JP7744656B2 - 軟骨組織体の製造方法 - Google Patents

軟骨組織体の製造方法

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Description

本発明は、軟骨組織体の製造方法に関する。
関節軟骨損傷の治療の一つである自家培養軟骨組織を移植する方法では、軟骨採取と培養軟骨移植の２回の手術が必要となるため、患者の負担が大きい。この患者負担の軽減等の観点から、移植のための軟骨組織を自家培養ではなく各種幹細胞の分化誘導・培養から作製する各種再生医療技術が提案されている。例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を中胚葉に誘導し、アスコルビン酸、ＢＭＰ２、ＴＧＦβ、ＧＤＦ５の存在下で培養することで、ディッシュ上の一部の細胞が軟骨細胞凝集物を形成し、それを剥離し、浮遊培養することで硝子軟骨組織を作り出す技術が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
A. Yamashita, M. Morioka, Y. Yahara, M. Okada, T. Kobayashi, S. Kuriyama, S. Matsuda, N. Tsumaki, Generation of scaffoldless hyaline cartilaginous tissue from human iPSCs, Stem cell reports 4 (2015) 404-418
上記技術では、ヒト多能性幹細胞より最終産物としての硝子軟骨組織を作り出すことはできるが、中間段階の細胞（＝ヒト軟骨前駆細胞）が規定されていない。そのため、高効率で、組織形状/性状の均一化された軟骨再生材料の大量生産が難しいという課題があった。
本発明者らは、これまでに幹細胞より軟骨組織を作製する際の中間段階の細胞及びその製造方法と、その細胞からの軟骨組織の製造方法について鋭意研究を行い、その一部について特許出願も行っている（例えば、PCT/JP2020/035517参照）。この方法では、中間段階の分化指向性を有する細胞（すなわち、軟骨前駆細胞）を拡大培養し、ストック化を行うことができ、品質管理された同ロットの細胞を、軟骨分化誘導処理することで軟骨組織とすることができるため、また作製した軟骨組織に軟骨細胞以外の細胞は含まれていないため、軟骨組織体を再生医療に使用する上で有利である。本発明は、そのような軟骨前駆細胞からの軟骨組織の作製を、所定の培養条件下で行うことにより、効率的な細胞増殖と共に、少数の細胞から大きな軟骨組織片の作成が可能となることを見出し、完成させたものである。
本発明は以下を包含する。
［１］ 細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：

［式中、
Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：

［式中、
Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなる複数のスポットを備える細胞凝集塊製造用基板を提供する工程；該基板に、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞を播種する工程；該細胞を培養し細胞凝集塊を作成する工程；該凝集塊を培養し軟骨組織体を作成する工程、を含むことを特徴とする、軟骨組織体の製造方法。
［２］ 式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、上記［１］に記載の製造方法。
［３］ 上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：

［式中、
Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 上記細胞の付着抑制能を有する基板が、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：

［式中、
Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
を含むコーティング膜をその表面の少なくとも一部に含む、上記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 軟骨組織体を作成する工程における培養が寒天を含有する培地で実施される、上記［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 寒天の重量平均分子量が１０，０００～６０，０００であり、寒天の含有量が培地の全量に対して０．００５（w/v）％以上２（w/v）％未満である、上記［５］に記載の製造方法。
本発明の製造方法は、品質管理された軟骨前駆細胞を原料とし、軟骨分化誘導処理することで軟骨組織とすることができるため、また作製した軟骨組織に軟骨細胞以外の細胞は含まれていないため、軟骨組織体を再生医療に安全に使用する上で有利である。さらに軟骨前駆細胞からの軟骨組織の作製を、所定の培養条件下で行うことにより、効率的な細胞増殖と共に、少数の細胞から大きな軟骨組織片の作成が可能となり、コストの面でも有利である。
実施例１で得られた細胞凝集塊製造用基板に形成された細胞凝集塊の全体像（左上）と拡大像（左下）、及びその赤色蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ）発現により可視化した細胞凝集塊の全体像（右上）と拡大像（右下）である。 実施例１で得られた軟骨組織体の実態顕微鏡写真である。 実施例１で得られた軟骨組織体の倒立顕微鏡写真（明視野）である。 ヘマトキシリン（ＨＥ）染色（左）、アルシアンブルー及染色（中央）、又はサフラニンＯ染色（右）した、実施例１で得られた軟骨組織体の組織切片の画像である。 評価例１において、実施例１で得られた軟骨組織体の移植４週間後に採取した組織片を、ＨＥ染色（左）、サフラニンＯ染色（中央）、又はトルイジンブルー染色（右）したものの画像である。
＜軟骨組織体の製造方法＞
本発明の軟骨組織体の製造方法は、
（１）細胞の付着抑制能を有する基板上に、式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなる複数のスポットを備える細胞凝集塊製造用基板を提供する工程；
（２）該基板に、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞を播種する工程；
（３）該細胞を培養し細胞凝集塊を作成する工程；及び
（４）該凝集塊を培養し軟骨組織体を作成する工程、
を含むことを特徴とする。
工程（１）
工程（１）では、細胞凝集塊製造用基板を提供する。本発明に係る細胞凝集塊製造用基板は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなる複数のスポットを備える。
（共重合体）
前記共重合体は、下記式（Ｉ）：

