CN113423437B - 超声造影剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种超声造影剂，其包含：全氟化碳微泡，所述微泡由磷脂膜稳定；和缓冲剂；其中所述超声造影剂的本体pH为约7.5或更高，优选约8.5或更高。所述超声造影剂用于长期储存并即时可用于体内。还公开了一种制备这样的超声造影剂的方法和超声造影剂在临床环境中的使用方法。

Description

超声造影剂及其使用方法
技术领域
本公开涉及受试者的体内成像和诊断领域，特别是涉及一种即时可用于体内的、并且在体内使用前可经受住长期储存的超声造影剂。本公开还涉及一种制备超声造影剂的方法和超声造影剂在临床环境中的使用方法。
背景技术
基于磷脂稳定的全氟化碳微泡的超声造影剂是本领域熟知的(参见例如Wheatley等人, J. Drug Del. Sci. Technol., 23(1), 57-72, 2013)。单个微泡由包封在一层稳定化磷脂分子的壳或膜中的、尺寸可为约2-10µm的气核组成。气态核是可压缩的，在经受超声波时可膨胀和收缩。微泡在暴露于超声时的膨胀和收缩会产生声学反向散射，这被用于诊断成像目的。微泡表面可进一步用靶向药物部分官能化，当在施加超声而使微泡破裂和/或发生空化时将释放该靶向药物部分，因此这样的超声造影剂也可用于治疗应用(Upadhyay 等人, RSC Adv., 6, 15016-15026, 2016)。
Sonazoid™是基于磷脂稳定的全氟化碳微泡的超声造影剂的一个实例。更特别地，Sonazoid™被配制为由冻干蔗糖截留全氟丁烷的微泡组成的粉末，所述微泡由储存在全氟丁烷的顶部空间下的氢化卵磷脂酰丝氨酸的膜稳定。Sonazoid™是通过将全氟丁烷(PFB)在氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)的水性分散体中连续均质化来无菌地生产的。在初始的微泡生成后，通过一系列受控的分离步骤来调节微泡的浓度和尺寸分布。最终的分散体(目标是使重构产品中每ml产生8µl微泡)通过添加蔗糖得以等张。将2ml该分散体填充到10ml玻璃小瓶中并冻干。冻干后，用全氟丁烷回填小瓶顶部空间，然后塞上塞子。换句话说，Sonazoid™是一种冻干产品，使用前必须用水重构。更特别地，在施用于受试者之前，该产品通过通过供给的排气过滤(5µm)穿刺器(Codan Chemoprotect® Spike, Codan GmbH &Co., 德国)加入2ml注射用无菌水、随后手动混合1分钟来重构。重构后，产品看起来为乳白色的均匀分散体。由于该分散体不透明，故难以目视检查外来颗粒。为确保不存在这样的颗粒，在施用前将产品通过过滤穿刺器抽取到注射器中。重构后，如果不搅拌，则微球将开始通过漂浮而分离并在液相的顶部形成乳油层。如果在重构后不立即使用，则应在使用前通过手动混合10秒来将产品重新均质化(Sontum, Ultrasound Med. & Biol., 34(5), 824–833, 2008)。
由于超声造影剂的有效要素为物理状态(微泡)而不是化学物质，故必须考虑两种类型的稳定性：物理和化学稳定性。换句话说，重点必须在如何控制和保持微泡浓度和尺寸分布以及组分的化学组成上。微泡通常是热力学不稳定的系统，在制备和储存期间可能发生物理变化(参见例如WO2015150354 A1；Segers 等人, Langmuir, 33, 10329-10339,2017；Borden 等人, Advances in Colloid and Interface Science 262, 39-49,2018)。另外，使微泡稳定的磷脂膜可能在溶液中发生水解降解，从而在最终产品中产生杂质。磷脂在酸性和碱性介质中容易发生水解裂解。只有在pH 7下磷脂才足够稳定，因为在这些条件下酯键水解不会进行到任何显著的程度(Phospholipids Handbook, 1993, GregorCevc编辑；参见第9章“Chemical stability”, Evstigneeva, 第323-324页)。温度和pH会强烈影响水解动力学(Phospholipids Handbook, 1993，Gregor Cevc编辑；参见第9章“Chemical stability”, Crommelin 等人, 第338-339页)。此外，已知一旦在低pH下开始水解降解，pH就会下降并导致降解加速。因此，Sonazoid™的早期开发过程中的一个主要挑战在于如何获得具有可接受的货架寿命的产品。产生呈冻干粉末形式的Sonazoid™制剂的冷冻干燥法迄今为止被认为是获得这样的产品的唯一途径。
尽管冷冻干燥法提供了具有优异的货架寿命稳定性和品质的产品，但由于其是时间和资源密集的，故也显著增加了制造成本，并且降低了最终用户(通常为医疗保健专业人员)的“易用性”。因此，本领域需要基于磷脂稳定的全氟化碳微泡的改进的超声造影剂，所述超声造影剂既具有高的储存稳定性又易于使用。
