JP7778377B2 - 小胞及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、生物医薬分野に属し、小胞及びその使用に関する。

細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）は、細胞から分泌される、タンパク質、核酸及び様々なサイトカインを含むナノスケール担体である。細胞外小胞は、内分泌又は傍分泌の方式により標的細胞に作用することがで、細胞間の物質輸送及び情報交換の過程において重要な役割を果たしている。研究により、細胞外小胞によって媒介される情報交換は、生体の生理的又は病理的過程において重要な調節的役割を果たしており、免疫調節、腫瘍増殖、血管形成、損傷修復などに関与することが見出された。現在、当該分野の研究は、主にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）に焦点を当てている。エクソソームは、直径が約３０－１５０ｎｍの細胞外小胞であり、その内部にＲＮＡ、脂質及びタンパク質などの成分が含まれる。エクソソームは、生体の様々な生理的／病理的調節に広く関与しており、多くの疾患の診断、治療及び予後評価に使用することができる。今まで、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、エクソソームの産生能力が最も高い細胞であると考えられている。大量の研究により、ＭＳＣ由来のエクソソームは、ＭＳＣの生物学的機能を模倣することができ、細胞の成長と分化の促進、組織欠陥の修復などにおいて重要な調節的役割を果たしていることが見出された。そのため、近年、ＭＳＣ由来のエクソソームによる細胞小胞療法は、顕著な発展を遂げた。しかし、現在、エクソソームによる細胞小胞療法には依然として多くの問題（主にエクソソームの抽出及び精製の過程が複雑で、かかる時間が長く、設備及び試薬に対する要求が高く、生理的エクソソームの産生量が比較的低いなど）がある。これらの欠陥のため、エクソソーム療法の臨床へのトランスレーション及び応用が制限されている。

血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）は、遺伝性血液凝固障害に起因する一群の出血性疾患であり、それらの共通の特徴は、活性トロンボプラスチンの産生障害、凝固時間の延長、生涯に軽度の外傷でも出血する傾向にあること、重症患者では顕著な外傷がなくても「特発性」出血が発生することである。２０１８年５月１１日に、国家衛生健康委員会などの５部門は、血友病を収載した「１回目希少疾患リスト」を共同で作成した。血友病は、主に血友病Ａ、血友病Ｂ及び血友病Ｃの３種類に分けられる。血友病Ａ、即ち、第ＶＩＩＩ因子血液凝固促進成分（ＶＩＩＩ：Ｃ）欠乏症は、伴性劣性遺伝疾患に属し、女性で伝え、男性で発症する疾患である。血友病Ｂ、即ち、因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠乏症も伴性劣性遺伝疾患であり、その発症数が血友病Ａよりも少ない。血友病Ｃ、即ち、因子ＸＩ（ＦＸＩ）欠乏症は、常染色体不完全劣性遺伝疾患であり、稀な血友病である。発症率では、血友病Ａは８０％－８５％と最も高く、血友病Ｂは１５％－２０％を占め、血友病Ｃは稀である。長い間、血友病の治療では、臨床的に外因系血液凝固因子の注射が主な介入として使用されている。しかし、この方法は、治療コストが高く、治療効果の持続期間が短く、自己抗体が産生されやすいなどの様々な問題があることから、適切で有効な治療手段にはならない。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、間葉系幹細胞に由来する小胞が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、小胞組成物が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、血友病に対する小胞含有医薬組成物が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、小胞のスクリーニング、同定又は抽出キットが提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、小胞のマーカーが提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、マーカーにより小胞を同定又はスクリーニングする方法が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、小胞の調製方法が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、体細胞又は幹細胞に由来する小胞が提供される。前記小胞は誘導性小胞であり、前記小胞が有するマーカーはシンタキシン４を含む。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、被験体の疾患又は前記疾患の合併症を治療、予防又は改善する方法が提供される。前記方法は、前記被験体に有効量の前記小胞、前記小胞組成物又は前記組成物を投与することを含む。前記疾患は出血性疾患である。いくつかの実施形態において、前記出血性疾患は、血液凝固因子の欠乏、血小板数の減少及び／又は機能障害に起因する出血を含む。いくつかの実施形態において、前記出血性疾患は、血友病、狼瘡性出血又はチェディアック・東症候群（Ｃｈｅｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む。いくつかの実施形態において、前記血友病は、血友病Ａ、血友病Ｂ又は血友病Ｃを含む。いくつかの実施形態において、前記疾患は、血友病Ａである。

いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、全能性幹細胞及び多能性幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＩＰＳ）を含む。

いくつかの実施形態において、前記体細胞は、骨芽細胞系を含む。

いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代培養細胞であってもよく、既存の又は或樹立された細胞系であってもよい。

いくつかの実施形態において、前記細胞系とは、適切な新鮮培地及び空間下で無限増殖可能な不死化細胞培養物を指す。

いくつかの実施形態において、前記細胞は樹立細胞株であってもよい。

いくつかの実施形態において、前記誘導性小胞は、外力によって正常な生存期間にある前記幹細胞又は体細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される小胞である。

いくつかの実施形態において、前記誘導性小胞は、スタウロスポラ（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒａ）の添加、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせにより幹細胞又は幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される。

いくつかの実施形態において、前記小胞が有するマーカーは、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５のうちの１種又は複数種をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記小胞は、マーカーであるシンタキシン４、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１及びインテグリンα５の組み合わせものを有する。

いくつかの実施形態において、前記小胞は、マーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４を高発現する。

いくつかの実施形態において、前記小胞は、マーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４に対する発現量がＭＳＣ又はエクソソームよりも高い。

いくつかの実施形態において、前記小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ約１－２倍、２－３倍、１－３倍、３－４倍及び３－６倍である。

いくつかの実施形態において、前記小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ約１．５－２倍、２．５－３倍、１．５－２．５倍、３．５－４倍及び３．５－５倍である。

いくつかの実施形態において、前記小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ約１．５－１．９倍、２．５－２．９倍、１．８－２．５倍、３．５－３．９倍及び４－５倍である。

いくつかの実施形態において、前記小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ約１．７６倍、２．８１倍、２．４１倍、３．６８倍及び４．４５倍である。

いくつかの実施形態において、前記エクソソームは、シンタキシン４を発現しないのに対し、本発明の小胞は、シンタキシン４を発現する。

いくつかの実施形態において、前記エクソソームは、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４を同時に発現しないのに対し、本発明の小胞は、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４を同時に発現する。

いくつかの実施形態において、前記小胞及び前記エクソソームは、同種由来のＭＳＣに由来する。

いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーによりＩＥＶの表面膜タンパク質を分析した結果、ＭＳＣに由来するＩＥＶは、ＭＳＣと類似する表面タンパク質であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３４、ＣＤ４５陰性を発現することができるとともに、ＩＥＶは、細胞外小胞の普遍性表面タンパク質であるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣ１ｑを発現することができる。

