨが温度依存性であるという事実は、冷蔵保存では体温のｐＨより高いｐＨとなるので、本開示による超音波造影剤の利点として使用することができる。

「バルクｐＨ」という用語は、溶液の表面ではなく溶液の体積の中心またはその近くなど、溶液のバルクまたは体積の内部で測定されたときの溶液（または懸濁液もしくは分散体）のｐＨを指す。バルクｐＨは、溶液の表面のｐＨと異なる可能性がある。本開示による超音波造影剤は、５℃の温度でアルカリ性の範囲内のバルクｐＨを有する。すなわち、５℃の温度で約７．５以上、適切には５℃の温度で１０．０以下、例えば、５℃の温度で約７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０、９．２５、９．５、９．７５、または１０．０のバルクｐＨを有する。現在好ましいバルクｐＨは、５℃の温度で約８．２５～９．２５、例えば、５℃の温度で８．２５、８．５、８．７５、９．０、または９．２５である。この文脈において、本文を通して、「約」という用語は、本明細書に言及するすべてのｐＨ値が、概して約０．１～０．５、すなわち、±０．１～０．５、例えば、±０．１、±０．２、±０．３、±０．４、または±０．５変動し得ることを意味することを意図している。

本発明の超音波造影剤は、好ましくは、低温で、特に、より長い保存期間にわたって保存される。約１か月までの保存期間には、室温までの温度が適切であり得る。保存温度は、超音波造影剤の凝固点より低くないことが好ましく、溶液として前記凝固点より上であることがより好ましい。本発明の超音波造影剤の保存のための代表的な温度範囲は、その凝固点より上で、かつ５℃付近までであろう。使用するときには、本発明の超音波造影剤は、対象に投与する前に周囲温度にされる。

本開示による超音波造影剤は、長期保存用であり、すなわち長期保存に耐えることができる。言い換えれば、超音波造影剤は、その物理的安定性および化学的安定性を長期保存中に維持する、すなわち、許容可能な、またはそれどころか優れた貯蔵寿命を有する。この文脈において、本文を通して、「長期」は、数か月または数年の期間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４か月の期間を意味することを意図している。長期保存は、好ましくは、およそ３～６℃の温度、例えば、３、４、５、または６℃で行う。

本開示による超音波造影剤は、購入したときのバイアルから直接即時使用可能であるので、現在市販されているフリーズドライ製剤とは異なる。ここで、「即時使用可能」とは、臨床現場で即時使用可能である、例えば、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療のために患者に注射するのに即時使用可能であることを意味する。

本開示による超音波造影剤は、液体形態、すなわち液体製剤であり、特に、本明細書の他の箇所で定義する通りの分散体、例えば水性分散体の形態である。液体製剤は長期保存用であり、臨床現場で即時使用可能である。

本開示による超音波造影剤に含まれる緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）、リン酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、および炭酸ナトリウムからなる群から選択されてもよい。

さらに、緩衝剤は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍＭの濃度を有してもよい。この文脈において、本文を通して、「約」という用語は、本明細書に言及するすべての濃度値が、概して約０．１～０．５ｍＭ、すなわち、±０．１～０．５、例えば、±０．１、±０．２、±０．３、±０．４、または±０．５ｍＭ変動し得ることを意味することを意図している。

本開示による超音波造影剤に含まれるリン脂質の膜は、好ましくは実効負電荷を有する。

本開示による現在好ましい超音波造影剤は、Sontum（上記）によって記載される通りのＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＳ）（以前はＮＣＩ ００１００として公知である）のような、水素添加卵黄ホスファチジルセリンによって安定化されたペルフルオロブタンのマイクロバブルを含み、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（すなわち、トリス）を緩衝剤としてさらに含む。

本開示による超音波造影剤は、等張化剤、すなわち、超音波造影剤を等張性にするために添加される賦形剤をさらに含んでもよい。等張化剤の例は、血漿中陽イオンの生体適合性対イオンとの塩、スクロース、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、およびマンニトールである。

本開示による超音波造影剤は、代替的にまたは追加的に、粘性剤、すなわち、超音波造影剤の粘性を変えるために添加される賦形剤、および／または浮遊低減剤（floatation-reducing agent）、例えば、プロピレングリコール、グリセロール、グリセリン、および／またはポリエチレングリコールを含んでもよい。