发明内容
提供既具有高的储存稳定性又易于使用的超声造影剂的上述目的通过本公开实现，本公开涉及一种呈分散体形式的稳定且即时可用(ready to use)的超声造影剂制剂，其可令人惊奇地在使用前经受住长期储存并且是即时可用的，即，准备好注射到受试者中。
更特别地，本公开涉及一种超声造影剂，其包含：
(a) 全氟化碳微泡，所述微泡由磷脂膜稳定；和
(b) 缓冲剂；
其中所述超声造影剂的本体pH为约7.5或更高，优选约8.5或更高。
本公开还涉及一种制备超声造影剂的方法，其包括以下步骤：
(i) 在磷脂的无菌水性分散体中连续地均质化全氟化碳，以生成分散在水性分散体中的磷脂稳定的全氟化碳微泡；
(ii) 将水性分散体中微泡的尺寸分布调节到中值尺寸在1至6µm、优选2至5µm的范围内；
(iii) 任选地，向水性分散体中加入张度剂；
(iv) 向水性分散体中加入缓冲剂，以将水性分散体的本体pH调节到约7.5或更高、优选约8.5或更高的pH；
(v) 调节水性分散体中微泡的浓度以达到约6-10µl/ml的目标微泡浓度；
(vi) 将水性分散体分配到小瓶中并用全氟化碳冲洗小瓶的顶部空间。
此外，本公开涉及一种用于改善受试者中组织的超声图像的对比度的方法、一种用于受试者中组织的体内成像的方法和一种用于受试者的诊断的方法，所述方法包括向受试者中注射如上所述的超声造影剂。
本公开还涉及用于如本文所述的方法中的超声造影剂。
此外，本公开涉及如本文所公开的超声造影剂用于制造用于如本文所公开的方法中的药剂的用途。
本公开的优选方面在以下详细描述和从属权利要求中描述。
附图说明
图1示意了在冻干前取得的、制备为非缓冲水性分散体并在5℃下储存8个月的Sonazoid散装产品的化学稳定性。
图2示意了分别制备为非缓冲水性分散体、制备为包含缓冲剂且在室温下本体pH为7的缓冲水性分散体、及制备为包含缓冲剂且在室温下本体pH为8的缓冲水性分散体，并在5℃下储存6个月的Sonazoid的冻干粉末的化学稳定性。
图3示意了分别制备为非缓冲水性分散体、制备为包含缓冲剂且在室温下本体pH为7的缓冲水性分散体、及制备为包含缓冲剂且在室温下本体pH为8的缓冲水性分散体，并在5℃下储存6个月的Sonazoid的冻干粉末的物理稳定性。
具体实施方式
本公开提供了一种储存稳定且即时可用的液体超声造影剂。通过提高pH并在产品中包含缓冲剂，实现了一种液体制剂，其与先前已知的Sonazoid™冻干粉末相比，最终用户将更容易操作，因为在使用当前要求保护的产品之前不需要粉末的重构。在此，我们希望指出，对于本领域技术人员来说，向基于磷脂稳定的全氟化碳微泡的超声造影剂中添加缓冲剂会产生功能性的超声造影剂并不是显而易见的，因为电解质(例如，存在于缓冲剂中)可能改变分散体的构成。然而，本申请的发明人已令人惊奇地设法将微泡的体积浓度和分布保持在期望的水平，即分别与先前已知的Sonazoid™重构冻干粉末的分散体的物理稳定性和化学稳定性相比，已设法在改善产品的化学稳定性的同时保持物理稳定性。因此，与先前已知的产品相比，当前要求保护的产品的储存稳定性得到改善。
通过在制剂中包含缓冲剂，根据本公开的超声造影剂在5℃的温度下具有在碱性范围内的本体pH。如下文在实施例中进一步示出的，碱性pH会显著降低存在于超声造影剂中的磷脂的水解速率，其从而会在长得多的时间内保持化学稳定。由于磷脂膜使微泡稳定，故磷脂的化学稳定性还会影响微泡的物理稳定性。
更特别地，本公开通过提供一种超声造影剂解决了或至少减轻了与基于磷脂稳定的全氟化碳微泡的现有超声造影剂相关的问题，本公开的超声造影剂包含：
(a) 全氟化碳微泡，所述微泡由磷脂膜稳定；和
(b) 缓冲剂；
其中所述超声造影剂的本体pH为约7.5或更高，优选约8.5或更高。
术语“造影剂”具有在体内医学成像领域中其常规的含义，并且是指呈适合于哺乳动物施用的形式的试剂，其有助于在目标区域或器官中提供比通过单独对哺乳动物受试者成像可获得的图像更清晰的图像。术语“受试者”是指哺乳动物体内，优选完整的哺乳动物体体内，更优选活的人类受试者。短语“呈适合于哺乳动物施用的形式”是指无菌、无热原、缺乏产生毒性或副作用的化合物并且在生物相容的pH (大约pH 4.0至10.5)下配制的组合物。这样的组合物缺乏可能有在体内引起栓塞的风险的微粒，并配制为在与生物流体(例如，血液)接触时不发生沉淀。这样的组合物还仅含有生物相容的赋形剂，并优选是等张的。
与其他体内成像剂一样，造影剂被设计为对待成像的哺乳动物受试者具有极小的药理作用。优选地，造影剂可以微创方式施用于哺乳动物体，即当由专业医学专家进行时对哺乳动物受试者没有实质性的健康风险。这样的微创施用优选静脉内施用到所述受试者的外周静脉中，而不需要局部或全身麻醉。