いくつかの実施形態において、前記誘導性小胞は、スタウロスポリンの添加、紫外線照射、飢餓法、熱応力法又はそれらの組み合わせにより間葉系幹細胞のアポトーシを誘導することにより産生される。

いくつかの実施形態において、前記小胞は、スタウロスポリンで間葉系幹細胞を誘導することにより産生される。

いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞の世代数は、２～５代目であってもよいが、これに限定されない。

いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約１ｎＭ－１００００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約１００ｎＭ－１００００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００ｎＭ－１００００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－１０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－９００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－８００ｎＭである。

いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．０３－６μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．０３－４．５μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．０３－１μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．０４－１μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．０５－１μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．１－１μＭである。いくつかの実施形態において、前記小胞の直径は約０．１５－１μＭである。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記小胞を含む小胞組成物がさらに提供される。

いくつかの実施形態において、前記小胞組成物は、他の従来技術に記載の小胞をさらに含み、例えば、エクソソーム、移動体、微小胞及びエクトソーム（Ｅｃｔｏｓｏｍｅ）を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、前記小胞の数は、前記小胞組成物に占める割合が約６５－１００％である。

いくつかの実施形態において、前記小胞の数は、前記小胞組成物に占める割合が約７５－９８％である。

いくつかの実施形態において、前記小胞の数は、前記小胞組成物に占める割合が約８０－９６％である。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記小胞又は前記小胞組成物を含む組成物がさらに提供される。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、医薬品、食品、保健機能製品、化粧品、添加剤又は中間品を含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、医薬品である。

いくつかの実施形態において、前記組成物は、薬学的又は免疫学的に許容される担体をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記組成物の剤形は、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル、キット又は貼付剤から選択される。

いくつかの実施形態において、前記小胞は、薬物担体として使用される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、マーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４の検出試薬のうちの１種又は複数種を含む前記小胞をスクリーニング、同定若しくは抽出するための試薬又はキットがさらに提供される。

いくつかの実施形態において、前記マーカーの検出試薬は、前記マーカーの遺伝子の発現量を検出するものである。

いくつかの実施形態において、前記マーカーの検出試薬は、前記マーカーのｍＲＮＡの発現量を検出するものである。

いくつかの実施形態において、前記マーカーの検出試薬は、前記マーカーのタンパク質の発現量を検出するものである。

いくつかの実施形態において、前記マーカーの検出試薬は、蛍光定量ＰＣＲ染料、蛍光定量ＰＣＲプライマー、蛍光定量ＰＣＲプローブ、抗体、抗体機能性断片及び複合抗体のうちの１種又は複数種である。

いくつかの実施形態において、前記キットは、ｑＰＣＲキット、ウェスタンブロッティング検出キット、フローサイトメトリー解析キット、免疫組織化学検出キット及びＥＬＩＳＡキットから選択される１種又は複数種である。

いくつかの実施形態において、前記キットは、フローサイトメトリー解析キットから選択される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、疾患若しくは前記疾患の合併症を治療、予防又は改善するための製品の調製における前記小胞、前記小胞組成物又は前記医薬組成物の使用がさらに提供される。前記疾患は、肝疾患、血友病を含む。

いくつかの実施形態において、前記疾患は、血友病である。前記小胞は、インビトロで顕著な血液凝固促進作用を発揮することができ、体内注射後に血友病マウスの出血傾向を顕著に改善することができるため、血友病の出血傾向の治療に適用され、応用の見通しが良い。

いくつかの実施形態において、前記疾患は、血友病Ａである。

いくつかの実施形態において、前記製品は、医薬品、食品、保健機能製品、化粧品、添加剤又は中間品を含む。

前記小胞を疾患の治療に使用する際に、前記小胞を、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、髄腔内注射又は注入、及び臓器内注入からなる群より選択される経路により投与することができる。例えば、静脈注射の場合、尾静脈より注射することができる。臓器内注入は、解剖学的空間、例えば、胆嚢、胃腸腔、食道、肺系（吸入による）及び／又は膀胱への注入を含む。

例として、胃腸腔注入である腹腔内注射は、尾静脈注射に比べ、同等の治療効果を得ることができる。腹腔内注射の安全性及び操作性は、尾静脈注射よりも優れている。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記小胞をスクリーニング又は同定する方法がさらに提供される。前記方法は、マーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４のうちの１種又は複数種を検出することを含む。

検出した結果、前記マーカーが陽性結果である場合、前記小胞であると判定される。

いくつかの実施形態において、前記マーカーの発現結果を対照と比較し、発現量が対照よりも顕著に高い場合、陽性結果として判定することができる。前記対照は、従来の他の小胞又はエクソソーム（エクソソーム、移動体、微小胞及びエクトソームのうちの１種又は複数種を含んでもよい）であってもよく、間葉系幹細胞に由来する他の小胞又はエクソソームであってもよい。

前記マーカーのうち、マーカーであるシンタキシンが好ましい。いくつかの実施形態において、検出される小胞のシンタキシン４の発現量がエクソソーム（例えば、同種細胞に由来するエクソソーム）の２－６倍（より好ましくは４－５倍）以上である場合、前記小胞（例えば、誘導性小胞）であると判定される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記小胞検出若しくは同定する試薬又はキットの調製における前記マーカーの検出試薬の使用であって、前記マーカーは、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４のうちの１種又は複数種を含み、前記試薬又はキットは、対照試薬をさらに含み、前記対照試薬は、エクソソーム、移動体、微小胞及びエクトソームのうちの１種又は複数種を含み、前記被検サンプル中の前記マーカーの発現量が対照試薬よりも高い場合、陽性であると判定されることを特徴とする使用が提供される。

いくつかの実施形態において、前記対照試薬は、エクソソームである。

いくつかの実施形態において、前記被検サンプル中のシンタキシン４の発現量がエクソソームの２－６倍以上である場合、前記小胞であると判定される。

いくつかの実施形態において、前記被検サンプル中のシンタキシン４の発現量がエクソソームの４－５倍以上である場合、前記小胞（例えば、誘導性小胞）であると判定される。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記小胞の調製方法が提供される。前記方法は、アポトーシス誘導剤を添加することにより幹細胞又は体細胞が前記小胞を産生するように誘導することである。

いくつかの実施形態において、前記方法は、間葉系幹細胞を培養するステップ（１）と、間葉系幹細胞の培養上清を収集するステップ（２）と、ステップ（２）の培養上清から小胞を分離するステップ（３）とを含む。

いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を培養するステップ（１）は、組織から間葉系幹細胞を分離するステップ（４）と、培地を添加して間葉系幹細胞を培養し、培地中の前記間葉系幹細胞をアポトーシス誘導剤と接触させるステップ（５）と、を含む。

いくつかの実施形態において、前記アポトーシス誘導剤は、スタウロスポリン、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、前記アポトーシス誘導剤は、スタウロスポリンである。

いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－１０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－９００ｎＭである。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は約５００－８００ｎＭである。

