JP7805589B2 - 自己組織化ペプチド - Google Patents

Description

本発明は自己組織化ペプチド、ゲル化剤、ゲル化剤を有効成分として含むゲル化組成物、徐放性ゲル調製用組成物、徐放性ゲル、及び徐放性ゲルの作製方法に関する。

ヒドロゲルを形成することができるペプチド（ペプチドゲル化剤）は、生体適合性や生分解性の優れたバイオマテリアルとして細胞や組織の培養に用いられており、近年では再生医療分野への応用が進められている。例えば、生体内外で細胞や臓器等と接着する足場材料（人工細胞外マトリックスや細胞足場材料等）や組織再生のための再生医療材料としての応用が期待されている。

従来から利用されているペプチドゲル化剤としては、動物組織から抽出されるゼラチンやコラーゲン、マウス肉腫細胞に由来するマトリゲル等が、細胞や組織の培養に幅広く用いられてきた。しかし、動物由来のペプチドゲル化剤は、分子量分布や成分組成が必ずしも均一ではなく、製造ロットごとの品質に差がある。また、生体内に導入される場合には、抽出物中に混入する微量成分やコンタミネーションによってアレルギーや未知の感染症を生じるリスクも避けることができない（非特許文献１～５）。

動物由来のペプチドゲル化剤の上記問題点を克服し得る有力な材料として、化学的に合成される低分子ペプチドゲル化剤（合成低分子ペプチドゲル化剤）の開発が進められている。合成低分子ペプチドゲル化剤は、特定のアミノ酸配列を有するペプチドとして、溶液合成や固相合成法によって高純度で合成することが可能である。それ故、製造ロットごとの品質は安定しており、コンタミネーションも極めて少ないという利点がある。

合成低分子ペプチドゲル化剤には、（i）1個又は2個のアミノ酸と芳香族性部位（シンナモイル基やFmoc基等）を連結した両親媒性ペプチド、（ii）βシート形成ペプチドの末端に長鎖アルキル鎖（パルミトイル基等）を連結した両親媒性ペプチド、（iii）親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を交互に連結した両親媒性ペプチド等が知られている（非特許文献６～７）。上記（iii）に該当する合成低分子ペプチドゲル化剤は、非天然骨格を含まず、天然アミノ酸のみから構成され得るため、特に臨床応用に適していると考えられる（非特許文献８～１０）。

しかし、これまでに開発された合成低分子ペプチドゲル化剤は、生理的条件下でゲル化しにくい点や、鎖長が大きいために製造コストが高い点が問題となっている。ペプチドゲル化剤に特定の機能を持たせるためにはペプチドゲル化剤にタンパク質等の生体機能分子を複合化することや、さらに複合化させた生体機能分子をゲルから長期間に亘って持続的に放出させることが必要となるが、生体機能分子の活性を保持したまま複合化するためには、生体機能分子が変性しない生理的温度かつ生理的pH条件下でゲル化し得ることが必要である。

例えば、上記（iii）の代表例である(RADA)₄ペプチドは、酸性条件下ではゲル化するが、生理的なpH条件下ではゲル化しない。酸性条件では、タンパク質等の生体機能分子の多くが変性し、活性が低下するか又は失活する。それ故、(RADA)₄ペプチドから形成されるヒドロゲル中に、タンパク質等の生体機能分子を活性な状態で複合化することは困難であり、再生医療材料としての利用可能性は制限されている。また、複合化させた生体機能分子をゲルから長期間に亘って持続的に放出させる技術は確立されていない。

したがって、再生医療材料としての利用可能性をさらに広げるために、生理的条件下でヒドロゲル形成を可能とし、かつ鎖長が比較的小さな合成低分子ペプチドゲル化剤、並びにそれに基づく徐放技術が必要とされている。

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本発明の目的は、生理的条件下でゲル化し、かつ鎖長が比較的小さなペプチドゲル化剤、及びそれに基づく徐放性ゲルを提供することである。

上記課題を解決するために、本発明者らは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を交互に連結した両親媒性ペプチドで、生理的温度かつ生理的pH条件下でゲル化し得るペプチドを探索した。

その結果、特定の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸が交互に連結した両親媒性ペプチドが、生理的条件下でゲルを形成し得ることを見出した。さらに鋭意研究を重ねた結果、当該ペプチドが従来のペプチドゲル化剤に比べて飛躍的に高い弾性率を有すること、並びに当該ペプチドから形成されるゲルが極めて優れた徐放特性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は上記新たな知見に基づくもので、以下の［１］～［１５］、及び（１）～（１６）を提供する。

［１］ヒドロゲル化する自己組織化ペプチドであって、以下の式：
Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa
（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを1個又は2個含み、前記自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸配列の全長が25アミノ酸以下である、前記自己組織化ペプチド。
［２］自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端がArgである、［１］に記載の自己組織化ペプチド。
［３］自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端の2アミノ酸がいずれもArgである、［１］に記載の自己組織化ペプチド。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを連結してなる融合ペプチド。
［５］前記連結が共有結合又は超分子相互作用によるものである、［４］に記載の融合ペプチド。
［６］機能性ペプチドが、ラミニン、VEGF、又はN-カドヘリンである、［４］又は［５］に記載の融合ペプチド。
［７］［１］～［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチド、又は［４］～［６］のいずれかに記載の融合ペプチドからなるゲル化剤。
［８］［７］に記載のゲル化剤を有効成分として含む、ゲル化組成物。
［９］ゲル化剤を２種以上含む、［８］に記載のゲル化組成物。
［１０］ゲル化した、［１］～［３］のいずれかに記載の自己組織化ペプチド、又は［４］～［６］のいずれかに記載の融合ペプチドを含む、人工細胞外マトリックス。
［１１］ゾル状態にある、［７］に記載のゲル化剤、又は［８］若しくは［９］に記載のゲル化組成物を水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することにより前記ゲル化剤又はゲル化組成物をゲル化する、ゲル化方法。
［１２］ゲル化剤又はゲル化組成物を水中又は水溶液中で維持する前記温度が4～60℃の範囲内である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物が、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンを含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］ゲル状態時の前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物がpH 6.0～8.0である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記ゲル化剤及び／又は前記ゲル化組成物の濃度が0.4重量％～10重量％である、［１１］～［１４］のいずれかに記載の方法。

（１）徐放性ゲル調製用組成物であって、第１の自己組織化ペプチドからなるゲル化剤、及び第２の自己組織化ペプチドと機能性部分とを連結してなる機能性分子を含み、前記第１及び第２の自己組織化ペプチドは、独立して、以下の式：
Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa
（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを1個又は2個含むものであり、前記第１及び第２の自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸配列の全長が25アミノ酸以下であり、前記機能性部分は機能性ペプチド及び／又は低分子化合物である、前記徐放性ゲル調製用組成物。
（２）第１及び／又は第２の自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端がArgである、（１）に記載の徐放性ゲル調製用組成物。
（３）第１及び／又は第２の自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端の2アミノ酸がいずれもArgである、（１）に記載の徐放性ゲル調製用組成物。
（４）ゲル化剤を２種以上含む、（１）～（３）のいずれかに記載の徐放性ゲル調製用組成物。
（５）前記連結が共有結合又は超分子相互作用によるものである、（１）～（４）のいずれかに記載の徐放性ゲル調製用組成物。
（６）機能性ペプチドが血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、及び肝細胞増殖因子（HGF）からなる群から選択される、（１）～（５）のいずれかに記載の徐放性ゲル調製用組成物。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の徐放性ゲル調製用組成物を含む、徐放性ゲル。
（８）（７）に記載の徐放性ゲルを含む、医薬組成物。
（９）移植用である、（８）に記載の医薬組成物。
（１０）血管新生促進及び／又は神経変性抑制のための、（８）又は（９）に記載の医薬組成物。
（１１）神経組織損傷及び／又は虚血の治療及び／又は予防に用いるための、（８）～（１０）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１２）神経組織損傷が脳梗塞である、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）徐放性ゲルの作製方法であって、（１）～（６）のいずれかに記載の徐放性ゲル調製用組成物を水又は水溶液と混合する工程、及び前記混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる工程を含む方法。
（１４）前記混合工程で、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに混合する、（１３）に記載の方法。
（１５）ゲル状態時の前記徐放性ゲルがpH 6.0～8.0である、（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）前記徐放性ゲル中のゲル化剤の濃度が0.4重量％～10重量％である、（１３）～（１５）のいずれかに記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-128805号、2020-146597号の開示内容を包含する。

本発明の自己組織化ペプチドによれば、生理的条件下でゲル化し、かつ鎖長が比較的小さなペプチドゲル化剤、及びそれに基づく徐放性ゲルを提供することができる。

各ペプチドサンプルのゲル形成能を試験した結果を示す図である。各ペプチドサンプルの流動性を調べるために、ミクロチューブ管の底面にてゲルを形成させた後、ミクロチューブ管を上下反転させて、サンプルがミクロチューブ管のキャップ側に落下するかどうかを試験した。図では写真の上方がミクロチューブ管の底部に対応する。ペプチドサンプルの一部又は全部がミクロチューブ管底面に残っている場合に、ペプチドサンプルがゲル化していると判断した。 疎水性アミノ酸としてバリンを含むペプチドサンプルのゲル形成能を試験した結果を示す図である。 レオロジー特性の測定結果を示す図である。横軸はせん断ひずみ（Shear strain）、縦軸は貯蔵弾性率G’及び損失弾性率G”を示す。 円偏光二色性スペクトルの測定結果を示す図である。 細胞接着性の評価結果を示す図である。各ペプチドゲル上に接着した細胞のDAPI染色（Ａ）、及び接着細胞数（Ｂ）を示す。エラーバーは標準偏差を示す。 （Ａ）GFP-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率、GFPタンパク質のP4ペプチドゲルへの取り込み率、GFP-RADA16融合ペプチドのRADA16ペプチドゲルへの取り込み率、及びGFPタンパク質のRADA16ペプチドゲルへの取り込み率を測定した結果を示す図である。（Ｂ）GFP-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率、及びGFP-RADA16融合ペプチドのRADA16ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を示す図である。図は3回の測定結果の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 （Ａ）VEGF-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率、及びVEGFペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率を測定した結果を示す図である。（Ｂ）VEGF-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率、及びVEGFペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を示す図である。図は3回の測定結果の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 マウス脳梗塞モデルにおける、VEGF-P4融合ペプチドによる歩行機能改善効果を示す図である。（Ａ）ペプチドゲルをマウス脳梗塞モデルに投与する前後で歩行機能解析を行い、治療効果を評価する方法を示す図である。（Ｂ）ペプチドゲルをマウス脳梗塞モデルに投与した前後の歩行機能解析結果を示す図である。各条件における結果の平均値を線で示す。「＊」はP4ペプチドゲル単独投与に対する有意差（P < 0.05、student t検定）を示す。 マウス脳梗塞モデルにおいて、VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルを投与した中大脳動脈遠位部の脳切片に対する、（Ａ）トマトレクチン（LEL）／DAPI染色、（Ｂ）LEL染色、（Ｃ）NeuN染色、（Ｄ)LEL／NeuN染色の結果を示す図である。（Ａ）において枠内に（Ｂ）～（Ｄ)の位置を示す。（Ａ）における矢印は、LEL陽性領域（損傷中心部）を示す。（Ｅ）ペプチドゲル投与後の損傷中心部の体積を示す。（Ｆ）ペプチドゲル投与後のペナンブラ領域の体積を示す。図は7匹の測定結果を箱ひげ図で示す。箱ひげ図におけるひげの下端、箱の下端、箱内部の線、箱の上端、及びひげの上端は、それぞれ最小値、第１四分位数、中央値、第３四分位数、及び最大値を示す。ただし、最小値及び最大値は、第１四分位数-1.5×四分位範囲（IQR）～第３四分位数+1.5×IQRの範囲内での最小値及び最大値とし、この範囲から外れた観測値は外れ値としてプロットする。 VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルによる血管新生促進効果を示す図である。マウス脳梗塞モデルにおいて、VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルを投与した中大脳動脈遠位部の脳切片に対する、（Ａ）ラミニン染色、（Ｂ）EdU染色、（Ｃ）DAPI染色、（Ｄ)重ね合わせを示す図である。矢印はEdU陽性の増殖細胞の位置を示す。（Ｅ）ペプチドゲル投与後のペナンブラ領域におけるラミニン陽性細胞数を示す。（Ｆ）ペプチドゲル投与後のペナンブラ領域におけるEdU／ラミニン共陽性細胞数を示す。図は7匹回の測定結果を箱ひげ図で示す。「＊」はP4ペプチドゲル単独投与に対する有意差（P < 0.05、student t検定）を示す。 VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルによる神経変性抑制効果を示す図である。マウス脳梗塞モデルにおけるペナンブラ領域の（Ａ）FJC染色、（Ｂ）DAPI染色、（Ｃ）重ね合わせを示す。矢印はFJC陽性の変性ニューロンの位置を示す。（Ｄ)ペプチドゲル投与後のペナンブラ領域におけるFJC陽性細胞数を示す。「＊」はP4ペプチドゲル単独投与に対する有意差（P < 0.05、student t検定）を示す。 VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルによる、神経細胞数の減少抑制効果を示す図である。マウス脳梗塞モデルのペナンブラ領域における（Ａ）NeuN染色、（Ｂ）DAPI染色、（Ｃ）重ね合わせを示す。矢印はNeuN陽性ニューロンの位置を示す。（Ｄ)ペプチドゲル投与後のペナンブラ領域におけるNeuN陽性細胞数を示す。「＊」はP4ペプチドゲル単独投与に対する有意差（P < 0.05、student t検定）を示す。 （Ａ）P4ペプチド（RIDARMRADIR、配列番号4）の構造を示す図である。（Ｂ）P4ペプチドにフルオレセインを連結したK(FAM)-G-P4融合ペプチドの構造を示す図である。 K(FAM)-G-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を示す図である。（Ａ）0、1、4、24、及び72時間の各時点において、P4ペプチドゲルから放出されたK(FAM)-G-P4融合ペプチドのUV吸収スペクトルを測定した結果を示す図である。（Ｂ）K(FAM)-G-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率（％）を示す図である。 さらなる5種類のペプチドサンプルについてゲル形成能を試験した結果を示す図である。ペプチドサンプルのゲル化は、図１と同様の方法によって試験した。