本開示はまた、
（ｉ）リン脂質の滅菌水性分散体中でペルフルオロカーボンを連続的に均質化して、水性分散体中に分散したペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルを生成するステップ；
（ｉｉ）水性分散体中のマイクロバブルの粒度分布を、１～６μｍ、好ましくは２～５μｍの範囲内のメジアン径に調整するステップ；
（ｉｉｉ）任意選択により、等張化剤を水性分散体に添加するステップ；
（ｉｖ）緩衝剤を水性分散体に添加して、水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上、好ましくは約８．５以上のｐＨに調整するステップ；
（ｖ）水性分散体中のマイクロバブルの濃度を調整して、約６～１０μｌ／ｍｌ、例えば、約６、７、８、９、または１０μｌ／ｍｌ、現在好ましくは約８μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するステップ；
（ｖｉ）水性分散体をバイアル中に分注し、バイアルのヘッドスペースをペルフルオロカーボンでフラッシュするステップ
を含む、超音波造影剤を調製する方法を対象とする。

言い換えれば、本開示は、
（ｉ）ペルフルオロカーボンをリン脂質の滅菌水性分散体中で連続的に均質化して、水性分散体中に分散したペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルを生成するステップ；
（ｉｉ）水性分散体中のマイクロバブルの粒度分布を、１～６μｍ、好ましくは２～５μｍの範囲内のメジアン径に調整するステップ；
（ｉｉｉ）任意選択により、等張化剤を水性分散体に添加するステップ；
（ｉｖ）緩衝剤を水性分散体に添加して、水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上、好ましくは約８．５以上のｐＨに調整するステップ；
（ｖ）水性分散体中のマイクロバブルの濃度を調整して、約６～１０μｌ／ｍｌ、例えば、約６、７、８、９、または１０μｌ／ｍｌ、現在好ましくは約８μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するステップ；
（ｖｉ）水性分散体をバイアル中に分注し、バイアルのヘッドスペースをペルフルオロカーボンでフラッシュするステップ；
を含み、
超音波造影剤の長期保存および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの注射前に分散体の凍結乾燥が行われないまたは必要とされないことを条件とする、
超音波造影剤を調製する方法を対象とする。

「水性分散体」における場合の「分散体」という用語は、一方の物質が他方の物質中に分散した組成物を意味することを意図している。どのように分散体が分類されるかは様々であり得るが、分類のための２つの主なアプローチは、（１）分散体の内相および外相の性質（例えば、固体、液体、または気体）、ならびに（２）その分散粒子のサイズの範囲（コロイド粒子対粗粒子）である。

「懸濁液」という用語は、従来より公知であるＳｏｎａｚｏｉｄ製剤について記載するために使用されてきた（例えば、国際公開第２０１５１５０３５４（Ａ１）号パンフレットを参照されたい）。しかし、「懸濁液」という用語は、医薬として使用するときは、今では一般に外相中に分散した固体粒子に主に使用されるので、本明細書では「分散体」という用語を、外相中に分散した気体を含む新たに開示する液体製剤に好ましく使用する。とは言え、「分散体」および「懸濁液」という用語は、本明細書で相互に交換可能に使用される場合がある。

「水性分散体」という用語は、水および／または水混和性溶媒を含む水性溶媒中のマイクロバブルの分散体を指す。水性溶媒は、好ましくは生体適合性担体である。「生体適合性担体」という用語は、組成物が生理学的に忍容性のあるような、すなわち、毒性または過度の不快感なく哺乳動物の身体に投与することができる流体、とりわけ液体を意味する。生体適合性担体は、適切には、発熱性物質不含の注射用滅菌水などの注射可能な担体液体；生理食塩水などの水溶液（有利には平衡させて、注射用の最終製品が等張性であるようにしてもよい）である。生体適合性担体に、当技術分野で周知であるような１種または複数の賦形剤、例えば：生体適合性緩衝剤を含む緩衝水溶液（例えば、リン酸緩衝液）；１種または複数の等張化物質（例えば、血漿中陽イオンの生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコースまたはスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトールまたはマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）、または他の非イオン性ポリオール材料（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液を添加してもよい。好ましくは、生体適合性担体は、発熱性物質不含の注射用水または等張性生理食塩水である。よって、水性分散体は、適切には水不混和性有機溶媒を除外する。