术语“微泡”具有在体内超声成像领域中其常规的含义，是指内径为0.1-10μm、通常在0.5至5μm之间的气体微泡。这样的微泡尺寸与红细胞相似，这使得它们在整个哺乳动物体的微血管和毛细血管中显示出相似的特征(Sirsi 等人,Bubble Sci. Eng. Technol,1(1-2), 3-17, 2009)。在本文中，术语“微泡”和“微球”可互换使用。
术语“全氟化碳”具有其常规的化学含义，为一组具有式CxFy的有机氟化合物的通用术语，即它们仅含有碳和氟(参见IUPAC, Compendium of Chemical Terminology (化学术语汇编), 第2版, 1997; 在线修订版本, 2006-)。带有前缀全氟-的化合物为烃，包括具有杂原子的那些，其中所有的C-H键都被替换为C-F键。全氟化碳包括全氟烷烃、氟代烯烃、氟代炔烃和全氟芳族化合物。术语“全氟化碳”和“碳氟化合物”可互换使用。根据本公开的合适的全氟化碳包括全氟烷烃，例如全氟丁烷、全氟丙烷和全氟戊烷。当前优选的本公开的全氟化碳为全氟丁烷(perfluorobutane，“PFB”)，其具有其标准的化学含义，并在医学用途的背景下也被称为十氟丁烷(perflubutane)。全氟正丁烷的化学式为CF3CF2CF2CF3或C4F10，沸点为-2.2℃。市售全氟正丁烷含有少量(通常2-4%)的全氟异丁烷异构体，即C4HF9。
根据本公开的合适的微泡包括由磷脂膜稳定的全氟化碳微泡，如例如在Sontum(上文)和Sirsi等人(上文)中所述。根据本公开的合适的磷脂膜(或壳或涂层)具有净负电荷。当前优选的磷脂为存在于氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)中的磷脂，即主要为磷脂酰丝氨酸和磷脂酸(Hvattum 等人, J. Pharm. Biomed. Anal., 42(4), 506-512, 2006)。磷脂膜的厚度通常为10至100nm。
在本文中，术语“缓冲剂”是指缓冲液，其为含有弱酸及其盐或弱碱及其盐的溶液，并且其对pH的变化具有抵抗力。换句话说，缓冲液为弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的水溶液。缓冲剂用于在溶液(或悬浮体或分散体)中保持稳定的pH，因为它们可中和少量的额外的酸或碱。缓冲剂选自任何生理上相容并且适合于体内注射到受试者中的缓冲剂。根据本公开的合适的缓冲剂的实例有三(羟甲基)氨基甲烷(缩写为Tris)、磷酸钠、氯化铵、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和碳酸钠。
当前优选的缓冲剂为Tris。Tris的pH是温度依赖性的。在低温下，Tris的pH高于在较高的温度下的pH。例如，如果Tris缓冲液在5℃下的pH为8.26，则该Tris缓冲液在25℃下的pH为7.7而在37℃下的pH为7.4。超声造影剂的储存优选在冷藏空间中进行，即在大约3-6℃的温度下，这有助于保持超声造影剂的物理和化学稳定性。如本文别处所解释和所示，碱性pH也有助于保持超声造影剂的化学稳定性和物理稳定性。同时，当体内注射到受试者中时，超声造影剂应优选具有接近于生理pH 7.4的pH。Tris的pH依赖于温度的事实可因此用作根据本公开的超声造影剂的优点，因为冷藏储存的pH将高于体温下的pH。
术语“本体pH”是指在溶液(或悬浮体或分散体)的本体或体积内测量的溶液的pH，如在溶液的体积的中心处或附近，而不是在溶液的表面处。本体pH可能与溶液的表面pH不同。根据本公开的超声造影剂在5℃的温度下具有在碱性范围内的本体pH，即在5℃的温度下具有约7.5或更高的本体pH，合适地在5℃的温度下至多10.0，如在5℃的温度下约7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75或10.0。当前优选的本体pH为在5℃的温度下约8.25-9.25，如在5℃的温度下8.25、8.5、8.75、9.0或9.25。在此背景下，贯穿全文，术语“约”旨在表示本文提及的所有pH值通常可变化约0.1-0.5，即±0.1-0.5，如±0.1、±0.2、±0.3、±0.4或±0.5。
本发明的超声造影剂优选在低温下储存，特别是对于较长的储存期。对于长达约1个月的储存期，最高达室温的温度可能是合适的。优选储存温度不低于超声造影剂的凝固点，更优选高于所述凝固点，作为溶液。用于储存本发明的超声造影剂的示例性温度范围将高于其凝固点且最高约5℃。在使用时，将在施用于受试者之前让本发明的超声造影剂达到环境温度。
根据本公开的超声造影剂用于长期储存，即可承受长期储存。换言之，所述超声造影剂在长期储存期间保持其物理稳定性和化学稳定性，即具有可接受的或甚至优异的货架寿命。在此背景下，贯穿全文，“长期”旨在指数月或数年的时间段，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月的时间段。长期储存优选在大约3-6℃的温度下进行，如在3、4、5或6℃下进行。