１．自己組織化ペプチド及び融合ペプチド
１－１．概要
本発明の第１の態様は、自己組織化ペプチド及び融合ペプチドである。本態様の自己組織化ペプチドは、式：Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaaで示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを含む。ここでXaaは独立してイソロイシン（I/Ile）又はメチオニン（M/Met）を示し、Yaaは独立してアスパラギン酸（D/Asp）、グルタミン酸（E/Glu）、リジン（K/Lys）、又はアルギニン（R/Arg）を示し、Zaaは独立してアラニン（A/Ala）又はグリシン（G/Gly）を示す。本態様の融合ペプチドは、本態様の自己組織化ペプチドを機能性ペプチドに連結してなるペプチドである。本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドは、生理的条件下でゲル化することができる。

１－２．用語の定義
本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
本明細書において「自己組織化ペプチド」とは、水又は水溶液に溶解したゾル状態から、固有の温度及び圧力条件下で固化し、ゲル状態になり得るペプチドをいう。例えば、コラーゲン（膠、ゼラチン、ゼリーを含む）や(RADA)₄ペプチド等が該当する。

「自己組織化」とは、小分子が分散媒中で分子間相互作用等により自発的に集合し、３次元立体構造を形成することをいう。例えば、糖（デンプン、グルコマンナン等の多糖類）、前述のコラーゲン、高吸収性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム）等は、固有の条件下で水又は水溶液中において、自己組織化によってファイバー状の１次元構造を形成し、さらにそれらが絡み合うことで３次元立体構造を有したゲル状態になる。自己組織化によりゲル化する物質を、本明細書では、しばしば「ゲル化剤」と表記する。本発明の自己組織化ペプチドは、ゲル化剤の一種である。

「ゾル」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散して、流動性を有する液体状態となったものをいう。例えば、ゲルを昇温することによってゲル化剤からなるコロイドが分散媒中で流動化したものが該当する。「コロイド」とは、分子やイオンが凝集して微粒子となり、媒質中に分散している状態をいう。コロイドを形成する微粒子を「コロイド粒子」と呼ぶ。
「ゾル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散し、流動性を有した液体状態をいう。例えば、ゲル化剤を水や水溶液等の分散媒中に分散させた状態や、ゲルを昇温させることによって流動化した状態が該当する。
「ゾル化」とは、ゲル状態からゾル状態への相転移現象である。

「ゲル」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化し、固体状となったものをいう。
「ゲル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化した状態をいう。一般的には、ゾルを降温させることによって固化した状態が該当する。
「ゲル化」とは、ゾル状態からゲル状態への相転移現象である。

本明細書において「ゲル化温度」とは、ゲル化剤が、ゾル状態からゲル状態に相転移する温度をいう。「ゾル化温度」とは、ゲル化剤が、ゲル状態からゾル状態に相転移する温度をいう。一のゲル化剤において、ゲル化温度とゾル化温度は、同一であってもよく、異なっていてもよい。通常、同一温度であるか、異なる温度であるかは、ゲル化剤の種類に基づく。

本明細書において「ペプチド」とは、1つ以上のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーをいう。「ペプチド」は、ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。したがって、「ペプチド」には、ジペプチドやトリペプチド等の数個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドから、多数のアミノ酸残基を含むポリペプチドまでが包含される。したがって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含される。

本明細書において「融合ペプチド」とは、本態様の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを連結したものをいう。自己組織化ペプチドと機能性ペプチドとの間の連結は、共有結合又は超分子相互作用であってもよい。共有結合は限定せず、例えばペプチド結合、ジスルフィド結合等が含まれる。本明細書において「超分子相互作用」とは、分子間の非共有結合性の相互作用を意味する。超分子相互作用には、水素結合、疎水性相互作用若しくは疎水結合、静電相互作用若しくはイオン結合、塩橋、配位結合等が例示される。限定はしないが、機能性ペプチドは、自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端に連結することが好ましく、さらに結合は、共有結合であることが好ましい。好ましい共有結合は、ペプチド結合である。

本明細書において「機能性ペプチド」とは、生体内若しくは生体外、又は細胞内若しくは細胞外において、特定の生物学的機能を有するペプチドをいう。本明細書において「特定の生物学的機能」とは、タンパク質や核酸等の生体分子、細胞、組織又は個体に任意の影響を与え得る機能であれば限定しない。特定の生物学的機能は天然又は非天然を問わず、例えば細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、代謝機能等が例示される。連結機能は、例えば特定の生物学的機能を有する他のペプチドや核酸等の生体分子、低分子化合物、又は金属イオンを連結させる機能が該当する。抗原抗体結合又は受容体リガンド相互作用を媒介する機能、RNA及び／又はDNA等の生体分子を結合する機能、ニッケルイオン、銅イオン等を結合する機能等が例示される。標識機能は、タンパク質や核酸等の生体分子、細胞、組織及び個体を標識する機能が該当する。例えば、蛍光標識やエピトープ標識等が挙げられる。

本明細書において「生体適合性」とは、生体への導入が可能である性質をいう。特に、ある材料が生体に対する毒性や副作用を有しないか、有していても極めて軽微である性質、及び／又は生体内において異物認識されず、排除されることがない性質をいう。本明細書において、「ペプチドが生体適合性を有する」とは、例えば、生物由来のコンタミネーションがないため人体に対してアレルギーや未知の感染症を生じるリスクがないか、非常に少ないペプチドをいう。生体適合性を有するペプチドには、例えば化学的に合成されたペプチド等が挙げられる。

本明細書において「生体」とは、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、又は個体をいう。限定はしないが、例えばヒト若しくはヒト以外の個体に由来する細胞、組織、若しくは器官、又はヒト若しくはヒト以外の個体に由来する細胞、例えばES細胞やiPS細胞から分化して得られる細胞や組織が挙げられる。好ましくは、ヒト由来の細胞、ヒト由来の細胞からなる組織若しくは器官、又はヒト個体である。

本明細書において「生理的条件」とは、生体分子の構造や活性、細胞や組織の構造や機能、又は個体の活動や生存が実質的に損なわれない、温度やpH等の条件をいう。より具体的には、生体内若しくは細胞内で存在し得る条件が該当する。本明細書において、生理的条件は、特にタンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくい条件を意味する。本明細書において、生理的pHは、タンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくいpHであれば限定しない。例えば、pH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。本明細書において、生理的温度は、タンパク質等の生体分子が変性しない、又は変性しにくい温度であれば限定しない。例えば0～65℃、4～60℃、20～50℃、又は30～40℃の範囲内の温度、例えば37℃である。

本明細書において「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれも包含する。非天然アミノ酸は、例えば任意の化学修飾基や置換基を有するアミノ酸である。本明細書においてアミノ酸は任意の光学異性体を含み、D体又はL体のいずれであってもよい。

本明細書において「疎水性アミノ酸」とは、疎水性を有するアミノ酸又は疎水性の高いアミノ酸をいう。例えば、アラニン（Ala/A）、グリシン（Gly/G）、プロリン（Pro/P)、バリン（Val/V）、ロイシン（Leu/L）、イソロイシン（Ile/I）、メチオニン（Met/M）、システイン（Cis/C）、フェニルアラニン（Phe/F）、チロシン（Tyr/Y）、及びトリプトファン（Trp/W）等が含まれる。

本明細書において「親水性アミノ酸」とは、親水性を有するアミノ酸又は親水性の高いアミノ酸をいう。例えば、アスパラギン酸（Asp/D）、グルタミン酸（Glu/E）、リジン（Lys/K）、ヒスチジン（His/H）、及びアルギニン（Arg/R）等が含まれる。

本明細書において「複数個」とは、例えば、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個、2～3個、又は2個をいう。

本明細書において「アミノ酸同一性」とは、比較する2つのペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入して整列化（アラインメント）したときの、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合（％）をいう。アミノ酸同一性を算出するための2つのアミノ酸配列の整列化は、Blast、FASTA、ClustalW等の既知プログラムを用いて行うことができる。

本明細書において「(アミノ酸の）置換」とは、特に断りの無い場合、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸間において、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換をいう。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr）、分枝鎖アミノ酸群（Leu, Val, Ile）、中性アミノ酸群（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr，Cys）、酸性アミノ酸群（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸群（Arg, Lys, His）、芳香族アミノ酸群（Phe, Tyr, Trp）内での置換が挙げられる。これらの群内でのアミノ酸置換であれば、ペプチドの性質に変化を生じにくいことが知られているため好ましい。

１－３．構成
１－３－１．自己組織化ペプチド
本態様の自己組織化ペプチドにおける構成について、以下で具体的に説明をする。
本態様の自己組織化ペプチドは、特定の規則に基づいて選択されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを含んでなるポリペプチド、又は該コアペプチドからなるポリペプチドによって構成される。

本明細書において「コアペプチド」とは、本発明の自己組織化ペプチドの一部又は全部を構成する9アミノ酸のペプチドである。本発明において、コアペプチドは疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互にペプチド結合で連結してなるペプチドであり、そのアミノ酸配列は特定の規則に基づいて選択される。

具体的には、本態様の自己組織化ペプチドは、以下の式：
Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa
（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを含む、又は該コアペプチドからなる。

一実施形態において、本態様の自己組織化ペプチドは、以下の式：
Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa
（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを含む、又は該コアペプチドからなる。

本態様の自己組織化ペプチドは、1個以上のコアペプチドを含む、又は1個以上のコアペプチドからなる。例えば、本態様の自己組織化ペプチドは、1個又は2個のコアペプチドを含んでもよい。

本態様の自己組織化ペプチドが2個のコアペプチドが含む場合、2個のコアペプチドは同一のアミノ酸配列からなるものであってもよく、又は異なるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

一実施形態では、本態様の自己組織化ペプチドは、コアペプチドのN末端側及びC末端側にさらなるアミノ酸残基を含まないものであってもよく、その場合、本態様の自己組織化ペプチドはコアペプチドのみからなる。そのような自己組織化ペプチドの例として、IRARMDADI（配列番号28）、IRADMRADI（配列番号29）、IRADMDARI（配列番号30）、IDARMRADI（配列番号31）、IDARMDARI（配列番号32）、IDADMRARI（配列番号33）、IRGDIRGDI（配列番号34）、IRGDMRGDI（配列番号35）、IRADIRADM（配列番号36）、IDARMRADM（配列番号37）、MDARIDARI（配列番号38）、MDADMRARI（配列番号39）、IRGDMRADI（配列番号46）、IRADMRGDI（配列番号47）、IRGDIRGDI（配列番号48）、IRGDIRADI（配列番号49）、及びIRADIRGDI（配列番号50）が挙げられる。

一実施形態では、本態様の自己組織化ペプチドは、コアペプチドのN末端側及び／又はC末端側に、1個のアミノ酸残基、又は複数個のアミノ酸残基からなるペプチド（以下、それぞれ「N末端側ペプチド」、「C末端側ペプチド」と表記する）を含んでもよい。本態様の自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端のアミノ酸残基は親水性アミノ酸であってもよい。本態様の自己組織化ペプチドにおけるN末端側ペプチド及び／又はC末端側ペプチドは、それぞれ1個以上の親水性アミノ酸を含んでもよい。