いくつかの実施形態において、ステップ（５）におけるアポトーシス誘導剤で細胞を処理する時間は、約１６－２４時間である。

いくつかの実施形態において、前記ステップ（３）において、小胞の分離方法は、超遠心分離法により前記小胞を分離するステップを含む。

いくつかの実施形態において、本発明では、単一のＭＳＣは、３００－２０００個の小胞を産生することができる。

いくつかの実施形態において、前記超遠心分離法により前記小胞を分離するステップは、収集された培養上清を１回目遠心分離し、上清を収集するステップ（ａ）と、ステップ（ａ）で収集された上清を２回目遠心分離し、上清を収集するステップ（ｂ）と、ステップ（ｂ）で収集された上清を３回目遠心分離し、沈殿を収集するステップ（ｃ）と、ステップ（ｃ）で収集された沈殿を４回目遠心分離し、沈殿を収集するステップ（ｄ）と、ステップ（ｄ）で収集された沈殿を５回目遠心分離し、沈殿を収集するステップ（ｅ）と、を含む。

いくつかの実施形態において、前記１回目遠心分離では、約５００－１５００ｇで５－３０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記１回目遠心分離では、約５００－１０００ｇで５－２０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記１回目遠心分離では、約５００－９００ｇで５－１５分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記２回目遠心分離では、約１０００－３０００ｇで５－３０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記２回目遠心分離では、約１５００－２５００ｇで５－２０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記２回目遠心分離では、約１５００－２２００ｇで５－１５分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記３回目遠心分離では、約１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記３回目遠心分離では、約１２０００－２５０００ｇで２０－６０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記３回目遠心分離では、約１２０００－２００００ｇで２０－４０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記４回目遠心分離では、約１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記４回目遠心分離では、約１２０００－２５０００ｇで２０－６０分間遠心分離する。いくつかの実施形態において、前記４回目遠心分離では、約１２０００－２００００ｇで２０－４０分間遠心分離する。

いくつかの実施形態において、特定のマーカーを有する小胞は、特定のマーカーに対する濃縮方法により濃縮することにより得られる。十分な小胞を得た後、培地を収集し、培地から特定の小胞を精製及び分離する。これは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法により実現することができる。このような方法は、例えば、分画超遠心分離によりエクソソームを分離する原始的な方法；及びポリマー沈殿（ＳＢＩ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡからのＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ）、免疫アフィニティー捕捉（Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、免疫磁気捕捉（Ｅｘｏ－ＦＬＯＷＴＭ，ＳＢＩ）などの新しい方法を含む。

免疫アフィニティー精製は、表面マーカーに基づいて特定の小胞を選択的に捕捉する方法である。ストレプトアビジンが共有結合で被覆された磁気ビーズと、ビオチン化された捕捉抗体との間の高親和性の結合により小胞の効率的な捕捉が実現される。捕捉された小胞は、溶出された後、構造が完成で、生物活性を有する。本発明の見出しに基づいて、前記小胞は、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４分子を特異的に高発現することができる。そのため、本発明は、この方法により小胞を分離、精製又は濃縮することができる。

いくつかの実施形態において、免疫磁気ビーズ法により前記小胞を濃縮することもできる。前記免疫磁気ビーズは、モノクローナル抗体と磁気ビーズとを結合することにより得られる。前記モノクローナル抗体は、抗シンタキシン４抗体、抗アネキシンＶ抗体、抗フロチリン－１抗体、抗カドヘリン１１抗体、抗インテグリンα５抗体のうちの１種又は複数種を含む。

いくつかの実施形態において、本発明によれば、誘導性小胞がさらに提供される。この誘導性小胞は、ＩＰＳ細胞に由来するものであって、ＩＰＳ細胞が正常な生存状態にあるときに介入又は誘導することによりＩＰＳ細胞をアポトーシスさせることで産生される亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）産物である。

本明細書において、「濃縮」という用語を使用するときに、１つ又は複数の小胞がサンプルに存在する任意の他の小胞からの分離、又はそれが生体の組織に存在することを発見する場合に比べ、小胞を含む組成物において前記小胞がより高い総百分率の含有量で存在することを含む。

一実施形態において、濃縮された小胞をサンプルから分離せず、小胞がサンプルに存在したまま小胞に対していずれかの診断を行う。前記サンプルをスライドガラスに乗せて顕微鏡を用いて診断することができ、この実施形態において小胞は検出されるが、分離されない。

別の実施形態において、濃縮された小胞をサンプルから分離する。

免疫磁気ビーズ分離技術（Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ－ｂａｓｅｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ＩＭＳ）は、近年発展してきた新しい免疫学的技術である。免疫磁気ビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ，ＩＭＢ）は、活性タンパク質抗体に結合可能であるとともに、磁石に吸着することもできる。処理した後、抗体は磁気ビーズに結合され、磁気ビーズは抗体の担体となる。磁気ビーズ上では、抗体が特異的抗原物質に結合されると、抗原－抗体－磁気ビーズ免疫複合体が形成される。このような複合体は、磁力の作用下で力学的移動することによって、複合体が他の物質から分離され、特異的抗原を分離する目的が達成される。免疫磁気ビーズ（ＩＭＢ）は、プラットフォームであり、抗原抗体結合原理を使用して作業する分野であれば、使用することができ、医学及び生物学の骨髄移植、或は幹細胞、オルガネラ、がん細胞、ホルモン、病原菌及び毒素の分離などには目覚ましい成果を上げた。近年、ＩＭＢは、その高感度及び特異性により食品、水、生物サンプル、環境などのサンプルにおける真菌毒素の分離及び検出作業に幅広く使用されており、良好な開発及び応用の見通しを示している。

本発明に記載の免疫磁気ビーズ方法では、特異的抗体が結合された磁気ビーズを用いて特異的表面抗原を有する標的小胞に結合させ、さらに磁界により吸着し、標的小胞を抽出する。

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記小胞の具体的な濃縮方法は以下のとおりである。即ち、抗シンタキシン４抗体、抗アネキシンＶ抗体、抗フロチリン－１抗体、抗カドヘリン１１抗体、抗インテグリンα５抗体のうちの１種又は複数種の抗体で被覆された免疫磁気ビーズを、小胞を含む細胞培養上清に加え、これによって、抗シンタキシン４抗体、抗アネキシンＶ抗体、抗フロチリン－１抗体、抗カドヘリン１１抗体、抗インテグリンα５のうちの１種又は複数種抗体に特異的結合可能な小胞が分離され、特定の小胞を濃縮する目的を達成することができる。いくつかの好ましい実施形態において、抗シンタキシン４抗体、抗アネキシンＶ抗体、抗フロチリン－１抗体、抗カドヘリン１１抗体及び抗インテグリンα５抗体で同時に被覆された免疫磁気ビーズを用いて分離された小胞は、純度が最も高く、血友病Ａのような疾患の治療効果が最も高い。