「水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上のｐＨに調整する」という語句は、好ましくは特定の温度、例えば５℃で測定したときに、水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上のｐＨに調整することを意味することを意図している。

本明細書では、「目標濃度」は、長期保存後の濃度、および／または対象におけるｉｎ ｖｉｖｏでの注射時の濃度として定義される。超音波造影剤の調製時に、マイクロバブルの濃度は初期に減少し、若干低い温度で安定化することがある。目標濃度は、既知の粒度分布の安定化マイクロバブルの適正な希釈に基づいて得られる。

マイクロバブルの目標濃度は、約６～１０μｌ／ｍｌ、好ましくは約８μｌ／ｍｌである。この文脈において、本文を通して、「約」という用語は、本明細書に言及するすべての濃度値が、概して約０．１～０．５μｌ／ｍｌ、すなわち、±０．１～０．５μｌ／ｍｌ、例えば、±０．１、±０．２、±０．３、±０．４、または±０．５μｌ／ｍｌ変動し得ることを意味することを意図している。

上記のステップ（ｖｉ）によって水性分散体をバイアル中に分注するときに、バイアルには通常、頂部まで充填しないで部分的にのみ充填し、それによって分散体の上にヘッドスペースを残し、それをヘッドスペースガスでフラッシュする（すなわち、充填する）ことができる。「ヘッドスペース」という用語は、その従来の意味を有し、バイアル中での水性分散体の上の気体を指す。水性分散体を保存することができる適切なタイプのバイアルまたは容器には、表面コーティング（例えば、イオン性浸出可能物を防ぐため）を有するバイアルなどの、注射用バイアル（例えば、プラスチックまたはガラスの、不透明または透明なもの）が含まれる。企図されるのはまた、超音波造影剤が予め充填された既製のシリンジであり、それによって、対象に注射する前に超音波造影剤をバイアルから吸引する必要がなくなることとなる。

超音波造影剤を調製する上記の方法において、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は任意の順序で行われてもよい。

超音波造影剤を調製する上記の方法において、ステップ（ｖ）がステップ（ｉ）の後およびステップ（ｖｉ）の前に行われることを条件として、ステップ（ｖ）は、ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のいずれか１つの前または後に行われてもよい。

上記の方法によって調製された超音波造影剤は、長期保存用であり、および／または臨床現場で即時使用可能であり、すなわち、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療などにｉｎ ｖｉｖｏで即時使用可能である。

本開示はさらに、対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、ならびに前記組織の超音波スキャンを実施することを含む方法を対象とする。

本開示はまた、対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、ならびに前記組織の画像を生成することを含む方法を対象とする。

さらに、本開示は、対象のｉｎ ｖｉｖｏ診断などの、対象を診断する方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、ならびに診断を下すために前記画像を評価することを含む方法を対象とする。

本開示はまた、対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、ならびに前記組織の超音波スキャンを実施することを含む方法に使用するための、超音波造影剤を対象とする。

さらに、本開示は、対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、ならびに前記組織の画像を生成することを含む方法に使用するための、超音波造影剤を対象とする。

本開示はまた、対象をｉｎ ｖｉｖｏ診断する方法であって、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、ならびに診断を下すために前記画像を評価することを含む方法に使用するための、超音波造影剤に関する。

本開示はさらに、対象における組織の超音波画像の造影を改善する（上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、ならびに前記組織の超音波スキャンを実施することを含む）ための医薬品を製造するための、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤の使用を対象とする。

また、本開示は、対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする（上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、ならびに前記組織の画像を生成することを含む）ための医薬品を製造するための、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤の使用に関する。

さらに、本開示は、対象をｉｎ ｖｉｖｏ診断する（上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、ならびに診断を下すために前記画像を評価することを含む）ための医薬品を製造するための、上記の態様および実施形態のいずれか１つによる超音波造影剤の使用を対象とする。

１つまたは複数の列挙された要素を「含む」組成物は、具体的に列挙されていない他の要素も含み得る。「含む」という用語は、「～から本質的になる」をサブセットとして含み、これは、組成物が、他の特徴物または構成成分の存在を伴わずに列挙された構成成分を含むことを意味する。