一実施形態では、自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端はArgであってもよい。すなわち、本態様の自己組織化ペプチドは、そのN末端のみがArgであってもよく、そのC末端のみがArgであってもよく、又はそのN末端及びC末端の両方がArgであってもよい。そのような自己組織化ペプチドの例として、RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIRADMDARIR（配列番号3）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、RIRGDIRGDIR（配列番号7）、RIRGDMRGDIR（配列番号8）、RIRADIRADMR（配列番号9）、RIDARMRADMR（配列番号10）、RMDARIDARIR（配列番号11）、RMDADMRARIR（配列番号12）、RIRGDMRADIR（配列番号41）、RIRADMRGDIR（配列番号42）、RIRGDIRGDIR（配列番号43）、RIRGDIRADIR（配列番号44）、及びRIRADIRGDIR（配列番号45）が挙げられる。

さらなる実施形態では、自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端の2アミノ酸がいずれもArgであってもよい。すなわち、本態様の自己組織化ペプチドは、そのN末端のみがArg-Argジペプチドであってもよく、C末端のみがArg-Argジペプチドであってもよく、又はN末端及びC末端の両方がArg-Argジペプチドであってもよい。

本態様の自己組織化ペプチドを構成するグリシン以外のアミノ酸は、光学異性体を問わず使用することができる。すなわち、D体又はL体のいずれを使用してもよい。

自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸配列の全長は、25アミノ酸以下である。例えば、20アミノ酸以下、15アミノ酸以下、又は10アミノ酸以下であってもよい。より具体的には、14アミノ酸、13アミノ酸、12アミノ酸、11アミノ酸、10アミノ酸、又は9アミノ酸であってもよい。

一実施形態では、本態様の自己組織化ペプチドはコアペプチドからなり、その場合アミノ酸配列の全長は9アミノ酸である。

別の実施形態では、本態様の自己組織化ペプチドはコアペプチドを含む11アミノ酸のペプチドであり、そのN末端及びC末端の両方がArgであってもよい。

さらに別の実施形態では、本態様の自己組織化ペプチドはコアペプチドを含む13アミノ酸のペプチドであり、そのN末端及びC末端の両方がArg-Argジペプチドであってもよい。

本態様の自己組織化ペプチドのN末端アミノ酸残基のアミノ基、及びC末端アミノ酸残基のカルボキシ基には、任意に修飾基が付加されていてもよい。例えば、本態様の自己組織化ペプチドのN末端はアセチル基が付加されていてもよい。また、本態様の自己組織化ペプチドのC末端はNH₂アミドが付加されていてもよい。

１－３－２．融合ペプチド
本態様の融合ペプチドは、本態様の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを連結してなるペプチドである。自己組織化ペプチドと機能性ペプチドの間の連結は、例えば共有結合又は超分子相互作用によるものであってもよい。一実施形態において、超分子相互作用は、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、配位結合等であってもよい。

本態様の融合ペプチドは、限定はしないが、例えば、本態様の自己組織化ペプチドの任意の位置で機能性ペプチドをペプチド結合等の共有結合により、又はリンカーを介して連結してなるペプチドである。本態様の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドが連結される位置は、例えば自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端であってもよい。本態様の自己組織化ペプチドが「機能性ペプチドのN末端及び／又はC末端にペプチド結合で連結」されるとは、本態様の自己組織化ペプチドが機能性ペプチドのN末端にのみ連結される場合、C末端にのみ連結される場合、並びにN末端及びC末端の両方に連結される場合のいずれをも包含するものとする。この他、本態様の自己組織化ペプチドのN末端やC末端以外のアミノ酸残基の側鎖に機能性ペプチドが連結されていてもよい。

本態様の融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、前述のように、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能を有するペプチドである。その機能は、限定はしないが、例えば、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、又は代謝機能が挙げられる。

また、本態様の融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、使用目的、細胞培養、細胞の接着、増殖、分化等の制御、組織又は器官の培養、形成、再生、又は血管誘導等の融合ペプチドの目的に応じて選択することができる。

本発明における機能性ペプチドは限定しないが、例えば、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、マーカータンパク質、及び人工ペプチド、並びにそれらのペプチド断片が挙げられる。ここでいう「細胞接着分子」とは、細胞の表面で細胞間、又は細胞と細胞外マトリックス間の接着に関わる分子である。限定はしないが、例えば、N-カドヘリン等のカドヘリン、インテグリン、セレクチン等が挙げられる。「細胞外マトリックス分子」とは、細胞外マトリックスを構成する分子である。限定はしないが、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン等が挙げられる。「分泌タンパク質」とは、細胞内で作られ、細胞外に分泌されるタンパク質である。限定はしないが、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、サイトカイン等が挙げられる。「結合タンパク質」とは、特定の分子と特異的に結合するタンパク質である。限定はしないが、例えば、抗原抗体結合を媒介する抗体若しくは抗体断片又は抗原、（ストレプト）アビジン、マルトース結合タンパク質（MBP）、受容体リガンド相互作用を媒介する受容体又はリガンド、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質等が挙げられる。特に、機能性ペプチドがDNA結合タンパク質又はRNA結合タンパク質である場合、機能性ペプチドが結合する核酸分子は他の1つ又は複数の核酸分子と多重らせん構造の形成等によって結合することができる。「マーカータンパク質」とは、細胞やタンパク質等を検出する際に標識となりうるタンパク質である。通常は、その活性に基づいて目的とするタンパク質の発現や存在の有無を判別できるポリペプチドが該当する。限定はしないが、例えば、GFP等の蛍光タンパク質、ルシフェリン、又はイクオリン等の発光タンパク質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、又はアルカリホスファターゼ（AP）等の酵素が挙げられる。「人工ペプチド」とは、タグペプチドとも呼ばれ、人工的に合成された数～十数アミノ酸からなるオリゴペプチドである。例えば、FLAGタグ、ヒスチジンタグ、HAタグ、DAPタグ等のエピトープタグ、及びHisタグやGSTタグ等が挙げられる。

また、本態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドは、任意に1以上の化学修飾基を結合していてもよい。化学修飾基の構造は特に限定しないが、それを結合する自己組織化ペプチド又は融合ペプチドに所望の機能を付与する部分である。所望の機能としては、例えば標識機能、リンカー機能、連結機能、及び結合機能等が挙げられる。標識機能を付与する化学修飾基の例としては、発色基や蛍光基（例えばフルオレセイン等）が挙げられる。リンカー機能を付与する化学修飾基の例としては、任意のポリマー（例えば、アルキレン等）が挙げられる。結合機能を付与する化学修飾基の例としては、ビオチン等の化合物が挙げられる。その他、本態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドに結合することができる化学修飾基としては、脂質、糖、アプタマー、受容体のリガンド等が挙げられる。脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンE、ビタミンA，ビタミンD）、ビタミンK等の脂溶性ビタミン、アシルCoA等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができる。糖としては、例えば、グルコース、及びスクロース等が挙げられる。

１－４．効果
本発明の自己組織化ペプチドは、生理的条件下でゲル化することができる。例えば、1気圧条件下では、例えば、20～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内、かつpH 6.0～8.0の範囲内又はpH 6.5～7.5の範囲内でゲル化することが可能である。それ故、ゲル中に包埋するタンパク質等の生体分子の活性が失われることなく、又は少なくともその活性の一部を保持した状態で、ゲルを形成することができる。

本態様の自己組織化ペプチドは、アミノ酸配列の全長が9アミノ酸～25アミノ酸であり、鎖長が比較的小さいため、低コストで大量に化学合成することができる。溶液合成や固相合成法によって高純度に合成することができるため、製造ロットごとの品質は安定しており、コンタミネーションも極めて少ないという利点がある。

本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドは、生体適合性を有し、生体への導入が可能である。

本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドは、遺伝子発現系を用いて合成することも可能である。本明細書において「遺伝子発現系」とは、宿主細胞内で外来の遺伝子を発現できる発現系、又は無細胞遺伝子発現系をいう。例えば、本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドをコードする核酸をプラスミド若しくはバクミド（Bacmid）のような自律複製可能な発現ベクターに導入し、大腸菌、昆虫細胞、培養細胞等の宿主に導入することによって、本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドを合成することも可能である。

また、本態様の自己組織化ペプチド及び融合ペプチドをコードする核酸（例えばDNA）、当該核酸を含む発現ベクター、並びに当該発現ベクターを導入した宿主細胞もまた提供される。

２．ゲル化剤
２－１．概要
本発明の第２の態様は、ゲル化剤である。本態様のゲル化剤は、第１態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドからなる。本態様のゲル化剤によれば、温度変化によって、ゾル状態からゲル状態への相転移、すなわちゲル化が可能である。

２－２．構成
本態様において「ゲル化剤」とは、第１態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドで構成され、そのアミノ酸配列の違いに基づき、所望の条件、例えば生理的条件下でゲル化させることができるゲル化剤である。
したがって、本態様におけるゲル化剤の基本構成は、第１態様の自己組織化ペプチド又は第１態様の融合ペプチドにおける「１－３．構成」に記載の内容と実質的に同一である。それ故、ここでは、その具体的な説明は省略する。
本態様におけるゲル化剤のpHは、限定はしない。例えばpH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。

３．ゲル化組成物
３－１．概要
本発明の第３の態様はゲル化組成物である。本態様のゲル化組成物は、第２態様に記載のゲル化剤を必須の有効成分とし、他にゲル化促進成分や担体等を包含してなる。本態様のゲル化組成物は、水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することによってゲル化することが可能である。

３－２．構成
３－２－１．構成成分
本発明のゲル化組成物は、有効成分及びそれ以外の成分によって構成されている。有効成分以外の成分は特に限定はしないが、例えば、ゲル化組成物のゲル化を促進し得る成分や担体等が挙げられる。以下、各構成成分について具体的に説明をする。

（１）有効成分
本態様のゲル化組成物は、必須の有効成分として1種類、又は2種類以上の第２態様に記載のゲル化剤を含む。すなわち、第１態様の自己組織化ペプチド及び／又は融合ペプチドを包含している。有効成分としての第２態様に記載のゲル化剤は、1種類であっても、又は異なる2種類以上の組み合わせであってもよい。例えば、第1態様の自己組織化ペプチドと融合ペプチドを各々1種類ずつ組み合わせることができる。

本態様のゲル化組成物は、他の有効成分として、薬剤等を包含することもできる。本明細書において「薬剤」とは、低分子化合物、ペプチド（酵素及び抗体を含む）、又は核酸（miRNA、siRNA、shRNA等のRNAi分子、アンチセンス核酸、アプタマー等を含む）を含む概念である。薬剤は、限定はしないが、疾患等の治療や症状軽減を目的とする治療医薬、疾患等を検出、診断するための検査医薬、害虫、害獣の忌避や駆除を目的とする農薬、殺ウイルス又は殺菌を目的とする消毒薬等、様々な種類の薬剤を包含する。本態様のゲル化組成物に包含される薬剤は、1種だけでなく、2種以上であってもよい。

ゲル化組成物に配合される第２態様に記載のゲル化剤の量（含有量）は、特に限定はされない。ゲル化の条件を勘案して適宜定めればよい。また、本発明のゲル化組成物を生体内に投与する場合には、そのゲル化組成物に包含されるゲル化剤の種類及び／又はその有効量、被験体の情報、ゲル化組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類に応じて適宜定めればよい。具体的には、ゲル化組成物に第２態様に記載のゲル化剤の濃度は、限定はしないが、例えば0.4重量％以上10重量％以下、1.0重量％以上10重量％以下であればよく、例えば1.0重量％以上2.0重量％以下であってもよい。本明細書において「有効量」とは、ゲル化組成物においてゲル化剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。ここで「被験体」とは、医薬組成物の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル、マーモセット等）等が該当する。好ましくはヒトである（この場合、特に「被験者」という）。また、「被験体の情報」とは、ゲル化組成物を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。ゲル化剤の最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、歯科医師、又は獣医師等の判断によって決定される。

（２）ゲル化促進成分
本態様のゲル化組成物は、必要に応じてそのゲル化を促進し得る成分を含んでもよい。ゲル化促進成分としては、限定しないが、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分が挙げられる。一般的に、タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分は、ペプチドゲル化剤のゲル化を促進し得るためである。

タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分は限定せず、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する陽イオン及び陰イオン等が挙げられる。当該効果を有する陽イオン及び陰イオンは、ホフマイスターシリーズとして当業者に周知である。陰イオンであれば、例えば、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、硫酸イオン等が挙げられる。陽イオンであれば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。

タンパク質の溶解度を低下させる効果を有する陽イオン及び陰イオンの濃度は特に限定しない。例えば、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上であってもよい。炭酸水素イオン又は炭酸イオンを用いる場合には、水溶液中では炭酸水素イオンと炭酸イオンは通常平衡状態にあることを考慮し、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計濃度は、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上、例えば、44 mMであってもよい。

（３）担体
本態様のゲル化組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
本明細書において「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。