いくつかの好ましい実施形態において、遠心分離方法に基づいて組合せ最適化を行い、細胞及び細胞破片などの不純物を除去して細胞培養上清が得られ、そして抗シンタキシン４抗体、抗アネキシンＶ抗体、抗フロチリン－１抗体、抗カドヘリン１１抗体、抗インテグリンα５抗体のうちの１種又は複数種の抗体で被覆された免疫磁気ビーズを前記細胞培養上清に加え、これによって、前記抗体に特異的に結合可能な小胞が分離され、特定の小胞を濃縮する目的が達成される。

いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞は、ヒト又はマウスに由来するが、これに限定されない。

いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来幹細胞又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞及び口腔由来間葉系幹細胞から選択される。

図１Ａから図１Ｅは、分離されたＢＭＭＳＣの表面マーカーのフローサイトメトリーによる検出結果である。 実施例２の操作フローチャートである。 フローサイトメトリー技術により分析されたＭＳＣ（１０^６個のＭＳＣ）が産生したＩＥＶ数の統計結果である。 図４Ａから図４Ｆは、ＩＥＶ粒子の直径検出を示す。図４Ａは、フローサイトメトリーにより検出されたＩＥＶの粒径分布図である。図４Ｂは、側方散乱光（ＳＳＣ）によるＩＥＶの散乱光強度の分析であり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｃは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の標準化小粒子ミクロスフェアを用いるＩＥＶの散乱光強度の分析であり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｄは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察されたＩＥＶであり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｅは、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）であり、ＩＥＶ粒径分布を示す。図４Ｆは、ナノフローサイトメトリー検出技術によるＩＥＶに対する単一小胞レベルの粒径検出であり、ＩＥＶの粒径分布である。 図５Ａから図５Ｋは、フローサイトメトリーによりＩＥＶの表面膜タンパク質を分析した結果である。 図６Ａから図６Ｄは、ＩＥＶの内容物分析である。図６Ａは、ＤＩＡ定量化技術によるＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム、ＭＳＣ－ＩＥＶの定量プロテオミクス分析結果である。図６Ｂは、ＩＥＶが特異的に高発現するタンパク質をスクリーニングして作成したヒートマップである。図６Ｃは、示差的タンパク質のＧＯ濃縮分析によりＩＥＶ発現アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４分子を分析した結果である。図６Ｄは、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔによりＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム、ＭＳＣ－ＩＥＶ発現アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４を検証した結果である。 血友病ＡマウスのインビボでのＩＥＶの血液凝固促進作用を示す。 図８Ａから図８Ｄは、血友病ＡマウスにＩＥＶを注射した後の各血液凝固因子のレベルの変化状況を示す。図８Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の変化状況を示す。図８Ｂは、ｖＷＦ因子の変化状況を示す。図８Ｃは、組織因子（ＴＦ）の変化状況を示す。図８Ｄは、プロトロンビンの変化状況を示す。 図９Ａから図９Ｂは、血友病ＡマウスモデルにおいてＩＥＶに対してＰＳ及びＴＦの遮断を行った後のＩＥＶのインビボ治療効果に対する影響状況を示す。図９Ｃは、ｌｐｒマウスに対してＩＥＶ注射治療を行った後、ｌｐｒマウスの出血傾向を顕著に改善できることを示す。図９Ｄは、ＣＨＳマウスに対してＩＥＶ注射治療を行った後、ＣＨＳマウスの出血傾向を顕著に改善できることを示す。 同種ＭＳＣに由来するＩＥＶ及びエクソソームの血友病Ａマウスに対する治療効果の比較を示す。ここで、ＷＴは野生型マウスであり、ＨＡ群は血友病Ａマウスモデルであり、ＨＡ＋ＩＥＶは血友病ＡマウスモデルにＩＥＶ治療を施すことを示し、ＨＡ＋ＰＳ－ＩＥＶは血友病ＡマウスモデルにＰＳ陰性ＩＥＶを投与することを示し、ＨＡ＋ＴＦ－ＩＥＶは血友病ＡマウスモデルにＴＦ陰性ＩＥＶを投与することを示し、ＨＡ＋エクソソームは血友病Ａマウスモデルにエクソソーム治療を施すことを示す。 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ｈＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶの光学顕微鏡下での形態図である。 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ｈＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶ粒子の直径分布のフローサイトメトリーの検出結果である。 図１３Ａから図１３Ｃは、ＩＥＶが皮膚及び毛髪を経由して排出され得ることを示す。図１３Ａは、皮膚表面でのＩＥＶの動的代謝の模式図である。図１３Ｂは、ＩＥＶが経時的に皮下組織から真皮層及び表皮へ徐々に移動することを示す。図１３Ｃは、７日目にマウスの体表から抜いた毛髪の毛嚢にＰＫＨ２６－ＩＥＶが存在することを発見したことを示す。 ハイコンテント分析（ＨＣＡ：ＨｉｇｈＣｏｎｔｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）システムで撮影されたｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの死亡過程の図である。 アポトーシスを誘導するｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣをフローサイトメトリーによりアポトーシス率を分析した結果を示し、ほとんどの細胞がアポトーシスしたことが証明されている。 フローサイトメトリーによりアネキシン５発現の陽性率を分析した結果、ｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣはともに発現率が８０％以上であることを示す。 ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により検出された２種類のＩＥＶの粒径を示す。 ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により検出された２種類のＩＥＶのＩＥＶ産生数を示す。 ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により検出された２種類のＩＥＶの電位を示す。

以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段をさらに説明する。具体的な実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。本発明の思想に基づいて当業者が行った非本質的な修正及び調整は、依然として本発明の保護範囲に含まれる。

本発明の実施例において、ＩＥＶは誘導性小胞の略称であり、誘導性小胞又は誘導性細胞外小胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＩＥＶ）と呼ばれてもよい。誘導性細胞外小胞とは、前駆細胞（例えば、幹細胞）が正常に生存しているときに介入又は誘導されてアポトーシスすることで産生した亜細胞産物を指す。通常、このような亜細胞産物は、膜構造を有し、アポトーシスマーカーを発現し、一部が遺伝物質ＤＮＡを含む。本発明者らは、誘導性細胞外小胞が細胞及び通常の細胞外小胞（例えば、エクソソームなど）と異なる物質であることを見出した。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞、例えば、非アポトーシス細胞、非老化細胞、老化により増殖が停滞したものではない細胞、凍結後に蘇生したものではない細胞、悪性化して異常増殖したものではない細胞又は損傷がない細胞などである。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、細胞培養過程において細胞が８０－１００％コンフルエントになったときの細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、対数増殖期の細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、ヒト又はマウス組織に由来する初代培養細胞及びその継代培養細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、樹立された細胞系又は細胞株から採取される。いくつかの実施形態において、前記前駆細胞は、初期細胞から採取される。