単数形「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、複数形も含むと解釈されるものとする。

従来より公知である注射用Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）粉末に見出される主な不純物は、ＨＥＰＳ－Ｎａ賦形剤の２つの構成成分である、ホスファチジルセリンナトリウム塩（ＰＳ）およびホスファチジン酸ナトリウム塩（ＰＡ）の加水分解から生じる、リン脂質の分解生成物である。賦形剤ＨＥＰＳ－Ｎａの加水分解は主に、水和リン脂質懸濁液のオートクレービング中に起きる。主要分解生成物は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リゾホスファチジルセリンナトリウム塩（リゾＰＳ）およびリゾホスファチジン酸ナトリウム塩（リゾＰＡ）である。ＰＡは、ＨＥＰＳ－Ｎａの構成成分として存在するが、ＰＳの分解生成物でもあり得る。ジアシルグリセロール（ジアシルＧ）は、別のリン脂質関連分解生成物である。以下の実施例において、製品の化学的安定性の尺度として使用される主なパラメータは、各測定時に存在するホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジン酸（ＰＡ）の百分率としての、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）である。リゾＰＳおよびリゾＰＡの存在も測定したが、対応するデータは、実施例の１つに関連して示すに過ぎない。以下の実施例で製品の物理的安定性の尺度として使用される主なパラメータは、マイクロバブルの体積濃度およびメジアン径である。

[実施例１]
市販のＳｏｎａｚｏｉｄ製造の凍結乾燥前の充填ラインからの残余を使用して試料を生成した。バルク製品を２０ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｆｌｅｘｂｏｙバッグに一時的に保存し、次いでＬＡＦベンチ内で４つの異なる滅菌バイアルタイプに充填し、その後ヘッドスペースをペルフルオロブタン（ＰＦＢ）でフラッシュした。２つの異なるＳｏｎａｚｏｉｄバッチを試験した（バッチ１、バッチ２）。

マイクロバブルの物理的安定性は、液体製剤によって最も影響を受けやすいパラメータであるため、保存時間に対するマイクロバブルの含有量およびマイクロバブルのサイズを評価した。一次応答は、クールター計数によるアッセイ分析からのパラメータ；数および体積濃度、ならびに数および体積加重平均径／分布であった。加えて、マイクロバブルの形態（形状、構造、凝集、異物など）を顕微鏡分析／画像分析によって評価し、脂質含有量および純度の化学分析を６か月（バッチ１）または８か月（バッチ２）の保存のサンプリングポイントでそれぞれ行った。すべての試料は５℃で保存した。

安定性の結果
マイクロバブルの物理的安定性は、驚くべきことに、Ｓｏｎａｚｏｉｄ水性分散体の製造から６か月後（バッチ１、バッチ２）であっても安定していた。しかし、図１に示すように、リン脂質の加水分解は、６か月後（バッチ１）および８か月後（バッチ２）に有意であった。図１は、凍結乾燥前に採取し、非緩衝水性分散体として調製し、５℃で６～８か月保存したＳｏｎａｚｏｉｄのバルク製品の試料における、加水分解に起因するリン脂質の分解度を示している（ｘ軸には月数）。加水分解度は、３つの分解生成物、すなわち、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リゾホスファチジルセリン（リゾＰＳ）、およびリゾホスファチジン酸（リゾＰＡ）の存在によって示され、各分析時に存在するホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジン酸（ＰＡ）の合計の百分率としてそれぞれ示される（ｙ軸には（ＰＳ＋ＰＡ）であるＦＦＡの百分率）。

さらに、６か月の保存後に（バッチ１、バッチ２）、ｐＨは、およそ６～７からおよそ４．９～６．４に減少し、すなわちすべての試料で減少したが、これはホスファチジルセリンの有意な加水分解に鑑みて予想された。

この研究から導き出された結論は、即時使用可能な製剤の許容可能な貯蔵寿命を得るには加水分解を有意に遅くしなければならないこと、および加水分解の臨界レベルは、おそらく加水分解不純物がマイクロバブルの特性に及ぼす記録された作用に基づいているに違いないことである。