根据本公开的超声造影剂不同于目前可商购获得的冻干制剂，因为它直接从购买状态的小瓶即时可用，其中“即时可用”指的是即时可用于临床环境中，如即时可用于注射到患者中，用于受试者的体内成像、诊断和/或治疗。
根据本公开的超声造影剂呈液体形式，即为液体制剂，特别是呈分散体的形式，如水性分散体，如本文别处所定义。所述液体制剂用于长期储存并即时可用于临床环境中。
根据本公开的超声造影剂中包含的缓冲剂可选自三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、磷酸钠、氯化铵、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和碳酸钠。
此外，缓冲剂的浓度可为约1mM至约10mM，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。在此背景下，贯穿全文，术语“约”旨在表示本文提及的所有浓度值通常可变化约0.1-0.5mM，即±0.1-0.5，如±0.1、±0.2、±0.3、±0.4或±0.5mM。
根据本公开的超声造影剂中包含的磷脂膜优选具有净负电荷。
当前优选的根据本公开的超声造影剂包含由氢化卵磷脂酰丝氨酸稳定的全氟丁烷微泡，如Sonazoid™ (GE Healthcare AS)，先前称为NCI 00100，如由Sontum (上文)所述，并还包含三(羟甲基)氨基甲烷(即，Tris)作为缓冲剂。
根据本公开的超声造影剂还可包含张度剂，即加入以使超声造影剂等张的赋形剂。张度剂的实例为血浆阳离子与生物相容性抗衡离子的盐、蔗糖、生理盐水、右旋糖、甘油和甘露醇。
替代地或补充地，根据本公开的超声造影剂可包含：粘度剂，即添加以改变超声造影剂的粘度的赋形剂，和/或漂浮减少剂(flotation-reducing agent)，例如丙二醇、丙三醇、甘油和/或聚乙二醇。
本公开还涉及一种制备超声造影剂的方法，其包括以下步骤：
(i) 在磷脂的无菌水性分散体中连续地均质化全氟化碳，以生成分散在水性分散体中的磷脂稳定的全氟化碳微泡；
(ii) 将水性分散体中微泡的尺寸分布调节到中值尺寸在1至6µm、优选2至5µm的范围内；
(iii) 任选地向水性分散体中加入张度剂；
(iv) 向水性分散体中加入缓冲剂，以将水性分散体的本体pH调节到约7.5或更高、优选约8.5或更高的pH；
(v) 调节水性分散体中微泡的浓度以达到约6-10µl/ml的目标微泡浓度，如约6、7、8、9或10µl/ml，当前优选约8µl/ml；
(vi) 将水性分散体分配到小瓶中并用全氟化碳冲洗小瓶的顶部空间。
换句话说，本公开涉及一种制备超声造影剂的方法，其包括以下步骤：
(i) 在磷脂的无菌水性分散体中连续地均质化全氟化碳，以生成分散在水性分散体中的磷脂稳定的全氟化碳微泡；
(ii) 将水性分散体中微泡的尺寸分布调节到中值尺寸在1至6µm、优选2至5µm的范围内；
(iii) 任选地向水性分散体中加入张度剂；
(iv) 向水性分散体中加入缓冲剂以将水性分散体的本体pH调节到约7.5或更高、优选约8.5或更高的pH；
(v) 调节水性分散体中微泡的浓度以达到约6-10µl/ml的目标微泡浓度，如约6、7、8、9或10µl/ml，当前优选约8µl/ml；
(vi) 将水性分散体分配到小瓶中并用全氟化碳冲洗小瓶的顶部空间；
前提条件是在超声造影剂的长期储存和/或体内注射之前不进行或不需要分散体的冷冻干燥。
术语“分散体”，如在“水性分散体”中，旨在指其中一种物质分散在另一种物质内的组合物。分散体的分类方式可不同，两种主要的分类途径是(1)分散体的内相和外相的性质(例如，固体、液体或气体)和(2)其分散颗粒的尺寸范围(胶体颗粒相比粗颗粒)。
术语“悬浮体”已用于描述先前已知的Sonazoid制剂(参见例如WO2015150354A1)。然而，由于术语“悬浮体”在药学上使用时现在通常主要用于分散在外相中的固体颗粒，故本文中的术语“分散体”优选用于新公开的包含分散在外相中的气体的液体制剂。然而，术语“分散体”和“悬浮体”在本文中可互换使用。
术语“水性分散体”是指微泡在水性溶剂中的分散体，水性溶剂包含水和/或可与水混溶的溶剂。水性溶剂优选为生物相容性载体。术语“生物相容性载体”指的是流体，尤其是液体，使得组合物在生理上可耐受，即可施用于哺乳动物体而没有毒性或过度不适。生物相容性载体合适地为可注射的载液，如无菌、无热原的注射用水；水溶液如生理盐水(其可被有利地平衡，使得注射用的最终产品是等张的)。可如本领域技术人员所熟知的那样向生物相容性载体中添加一种或多种赋形剂，如：包含生物相容性缓冲剂的水性缓冲液溶液(例如，磷酸盐缓冲液)；一种或多种张力调节物质(例如，血浆阳离子与生物相容性抗衡离子的盐)、糖(例如，葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如，山梨醇或甘露醇)、甘醇(例如，甘油)或其他非离子多元醇材料(例如，聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选地，生物相容性载体为无热原的注射用水或等张生理盐水。因此，水性分散体适当地排除了不可与水混溶的有机溶剂。