溶媒は、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよいが、好ましくは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液である。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、細胞培養や組織培養等に用いられる任意の培地等が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。培地は、市販培地を使用してもよく、一例を挙げればDMEM培地、ハムF12培地、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地、イーグルMEM培地、αMEM培地、MEM培地、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、MCDB131培地、ウィリアム培地Ｅ、IPL41培地、Fischer's培地等を使用してもよい。

賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。

乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。

流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。

上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、pH調節剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。

このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分であるゲル化剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。

３－２－２．ゲル化組成物の性質
本態様のゲル化組成物のpHは、限定はしない。例えば生理的pHであってもよく、pH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。

本態様のゲル化組成物は、水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することによってゲル化し得る。当該ゲル化温度は、原則的には有効成分であるゲル化剤を構成する自己組織化ペプチド又は融合ペプチドのそれに基づく。したがって、本態様のゲル化組成物は、例えば1気圧条件下において、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内の温度、例えば37℃でゲル化し得る。

本態様のゲル化組成物が融合ペプチドを含む場合には、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの活性が実質的に失われることなく、又は少なくともその活性の一部を保持したままで、ゲル化組成物を生理的条件下でゲル化させることができる。それ故、本態様のゲル化組成物がゲル化した後において、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの生物学的機能に基づく機能が発揮され得る。例えば、機能性ペプチドとしてVEGFを用いる場合には、ゲル化したゲル化組成物を外科的方法等により生体内に移植することによって、当該ゲルにおける血管形成を誘導することができる。

また、本態様のゲル化組成物は、生体内又は生体外において人工細胞外マトリックスとして使用することもできる。この場合も、本態様のゲル化組成物がゲル化した後、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの生物学的機能に基づく機能が発揮され得る。機能性ペプチドとして、例えば、ラミニンやN-カドヘリン等の細胞外マトリックス分子を用いることができる。人工細胞外マトリックスとして使用する場合、体内でゲル化したゲル化組成物は、当該ゲルにおいて細胞の接着、増殖、分化等の制御、及び組織又は器官の形成、再生等を可能とする。

被験体に導入された本態様のゲル化組成物は、投与部位において細胞の接着、増殖、分化等の制御、及び組織又は器官の形成、再生等が十分に達成された後、対象部位を外科手術等により切開して、ゲル化組成物を移植部位から除去することも可能である。

３－２－３．剤形
本態様のゲル化組成物の剤形は、特に限定しない。例えば、対象部位への導入が可能な固形剤であってもよい。固形剤の場合、その形状は問わない。粉剤、散剤、顆粒剤、錠剤等の一般的な固形剤形の他、移植用部材としての形状であってもよい。固形剤は固体であることから、固形剤としてのゲル化組成物は、通常ゲル状態である。

３－２－４．適用方法
本態様のゲル化組成物の適用方法は、特に限定しないが、好ましくは非経口投与であり、さらに好ましくは局所投与である。局所投与には、例えば、筋肉内投与、皮下投与、組織投与、及び器官投与が該当する。本態様のゲル化組成物を局所投与する場合には、本態様のゲル化組成物をゲル状態のまま対象部位に導入してもよい。例えば、対象部位を外科手術により切開して、ゲル状態のまま移植することができる。投与量は、有効成分が奏効する上で有効な量であればよい。有効量は、被験体情報に応じて適宜選択される。

３－２－５．除去方法
本態様のゲル化組成物は、必要に応じて、投与部位から除去することができる。例えば、外科手術により投与部位を切開して、ゲル状態のまま外科的に除去することができる。

４．人工細胞外マトリックス
４－１．概要
本発明の第４の態様は人工細胞外マトリックスである。本態様の人工細胞外マトリックスは、第２態様に記載のゲル化剤、又は第３態様に記載のゲル化組成物で構成される。本態様の人工細胞外マトリックスは、生体外又は生体内のいずれでも使用することができる。本態様の人工細胞外マトリックスが融合ペプチドを含む場合、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの活性を保持することができる。

４－２．構成
本明細書において「人工細胞外マトリックス」とは、細胞培養又は組織再生用の足場材料であり、細胞の接着、増殖、分化等の制御、移植細胞、移植組織又は移植器官の培養、形成、再生等を可能とする材料をいう。人工細胞外マトリックスは、生体外で使用してもよく、又は生体内で使用してもよい。

本明細書において「細胞の接着、増殖、分化等の制御」とは、細胞の接着、増殖、分化の促進及び／又は抑制をいう。

本態様の人工細胞外マトリックスは、第２態様に記載のゲル化剤、又は第３態様に記載のゲル化組成物で構成される。したがって、本態様における基本構成は、第２態様のゲル化剤、又は第３態様に記載のゲル化組成物の構成と実質的に同一である。

本態様の人工細胞外マトリックスは、原則としてゲル状態のゲル化剤である。これは、細胞の足場として機能するには、細胞が固着するための一定の剛性が必要であり、液体状のゾルでは、通常、その目的を達成し得ないためである。

本態様の人工細胞外マトリックスが融合ペプチドを含む場合、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、例えば細胞の接着、増殖、分化等を制御する分子、又は組織若しくは器官の形成、再生等を制御する分子である。例えば、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、マーカータンパク質及び人工ペプチド、並びにそれらのペプチド断片である。本態様の人工細胞外マトリックスに含まれ得る融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、好ましくは細胞接着分子、細胞外マトリックス分子であり、例えばラミニン、N-カドヘリンである。

４－３．効果
本態様の人工細胞外マトリックスは、生体外又は生体内において、細胞の接着、増殖、分化等の制御を可能にし、又は組織若しくは器官の形成、再生等を可能にする。

本態様の人工細胞外マトリックスを生体内で用いる使用態様は、「３．ゲル化組成物」の「３－２．構成」に記載されており、ここではその具体的な説明は省略する。

本態様の人工細胞外マトリックスを用いる場合には、対象とする細胞、組織又は器官の目的とする形状に合わせて人工細胞外マトリックスの形状を加工することができる。例えば、本発明の人工細胞外マトリックスは、ゾル状態にて鋳型に流し込み、ゲル化させることで成形することができる。或いは、本発明の人工細胞外マトリックスは、局所的な加熱処理により、ゲルの一部をゾル化し、目的の形状に成形することが可能である。

５．ゲル化方法
５－１．概要
本発明の第５の態様は、本発明のゲル化剤又はゲル化組成物のゲル化方法である。

５－２．方法
５－２－１．工程
本発明のゲル化方法は、ゾル状態にある、本発明のゲル化剤又はゲル化組成物を水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することを必須の工程として含む。本工程により、本発明のゲル化剤又はゲル化組成物は、ゾル状態からゲル状態へと相転移することができる。

本工程において使用する温度は、使用するゲル化剤又はゲル化組成物の種類によって異なるので、その種類に応じて適宜定めればよい。例えば、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内、例えば37℃において本発明のゲル化剤又はゲル化組成物を維持してもよい。特に本態様の人工細胞外マトリックスが融合ペプチドを含む場合には、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの活性が失われない、又はその活性の少なくとも一部が残存する温度条件が好ましく、例えば、4～80℃の範囲内、10～70℃の範囲内、15～60℃の範囲内、20～50℃の範囲内、又は30～40℃の範囲内、例えば37℃の温度条件を使用することができる。

本工程で用いる温度の制御方法は特に限定せず、公知の方法を用いればよい。例えば、ゲル化剤又はゲル化組成物を恒温槽等に配置する方法等が挙げられる。

本工程に供するゲル化剤又は前ゲル化組成物は、そのゲル化を促進し得る成分を含んでもよい。ゲル化促進成分としては、限定しないが、例えばタンパク質の溶解度を低下させる効果を有する成分を使用することができる。当該効果を有する陰イオンとしては、例えば、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、硫酸イオン等が挙げられる。当該効果を有する陽イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。上記成分の濃度は特に限定しない。例えば、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上であってもよい。炭酸水素イオン又は炭酸イオンを用いる場合には、水溶液中では炭酸水素イオンと炭酸イオンは通常平衡状態にあることを考慮し、炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計濃度は、1 mM以上、5 mM以上、10 mM以上、20 mM以上、30 mM以上、又は40 mM以上、例えば、44 mM以上であってもよい。

本工程に供するゲル化剤又は前ゲル化組成物のゲル状態時におけるpHは、限定はしない。例えばpH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。

本工程に供するゲル化剤、又は前ゲル化組成物に含まれるゲル化剤の濃度は、限定はしないが、例えば0.4重量％以上10重量％以下、又は1.0重量％以上10重量％以下であればよく、例えば1.0重量％以上2.0重量％以下であってもよい。

６．徐放性ゲル調製用組成物
６－１．概要
本発明の第６の態様は、徐放性ゲル調製用組成物である。本発明の徐放性ゲル調製用組成物は、ゲル化剤及び機能性分子を必須の有効成分とし、他にゲル化促進成分や担体等を包含してなる。本態様の徐放性ゲル調製用組成物によれば、生理的条件下で機能性分子の活性を維持しながらゲルを形成させ、さらに機能性分子を徐放させることができる。

６－２．用語の定義
本明細書において「徐放」とは、物質が空間中に徐々に放出されることをいう。本明細書では、特にゲルに含まれる物質が、ゲルから徐々に放散されることをいう。例えば、物質がゲルに内包されていない場合に放散される速度よりも遅い速度で放散されることをいう。生体内に埋め込まれたゲルから機能性分子が徐放される場合、その周囲の空間（例えば、ゲルが埋め込まれた疾患部位、損傷部位、組織、又は器官）では長期間に亘って機能性分子が存在し、その機能が提供される。

本明細書において「長期」又は「長期間」とは、通常の条件下で物質が放散され続ける期間よりも長い期間を意味する。具体的には、ゲルに内包されていない物質が同一条件下で放散され続ける期間よりも長いことを意味する。具体的な期間は物質の種類によって異なるが、例えば、１時間以上、２時間以上、３時間以上、６時間以上、半日以上、１日以上、２日以上、３日以上、１週間以上、２週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、６か月以上、又は１年以上の期間が該当する。

「血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）」は、血管形成及び血管新生に関与する一群の糖タンパク質である。VEGFは一般的にホモ二量体として機能する。VEGFには、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤増殖因子-1（placental growth factor-1; PlGF-1）、PlGF-2、及びそのスプライシングバリアント等のアイソフォーム等が含まれる。ヒトにおけるVEGF-Aアイソフォームには、VEGF121、VEGF165、VEGF189、及びVEGF206の4種類のスプライシングバリアントが知られている。

本明細書において、「線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；FGF）」は、発生、血管新生、及び創傷治癒における機能等の様々な機能を有するペプチドである。ヒトではFGF1～FGF14及びFGF16～FGF23の22種類のFGFが知られている。

本明細書において、「肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor；HGF）」は、細胞増殖、抗細胞死、血管新生等の多彩な活性を有するペプチドである。

６－３．構成
本発明の徐放性ゲル調製用組成物は、有効成分及びそれ以外の成分によって構成されている。有効成分以外の成分は特に限定はしないが、例えば、徐放性ゲル調製用組成物のゲル化を促進し得る成分、担体、及び他の薬剤等が挙げられる。以下、各構成成分について具体的に説明をする。

（１）有効成分
本発明の徐放性ゲル調製用組成物は、ゲル化剤及び機能性分子を含む。
本発明の徐放性ゲル調製用組成物に含まれるゲル化剤の構成は、第２態様において自己組織化ペプチドからなるゲル化剤の構成に準じる。したがって、ゲル化剤を構成する自己組織化ペプチド（以下、「第１の自己組織化ペプチド」と表記する）の構成は、第１態様の自己組織化ペプチドの構成に準じる。

本発明の徐放性ゲル調製用組成物に含まれる機能性分子は、自己組織化ペプチド（以下、上記第１の自己組織化ペプチドと区別して、「第２の自己組織化ペプチド」と表記する）と、機能性部分とを連結してなる分子である。第２の自己組織化ペプチドの構成もまた、第１態様の自己組織化ペプチドの構成に準じる。

第１及び第２の自己組織化ペプチドのアミノ酸配列は互いに独立して選択される。したがって、そのアミノ酸配列は同一であっても、又は異なるものであってもよい。

具体的には、本発明の徐放性ゲル調製用組成物において、ゲル化剤を構成する第１の自己組織化ペプチド、及び機能性分子に含まれる第２の自己組織化ペプチドは、独立して、以下の式：
Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa-Yaa-Zaa-Yaa-Xaa
（式中、Xaaは独立してIle又はMetであり、Yaaは独立してAsp、Glu、Lys、又はArgであり、Zaaは独立してAla又はGlyである）
で示されるアミノ酸配列からなるコアペプチドを1個又は2個含むものであり、第１及び第２の自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸配列の全長は25アミノ酸以下である。

本発明の徐放性ゲル調製用組成物は、ゲル化剤を２種以上含んでもよい。すなわち、本発明の徐放性ゲル調製用組成物には、第１の自己組織化ペプチドとして、２種以上の異なる自己組織化ペプチドが含まれていてもよい。