上の実施例１から、即時使用可能なＳｏｎａｚｏｉｄは、有意な化学分解のために、既存の製剤（すなわち、水中で保存する場合）では得ることができないことが示唆された。既存のＳｏｎａｚｏｉｄ製剤は緩衝液を含有しておらず、ｐＨは典型的には約６～７である。上の実施例１による有意な加水分解の後、ｐＨは４．９～６．４に減少する。

リポソーム分散体に関連する文献データから、リン脂質の加水分解はｐＨに影響を受けることが示唆される（Grit et al, Biochim. Biophys. Acta, 1167, 49-55, 1993）。しかし、リン脂質安定化マイクロバブルはいくつかの点でリポソームとは異なるために、リポソームと共に使用される緩衝液がマイクロバブルに適合性があるとは限らず、リポソームで得られた安定性データをリン脂質安定化マイクロバブルに転用できるとも限らない。マイクロバブルは、単一の安定化単一層を含有し、外相と内相の間に気体分子以外に水の輸送はない。物理的には、マイクロバブルは、内部相と外部相の間で大きく異なるために浮く傾向がある一方で、小さな単層リポソームは、目に見える沈降を有することなく、保存中に物理的に均質であり得る。したがって、マイクロバブルは、保存中の合体を防ぐために追加的な表面安定化または電荷を必要とし得る。イオンの追加は表面電荷を遮蔽することとなり、分散体の物理的安定性を低減させることが予想されるはずである。

それにもかかわらず、本発明の発明者らは、貯蔵寿命安定性の第２の研究を行うことを決意し、その研究では、ｐＨを上げて中性または塩基性にすることによって、および初期加水分解によるｐＨの減少を防止する緩衝液を添加することによって、分解が有意に遅延するかどうかを試験した。その研究計画および前記研究の安定性の結果を、以下の実施例２に開示する。

[実施例２]
ｐＨを制御し、安定化するために、５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝液を使用して、２つの異なる試験分散体を得た；それぞれ、５℃で７．５（本明細書の他の箇所に記載したように、トリスのｐＨは温度依存性なので、室温で約ｐＨ７に相当する）のバルクｐＨを有するＳｏｎａｚｏｉｄの緩衝水性分散体であるもの、および５℃で８．５（室温で約ｐＨ８に相当する）のバルクｐＨを有するＳｏｎａｚｏｉｄの緩衝水性分散体であるものである。さらに、非緩衝水性分散体中のＳｏｎａｚｏｉｄを参照として使用した。

試料の調製にフリーズドライのＳｏｎａｚｏｉｄを使用した。ストック緩衝液を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ緩衝液キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのｐＨ７．０および８．０（室温で）を有する１Ｍトリス溶液から作製した。このトリス緩衝液をＢ．Ｂｒａｕｎ製の１００ｍｌのＷａｔｅｒ Ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＷＦＩ）Ｅｃｏｆｌａｃボトル中で希釈した。

５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７（室温で）のＳｏｎａｚｏｉｄバイアルの作製：
・滅菌フィルタを有するシリンジを使用して、１ＭトリスｐＨ７．０緩衝液キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、ＡＭ９８５０Ｇ Ａｍｂｉｏｎ）から０．５ｍｌを吸引し、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳＡ．によって製造されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｃｏｆｌａｃ ＷＦＩ １００ｍｌに注入する。ボトルを振って、均質な緩衝液を得る。２０個のＳｏｎａｚｏｉｄバイアルを再構成し、滅菌フィルタでバイアルを空気抜きする。

５ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８（室温で）のＳｏｎａｚｏｉｄバイアルの作製：
・滅菌フィルタを有するシリンジを使用して、１ＭトリスｐＨ８．０緩衝液キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、ＡＭ９８５０Ｇ Ａｍｂｉｏｎ）から０．５ｍｌを吸引し、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳＡ．によって製造されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｃｏｆｌａｃ ＷＦＩ １００ｍｌに注入する。ボトルを振って、均質な緩衝液を得る。２０個のＳｏｎａｚｏｉｄバイアルを再構成し、滅菌フィルタでバイアルを空気抜きする。

比較用に、１５個のバイアルのＳｏｎａｚｏｉｄをＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳＡ．によって製造されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｃｏｆｌａｃ ＷＦＩ １００ｍｌからの注射用水で再構成した。すべてのバイアルを再構成後に５℃で保存した。