本発明において、ＩＥＶはＩＥＶｓと同じである。本発明において、ＳＴＳはスタウロスポリンである。本発明において、Ｅｘｏｓｏｍｅｓはエクソソームである。

「含む」又は「含有する」とは、組成物（例えば、媒質）及び方法が列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味する。組成物及び方法を定義するために使用されるときに、「基本的に・・・からなる」とは、前記目的組み合わせに対していかなる重要な意義を有する他の要素を排除することを意味する。したがって、基本的に本発明書で定義される元素からなる組成物は、保護が要求される本発明の基本及び新規特徴に実質的に影響しない他の材料又はステップを排除しない。「・・・からなる」とは、他の組成部分の微量元素及び実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの用語のそれぞれで定義される実施形態は、全て本発明の範囲内に含まれる。

「有効量」とは、有利又は必要な結果（例えば、免疫応答の増強、医学状況（疾患、感染など）の治療、予防又は改善）を実現するのに十分な量を指す。有效量は、１回又は複数回の施用、応用又は用量中で投与することができる。適切な用量は、体重、年齢、健康、治療される疾患又は状況及び投与経路に依存する。

本明細書で使用されるように、「高発現」などの用語は、核酸又はタンパク質の発現を従来技術の小胞（例えば、エクソソーム）に含まれるレベルよりも高いレベルに増加させることを含むことを意図している。

本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」とは、いかなる標準薬物担体、例えば、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル、キット又は貼付剤を指す。通常、このような担体は、賦形剤、例えば、澱粉、エマルジョン、糖、特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪又は油、ガム、グリコール又は他の既知の賦形剤を含む。これらの担体は、矯味剤及び着色剤又は他の成分をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、緩衝液、不活性な無毒固体（例えば、マンニトール、タルク）が含まれるが、これらに限定されない。知られている常法によりこのような担体を含む組成物を調製する。所望の投与方式及び所望の用途に応じて、組成物は、固体、半固体又は液体剤形の形態であってもよく、例えば、粉末、粒子、結晶、液体、懸濁液、リポソーム、糊剤、クレーム、軟膏などであり、相対的に正確な用量の単位用量で投与するのに適した形態であってもよい。

本発明において、「組成物」中の成分は、混合物として存在してもよく、分かれて包装されてもよい。分かれて包装される成分は、それぞれ佐剤を含んでもよい。前記佐剤とは、薬学的に薬物の治療効果を補助可能な手段を指す。組成物中の成分が分かれて包装される場合、分かれて包装されるそれぞれの成分は、同時に投与されてもよく、任意の前後順序で投与されてもよく、この場合、患者に１つの薬物を投与して治療し、次に他の薬物を投与する。前記患者は、哺乳動物被験体、特にヒトである。

本発明において、前記「組成物」は、１つの成分がもう１つの成分で包まれる形態で存在してもよい。いくつかの実施形態において、組成物では、前記誘導性小胞は薬物担体として疾患を治療又は予防する薬物を前記誘導性小胞内に包む。

本発明において、対応する試薬の由来は以下のとおりである。ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ；Ｐ３０３－１００）、グルタミン（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ；Ｐ３００－１００）、リン酸デキサメタゾンナトリウム（Ｓｉｇｍａ；Ｄ－８８９３）、α－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ；１２５７１－０６３）、２－ＭＥ（ＧＩＢＣＯ；２１９８５－０２３）。

実施例１：ＭＳＣの分離培養
動物倫理委員会の指導に従って過剰なＣＯ_２でマウスを安楽死させ、無菌条件下で脛骨及び大腿骨を摘出し、それらに付着した筋肉及び結合組織を除去し、さらに骨幹端を分離して骨髄腔を露出させ、１０ｍＬ無菌注射器で体積分率１０％の胎牛血清を含むＰＢＳを吸い出して骨髄腔を繰り返して洗い流し、孔径７０μｍの細胞濾過網で濾過した後、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を除去した後、底部の細胞沈殿を収集し、ＰＢＳで再懸濁させ、さらに５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、最終的な細胞沈殿を収集した。次に、細胞をフローサイトメトリーにより選別し、ＣＤ３４－及びＣＤ９０＋を選別標準としてＢＭＭＳＣを得た。最後に、Ｄｅｘ（－）培養液で細胞を再懸濁させ、直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。２４ｈ後、上清液における壁に付着していない細胞を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｄｅｘ（－）培養液を加えて引き続き培養した。１週間後に同量のＤｅｘ（＋）培養液を加え、さらに１週間後に密集した初代ＢＭＭＳＣコロニーが観察された。トリプシンを用いて３７℃でインキュベートしてＢＭＭＳＣを消化し、継代増幅させ、その後、３日ごとにＤｅｘ（＋）培養液を交換し、培養皿いっぱいになった後、継代した。Ｐ２代のＢＭＭＳＣを用いて後の実験を行った。

Ｄｅｘ（－）培養液成分を表１に示し、Ｄｅｘ（＋）培養液成分を表２に示す。

フローサイトメトリーによる表面マーカーの分析方法により分離されたＢＭＭＳＣの純度を評価した。表面マーカーの同定については、トリプシンでＰ２代のＢＭＭＳＣを消化して収集した後、ＰＢＳで１回洗浄し、５×１０^５／ｍＬの密度で細胞を３％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＰＥ蛍光色素を結合したＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４５及びＣＤ３４抗体を１μＬ添加し、ブランク群には添加しなかった。４℃、暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターにかけた。フローサイトメトリーによる検出結果を図１Ａ－１Ｅに示す。結果から分かるように、分離された細胞はＢＭＭＳＣ（骨髄間葉系幹細胞）であった。

実施例２：誘導性小胞の取得
実施例１で２代目まで培養したＭＳＣ（骨髄由来ＭＳＣ，ＢＭＭＳＣ）を実施例１における培地（Ｄｅｘ（＋）培養液）で８０％－９０％コンフルエントまで引き続き培養した後、ＰＢＳで２回洗い流し、５００ｎＭのＳＴＳを含む無血清培地（α－ＭＥＭ培地）を加えてアポトーシスを誘導し、３７℃で２４ｈインキュベートし、細胞上清液を収集し、ＩＥＶの分離及び抽出に使用した。

図２に示される作業プロセスに従って、収集された培養上清中でＩＥＶの分離及び抽出を行った。具体的な手順は、８００ｇで１０分間遠心分離した後、上清液を収集し、次に２０００ｇで１０分間遠心分離し、さらに上清液を収集した後、１６０００ｇで３０分間遠心分離し、上清液を除去し、無菌ＰＢＳでＩＥＶを再懸濁させ、次に１６０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清液を除去し、３００－５００μＬ無菌ＰＢＳでＩＥＶを再懸濁させることを含む。

比較例１：同種ＭＳＣに由来するエクソソームの分離及び抽出
実施例１で２代目まで培養したＭＳＣ（骨髄由来ＭＳＣ，ＢＭＭＳＣ）を実施例１における培地で８０％－９０％コンフルエントまで引き続き培養した後、ＰＢＳで２回洗い流し、無血清培地を加え、３７℃で４８ｈインキュベートし、細胞上清液を収集し、エクソソームの分離及び抽出に使用した。