上記の機能性分子において、第２の自己組織化ペプチドと機能性部分との間の連結は、共有結合又は超分子相互作用であってもよい。共有結合、及び超分子相互作用については、第１態様の記載に準じる。限定はしないが、機能性部分は、第２の自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端に連結することが好ましく、さらに結合は、共有結合であることが好ましい。共有結合は、例えばペプチド結合である。

本発明の徐放性ゲル調製用組成物において、機能性分子に含まれる機能性部分は、機能性ペプチド及び／又は低分子化合物である。ここでいう機能性ペプチドは、第１態様の記載に準じるものとする。限定しないが、例えば、機能性ペプチドは血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、及び／又は肝細胞増殖因子（HGF）であってもよい。

VEGFは、VEGFファミリーに属する任意のペプチド、そのバリアントやアイソフォーム、変異体、又はペプチド断片のいずれであってもよい。ここでVEGFファミリーに属する任意のペプチドには、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF-1、及びPlGF-2が例示される。特にVEGFがVEGF-Aである場合、VEGF-AにはVEGF121、VEGF165、VEGF189、及びVEGF206の少なくとも4種類のスプライシングアイソフォームが存在するが、そのいずれであってもよい。

VEGFが由来する生物種は限定しない。したがって、VEGFは、ヒトのVEGF、並びにヒト以外の種のVEGFオルソログ、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウシ、カニクイザル、マーモセット等の哺乳動物種のVEGFオルソログであってもよい。

一実施形態では、VEGFはヒトVEGF165又はVEGF165オルソログである。ヒトVEGF165は、例えば配列番号27で示すアミノ酸配列からなるhVEGFA165や、そのSNP変異体等が挙げられる。VEGF165オルソログには、限定しないが、例えば配列番号40で示すアミノ酸配列からなるマウスオルソログmVegfa164等が挙げられる。

VEGFの変異体又はペプチド断片は、VEGFと同等以上のVEGF活性（例えば血管新生促進活性及び／又は神経変性抑制活性等）を有することが好ましい。VEGF165の変異体の例としては、配列番号27又は配列番号40で示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号27又は配列番号40で示すアミノ酸配列と60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるVEGF165変異体等が挙げられる。

FGFは、FGFファミリーに属する任意のペプチド（例えばFGF1～FGF14及びFGF16～FGF23）、そのバリアントやアイソフォーム、変異体、又はペプチド断片のいずれであってもよい。FGFが由来する生物種は限定しない。したがって、FGFは、ヒトのFGF（例えば配列番号21で示すアミノ酸配列からなるhFGF2）、又はヒト以外の生物種（例えば哺乳動物種）のFGFオルソログであってもよい。FGFの変異体又はペプチド断片は、FGFと同等以上のFGF活性（例えば血管新生促進活性及び／又は神経変性抑制活性等）を有することが好ましい。

HGFは、特に限定せず、HGFの任意のバリアントやアイソフォーム、変異体、又はペプチド断片のいずれであってもよい。HGFが由来する生物種は限定しない。したがって、HGFは、ヒトのHGF（例えば配列番号22で示すアミノ酸配列からなるhHGF）、又はヒト以外の生物種（例えば哺乳動物種）のHGFオルソログであってもよい。HGFの変異体又はペプチド断片は、HGFと同等以上のHGF活性（例えば血管新生促進活性及び／又は神経変性抑制活性等）を有することが好ましい。

徐放性ゲル調製用組成物に配合されるゲル化剤及び機能性分子の量（含有量）は、特に限定はされない。ゲル化条件や徐放性ゲルの用途を勘案して適宜定めればよい。また、本発明の徐放性ゲル調製用組成物を生体内に投与する場合には、その徐放性ゲル調製用組成物に包含されるゲル化剤及び機能性分子の種類及び／又はその有効量は、被験体の情報、徐放性ゲル調製用組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類に応じて適宜定めればよい。具体的には、徐放性ゲル調製用組成物に含まれるゲル化剤の濃度は、限定はしないが、例えば0.4重量％以上10重量％以下、1.0重量％以上10重量％以下であればよく、例えば1.0重量％以上2.0重量％以下であってもよい。徐放性ゲル調製用組成物に含まれる機能性分子の濃度は、限定はしないが、ゲル化剤の濃度の100,000分の1～100分の1、又は10,000分の1～1,000分の1であってもよく、例えば1×10^-6重量％以上0.1重量％以下、1×10^-5重量％以上1×10^-2重量％以下、又は1×10^-4重量％以上1×10^-3重量％以下であってもよい。

（２）ゲル化促進成分、担体、及び他の薬剤
本発明の徐放性ゲル調製用組成物は、必要に応じてそのゲル化を促進し得る成分（ゲル化促進成分）、薬学的に許容可能な担体、及び／又は他の薬剤を含むことができる。ゲル化促進成分及び担体は第３態様の記載に準じる。

他の薬剤は、特に制限せず、例えば、機能性分子と同様の薬理効果を有する薬剤や、抗生物質等が挙げられる。

また、本発明の徐放性ゲル調製用組成物の剤形、適用方法、及び除去方法は、第３態様の「３－２－３．剤形」、「３－２－４．適用方法」、及び「３－２－５．除去方法」に準じる。

６－４．効果
本態様の徐放性ゲル調製用組成物によれば、機能性分子の活性を損なわない生理的条件でゲル化させることができ、さらに機能性分子をゲルから徐放させることができる。本態様の徐放性ゲル調製用組成物から調製されるゲルは、機能性分子の取り込み効率が高く、優れた徐放性を有する。

７．徐放性ゲル
７－１．構成
本発明の第７の態様は徐放性ゲルである。
本態様の徐放性ゲルは、第６態様に記載の徐放性ゲル調製用組成物の構成に加えて、水又は水溶液を含む。したがって、本態様の徐放性ゲルにおいて、水又は水溶液以外の基本構成は、第６態様に記載の徐放性ゲル調製用組成物の構成と実質的に同一である。

本態様の徐放性ゲルのpHは、特に制限せず、例えばpH 4.0～10.0の範囲内、pH 5.0～9.0の範囲内、pH 6.0～8.0の範囲内、又はpH 6.5～7.5の範囲内、例えばpH 7.4である。本態様の徐放性ゲルのpHは、好ましくはゲルに内包される機能性分子の活性が失われない、又はその活性の少なくとも一部が維持される、pHである。

本態様の徐放性ゲルに含まれるゲル化剤の濃度は、特に限定せず、例えば0.4重量％以上10重量％以下、又は1.0重量％以上10重量％以下であればよく、例えば1.0重量％以上2.0重量％以下であってもよい。

７－２．効果
本態様の徐放性ゲルは、機能性分子をその活性が失われることなく内包することが可能であり、機能性分子を長期間に亘って放出し続けることができる。
本態様の徐放性ゲルは、形状の加工が容易である。例えば、生体内に埋め込む場所（例えば、疾患部位、損傷部位等）に合わせて徐放性ゲルの形状を加工することができる。

８．医薬組成物
８－１．構成
本発明の第８の態様は医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、第７態様の徐放性ゲルを含む。したがって、本態様の医薬組成物の構成は、下記の構成以外については、第６～７態様の記載に準じる。本発明の医薬組成物において、機能性分子に含まれる機能性ペプチドは、例えばVEGF、FGF、及び／又はHGFである。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は移植用である。本発明の医薬組成物は、例えば対象部位を外科手術により切開して、移植することができる。

また、本発明の医薬組成物は、血管新生促進及び／又は神経変性抑制のために使用することができる。

本発明の医薬組成物の対象疾患は特に限定しない。本発明の医薬組成物に含まれる機能性分子の機能性部分として疾患に対する治療及び／又は予防に有効な機能性ペプチド又は低分子化合物を用いることによって、任意の疾患の治療及び／又は予防に有効な徐放性の医薬組成物を提供することができるためである。具体的な対象疾患としては、以下に限定しないが、神経組織損傷及び／又は虚血が挙げられる。

本明細書において「神経組織損傷」は、中枢神経組織損傷及び末梢神経組織損傷のいずれも包含する。

中枢神経組織損傷には、脳損傷及び脊髄損傷が含まれる。脳損傷は、例えば外傷性脳損傷、脳血管障害等である。脳血管障害は、脳梗塞（虚血性脳血管障害）及び脳出血のいずれも包含する。脊髄損傷は、例えば頚髄損傷、胸髄損傷、腰髄損傷、仙髄損傷等である。

末梢神経組織損傷は、任意の末梢神経組織における損傷が包含される。例えば運動神経、感覚神経、及び自律神経の損傷が挙げられる。

本明細書において「虚血」は、任意の器官や組織における虚血である。例えば、下肢虚血（例えば、閉塞性動脈硬化症や、その重症型である重症下肢虚血）、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞等）や、上記の脳血管障害等が挙げられる。

本明細書において、治療は、限定しないが、根治的治療及び予防的治療を含む。また、予防は、発症予防、進行予防、及び再発予防を含む。

８－２．効果
本発明の医薬組成物を対象者の疾患部位、損傷部位、虚血部位、又はその近傍部位に移植することによって、VEGF等の機能性分子を長期間に亘って持続的に放出し続けることが可能となり、血管新生の促進や神経変性の抑制をもたらすことができる。或いは、本発明の医薬組成物を対象者の体内の特定の部位に移植することによって、機能性分子を長期間に亘って全身に持続的に放出し続けることもできる。

したがって、本発明の医薬組成物によれば、機能性分子に含まれる機能性ペプチドや低分子化合物の機能を生体内でより長期的に発揮させることが可能となり、治療効果を増大させることができる。

脳血管障害はCT検査やMRI検査等の画像検査でリスク発見が可能であり、本発明の医薬組成物によってその発症を予防することができる。また、脳梗塞等の脳血管障害は再発性が高いが、本発明の医薬組成物によってその再発を予防することもできる。

９．徐放性ゲルの作製方法
９－１．概要
本発明の第９の態様は、徐放性ゲルの作製方法である。本態様の徐放性ゲル作製方法によれば、活性の少なくとも一部を維持する機能性分子又は機能性部分を含む徐放性ゲルを作製することができる。

９－２．工程
本発明の徐放性ゲル作製方法は、第６態様の徐放性ゲル調製用組成物を水又は水溶液と混合する工程（混合工程）、及び混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる工程（ゲル化工程）を必須の工程として含む。

混合工程では、ゲル化工程におけるゲル化を促進し得る成分をさらに混合してもよい。そのようなゲル化促進成分の構成は第３態様の記載に準じるものとし、ここでの説明は省略する。

ゲル化工程において使用する温度、ゲル化工程で用いる温度の制御方法、ゲル状態時におけるゲルのpHは、徐放性ゲル中のゲル化剤の濃度は、第５態様の記載に準じる。

＜実施例１：ペプチドサンプルの流動性試験＞
（目的）
生理的条件下でゲル化する自己組織化ペプチドを開発する。
（方法）
（１）ペプチドの化学合成
計18種類のペプチド：RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIRADMDARIR（配列番号3）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、RIRGDIRGDIR（配列番号7）、RIRGDMRGDIR（配列番号8）、RIRADIRADMR（配列番号9）、RIDARMRADMR（配列番号10）、RMDARIDARIR（配列番号11）、RMDADMRARIR（配列番号12）、RVRVRVDVDVR（配列番号13）、RVRVDVRVDVR（配列番号14）、RVRVDVDVRVR（配列番号15）、RVDVRVRVDVR（配列番号16）、RVDVRVDVRVR（配列番号17）、及びRVDVDVRVRVR（配列番号18）を、ポリスチレンレジンを用いるFmocペプチド固相合成法によって、以下の方法によりそれぞれ0.10 mmolスケールで合成した。合成されたペプチドのN末端にはアセチル基が結合しており、C末端はNH₂アミドである。

固相合成用チューブ（株式会社ハイペップ研究所、固相合成用チューブポリプロピレン製LibraTube本体チューブ5 mL、固相合成用キャップポリプロピレン製LibraTube上部キャップ）中で、Fmoc-NH-SAレジン（渡辺化学株式会社）（250 mg, 0.10 mmol）をN,N’-ジメチルホルムアミド（DMF）（キシダ化学株式会社）中で1晩浸漬し、膨張させた。ピぺリジン（キシダ化学株式会社）(20％ in DMF, 2 mL)を加え、１分間ボルテックスで攪拌し、その後反応溶液を除去した。ピペリジン（20％ in DMF, 2 mL）を加え、室温で10分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF（2 mL）で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kit（東京化成工業株式会社）を用いてレジンが呈色することを確認した。塩化メチレン（株式会社ゴードー）（2 mL）、DMF（2 mL）でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。N末端のアミノ酸（0.30 mmol）に縮合剤カクテル（700 μL）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（ナカライテスク株式会社）とN-メチル-2-ピロリドン（NMP）（キシダ化学株式会社）の混合液（DIEA/NMP = 2.75/14.25 (v/v), 700 μL）を加えて溶解させ、レジンに添加した。縮合剤カクテルは、HBTU（渡辺化学株式会社）3.05 g、HOBt・H₂O（渡辺化学株式会社）1.25 g、DMF 16 mLを予め混合し調製したものを使用した。室温で15分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF（2 mL）で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kit（東京化成工業株式会社）を用いてレジンが呈色しないことを確認した。塩化メチレン（2 mL）、DMF（2 mL）でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。以降、アミノ酸配列に従って上記の操作を繰り返し、ペプチド鎖を伸長した。ペプチド鎖の伸長には、Fmoc-Ala-OH・H2O、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Met-OH、及びFmoc-Gly-OH（渡辺化学株式会社）を使用した。