短语“将水性分散体的本体pH调节到约7.5或更高的pH”旨在指将水性分散体的本体pH调节到约7.5或更高的pH，如优选在特定的温度例如5℃下所测量。
在本文中，“目标浓度”定义为长期储存后的浓度和/或体内注射到受试者中时的浓度。在制备超声造影剂后，微泡的浓度最初可能降低并稳定在略低的浓度下。目标浓度基于对已知尺寸分布的经稳定微泡的适当稀释获得。
微泡的目标浓度为约6-10μl/ml，优选约8μl/ml。在此背景下，贯穿全文，术语“约”旨在表示本文提及的浓度值通常可变化约0.1-0.5µl/ml，即±0.1-0.5µl/ml，如±0.1、±0.2、±0.3、±0.4或±0.5µl/ml。
当根据上述步骤(vi)将水性分散体分配到小瓶中时，小瓶通常不填充到顶部而是仅部分填充，从而在分散体上方留下可用顶部空间气体冲洗(即，填充)的顶部空间。术语“顶部空间”具有其常规含义，并且是指小瓶内水性分散体上方的气体。其中可储存水性分散体的合适类型的小瓶或容器包括注射小瓶(例如，不透明或透明的塑料或玻璃)，如具有表面涂层(例如，以防止离子浸出物)的小瓶。还考虑了预填充有超声造影剂的预制注射器，这将避免在将超声造影剂注射到受试者中之前从小瓶抽取超声造影剂的需要。
在制备超声造影剂的上述方法中，步骤(iii)和(iv)可以任意顺序进行。
在制备超声造影剂的上述方法中，步骤(v)可在步骤(ii)、(iii)和(iv)中的任一之前或之后进行，前提条件是步骤(v)在步骤(i)之后并在步骤(vi)之前进行。
根据上述方法制备的超声造影剂用于长期储存和/或即时可用于临床环境中，即，即时可用于体内，如用于受试者的体内成像、诊断和/或治疗中。
本公开还涉及一种改善受试者中组织的超声图像的对比度的方法，其包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂和进行所述组织的超声扫描。
本公开还涉及一种用于受试者中组织的体内成像的方法，其包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述组织的超声扫描和生成所述组织的图像。
此外，本公开涉及一种用于受试者的诊断、如受试者的体内诊断的方法，其包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述受试者中目标区域的超声扫描、生成所述目标区域的图像和评估所述图像以作出诊断。
本公开还涉及用于改善受试者中组织的超声图像的对比度的方法中的超声造影剂，所述方法包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂和进行所述组织的超声扫描。
此外，本公开涉及用于受试者中组织的体内成像的方法中的超声造影剂，所述方法包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述组织的超声扫描和生成所述组织的图像。
本公开还涉及用于受试者的体内诊断的方法中的超声造影剂，所述方法包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述受试者中目标区域的超声扫描、生成所述目标区域的图像和评估所述图像以作出诊断。
本公开还涉及根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于改善受试者中组织的超声图像的对比度(包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂和进行所述组织的超声扫描)。
另外，本公开还涉及根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于受试者中组织的体内成像(包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述组织的超声扫描和生成所述组织的图像)。
此外，本公开涉及根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于受试者的体内诊断(包括向所述受试者中注射根据任一上述方面和实施方案的超声造影剂、进行所述受试者中目标区域的超声扫描、生成所述目标区域的图像和评估所述图像以作出诊断)。
“包含”一种或多种所记载要素的组合物还可包含其他未明确记载的要素。术语“包含”包括“基本上由……组成”作为子集，后者意味着组合物具有所列出的组分而不存在其他的特征或组分。