抽出手順は、８００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を收集し、２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を収集し、１６０００ｇで３０分間遠心分離し、上清液を収集し、１２００００ｇで９０分間遠心分離し、上清液を除去し、無菌ＰＢＳで沈殿を再懸濁させ、１２００００ｇでさらに９０分間遠心分離し、上清を除去し、底部のエクソソームを収集し、無菌ＰＢＳで再懸濁させることを含む。

実施例３：ＩＥＶの分析
１、ＩＥＶの定量及び膜タンパク質の分析
フローサイトメトリーにより実施例２で得られたＩＥＶを定量分析した。測定時点は１時間目、４時間目、８時間目、１６時間目及び２４時間目であった。結果として、１０^６個のＭＳＣは、１時間目、４時間目、８時間目、１６時間目及び２４時間目まで誘導された後、それぞれ０．７６×１０^８、１．２９×１０^８、１．９５×１０^８、２．４８×１０^８、３．１４×１０^８個のＩＥＶを産出することができ、明らかなように、２４時間誘導された後、単一のＭＳＣは３００個のＩＥＶを産出することができた（図３）。

また、フローサイトメトリーにより検出したところ、ＩＥＶの粒径分布が１μｍ以下に集中し、９４．９７％を占めることが発見され（図４Ａ）、側方散乱光（ＳＳＣ）の分析結果は、同様にＩＥＶ散乱光強度が１μｍ以下の範囲に集中することを示している（図４Ｂ）。さらに、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の標準化小粒子ミクロスフェア（０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ）によりＩＥＶの散乱光強度を分析した結果、ＩＥＶの粒径が０．２μｍ以下に集中することを示している（図４Ｃ）。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察結果は、フローサイトメトリーによる検出結果と類似し、ほとんどの小胞の直径は２００ｎｍ及び２００ｎｍ以下であることを示している（図４Ｄ）。ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）結果は、透過型電子顕微鏡による観察結果に一致し、ＩＥＶ粒径の平均値は１６９ｎｍであることを示している（図４Ｅ）。最先端のナノフローサイトメトリー検出技術により単一小胞レベルの粒径検出を行った結果も、ＩＥＶの平均粒径は１００．６３ｎｍであることを示している（図４Ｆ）。

フローサイトメトリーにより実施例２で抽出されたＩＥＶの表面膜タンパク質を分析した結果、ＭＳＣに由来するＩＥＶはＭＳＣと類似する表面タンパク質、即ち、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３４、ＣＤ４５陰性を発現することができる。また、ＩＥＶは、細胞外小胞の普遍性表面タンパク質ＣＤ９，ＣＤ６３，ＣＤ８１及びＣ１ｑを発現することができた（図５Ａ－５Ｋ）。

２、ＩＥＶの内容物分析
タンパク質ＤＩＡ定量化技術によりＢＭＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム（比較例１で抽出されたもの）、ＭＳＣ－ＩＥＶ（実施例２で得られたもの）の定量プロテオミクス分析を完成した。結果として、ＭＳＣ－エクソソーム及びＭＳＣ－ＩＥＶのタンパク質内容物発現は、母細胞と比較的高い一致性を有し、１７０種類のタンパク質はＩＥＶにおいて特異的に高発現された（図６Ａ）。

バイオインフォマティクス解析により、ＩＥＶが特異的に高発現するタンパク質をスクリーニングし、ヒートマップを作成し（図６Ｂ）、さらに、示差的タンパク質のＧＯ濃縮分析結果と合わせて、ＩＥＶはアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４分子を特異的に高発現できることを明確にし、同種ＭＳＣに由来するエクソソームに比べ、ＩＥＶの５種類の特徴的分子の発現量がいずれも顕著にアップレギュレーションされた。具体的には、ＩＥＶにおけるマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４は、エクソソームにおける対応するマーカーの発現量に対してそれぞれ１．７６倍、２．８１倍、２．４１倍、３．６８倍及び４．４５倍であった（図６Ｃ）。最後に、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ技術によりさらに検証した結果、ＤＩＡ定量分析の結果に一致した（図６Ｄ）。

ＭＳＣ－エクソソーム：ＢＭＭＳＣに由来するエクソソーム
ＭＳＣ－ＩＥＶ：ＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶ
前記内容物分析におけるＭＳＣと、エクソソーム及びＩＥＶを抽出するＭＳＣとは同一のＢＭＭＳＣ細胞株であった。

実施例４：出血性疾患マウスの治療におけるＭＳＣに由来するＩＥＶの使用及びメカニズムの研究
（１）血友病マウスの治療におけるＩＥＶの使用
インビトロ血液凝固実験により、実施例２で得られたＩＥＶ及び比較例１で抽出されたエクソソームのインビトロ血液凝固促進効果を検出した。結果を表３に示す。ＩＥＶは、ほとんどの血漿のインビトロでの凝固時間を短縮させることができ、血液凝固促進効果がエクソソームよりも優れた。一方、第ＩＩ、Ｖ、Ｘ因子が欠乏した血漿では、ＩＥＶはインビトロ血液凝固促進作用を発揮することができず、ＩＥＶのインビトロ血液凝固促進作用が血液凝固共通経路の上流により集中することを示している。

血友病Ａマウス（血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏）をモデルとし、尾静脈から９×１０^８個のＩＥＶを注射し、ＩＥＶのインビボ血液凝固促進作用を観察した。結果を図７に示す。ＩＥＶで治療された後、血友病マウスの出血傾向が顕著に改善され、治療効果が１４日間安定して維持された。

実験結果から分かるように、ＩＥＶは、インビトロで顕著な血液凝固促進作用を発揮することができる。また、インビボ注射後に、出血傾向を顕著に改善することができ、血友病Ａによる出血傾向の改善に適用される。

マウス血漿中の様々な血液凝固因子のレベルを同時に検出したところ、第ＶＩＩＩ因子、第ｖＷＦ因子、組織因子（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ，ＴＦ）及びプロトロンビン（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）はいずれも顕著に変化しなかった（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ）。

血友病Ａマウスモデルでは、正常ＩＥＶ、ＰＳ陰性ＩＥＶ及びＴＦ陰性ＩＥＶをそれぞれ注射し、７日後、尻尾切り実験を行った。結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。ＰＳ及びＴＦの遮断はＩＥＶのインビボ治療効果に影響を与えず、ＩＥＶが血友病マウスを治療するメカニズムがＰＳ及びＴＦに関係がないことを初歩的に示している。従来の文献では、細胞外小胞が血液凝固促進作用を発揮するのがその表面のＰＳ及びＴＦに高度に依存するのに対し、ＩＥＶのインビボ実験結果は従来の研究と一致せず、インビボ環境下では、ＩＥＶが新しい作用メカニズムにより血液凝固促進作用を発揮する可能性があることを示唆している。

（２）狼瘡性出血マウスの治療におけるＩＥＶの使用
臨床上、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；全身性紅斑性狼瘡）の患者は、出血傾向にある場合が多く、現在、具体的なメカニズムが不明確であり、従来の文献ではＳＬＥを伴う血小板減少などの要因に関連すると考えられている。治療方法として、輸血又は血小板輸血の方法が使用される場合が多いが、効果は十分ではなかった。