ペプチドを伸長後、溶媒を除去し、無水酢酸（関東化学株式会社）（25％塩化メチレン溶液、2 mL）を加え、室温で5分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF（2 mL）で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kitを用いてレジンが呈色しないことを確認した。塩化メチレン（2 mL）、DMF（2 mL）でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。

次に以下の手順でペプチドをレジンから切り出し、凍結乾燥した。デシケーター内で乾燥させたレジンに脱保護カクテルを加え、室温で30分ごとに軽く振盪し、90分間静置させた。脱保護カクテルは、トリフルオロ酢酸（TFA）（キシダ化学株式会社）2375 μL、トリイソプロピルシラン（TIS）（東京化成工業株式会社）62.5 μL、水62.5 μLを予め混合し調製したものを使用した。濾液を15 mL遠沈管に回収した。合成チューブにTFA（500 μL）を加え、濾液を先ほどの遠沈管に回収した。この操作を3回繰り返した。濾液を回収した遠沈管にジエチルエーテル（キシダ化学株式会社）（40 mL）を加え、十分に攪拌した。遠心分離（4℃, 3500×g, 5分）し、上澄みを除去した。この操作を3回繰り返した。10分間ドラフト内で静置し、乾燥させた後、デシケーターで2時間以上乾燥させた。乾燥後のサンプルをイオン交換水に分散させ、凍結乾燥した。

（２）自己組織化ペプチドを含むゲルの作製
1 mLのミクロチューブ管（内径5 mm、高さ5 cmのガラス製容器；マルエム、型番No.1）に凍結乾燥後のペプチド粉末2.5 mgとD-MEM（1×ペニシリン、4.0 mM HEPES、44 mM NaHCO₃含有；pH 7.4）250 μLを加え、水浴型超音波装置（AS12GTU、35 kHz、60 W）中で超音波を照射することによってペプチドを1.0重量％濃度で分散させた。その後、CO₂インキュベータ（37℃、CO₂濃度5％）内にて、ミクロチューブ管の底面を下にして垂直に立てた状態で48時間静置した。ペニシリン（Life Technologies Corporation、型番15140148）はカビの発生を防ぐ目的で抗菌剤として100 U/mLにて使用し、CO₂インキュベータは生体内と近い条件でゲル化を行うために用いた。

（３）流動性試験
ペプチドサンプルが流動性を失ってゲル化しているかどうかを試験するために、CO₂インキュベータ（37℃、CO₂濃度5％）内でサンプルを密封し、インキュベータ外に取り出し速やかにミクロチューブ管を上下反転させ、ペプチドサンプルの写真を撮影して記録した。ペプチドサンプルの一部又は全部がミクロチューブ管の底面側に残っている場合に、ペプチドサンプルが流動性を失い、ゲル化していると判断した。これに対して、ペプチドサンプルの全部がミクロチューブ管のキャップ側に落下する場合には、ペプチドサンプルがゲル化していないと判断した。

（結果）
図１及び２に各ペプチドサンプルに対する流動性試験の結果を示す。
18種類のペプチドのうち、12種類のペプチドサンプル：RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIRADMDARIR（配列番号3）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、RIRGDIRGDIR（配列番号7）、RIRGDMRGDIR（配列番号8）、RIRADIRADMR（配列番号9）、RIDARMRADMR（配列番号10）、RMDARIDARIR（配列番号11）、及びRMDADMRARIR（配列番号12）は、ミクロチューブ管の上下反転後に、その一部又は全部がミクロチューブ管の底面側に留まり、流動性を失ってゲル化していることが示された（図１）。

一方、Valを含む6種類のペプチド：RVRVRVDVDVR（配列番号13）、RVRVDVRVDVR（配列番号14）、RVRVDVDVRVR（配列番号15）、RVDVRVRVDVR（配列番号16）、RVDVRVDVRVR（配列番号17）、及びRVDVDVRVRVR（配列番号18）は、いずれも同一条件下において、サンプルのほぼすべてがミクロチューブ管のキャップ側に落下し、ゲル化しなかった（図２）。

図１においてゲル化を示した12種類のペプチドは、N末端側から1、3、5、7、9、11番目に親水性アミノ酸残基としてArg又はAspを有し、N末端側から2、4、6、8、10番目の位置に疎水性残基としてIle、Met、Ala、又はGlyを有する。これに対し、図２においてゲル化しなかった6種類のペプチドは、N末端側から1、3、5、7、9、11番目に親水性アミノ酸残基としてArg又はAspを有する点で前記12種類のペプチドと類似しているが、N末端側から2、4、6、8、10番目の位置に疎水性残基としてValを有する点で異なっている。両者は疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を交互にペプチド結合で連結してなるペプチドである点で類似しており、非常によく似た化学的特性を有することが予想される。それにもかかわらず、N末端側から2、4、6、8、10番目の位置の疎水性残基としてValではなくIle、Met、Ala、又はGlyが配置される場合にのみ生理的条件下でゲル化し得ることは予想外であった。

＜実施例２：ペプチドゲルのレオロジー特性＞
（目的）
自己組織化ペプチドによって形成されるゲルのレオロジー特性を解析する。

（方法）
実施例１で調製した1.0重量％濃度のゲルのうち、例として6種類のペプチドサンプル：RIRARMDADIRペプチド（配列番号1）、RIRADMRADIRペプチド（配列番号2）、RIDARMRADIRペプチド（配列番号4）、RIDARMDARIRペプチド（配列番号5）、RIDADMRARIRペプチド（配列番号6）、及びRIRGDMRGDIRペプチド（配列番号8）によって形成されるゲルについて、そのレオロジー特性を測定した。

ペプチドサンプルのレオロジー特性の測定は、レオメーター（Malvern Panalytical、Kinexus lab+）を用いて250 μLのサンプルに対して行った。具体的には、0.2 mmのギャップでサンプルをプレートで挟み、20℃にて測定を行った。

レオロジー特性の測定によって、各ペプチドから形成されるゲルの貯蔵弾性率G’と損失弾性率G”が得られる。貯蔵弾性率G’は物体に外力とひずみにより生じたエネルギーのうち物体の内部に保存する成分、損失弾性率G”は外部へ拡散する成分を表す。測定試料がゲルである場合、一般的に貯蔵弾性率G’が損失弾性率G”を上回る。

（結果）
6種類のペプチドサンプルについてレオロジー特性を測定した結果を図３に示す。
測定した6種類のペプチドサンプルでは、いずれも貯蔵弾性率G’が損失弾性率G”を上回っていた。この結果から、測定した6種類のペプチドサンプルから形成される非流動性固形物はゲルであることが示された。

上記6種類のペプチドサンプルについて測定された貯蔵弾性率G’と公知のペプチドゲルの貯蔵弾性率G’とを比較した結果を以下の表１に示す。

表１に示すように、本発明のペプチドによって形成されるゲルは、(RADA)₄、SPG178、及びK₂(QFQL)₃K₂等の公知のゲル化ペプチドと比較して飛躍的に高い弾性率を有することが示された。すなわち、本発明のペプチドは、公知のペプチドゲル化剤と比較して飛躍的に硬いゲルを形成することができる。

例えば、表１において、公知のペプチドゲル化剤であるSPG178は、pH 7.0、及び1.0又は1.5重量％濃度の条件でゲルを形成するが、このゲルの貯蔵弾性率G’は70～300に過ぎず（Komatsu, S. et al. Plos One, 2014, 9 (7), e102778.）、参考のため以下の表２に示すマヨネーズやケチャップの弾性率（約10³）にも満たない。

また、表１に示す別の公知のペプチドゲル化剤であるK₂(QFQL)₃K₂は、2.0重量％濃度の条件下PBS（pH 7.4）中でゲルを形成するが、このゲルの貯蔵弾性率G’は500未満であり（Bakota, E. L. et al. Biomacromolecules, 2013, 14 (5), 1370-1378.）、表２に示すマヨネーズやケチャップの弾性率（約10³）にも満たない。それ故、K₂(QFQL)₃K₂から形成されるゲルでは、生体内導入時の安定的使用が困難である。

一方、本発明のペプチドによって形成されるゲルの貯蔵弾性率G’は4,000～60,000に達し（表１）、表２に示すこんにゃくやコーヒーゼリー（約10⁴）と同等又はそれ以上の弾性率を示した。

以上の結果から、本発明のペプチドは、公知のペプチドゲル化剤と比較して飛躍的に優れた弾性率を有し、優れた耐用性を有することが示された。

さらに、本発明のペプチドは、(RADA)₄、SPG178、及びK₂(QFQL)₃K₂等の公知のゲル化ペプチドと比較してアミノ酸配列が短いため、低コストで大量に化学合成することができる点でも有利である。

＜実施例３：円偏光二色性スペクトルの測定＞
（目的）
自己組織化ペプチドの立体構造を解析する目的で円偏光二色性スペクトルを測定する。
「円偏光二色性」とは、タンパク質が円偏光を吸収する際に左円偏光と右円偏光に対して吸光度に差が生じる現象のことをいう。タンパク質の立体構造にβシート構造が含まれている場合、円偏光二色性スペクトルにおいて220 nm付近の負のコットン効果が観測される。

（方法）
実施例１で調製した1.0重量％濃度のペプチドゲルのうち、例として3種類のペプチド：RIDARMRADIRペプチド（配列番号4）、RIRADMRADIRペプチド（配列番号2）、及びRIDARMDARIRペプチド（配列番号5）について、20℃、40℃、60℃、及び80℃における円偏光二色性スペクトル、並びに80℃から20℃に再冷却した際の円偏光二色性スペクトルを測定した。

円偏光二色性スペクトルは、JASCO J-1100 CD Spectrometerを使用して、組立セル（GL Science、AB20-UV-0.1、セル長0.1 mm）を用いて測定した。測定範囲は190-400 nm、データ取込間隔は0.2 nm、走査速度は200 nm/分、試料濃度は1.0重量％であった。円偏光二色性スペクトル測定時における温度制御は、JASCO 温調ユニット及び水冷ペルチェセルホルダ PTC-514を用いて行った。

（結果）
円偏光二色性スペクトルの測定結果を図４に示す。
RIDARMRADIRペプチド（配列番号4）、RIRADMRADIRペプチド（配列番号2）、及びRIDARMDARIRペプチド（配列番号5）の3種類のペプチドサンプルはいずれも、220 nm付近で負のコットン効果を示した。これは、βシート構造に帰属される特徴的なシグナルであることから、ゲルを形成するペプチドがβシート状に自己集合していることが示された。

3種類のペプチドサンプルについて、220 nm付近の負のコットン効果は20～80℃の条件下で維持された。よって、ペプチドゲルを構成するβシート構造が20～80℃の温度範囲において安定に維持されていることが示された。

＜実施例４：細胞接着性の評価＞
（目的）
ペプチドゲルの細胞接着性を評価する。

（方法）
実施例１で調製したペプチドゲルのうち、例として3種類のペプチド：RIRADMRADIRペプチド（配列番号2）、RIDARMRADIRペプチド（配列番号4）、及びRIDARMDARIRペプチド（配列番号5）について、細胞接着性を評価する。
実施例１と同様の方法で1.0重量％濃度のペプチドサンプルを調製した。50 μLのペプチドサンプルをチャンバースライド（Millipore社、Millicell EZ 8-well glass）上に滴下し、遠心式濃縮機（TAITEC社、VC-96W）を用いて減圧乾燥することによって、ペプチドをコートしたチャンバースライドを作製した。1.8×10⁵個のマウス胎仔由来3T3細胞（NIH3T3細胞）を10％血清を含有するDMEM培地（44 mM NaHCO₃含有、Gibco社、11995-065）250 μLに懸濁し、ペプチドをコートしたチャンバースライドに播種した後、CO₂インキュベータ（37℃、CO₂濃度5％）内で30分間インキュベートした。PBSでチャンバースライドを洗浄して非接着細胞を除去した。洗浄後に残った接着細胞を4％PFAで固定後、DAPI染色を行った。接着細胞数はサンプリングバイアスを排除した厳密な定量手法であるステレオロジーにて測定した。具体的には、300 μm×300 μmの領域中で100 μm×100 μmのフレームを9箇所作成し、その各フレーム内にいる細胞数を数えた。得られた細胞数に基づいて1 mm×1 mmの領域中の細胞数への換算を行った。本実施例では、細胞接着性のペプチドゲルを形成することが知られている(RADA)₄ペプチド（配列番号19）を対照として使用した。