安定性の結果
選択した応答は、マイクロバブルのサイズおよび濃度（クールター計数による）、ならびに純度（薄層クロマトグラフィー、ＴＬＣによる）ならびにｐＨであった。

図２は、非緩衝注射用水、ｐＨ７（室温で）の緩衝剤、またはｐＨ８（室温で）の緩衝剤でそれぞれ再構成され、５℃で６か月間保存されたフリーズドライのＳｏｎａｚｏｉｄ粉末の試料における、加水分解に起因するリン脂質の分解度を示す（ｘ軸には月数）。加水分解度は、分解生成物である遊離脂肪酸（ＦＦＡ）によって示され、各分析時に存在するホスファチジルセリン（ＰＳ）とホスファチジン酸（ＰＡ）の合計の百分率としてそれぞれ示される（ｙ軸には（ＰＳ＋ＰＡ）であるＦＦＡの百分率）。

図３は、５℃で保存中のマイクロバブルの体積濃度を６か月まで示す（ｘ軸には月数；ｙ軸には体積濃度（単位μｌ／ｍｌ））。この図は、各データ点につき１０個の試料の平均結果を示す。データ点間の変動は、通常の分析変動であり、６か月の保存後の体積濃度の変化に関して傾向は見られなかった。よって、体積濃度は６か月の保存中に安定であった。

マイクロバブルのメジアン径も６か月の保存中に安定であることが見出された（データは示さず）。

２つの試験分散体の、時間ゼロ、３か月後、および６か月後のｐＨ値をそれぞれ以下の表１に示す。

[実施例４]
本開示による超音波造影剤は、以下のように調製する。ペルフルオロブタンをＨＥＰＳナトリウムの滅菌水性分散体中で均質化することによってマイクロバブルを形成して、水中に分散したＰＦＢのＨＥＰＳ安定化マイクロバブルを生成する。浮選を繰り返して小さい方のマイクロバブルを除去することによってマイクロバブルの粒度分布を調整し、１～６μｍの間のメジアン径を得る。分散体を水で希釈する。任意選択により、スクロースなどの等張化剤で張度を調整する。

分散体のｐＨは、５ｍＭの濃度にトリスを添加することによって、約７．５以上などの、望ましいアルカリ性のｐＨに調整する。

目標濃度は、既知の粒度分布の安定化マイクロバブルの適正な希釈に基づいて得られる。これは、例えば、次のように行ってもよい。マイクロバブルの濃度は、例えば、マイクロバブルの濃度を８～２０μｌ／ｍｌの間に調整することによって、保存後に約６～１０μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するように調整される。

分散体を２～１０ｍｌのバイアル中に充填し、施栓およびキャッピングの前にヘッドスペースをＰＦＢでフラッシュする。

バイアルを冷蔵して保存する。

考察
ＦＦＡの百分率は、試料間の加水分解の相違のマーカーとして使用した。実施例２のトリス緩衝液を含有する試料におけるＦＦＡの百分率は、実施例１および２の非緩衝水溶液におけるＦＦＡの百分率と比較して、６か月の保存後に有意に低かった。実施例２の研究で測定されたすべての他の純度パラメータは、６か月後に安定していた（データは示さず）。データから、保存中に緩衝液を用いてｐＨを上げ、安定化すると、加水分解の低減に有意な効果があることが示される。５℃でｐＨ８．５であれば、反応速度に応じて１～２年の貯蔵寿命は可能であり得る（図２に示す結果に基づくと、加水分解の速度が線形ならば、３０か月以上）。

実施例１から、水中で６か月間５℃で保存されたリン脂質安定化ペルフルオロカーボンマイクロバブルがリン脂質の有意な加水分解を起こし、それによってマイクロバブルの物理的安定性も影響を受け、６か月後に体積濃度が減少することが示された。それと比較して、マイクロバブルを６か月間５℃で保存したが、緩衝液を含有する水性分散体中で７．５または８．５より上のｐＨで保存した実施例２から、加水分解が有意に少なく、物理的安定性が何も影響を受けないことが示された。イオンの添加は、個々のマイクロバブル間の反発作用を低減することが知られているが、少量の緩衝液を添加しても、目に見える凝集をもたらさなかった。また、体積濃度およびメジアン径などの物理的なマイクロバブルパラメータは、６か月後に影響を受けなかった。