单数“一个”和“一种”应理解为也包括复数。
在先前已知的注射用Sonazoid™粉末中存在的主要杂质为磷脂的降解产物，其由HEPS-Na赋形剂的两种组分磷脂酰丝氨酸钠盐(PS)和磷脂酸钠盐(PA)的水解产生。赋形剂HEPS-Na的水解降解主要发生在水合磷脂悬浮体的高压灭菌过程中。主要降解产物为游离脂肪酸(FFA)、溶血-磷脂酰丝氨酸钠盐(溶血-PS)和溶血磷脂酸钠盐(溶血-PA)。PA作为HEPS-Na中的组分存在，但也可能是PS的降解产物。二酰基甘油(二酰基-G)是另一种与磷脂有关的降解产物。在以下实施例中，用作产品的化学稳定性的度量的主要参数为每次测量时存在的游离脂肪酸(FFA)，作为占磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)的百分数。还测量了溶血-PS和溶血-PA的存在，但仅关于实施例中的一个示出了相应的数据。在以下实施例中用作产品的物理稳定性的度量的主要参数为微泡的体积浓度和中值尺寸。
实施例1
使用来自商业Sonazoid生产的冷冻干燥前填充生产线的剩余物来生成样品。将散装产品暂时储存在20L的Sartorius Stedim Flexboy袋中，然后在LAF工作台中填充到四种不同的无菌小瓶类型中，随后用全氟丁烷(PFB)冲洗顶部空间。测试了两个不同的Sonazoid批次(批次1、批次2)。
由于微泡的物理稳定性是最可能受液体制剂影响的参数，故评价了微泡含量和微泡尺寸与储存时间的关系。主要响应为来自通过库尔特计数的测定分析的参数；数量和体积浓度及数量和体积加权平均直径/分布。另外，通过显微镜/图像分析评价微泡形态(形状、结构、团聚、异物等)，并分别在储存6个月(批次1)或8个月(批次2)的采样时间进行脂质含量和纯度的化学分析。所有样品均在5℃下储存。
稳定性结果
即使在Sonazoid水性分散体的制造后6个月(批次1、批次2)，微泡的物理稳定性也令人惊奇地稳定。然而，如图1中所示，磷脂的水解在6个月(批次1)和8个月(批次2)后显著。图1示出了在冻干前取得的Sonazoid散装产品的样品中水解所导致的磷脂降解的程度，该样品制备为非缓冲水性分散体并在5℃下储存6-8个月(x-轴上为月数)。水解的程度由三种降解产物的存在来说明：分别在每次分析时存在的游离脂肪酸(FFA)、溶血磷脂酰丝氨酸(溶血-PS)和溶血磷脂酸(溶血-PA)，作为占磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)的总和的百分数(y轴上为(PS+PA)的%FFA)。
此外，在储存6个月后(批次1、批次2)，pH已从大约6-7降到大约4.9-6.4，即所有样品中均降低，鉴于磷脂酰丝氨酸的显著水解，这是预料之中的。
从这项研究得出的结论是，水解必须显著减慢才能获得即时可用制剂可接受的货架寿命，并且水解的临界水平很可能必须基于文献记录的水解杂质对微泡性质的影响。
上述实施例1表明，由于显著的化学降解，用现有的制剂(即当储存在水中时)无法获得即时可用的Sonazoid。现有的Sonazoid制剂不含缓冲液，pH通常为约6至7。在根据上述实施例1显著水解后，pH降到4.9至6.4。
与脂质体分散体相关的文献数据表明，磷脂水解受pH影响(Grit 等人, Biochim.Biophys. Acta, 1167, 49-55, 1993)。然而，与脂质体一起使用的缓冲液不一定与微泡相容，并且用脂质体获得的稳定性数据不一定可迁移到磷脂稳定的微泡，因为磷脂稳定的微泡在几个方面不同于脂质体。它们含有单个稳定化单层，并且在外相与内相之间除了气体分子之外没有水的传输。在物理上，由于内相与外相之间大的差异，故微泡倾向于漂浮，而小的单层脂质体在储存过程中可能是物理上均质的，没有明显的沉降。因此，微泡可能需要额外的表面稳定化或电荷以避免在储存过程中聚结。添加的离子会屏蔽表面电荷，从而预计会降低分散体的物理稳定性。
然而，本申请的发明人决定进行货架寿命稳定性的第二项研究，其中测试通过将pH增至中性或碱性、和通过添加防止pH因初始水解而降低的缓冲液是否会显著减慢降解。所述研究的研究设计和稳定性结果在以下实施例2中公开。
实施例2
为了控制和稳定pH，使用5mM的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液来分别获得两种不同的试验分散体；一种在5℃下具有7.5的本体pH (对应于室温下约7的pH，因为Tris的pH是温度依赖性的，如本文别处所述)的Sonazoid缓冲水性分散体，和一种在5℃下具有8.5的本体pH (对应于室温下约8的pH)的Sonazoid缓冲水性分散体。此外，使用在非缓冲水性分散体中的Sonazoid作为参考。
使用冻干的Sonazoid来制备样品。由来自Invitrogen缓冲液试剂盒(TermoFisher Scientific)的pH 7.0和8.0 (在室温下)的1M Tris溶液制备储备缓冲溶液。将此Tris缓冲液在来自B. Braun的100ml注射用水(WFI) Ecoflac瓶中稀释。