（結果）
接着細胞のDAPI染色と接着細胞数を図５に示す。
Sigmacote（シグマアルドリッチ社、SL2-25ML）でチャンバースライド表面をシリコン化処理した場合（図５、「Sigmacote」）、及びチャンバースライド表面を処理せず積極的な接着を促進しない場合（図５、「noncoat」）では、チャンバースライドに接着する細胞の数が少なかった。これに対して、本発明のRIRADMRADIRペプチド（配列番号2）、RIDARMRADIRペプチド（配列番号4）、及びRIDARMDARIRペプチド（配列番号5）は、(RADA)₄ペプチドと同等か又はそれ以上の細胞接着性を有することが示された。
この結果から、本発明のペプチドゲル化剤が、細胞接着性を有する人工細胞外マトリックスや細胞足場材として使用し得ることが示された。

＜実施例５：GFP-P4融合ペプチドのペプチドゲルへの取り込み＞
（目的）
GFPタンパク質と自己組織化ペプチドとを連結してなる融合ペプチドについて、ペプチドゲルへの取り込みの効率を評価する。なお、以降の実施例では、本発明の自己組織化ペプチドの一例としてアミノ酸配列RIDARMRADIR(配列番号4)からなるペプチド（以下、「P4ペプチド」と表記する）を用いるが、P4ペプチドで得られる効果は本発明の他のすべての自己組織化ペプチドについても同様に得られることは明らかである。

（方法）
（１）P4ペプチド溶液の調製
配列番号4で示すアミノ酸配列からなるP4ペプチドを1.0重量％濃度で含むP4ペプチド溶液を、実施例１と同様の方法で調製した。

（２）GFP-P4融合ペプチドの調製
GFPタンパク質のC末端側にアミノ酸配列RIDARMRADIR(配列番号4)からなるペプチド（P4ペプチド）を融合したGFP-P4融合ペプチドを発現するプラスミド、及びP4ペプチドを融合していないGFPタンパク質を発現するプラスミドを以下の方法で作製した。

特願2020-45109に記載のpCAG-GFP-RADA16プラスミドを鋳型として、GFP及び6xHisTagをコードする配列部分をCAG-Fw1プライマー（配列番号23）及びP4-Rv1プライマー（配列番号24）でPCR増幅した。次に、その増幅産物を鋳型としてCAG-Fw2プライマー（配列番号25）及びP4-Rv2プライマー（配列番号26）でPCR増幅し、GFP-P4断片を取得した。GFP-P4断片をNheI/XhoIで切断後、pCAG-CSTに挿入することにより、GFP-P4融合ペプチドを発現するためのpCAG-GFP-P4プラスミドを作製した。

次に本発明者らによる過去の文献（Oshikawa, M. et al., Adv Healthc Mater. 2017;6(11):10.1002/adhm.201700183, PMID: 28488337）に記載の方法によってGFP-P4融合ペプチド及びGFPタンパク質を発現及び抽出した。具体的には、pCAG-GFP-P4及びpCAG-GFPプラスミドを293T細胞に遺伝子導入した。4日間培養した後、細胞溶解液（0.5％ Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH8.0)）500 μLで細胞を溶解した。この溶解画分を限外濾過カラム（メルク社、amicon ultra 10K）を使用して、0.1×PBS（137 mM NaCl, 2.70 mM KCl, 0.810 mM Na₂HPO₄, 0.147 mM KH₂PO₄ (pH7.4)）溶液に置換して濃縮した。また、対照として使用したGFP-RADA16融合ペプチドは、特願2020-45109に開示される方法によって調製した。

得られたGFP-P4融合ペプチド、GFP-RADA16融合ペプチド、及びGFPタンパク質の濃度はサンドイッチELISA法によって測定した。固相化抗体には抗GFPニワトリ抗体（アブカム社, ab13970）、検出抗体には抗GFPウサギ抗体（アブカム社, ab290）を用いた。

（３）GFP取り込み率の測定
1.5 mLチューブに、2％P4ペプチド溶液又は1％RADA16ペプチド溶液50 μLに対して、モル比が10⁵分の1となるようにH₂Oで希釈したGFP-P4融合ペプチド溶液、GFP-RADA16融合ペプチド溶液、又はGFP溶液を40 μL加え（GFP融合ペプチド又はGFPの「添加量」という）、さらに100 mM HEPES溶液を加えた10×DMEM溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社, 12100061）を10 μL加え、ピペッティング操作でゲル化させた。その後、PBS溶液（137 mM NaCl, 2.70 mM KCl, 8.10 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄ (pH7.4)）500 μLで3回洗浄した。これらの上清中のGFP融合ペプチド又はGFPの濃度をサンドイッチELISA法で測定し、これを非取り込み画分（GFP融合ペプチド又はGFPの「非取り込み量」という）とすることによって、GFP融合ペプチド又はGFPの「取り込み量」を［添加量－非取り込み量］として計算し、取り込み率（％）＝取り込み量／添加量を決定した。

（結果）
GFP-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率、GFPタンパク質のP4ペプチドゲルへの取り込み率、GFP-RADA16融合ペプチドのRADA16ペプチドゲルへの取り込み率、及びGFPタンパク質のRADA16ペプチドゲルへの取り込み率の測定結果を図６Ａに示す。

P4ペプチドを融合していないGFPタンパク質は、P4ペプチドゲルにほとんど取り込まれなかった（図６Ａ、「GFP + P4」）。これに対して、GFP-P4融合ペプチドは、P4ペプチドゲルに90％を超える極めて高い効率で取り込まれた（図６Ａ、「GFP-P4 + P4」）。一方、GFP-RADA16融合ペプチドは、RADA16ペプチドゲルに効率的に取り込まれたが、取り込み効率は70％よりも低かった（図６Ａ、「GFP-RADA16 + RADA16」）。

以上の結果から、GFPにP4ペプチドを融合することによって、P4ペプチドゲルへの取り込み率を大幅に増大させることが示された。また、RADA16ペプチドと比べて、P4ペプチドは取り込み率を大幅に上昇することが示された。

＜実施例６：GFP-P4融合ペプチドのペプチドゲルからの徐放＞
（目的）
GFP-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定し、徐放特性を評価する。

（方法）
放出率の測定は以下の方法で行った。実施例５においてGFP-P4融合ペプチドを取り込ませたP4ペプチドゲル、又はGFP-RADA16融合ペプチドを取り込ませたRADA16ペプチドゲルを、10％FBSを含む200 μLのPBS溶液中で懸濁し、高速振盪機（東京理化器械社、CM-1000）を用いて、37℃、500 rpmの条件で連続撹拌した。0、6、12、24、72、96、及び168時間後の各時点において、サンプルの上清に含まれるGFP融合ペプチド又はGFPの濃度をサンドイッチELISA法で測定して、上清中に放出されたGFP融合ペプチド又はGFPの量（「放出量」という）を決定し、放出率（％）＝放出量／取り込み量を決定した。

（結果）
GFP-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率、及びGFP-RADA16融合ペプチドのRADA16ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を図６Ｂに示す。GFP-RADA16融合ペプチドでは、RADA16ペプチドゲルからの放出が6時間以降でほとんど認められず、168時間後における放出率は5％程度に過ぎなかった（図６Ｂ、「GFP-RADA16 + RADA16」）。これに対して、GFP-P4融合ペプチドはP4ペプチドゲルから放出が長時間持続し、168時間後の放出率は40％近くにまで達した。
この結果から、P4ペプチドは、RADA16ペプチドと比較して、より長時間に亘ってより多くの機能性分子の放出を可能にすることが示された。したがって、P4ペプチドゲルが優れた徐放効果を有することが示された。

＜実施例７：VEGF-P4融合ペプチドのペプチドゲルへの取り込み＞
（目的）
VEGFペプチドとP4ペプチドとを連結してなるVEGF-P4融合ペプチドについて、P4ペプチドゲルへの取り込みの効率を評価する。

（方法）
VEGFペプチドのC末端側にアミノ酸配列RIDARMRADIR(配列番号4)からなるペプチド（P4ペプチド）を融合したVEGF-P4融合ペプチド、及びP4ペプチドを融合していないVEGFペプチドを発現するプラスミドを以下の方法で作製した。

特願2020-45109に記載のpCAG-VEGF-A16Gプラスミドを鋳型として、VEGF及び6xHisTagをコードする配列部分をCAG-Fw1プライマー（配列番号23）及びP4-Rv1プライマー（配列番号24）でPCR増幅した。次に、その増幅産物を鋳型としてCAG-Fw2プライマー（配列番号25）及びP4-Rv2プライマー（配列番号26）でPCR増幅し、VEGF-P4断片を取得した。VEGF-P4断片をNheI/XhoIで切断後、pCAG-CSTに挿入することにより、VEGF-P4融合ペプチドを発現するためのpCAG-VEGF-P4プラスミドを作製した。

次に本発明者らによる過去の文献（Oshikawa, M. et al., Adv Healthc Mater. 2017;6(11):10.1002/adhm.201700183, PMID: 28488337）に記載の方法によってVEGF-P4融合ペプチド及びVEGFペプチドを発現及び抽出した。具体的には、pCAG-VEGF-P4及びpCAG-VEGFプラスミドを293T細胞に遺伝子導入し、これを7日間培養することによって、培養上清を得た。この画分を限外濾過カラム（メルク社、amicon ultra 10K）で、0.1×PBS（137 mM NaCl , 2.70 mM KCl , 0.810 mM Na₂HPO₄, 0.147 mM KH₂PO₄ (pH7.4)）溶液に置換して濃縮した。

得られたVEGF-P4融合ペプチド、及びVEGFペプチドの濃度はサンドイッチELISA法によって測定した。固相化抗体には抗VEGFヤギ抗体（R&D社, AF-493-NA）、検出抗体にはビオチン化抗VEGFヤギ抗体（R&D社, R&D BAF493）を用いた。
ペプチドゲルへの取り込み効率の測定は実施例５と同様の方法で行い、取り込み率（％）を決定した。

（結果）
VEGF-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率、及びVEGFペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み率を測定した結果を図７Ａに示す。
VEGF-P4融合ペプチドは、P4ペプチドを融合していないVEGFペプチドに比べて、P4ペプチドゲルへの高い取り込み率を示した。この結果から、VEGFペプチドへのP4ペプチドの融合により、P4ペプチドゲルへの取り込みが大きく促進されることが示された。

＜実施例８：VEGF-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの徐放＞
（目的）
VEGF-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定し、徐放特性を評価する。（方法）
0、6、12、24、72、96、及び168時間後の各時点において、サンプルの上清に含まれるVEGF-P4融合ペプチド又はVEGFペプチドの濃度をサンドイッチELISA法で測定した。P4ペプチドゲル中に取り込まれていたVEGF-P4融合ペプチド又はVEGFペプチドの量に対する、各時点における放出量の割合（放出率（％））＝放出量／取り込み量を決定した。
（結果）
VEGF-P4融合ペプチド及びVEGFペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を図７Ｂに示す。VEGFペプチドは、P4ペプチドゲルからの放出がほとんど認められなかった（図７Ｂ、「VEGF + P4」）。これに対して、VEGF-P4融合ペプチドはP4ペプチドゲルからの放出が長期間に亘って持続し、168時間後には放出率が約50％に達した。
この結果から、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルに内包させることによって優れた徐放特性が得られることが示された。

＜実施例９：VEGF-P4融合ペプチドを含むP4ペプチドゲルによる、マウス脳梗塞モデルの歩行機能改善効果＞
（目的）
VEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲルをマウス脳梗塞モデルの脳内に埋め込み、歩行傷害に対する治療効果を評価する。

（方法）
ペプチドゲルの作製は1.5mlチューブに、2％P4ペプチド溶液25 μLに対して、モル比が10⁵分の1となるようにH₂Oで希釈したVEGF-P4融合ペプチド又はVEGFペプチドを25 μL加えた。ピペッティングの後CO₂インキュベータで3日間静置してゲルを形成させた。
マウス脳梗塞モデルは、本発明者らが過去に報告した中大脳動脈遠位部梗塞（dMCAO）モデルを用いた（Oshikawa, M. et al., Adv Healthc Mater. 2017;6(11):10.1002/adhm.201700183, PMID: 28488337）。脳梗塞モデル作製後7日目に、本発明者らによる過去の文献（Jinnou, H., et al., Cell Stem Cell., 2018, 22(1), 128-137.e9., PMID: 29276142）に記載の方法に準じて1回目の歩行機能解析を行った（図８Ａ、「歩行機能解析1」）。1回目の歩行機能解析の後、dMCAOモデル作製時に開頭した側頭部の中大脳動脈遠位部からペプチドゲルを投与した（図８Ａ、「注入」）。投与量は1個体あたり2 μLとした。投与後7日目（脳梗塞モデル作製後14日目）に歩行機能解析を行い（図８Ａ、「歩行機能解析2」）、その後に灌流固定を行い、脳切片を作製した。歩行機能の評価は、総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合（踏み外し回数／総歩数（％））を算出して行った。