［式中、
Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：

［式中、
Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む。
本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基又は１－エチルプロピル基が挙げられる。
Ｒa１及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基及びｎ－ブチル基から選ばれることが好ましいが、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基が最も好ましい。
本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、１－エチル－トリメチレン基等が挙げられる。これらの中で、Ｒa２としてはエチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましい。
したがって、上記式（Ｉ）で表されるモノマーとしては、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルメタクリレートなどが挙げられ、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。上記式（ＩＩ）で表されるモノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸などが挙げられ、メタクリル酸が好ましい。
前記共重合体中の式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率は、９９モル％～５１モル％が好ましく、９８モル％～６０モル％がより好ましく、９５モル％～７０モル％がさらに好ましく、９３モル％～７０モル％がさらにより好ましい。式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位のモル比率が５０モル％以上であると、共重合体のアニオン性が過剰となり、細胞の接着力が低下する傾向がある。なお、本明細書において、他に断りのない限り、各モノマーから誘導される繰り返し単位のモル比率は、モノマーの仕込み量（モル量）から算出した比率に置き換えることができる。
前記共重合体は、式（Ｉ）／式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位と共に、さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーから誘導される構造単位を含んでいてもよい。２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとは、具体的には、２つ以上の炭素－炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば多官能アクリレート化合物、多官能アクリルアミド化合物、多官能ポリエステル、又はイソプレン化合物などが挙げられる。
好ましい具体例としては下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーが挙げられる。


式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す。これらの中で、式（ＩＩＩ）で表されるモノマーが好ましい。
Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
Ｒｅはメチレン基、エチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましく、エチレン基がより好ましい。
ｎは１～５０の数であるが、ｎは１～３０の数であることが好ましく、ｎは１～１０の数であることがより好ましい。
前記共重合体中の２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマー（典型的には、式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマー）から誘導される繰り返し単位のモル比率は、０モル％～５モル％が好ましく、０モル％～３モル％がより好ましい。２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーから誘導される繰り返し単位のモル比率が５モル％を超えると、過度な架橋による高分子量化により、製造中にゲル化して製造を困難にする恐れがある。
前記共重合体は、さらに任意の追加モノマー成分として、エチレン性不飽和モノマー、又は多糖類若しくはその誘導体から誘導される繰り返し単位を含んでいてもよい。エチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーを挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。
親水性の官能性誘導体とは、親水性の官能基又は構造を有するエチレン性不飽和モノマーを指す。親水性の官能性基又は構造の例としては、ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。
ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：

を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。
アミド構造は、下記式：

［ここで、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等、具体的には、メチル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマーは、例えば、特開２０１０－１６９６０４号公報等に開示されている。
アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ－Ａｌｋ－ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（－Ａｌｋ－Ｏ－）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマーは、例えば、特開２００８－５３３４８９号公報等に開示されている。
アミノ基は、式：－ＮＨ２、－ＮＨＲ１９又は－ＮＲ２０Ｒ２１［ここで、Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本発明におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－（ｔ－ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。
スルフィニル基は、下記式：