この結果から、緩衝剤を添加して分散体の形態の超音波造影剤のｐＨを上げることは、負に帯電したリン脂質の分解速度を有意に減少させる実現可能な方法であることが示される。同時に、この結果から、マイクロバブルの外観または体積濃度は、緩衝剤の添加によって影響を受けないことが示される。よって、分散体の物理的安定性と化学的安定性の両方が、生理学的に許容されるレベルで保存中に維持されることが示された。したがって、本開示は、即時使用可能（対象にｉｎ ｖｉｖｏで即時注射可能であることを意味する）であると共に、そのような使用の前に長期保存に耐える、超音波造影剤を提供する。

本開示は、上記のその例示的な実施形態に制限されないこと、および添付の特許請求の範囲内で考えられる本開示のいくつかの変更が可能であることを理解されたい。

本発明は、以下の態様を含む。
＜１＞
（ａ）リン脂質の膜によって安定化された、ペルフルオロカーボンのマイクロバブル；および
（ｂ）緩衝剤；
を含み、約７．５以上、好ましくは約８．５以上のバルクｐＨを有する、
超音波造影剤。
＜２＞
長期保存用である、＜１＞に記載の超音波造影剤。
＜３＞
臨床現場で、例えば、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療に即時使用可能である、＜１＞または＜２＞に記載の超音波造影剤。
＜４＞
前記緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）、リン酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン、および炭酸ナトリウムからなる群から選択される、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜５＞
前記緩衝剤が、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度を有する、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜６＞
前記リン脂質の膜が、実効負電荷を有する、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜７＞
等張化剤をさらに含む、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜８＞
粘性剤、および／または浮遊低減剤をさらに含む、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜９＞
前記ペルフルオロカーボンが、ペルフルオロブタン、ペルフルオロプロパン、およびペルフルオロペンタンから選択される、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜１０＞
前記ペルフルオロカーボンがペルフルオロブタンであり、前記リン脂質が水素添加卵黄ホスファチジルセリンである、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の超音波造影剤。
＜１１＞
（ｉ）ペルフルオロカーボンをリン脂質の滅菌水性分散体中で連続的に均質化して、水性分散体中に分散したペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルを生成するステップ；
（ｉｉ）前記水性分散体中のマイクロバブルの粒度分布を、１～６μｍ、好ましくは２～５μｍの範囲内のメジアン径に調整するステップ；
（ｉｉｉ）任意選択により、等張化剤を前記水性分散体に添加するステップ；
（ｉｖ）緩衝剤を前記水性分散体に添加して、前記水性分散体のバルクｐＨを約７．５以上、好ましくは約８．５以上のｐＨに調整するステップ；
（ｖ）前記水性分散体中のマイクロバブルの濃度を調整して、約６～１０μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するステップ；
（ｖｉ）前記水性分散体をバイアルに分注し、前記バイアルのヘッドスペースをペルフルオロカーボンでフラッシュするステップ
を含む、超音波造影剤を調製する方法。
＜１２＞
ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が任意の順序で行われる、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
ステップ（ｖ）がステップ（ｉ）の後およびステップ（ｖｉ）の前に行われることを条件として、ステップ（ｖ）が、ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のいずれか１つの前または後に行われる、＜１１＞または＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞
前記超音波造影剤が、長期保存用であり、および／または、
臨床現場で、例えば、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療に即時使用可能である、
＜１１＞～＜１３＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞
凍結乾燥のステップを含まない、＜１１＞～＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞
＜１１＞～＜１５＞のいずれかに記載の方法によって調製された、超音波造影剤。
＜１７＞
対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法であって、＜１＞～＜１０＞または＜１６＞のいずれかに記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、および前記組織の超音波スキャンを実施することを含む方法。
＜１８＞
対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法であって、＜１＞～＜１０＞または＜１６＞のいずれかに記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、および前記組織の画像を生成することを含む方法。
＜１９＞
対象を診断する方法であって、＜１＞～＜１０＞または＜１６＞のいずれかに記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、および診断を下すために前記画像を評価することを含む方法。
＜２０＞
＜１７＞～＜１９＞のいずれかに記載の方法に使用するための、超音波造影剤。
＜２１＞
＜１７＞～＜１９＞のいずれかに記載の方法に使用するための医薬品を製造するための、＜１＞～＜１０＞または＜１６＞のいずれかに記載の超音波造影剤の使用。