（結果）
マウス脳梗塞モデルにペプチドゲルを投与した結果を図８Ｂに示す。VEGFペプチドを含まないP4ペプチドゲル単独（「P4単独」）、VEGF-P4融合ペプチド単独（「VEGF-P4単独」）、及びP4ペプチドを融合していないVEGFペプチドを内包するP4ペプチドゲル（「VEGF + P4単独」）を投与した場合には、歩行機能の改善が認められなかった。これに対して、VEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲル（「VEGF-P4 + P4単独」）を投与した場合において、総歩数のうち足を滑らせた歩数の割合が低下し、歩行機能に対する改善効果が認められた。

したがって、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルに内包させて投与することによって、脳梗塞で生じる歩行機能障害の回復を促進することが示された。この結果と以降の実施例の結果から、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルから徐放させることによって、VEGF機能を長期間に亘って供給することが可能となり、血管新生（実施例１１）、神経変性抑制（実施例１２）、及び神経細胞数の減少抑制（実施例１３）が持続的に促進され、脳機能が脳梗塞から速やかに回復することが示された。

＜実施例１０：損傷中心部とペナンブラ領域の体積への影響＞
（目的）
実施例９の各条件において、損傷中心部とペナンブラ領域の体積の差の有無を検討する。
（方法）
実施例９においてペプチドゲルを投与した中大脳動脈遠位部の脳切片を作製した。この切片に対して、DyLight 488標識トマトレクチン（LEL）（ベクター社, DL-1174）染色による活性化ミクログリア可視化、ニューロンマーカー抗NeuN抗体（ミリポア社, MAB377）による染色、DAPI（シグマ社, D9542）による核染色を同時に行った。活性化ミクログリアを示すLEL陽性領域を損傷中心部（core）、LEL陰性かつNeuN弱陽性領域をペナンブラ（penumbra）領域とした。損傷中心部及びペナンブラ領域の各々の体積を、ステレオロジー（マイクロブライトフィールドジャパン社, stereoinvestigator）を用いて測定した。
（結果）
VEGFペプチドを含まないP4ペプチドゲル単独、VEGF-P4融合ペプチド単独、P4ペプチドを融合していないVEGFペプチド、及びVEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲルを投与したいずれの場合においても、損傷中心部とペナンブラ領域の体積に有意な変化は認められなかった（図９）。この結果に基づいて、以下の実施例１１～１３では各細胞種の細胞数の変化について検討した。

＜実施例１１：血管新生促進効果＞
（目的）
実施例９の各条件において、血管新生促進効果の有無を検討する。
（方法）
実施例９の各条件下において、ペプチドゲルの投与後に、EdUを8時間おきに1週間投与し、灌流固定後に脳切片を作製した。EdUの投与は、本発明者らによる過去の文献（Oshikawa, M., et al., Development, 2017, 144(18), 3303-3314.）に記載の方法に準じて行った。血管内皮細胞のマーカーであるラミニンの陽性細胞を抗ラミニン抗体（アブカム社, ab11575）で可視化し、EdUはAlexa 647 Azide（Invitrogen社, A10277）を用いたクリック反応によって可視化した。ペナンブラ領域におけるラミニン陽性細胞数、及びEdU／ラミニン共陽性細胞数をステレオロジーによって測定した。
（結果）
VEGFペプチドを含まないP4ペプチドゲル単独、VEGF-P4融合ペプチド単独、及びP4ペプチドを融合していないVEGFペプチドを投与した場合と比較して、VEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲルを投与した場合では、ラミニン陽性細胞数、及びEdU／ラミニン共陽性細胞数の有意な増加が認められた（図１０）。
この結果から、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルから徐放させることによって、VEGF機能の長期に亘る持続的な供給が可能となり、脳梗塞後のペナンブラ領域において血管新生が促進されることが示された。

＜実施例１２：神経変性抑制効果＞
（目的）
実施例９の各条件において、神経変性抑制効果の有無を検討する。
（方法）
変性ニューロンに特異的に結合する蛍光色素を含むFluoro-Jade C（FJC）（バイオセンシズ社, TR-100-FJT）、及びDAPIを用いて組織染色を行った後、ペナンブラ領域におけるFJC陽性細胞数をステレオロジーにて測定した。
（結果）
VEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲルを投与した場合では、FJC陽性細胞の数の減少が認められた（図１１）。この結果から、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルから徐放させることによって、脳梗塞後のペナンブラ領域における神経変性が抑制されることが示された。

＜実施例１３：神経細胞数の減少抑制効果＞
（目的）
実施例９の各条件において、神経細胞数の減少抑制効果の有無を検討する。
（方法）
ニューロンマーカーの抗NeuN抗体で免疫組織染色を行い、DAPI（シグマ社, D9542）で核染色を行った。ペナンブラ領域におけるNeuN陽性細胞の数をステレオロジーにて測定した。
（結果）
VEGF-P4融合ペプチドを内包するP4ペプチドゲルを投与した場合において、NeuN陽性細胞の数の有意な増加が認められた（図１２）。この結果から、VEGF-P4融合ペプチドをP4ペプチドゲルから徐放させることによって、脳梗塞後のペナンブラ領域における神経細胞数の減少が抑制されることが示された。

＜実施例１４：K(FAM)-G-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの徐放＞
（目的）
フルオレセイン（FAM）と自己組織化ペプチドとを連結してなるFAM-P4融合ペプチドについて、P4ペプチドゲルからの放出率を測定する。
（方法）
（１）FAM-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルへの取り込み
アミノ酸配列RIDARMRADIR(配列番号4)からなるペプチド（P4ペプチド、図１３Ａ）とフルオレセインとを連結したK(FAM)-G-P4融合ペプチドを合成した（図１３Ｂ）。具体的には、5(6)-CarboxyfluoresceinとKG-P4-resinを固相合成反応で結合させ、TFAを用いたレジンからの切り出しによってK(FAM)-G-P4融合ペプチドを合成した。1.0重量％濃度P4ペプチド溶液に対して、モル比で1/100,000量のK(FAM)-G-P4融合ペプチド、及びDMEM+HEPES溶液を加えて100 μLに調整し、混合した。5,000 rpmで5分間遠心後、上清を可能な限り採取し、1.5 mLチューブに回収し-20℃で保存した。
（２）放出率の測定
K(FAM)-G-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率の測定は、実施例６の方法に準じて行った。放出されたK(FAM)-G-P4融合ペプチドの濃度は、UV吸収スペクトルを測定し、495 nmにおける吸光度に基づいて決定した。P4ペプチドゲル中に取り込まれていた当初のK(FAM)-G-P4融合ペプチドの量に対する、0、1、4、24、及び72時間の各時点における放出量の割合（放出率（％））を決定した。
（結果）
K(FAM)-G-P4融合ペプチドのP4ペプチドゲルからの放出率を測定した結果を図１４に示す。K(FAM)-G-P4融合ペプチドの46.1％が72時間かけて放出されることが明らかになった。この結果から、低分子をP4ペプチドに融合した場合においても、P4ペプチドゲルから長期間に亘って放出が持続することが示された。

＜実施例１５：さらなる自己組織化ペプチドの作製と流動性試験＞
（目的）
生理的条件下でゲル化する、さらなる自己組織化ペプチドを開発する。
（方法と結果）
実施例１の（１）～（３）と同様の方法により、さらなる5種類のペプチド：RIRGDMRADIR（配列番号41）、RIRADMRGDIR（配列番号42）、RIRGDIRGDIR（配列番号43）、RIRGDIRADIR（配列番号44）、及びRIRADIRGDIR（配列番号45）を合成し、ゲル化及び流動性試験を行った。
図１５に各ペプチドサンプルに対する流動性試験の結果を示す。RIRGDMRADIR（配列番号41）、RIRADMRGDIR（配列番号42）、RIRGDIRGDIR（配列番号43）、RIRGDIRADIR（配列番号44）、及びRIRADIRGDIR（配列番号45）はいずれもミクロチューブ管の上下反転後に、その全部がミクロチューブ管の底面側に留まり、流動性を失ってゲル化していることが示された（図１５）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (27)

1. RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、及びRIRGDMRGDIR（配列番号8）からなる群から選択される、ヒドロゲル化する自己組織化ペプチド。
2. 請求項１に記載の自己組織化ペプチドのN末端側及び／又はC末端側に機能性ペプチドを連結してなる融合ペプチドであって、
   機能性ペプチドは、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、及び代謝機能からなる群から選択される機能を有する、前記融合ペプチド。
3. 請求項１に記載の自己組織化ペプチドのN末端側及び／又はC末端側に機能性ペプチドを連結してなる融合ペプチドであって、
   機能性ペプチドは、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、及びマーカータンパク質からなる群から選択される、前記融合ペプチド。
4. 機能性ペプチドが、ラミニン、VEGF、又はN-カドヘリンである、請求項２又は３に記載の融合ペプチド。
5. 請求項１に記載の自己組織化ペプチド、又は請求項２～４のいずれか一項に記載の融合ペプチドからなるゲル化剤。
6. 請求項５に記載のゲル化剤を有効成分として含む、ゲル化組成物。
7. ゲル化剤を２種以上含む、請求項６に記載のゲル化組成物。
8. ゲル化した、請求項１に記載の自己組織化ペプチド、又は請求項２～４のいずれか一項に記載の融合ペプチドを含む、人工細胞外マトリックス。
9. ゾル状態にある、請求項５に記載のゲル化剤、又は請求項６若しくは７に記載のゲル化組成物を水中又は水溶液中でそのゲル化温度以下の温度で維持することにより前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物をゲル化する、ゲル化方法。
10. 前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物を水中又は水溶液中で維持する前記温度が4～60℃の範囲内である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物が、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. ゲル状態時の前記ゲル化剤又は前記ゲル化組成物がpH 6.0～8.0である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ゲル化剤及び／又は前記ゲル化組成物の濃度が0.4重量％～10重量％である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 徐放性ゲル調製用組成物であって、
    第１の自己組織化ペプチドからなるゲル化剤、及び第２の自己組織化ペプチドのN末端側及び／又はC末端側に機能性部分を連結してなる機能性分子を含み、
    前記第１及び第２の自己組織化ペプチドは、独立して、RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、及びRIRGDMRGDIR（配列番号8）からなる群から選択され、
    前記機能性部分は機能性ペプチド及び／又は低分子化合物であり、
    機能性ペプチドは、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、及び代謝機能からなる群から選択される機能を有し、かつ／又は細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、及びマーカータンパク質からなる群から選択される、前記徐放性ゲル調製用組成物。
15. ゲル化剤を２種以上含む、請求項１４に記載の徐放性ゲル調製用組成物。
16. 機能性ペプチドが血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、及び肝細胞増殖因子（HGF）からなる群から選択される、請求項１４に記載の徐放性ゲル調製用組成物。
17. 請求項１４に記載の徐放性ゲル調製用組成物を含む、徐放性ゲル。
18. 請求項１７に記載の徐放性ゲルを含む、医薬組成物。
19. 移植用である、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 血管新生促進及び／又は神経変性抑制のための、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
21. 神経組織損傷及び／又は虚血の治療及び／又は予防に用いるための、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
22. 前記神経組織損傷が脳梗塞である、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 徐放性ゲルの作製方法であって、
    請求項１４～１６のいずれか一項に記載の徐放性ゲル調製用組成物を水又は水溶液と混合する工程、及び
    前記混合工程後に得られる混合物をゲル化温度以下の温度に維持することによりゲル化させる工程
    を含む方法。
24. 前記混合工程で、炭酸水素イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択されるいずれか１種以上の陰イオンをさらに混合する、請求項２３に記載の方法。
25. ゲル状態時の前記徐放性ゲルがpH 6.0～8.0である、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 前記徐放性ゲル中のゲル化剤の濃度が0.4重量％～10重量％である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 自己組織化ペプチドのN末端側及び／又はC末端側に機能性部分を連結してなる機能性分子であって、
    前記自己組織化ペプチドは、RIRARMDADIR（配列番号1）、RIRADMRADIR（配列番号2）、RIDARMRADIR（配列番号4）、RIDARMDARIR（配列番号5）、RIDADMRARIR（配列番号6）、及びRIRGDMRGDIR（配列番号8）からなる群から選択され、
    前記機能性部分は機能性ペプチド及び／又は低分子化合物であり、
    機能性ペプチドは、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、連結機能、標識機能、及び代謝機能からなる群から選択される機能を有し、かつ／又は細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、及びマーカータンパク質からなる群から選択される、前記機能性分子。