本発明では、ｌｐｒマウスにＩＥＶ（実施例２で抽出されたもの）を注射し、７日後に尻尾切り実験を行った。結果として、ＩＥＶで治療した後、ｌｐｒマウスの出血傾向が顕著に改善され、治療効果が７日間安定して維持された（図９Ｃ）。ここで、ｌｐｒマウスはＳＬＥの代表的な動物モデルである。
実験結果から分かるように、ＩＥＶは、紅斑性狼瘡性出血傾向の改善に適用される。

（３）チェディアック・東症候群マウスの治療におけるＩＥＶの使用
チェディアック・東症候群（ＣＨＳ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、常染色体劣性遺伝性疾患であり、近親婚の子孫によく見られ、病原遺伝子がリソソーム輸送調節遺伝子（ＬＹＳＴ）である。ＬＹＳＴ遺伝子の変異は、しばしば異常ＬＹＳＴタンパク質の産生を引き起こす、ということで血小板機能障害を引き起こす。患者は、臨床的に明らかな出血傾向を示し、今まで効果的な予防及び治療手段はない。

本発明では、ＣＨＳマウスにＩＥＶ（実施例２で得られたもの）を注射し、１０日後に尻尾切り実験を行った。結果として、ＩＥＶで治療した後に、ＣＨＳマウスの出血傾向が顕著に改善され、治療効果が１０日間安定して維持された（図９Ｄ）。

実験結果から分かるように、ＩＥＶは、チェディアック・東症候群マウスの出血傾向の改善に適用される。

比較例２
血友病Ａマウスモデルに対して、同種ＭＳＣに由来するＩＥＶ（実施例２で得られたもの）及びエクソソーム（比較例１で抽出されたもの）の注射治療（９×１０^８個の）をそれぞれ行った。結果として、ＩＥＶはマウスの出血傾向を改善することができたのに対し、エクソソームは顕著な治療効果を有さなかった（図１０）。

実施例２で得られたＩＥＶと、比較例１で調製されたエクソソームとのインビトロ血液凝固促進効果の比較
実施例２で得られたＩＥＶは、直径が０．０３μｍ～０．２μｍ及び０．２μｍ～１μｍ範囲内であり、マーカーであるシンタキシン４、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１及びインテグリンα５を発現し、インビトロでの血液凝固促進効果が高かったのに対し、比較例１で調製されたエクソソームは、直径が０．０３μｍ～０．１５μｍであり、マーカーである補体Ｃ１ｑ、補体Ｃ３、トロンボスポンジン－１及びトロンボスポンジン－２を発現し、インビトロでの血液凝固促進効果が比較的低かった。

実施例５
１、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞；ｉＰＳＣ）の細胞培養
（１）レンチウイルスの調製
１ｍＬのＤＭＥＭをＥＰ管に移し、５μｇの遺伝子発現プラスミド及び５μｇのｖｓｖｇプラスミドを加え、２５μＬのリポソームを加え、室温で２０分間軽く撹拌した。混合物を培養されたＧＰ２－２９３細胞（９５％均一混合）に滴下し、回転させて混合物を均一に分布させた。１２時間後に、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋グルタミン）に交換した。培地交換の２４時間後、ウイルスを含む培地を収集し、４８時間後にさらに培地を収集した。

（２）細胞リプログラミングの誘導
各ウェル（１２ウェルプレート）にステップ（１）で培養されたＧＰ２－２９３細胞を５×１０^５個接種し、８０％コンフルエントになった後、５００－１０００μＬ／ウェルの培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋グルタミン）にウイルスを１００ｎｇ加え、４μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を加え、１２ｈインキュベートした後、新しい培地に交換し、上記のステップを繰り返した。７日内で、５×１０^４個の誘導された細胞を、フィーダー細胞（ｍＥＦ）を含む１０ｃｍ培養皿に接種した。翌日に、培地を、ｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）を含むＥｓ培地に交換し、１日おきに交換した。５日後、細胞がクローンを開始し、４０日後もＥｓ様クローンがない場合、失敗したと判定した。

（３）細胞継代
６０％コンフルエントになった後、各皿に０．５ｍｌのａｃｃｕｔａｓｅを添加し、室温下で１分間静置した。分離された細胞凝集体を１５ｍＬ遠心分離管に移し、別途２ｍＬのｍＴｅＳＲ１を用いていかなる残りの凝集体を収集した。洗浄液を１５ｍｌ試験管に加えた。室温下、２００ｇで細胞凝集体を含む１５ｍＬ試験管を５分間遠心分離した。上清液を吸い出した。細胞を再懸濁させ、細胞を凝集状態に保持することを確保した。ヒトｉＰＳ細胞及びｍＴｅＳＲ１をマトリゲルがコーティングされた新しいプレート上に凝集させた。培養皿を３７℃インキュベータに入れ、細胞凝集体の凝集塊の運動を均一に分布するように、培養皿を素速く左右移動させた。３７℃、５％二酸化炭素及び９５％湿度の条件下で培養した。培養液を毎日交換した。

２、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン１４骨芽細胞系の培養
購入したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン１４を急速解凍した後、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を除去した後、底部の細胞沈殿を収集し、Ｄｅｘ（－）培養液で細胞を再懸濁させ、直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。培養皿いっぱいになった後、トリプシンを用いて３７℃でインキュベートして消化し、継代増幅した。その後、３日ごとにＤｅｘ（－）培養液を交換した。複数回継代して細胞を使用することができる。ここで、Ｄｅｘ（－）培養液成分を表５に示す。

３、ＩＥＶの分析
骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ｉＰＳ細胞及びヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）に由来するＩＥＶの比較を含む。前記３種類の細胞に由来するＩＥＶの取得方法は、実施例２と同じである。

(1)形態検出
実験結果として、図１１に示すように、４００倍光学顕微鏡下でｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）、骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１に由来するＩＥＶは、ヒトＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶの形態に類似し、比較的不規則であった。

（２）ＩＥＶ粒子の直径検出
フローサイトメトリーにより検出した。実験結果として、図１２に示すように、フローサイトメトリーによる検出結果は、骨芽細胞系ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１及びヒト骨髄間葉系幹細胞ｈＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶの粒径分布は類似した。

（３）ＩＥＶの表面マーカーの検出
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの方法により検出した。実験結果として、図１３に示すように、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）及びヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）に由来するＩＥＶの表面マーカーを比較したところ、この２種類の細胞に由来するＩＥＶはいずれもＩＥＶマーカーであるアネキシンＶを高発現した。ｈＢＭＭＳＣに比べ、ｉＰＳ細胞に由来するＩＥＶはシンタキシン４を比較的高いレベルで発現した。