构建5mM Tris缓冲液 7 pH (在室温下) Sonazoid小瓶：
• 使用带无菌过滤器的注射器从Thermo Fisher Scientific AM9850G Ambion的1M Tris pH 7.0缓冲液试剂盒Invitrogen中抽取0.5ml，并将其注射到B. Braun MedicalSA生产的GE Healthcare Ecoflac WFI 100ml中。摇动瓶子以得到均匀的缓冲溶液。重构20个Sonazoid小瓶，用无菌过滤器将小瓶排气。
构建5mM Tris缓冲液 8 pH (在室温下) Sonazoid小瓶：
• 使用带无菌过滤器的注射器从Thermo Fisher Scientific AM9850G Ambion的1M Tris pH 8.0缓冲液试剂盒Invitrogen中抽取0.5ml，并将其注射到B. Braun MedicalSA生产的GE Healthcare Ecoflac WFI 100ml中。摇动瓶子以得到均匀的缓冲溶液。重构20个Sonazoid小瓶，用无菌过滤器将小瓶排气。
为了比较，用来自B. Braun Medical SA生产的GE Healthcare Ecoflac WFI100ml的注射用水重构15个Sonazoid小瓶。重构后将所有小瓶储存在5℃下。
稳定性结果
选择的响应为微泡尺寸和浓度(通过库尔特计数)及纯度(通过薄层色谱法，TLC)和pH。
图2示出了在分别用非缓冲注射用水、pH 7 (在室温下)的缓冲剂或pH 8 (在室温下)的缓冲剂重构并在5℃下储存6个月(x轴上为月数)的冻干Sonazoid粉末的样品中水解所导致的磷脂降解的程度。水解的程度由分别在每次分析时存在的降解产物游离脂肪酸(FFA)作为占磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酸(PA)的总和的百分数(y轴上为(PS+PA)的%FFA)来说明。
图3示出了在5℃下储存至6个月期间微泡的体积浓度(x轴上为月数；y轴上为体积浓度，单位µl/ml)。该图的每个数据点示出了10个样品的平均结果。数据点之间的变化是正常的分析变化，并且在储存6个月后没有可见的体积浓度变化趋势。因此，在6个月的储存期间，体积浓度是稳定的。
还发现微泡的中值尺寸在6个月的储存期间是稳定的(数据未示出)。
下表1中示出了分别在时间零时、3个月后和6个月后两种试验分散体的pH值。
表1：pH值
小瓶编号 零 3个月 6个月
pH 8开始 8.04 7.97 8.08
pH 7开始 7.28 7.26 7.38
实施例4
如下制备根据本公开的超声造影剂。通过如下来形成微泡：在HEPS钠的无菌水性分散体中均质化全氟丁烷，以生成分散在水中的HEPS稳定的PFB微泡。通过反复浮选以除去较小的微泡来调节微泡尺寸分布，并获得1至6µm之间的中值尺寸。用水稀释分散体。任选地，用张度剂如蔗糖调节张度。
通过添加Tris至5mM的浓度，将分散体的pH调节至期望的碱性pH，如约7.5或更高。
目标浓度基于对已知尺寸分布的经稳定微泡的适当稀释获得。这可例如如下进行。调节微泡的浓度，例如通过将微泡的浓度调节到8-20µl/ml之间，以在储存后达到约6-10μl/ml的目标微泡浓度。
将分散体填充到2-10ml小瓶中，并在加塞和加盖前用PFB冲洗顶部空间。
将小瓶冷藏储存。
讨论
使用%FFA作为样品之间水解差异的标志。与实施例1和2的非缓冲水溶液中的%FFA相比，储存6个月后实施例2中含Tris缓冲液的样品中的%FFA显著较低。在实施例2的研究中测量的所有其他纯度参数在6个月后均稳定(数据未示出)。数据表明，在储存期间提高pH并用缓冲液稳定pH对减少水解具有显著作用。在5℃下pH 8.5下，取决于动力学，1-2年的货架寿命是可能的(基于图2中示出的结果，如果水解速率是线性的，则货架寿命为30个月以上)。
实施例1表明，在5℃下于水中储存6个月的磷脂稳定的全氟化碳微泡发生磷脂的显著水解，这也影响微泡的物理稳定性，6个月后体积浓度下降。相比之下，其中微泡在5℃下但在高于7.5或8.5的pH下于含有缓冲液的水性分散体中储存6个月的实施例2显示出显著较少的水解，并且对物理稳定性没有影响。尽管已知添加离子会降低各个微泡之间的排斥力，但添加少量的缓冲液没有产生可见的聚集。此外，物理微泡参数如体积浓度和中值尺寸在6个月后未受影响。
结果表明，添加缓冲剂以提高呈分散体形式的超声造影剂的pH是显著降低带负电荷的磷脂的降解速率的可行方法。同时，结果表明微泡的视觉外观或体积浓度不受缓冲剂的添加的影响。因此，已证实分散体的物理稳定性和化学稳定性在储存期间均保持在生理学可接受的水平。因此，本公开提供了一种超声造影剂，其既是即时可用的(意味着准备好在受试者中体内注射)，又能在这样的使用前经受住长期储存。