Claims (20)

1. （ａ）リン脂質の膜によって安定化された、ペルフルオロカーボンのマイクロバブルであって、前記ペルフルオロカーボンがペルフルオロブタンであり、前記リン脂質が水素添加卵黄ホスファチジルセリンである、ペルフルオロカーボンのマイクロバブル；および
   （ｂ）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）である、緩衝剤；
   を含み、５℃の温度で測定した場合に約７．５から約８．５のバルクｐＨを有する、超音波造影剤。
2. 長期保存用である、請求項１に記載の超音波造影剤。
3. 臨床現場で即時使用可能である、請求項１または２に記載の超音波造影剤。
4. 臨床現場が、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療のためのものである、請求項３に記載の超音波造影剤。
5. 前記緩衝剤が、約１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の超音波造影剤。
6. 前記リン脂質の膜が、実効負電荷を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の超音波造影剤。
7. 等張化剤をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の超音波造影剤。
8. 粘性剤、および／または浮遊低減剤をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の超音波造影剤。
9. （ｉ）ペルフルオロカーボンをリン脂質の滅菌水性分散体中で連続的に均質化して、水性分散体中に分散したペルフルオロカーボンのリン脂質安定化マイクロバブルを生成するステップ；
   （ｉｉ）前記水性分散体中のマイクロバブルの粒度分布を、１～６μｍ、好ましくは２～５μｍの範囲内のメジアン径に調整するステップ；
   （ｉｉｉ）任意選択により、等張化剤を前記水性分散体に添加するステップ；
   （ｉｖ）緩衝剤を前記水性分散体に添加して、前記水性分散体のバルクｐＨを、５℃の温度で測定した場合に約７．５から約８．５のｐＨに調整するステップ；
   （ｖ）前記水性分散体中のマイクロバブルの濃度を調整して、約６～１０μｌ／ｍｌのマイクロバブルの目標濃度を達成するステップ；
   （ｖｉ）前記水性分散体をバイアルに分注し、前記バイアルのヘッドスペースをペルフルオロカーボンでフラッシュするステップ
   を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を調製する方法。
10. ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）が任意の順序で行われる、請求項９に記載の方法。
11. ステップ（ｖ）がステップ（ｉ）の後およびステップ（ｖｉ）の前に行われることを条件として、ステップ（ｖ）が、ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のいずれか１つの前または後に行われる、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記超音波造影剤が、長期保存用であり、および／または、
    臨床現場で即時使用可能である、
    請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 臨床現場が、対象のｉｎ ｖｉｖｏイメージング、診断、および／または治療のためのものである、請求項１２に記載の方法。
14. 凍結乾燥のステップを含まない、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法に用いるための医薬組成物であって、前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、および前記組織の超音波スキャンを実施することを含み、
    前記医薬組成物が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、医薬組成物。
16. 対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法に用いるための医薬組成物であって、前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、および前記組織の画像を生成することを含み、
    前記医薬組成物が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、医薬組成物。
17. 対象を診断する方法に用いるための医薬組成物であって、前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、および診断を下すために前記画像を評価することを含み、
    前記医薬組成物が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、医薬組成物。
18. 対象における組織の超音波画像の造影を改善する方法に使用するための医薬品を製造するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤の使用であって、
    前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、および前記組織の超音波スキャンを実施することを含み、
    前記医薬品が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、使用。
19. 対象における組織をｉｎ ｖｉｖｏイメージングする方法に使用するための医薬品を製造するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤の使用であって、
    前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記組織の超音波スキャンを実施すること、および前記組織の画像を生成することを含み、
    前記医薬品が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、使用。
20. 対象を診断する方法に使用するための医薬品を製造するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤の使用であって、
    前記方法が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を前記対象に注射すること、前記対象における関心領域の超音波スキャンを実施すること、前記関心領域の画像を生成すること、および診断を下すために前記画像を評価することを含み、
    前記医薬品が、請求項１～８のいずれか１項に記載の超音波造影剤を含む、使用。