実施例６：ＩＥＶは皮膚及び毛髪を経由して排出可能である。
実施例２で調製されたＩＥＶを４×１０^６個取り、ＤＩＲで標識し、２００μＬのＰＢＳで再懸濁させ、尾静脈からヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕの体内に全身注射し、１、３、７日観察した後、生体イメージング機により皮膚表面でのＩＥＶの分布を検出した。結果を図１３Ａ－１３Ｃに示す。

図１３Ａから分かるように、ＩＥＶは皮膚表面に達することができ、３日目に数が最も多く、７日目にほぼ消え、皮膚表面でのＩＥＶの動的代謝の過程を示す（図１３Ａ）。免疫蛍光結果は、ＰＫＨ２６－ＩＥＶがＣ５７マウスに全身注射された後、経時的に皮下組織から真皮層及び表皮へ徐々に移動することを示している。７日目に皮膚表面の角質層にＩＥＶの多量存在が観察され、全身注射されたＩＥＶは皮膚角質層の脱落に伴って排泄されることを示唆している（図１３Ｂ）。また、７日目にマウス体表から抜いた毛髪の毛嚢にＰＫＨ２６－ＩＥＶの存在が観察され、全身注射されたＩＥＶは毛髪の脱落にも伴って代謝されることを示している（図１３Ｃ）。本実施例では、ＩＥＶは皮膚及び毛髪により排出されることを示しており、ＩＥＶの注射又はインビボでの含有量の増加は安全性を有することを証明している。

実施例７
ｈｉＰＳＣの培養は、実施例５と同様であり、ｈＵＣＭＳＣも当該技術分野の常法により培養された。
前記ｈｉＰＳＣは、２６－２９代目であってもよいが、これに限定されず、本実施例で具体的に使用されるのは２６代目であった。前記ｈＵＣＭＳＣは、７－９代目であってもよいが、これに限定されず、本実施例で具体的に使用されるのは７代目であった。

１、実験方法
（１）スタウロスポリン（５００ｎＭ）でｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣを約９ｈ誘導して細胞をアポトーシスさせ（他のステップは実施例２と同様）、アネキシンＶ（１５ｍｉｎ）及び７ＡＡＤ（３ｍｉｎ）で染色し、フローサイトメトリーにより細胞アポトーシス率を検出した。
（２）ステップ（１）のアポトーシス細胞の上清からＩＥＶを分離し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶの発現率を検出した。分画遠心法によりＩＥＶを抽出した。手順は、８００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、２０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し（このステップ以外の他の抽出ステップは実施例２と同様）、１６０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、１６０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、ＩＥＶを得ることを含む。
アネキシンＶで１５ｍｉｎ染色し、フローサイトメーターにかけた。

２、実験結果
（１）本発明者らは、ハイコンテントでｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの死亡過程を撮影したところ、両者の死亡過程に違いがあることを見出した。ｈｉＰＳＣは、核と細胞質を中心として多中心収縮し、次いで泡発生を伴って樹枝状の分岐を形成する一方、ｈＵＣＭＳＣは、核を中心として単一中心収縮すると同時に、分岐形成及び泡発生などを伴った。結果を図１４に示す。
（２）アポトーシスを誘導するｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣについてフローサイトメトリーによりアポトーシス率を分析した結果、ほとんどの細胞がアポトーシスしたことを証明している。結果を図１５に示す。
（３）フローサイトメトリーによりアネキシン５発現の陽性率を検出した結果、ｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの発現率はともに８０％以上であった。結果を図１６に示す。
（４）ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により２種類のＩＥＶを特徴付けた。
１）結果として、図１７に示されるように、ｈｉＰＳＣに由来するＩＥＶの粒径は約１００ｎｍであり、ｈＵＣＭＳＣに由来するＩＥＶの粒径は約１８０ｎｍであった。
２）結果として、図１８に示されるように、ｈｉＰＳＣに由来するＩＥＶの収量は２１９７１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｈｉＰＳＣであり、ｈＵＣＭＳＣに由来するＩＥＶの収量は８８６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｈＵＣＭＳＣであった。
３）結果として、図１９に示されるように、ｈｉＰＳＣに由来するＩＥＶの電位は約－１２ｍＶであり、ｈＵＣＭＳＣに由来するＩＥＶの電位は約－４５ｍＶであった。

Claims (8)

1. 幹細胞又は体細胞である細胞に由来する誘導性小胞がサンプルに存在するかどうかを検出のためのデータを収集する方法であって、
   前記サンプル中のシンタキシン４の発現量を検出することを含む、方法。
2. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞は、誘導多能性幹細胞、骨芽細胞系又は骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記サンプルにおけるシンタキシン４の発現量が前記細胞に由来するエクソソーム、移動体、微小胞又はエクトソームにおいてのシンタキシン４の発現量に対してより高い場合、
   前記誘導性小胞が前記サンプルの中に存在を示すデータを収集することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記サンプルにおけるシンタキシン４の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのシンタキシン４の発現量に対して３－６倍高い場合、
   前記誘導性小胞が前記サンプルの中に存在を示すデータを提供することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記サンプル中のアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１又はインテグリンα５の発現量を検出することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記サンプル中のアネキシンＶの発現量を検出し、前記サンプルにおけるアネキシンＶの発現量が前記細胞に由来するエクソソーム、移動体、微小胞又はエクトソームにおいてのアネキシンＶの発現量に対してより高く、
   前記サンプル中のフロチリン－１の発現量を検出し、前記サンプルにおけるフロチリン－１の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのフロチリン－１の発現量に対してより高く、
   前記サンプル中のカドヘリン１１の発現量を検出し、前記サンプルにおけるカドヘリン１１の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのカドヘリン１１の発現量に対してより高く、又は
   前記サンプル中のインテグリンα５の発現量を検出し、前記サンプルにおけるインテグリンα５の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのインテグリンα５の発現量に対してより高く、
   かつ、
   前記サンプルにおけるシンタキシン４の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのシンタキシン４の発現量に対してより高い場合、
   前記誘導性小胞が前記サンプルの中に存在を示すデータを提供することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記サンプル中のアネキシンＶの発現量を検出し、前記サンプルにおけるアネキシンＶの発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのアネキシンＶの発現量に対して１－２倍高く、
   前記サンプル中のフロチリン－１の発現量を検出し、前記サンプルにおけるフロチリン－１の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのフロチリン－１の発現量に対して２－３倍高く、
   前記サンプル中のカドヘリン１１の発現量を検出し、前記サンプルにおけるカドヘリン１１の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのカドヘリン１１の発現量に対して１－３倍高く、又は
   前記サンプル中のインテグリンα５の発現量を検出し、前記サンプルにおけるインテグリンα５の発現量が前記細胞に由来する前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのインテグリンα５の発現量に対して３－４倍高く、
   かつ、
   前記サンプルにおけるシンタキシン４の発現量が前記エクソソーム、前記移動体、前記微小胞又は前記エクトソームにおいてのシンタキシン４の発現量に対して３－６倍高い場合、
   前記誘導性小胞が前記サンプルの中に存在を示すデータを提供することをさらに含む、請求項７に記載の方法。