应理解，本公开不限于其上述示例性实施方案，并且在附随的权利要求的范围内，本公开的若干可想到的修改是可能的。

Claims (20)

1.一种超声造影剂，所述超声造影剂包含：
(a) 全氟化碳微泡，所述微泡由磷脂膜稳定；和
(b) 缓冲剂；
其中所述超声造影剂的本体pH在5℃下为7.5-8.5，其中所述缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，所述全氟化碳为全氟丁烷，并且所述磷脂为氢化卵磷脂酰丝氨酸，
其中所述超声造影剂是水性分散体。
2.根据权利要求1所述的超声造影剂，所述超声造影剂用于长期储存。
3.根据权利要求1所述的超声造影剂，所述超声造影剂即时可用于临床环境中。
4.根据权利要求1所述的超声造影剂，所述超声造影剂用于受试者的体内成像、诊断和/或治疗。
5.根据权利要求1所述的超声造影剂，其中所述缓冲剂的浓度为1mM至10mM。
6.根据权利要求1所述的超声造影剂，其中所述磷脂膜具有净负电荷。
7.根据权利要求1所述的超声造影剂，其中所述超声造影剂还包含张度剂。
8.根据权利要求1所述的超声造影剂，其中所述超声造影剂还包含粘度剂和/或漂浮减少剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的超声造影剂，其中所述超声造影剂由以下组成：
(a) 全氟化碳微泡，所述微泡由磷脂膜稳定；和
(b) 缓冲剂；
其中所述超声造影剂的本体pH在5℃下为7.5-8.5，其中所述缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，所述全氟化碳为全氟丁烷，并且所述磷脂为氢化卵磷脂酰丝氨酸，
其中所述超声造影剂是水性分散体。
10.一种制备超声造影剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 在磷脂的无菌水性分散体中连续地均质化全氟化碳，以生成分散在水性分散体中的磷脂稳定的全氟化碳微泡；
(ii) 将所述水性分散体中微泡的尺寸分布调节到中值尺寸在1至6 µm的范围内；
(iii) 任选地向所述水性分散体中加入张度剂；
(iv) 向所述水性分散体中加入缓冲剂，以将所述水性分散体的本体pH调节到在5℃下7.5-8.5的pH；
(v) 调节所述水性分散体中微泡的浓度，以达到约6-10 µl/ml的目标微泡浓度；
(vi) 将所述水性分散体分配到小瓶中，并用全氟化碳冲洗所述小瓶的顶部空间，
其中所述缓冲剂为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，所述全氟化碳为全氟丁烷，并且所述磷脂为氢化卵磷脂酰丝氨酸，
其中所述超声造影剂是水性分散体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述中值尺寸在2至5 µm的范围内。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(iii)和(iv)以任何顺序进行。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中步骤(v)在步骤(ii)、(iii)和(iv)中的任一之前或之后进行，前提条件是步骤(v)在步骤(i)之后并在步骤(vi)之前进行。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述超声造影剂用于长期储存和/或即时可用于临床环境中。
15.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述超声造影剂用于受试者的体内成像、诊断和/或治疗。
16.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，所述方法不包括冻干步骤。
17.一种超声造影剂，所述超声造影剂根据如权利要求10-16中任一项所限定的方法制备。
18.根据权利要求1-9或17中任一项所述的超声造影剂在制备用于改善受试者中组织的超声图像的对比度的方法的药剂中的用途，所述方法包括向所述受试者中注射所述超声造影剂和进行所述组织的超声扫描。
19.根据权利要求1-9或17中任一项所述的超声造影剂在制备用于受试者中组织的体内成像的方法的药剂中的用途，所述方法包括向所述受试者中注射所述超声造影剂、进行所述组织的超声扫描和生成所述组织的图像。
20.根据权利要求1-9或17中任一项所述的超声造影剂在制备用于诊断受试者的方法的药剂中的用途，所述方法包括向所述受试者中注射所述超声造影剂、进行所述受试者中目标区域的超声扫描、生成所述目标区域的图像和评估所述图像以作出诊断。
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