［ここで、Ｒ２２は、有機基（例えば、炭素原子数１乃至１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１乃至１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。スルフィニル基の導入方法として、特開２０１４－４８２７８号公報等に開示された方法を挙げることができる。
本願の共重合体は、それ自体公知の方法（例えば特開２０１４－１６２８６５号公報、国際公開第２０２０／０４０２４７号に記載の方法）で製造できる。
前記共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、２０，０００～１，０００，０００であり、５０，０００～８００，０００であることがさらに好ましい。
前記共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００であり、１．２～８．０であることが好ましく、１．４～６．０であることが好ましく、１．５～５．０であることが好ましく、１．６～４．５であることが好ましい。
前記数平均分子量（Ｍｎ）と数平均分子量（Ｍｎ）は、例えばGel Filtration Chromatographyにより求めることができる。
前記共重合体を利用することで、細胞を接着させた後に剥離させて細胞凝集塊（スフェロイド）を形成させることが可能である。なお細胞凝集塊とは、細胞が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。
（基板）
本発明で使用される細胞凝集塊製造用基板は、前記共重合体を基板の表面にスポット状に塗布し乾燥することにより製造できる。ここで「表面」とは、細胞又は細胞培養液などの内容物と接する面を指し、特に基板が細胞培養容器の一部である場合は、内容物と接する面のうちの底面を指す。
基板表面の形状は、平面であっても凹凸があってもよいが、平面形状であることが好ましい。また基板は、いわゆる細胞培養容器又はその一部であってもよい。細胞培養容器としては、細胞の培養に一般的に用いられるペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュなどのシャーレ又はディッシュ、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコなどのフラスコ、プラスチックバッグ、テフロン（登録商標）バッグ、培養バッグなどのバッグ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレートなどのプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ローラーボトルなどのボトル等が挙げられる。
基板の材質は、例えば、ガラス、金属、金属含有化合物若しくは半金属含有化合物、活性炭又は樹脂を挙げることができる。金属は、典型金属：（アルミニウム族元素：Al、Ga、In；鉄族元素：Fe、Co、Ni；クロム族元素：Cr、Mo、W、U；マンガン族元素：Mn、Re；貴金属：Cu、Ag、Au等が挙げられる。金属含有化合物若しくは半金属含有化合物は、例えば基本成分が金属酸化物で、高温での熱処理によって焼き固めた焼結体であるセラミックス、シリコンのような半導体、金属酸化物若しくは半金属酸化物（シリコン酸化物、アルミナ等）、金属炭化物若しくは半金属炭化物、金属窒化物若しくは半金属窒化物（シリコン窒化物等）、金属ホウ化物若しくは半金属ホウ化物等の無機化合物の成形体等の無機固体材料、アルミニウム、ニッケルチタン、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）が挙げられる。
樹脂としては、天然樹脂若しくはその誘導体、又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂若しくはその誘導体としては、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、ニトロセルロース（ＮＣ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等、合成樹脂としてはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂（ＡＢＳ）又はテフロン（登録商標）が好ましく用いられる。
本発明で使用される細胞凝集塊製造用基板の製造では、前記共重合体を基板の表面にスポット状に塗布し乾燥する際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。基板の材質は１種類であっても２種類以上の組み合わせであってもよい。
（スポット）
本発明で使用される細胞凝集塊製造用基板は、前記共重合体からなる複数のスポットを備える。基板の表面積に対するスポットの総面積の割合は、特に限定はないが、例えば３０％以上であり、かつ各スポットの直径が例えば５０～５０００μｍであり、スポット間の間隔が例えば３０～１０００μｍである。スポットの形状は、特に限定されないが、例えば略円状、四角形形状であるが、略円状のスポットであることが好ましい。
基板の表面積に対するスポットの総面積の割合、各スポットの直径やスポット間の間隔は、用いる細胞や基板の種類、細胞凝集塊の所望のサイズ等に応じて、所定の範囲から適宜選択することができるが、基板の表面積に対するスポットの総面積の割合は、３０％以上、４０％以上、５０％以上であることが好ましく、かつ９９％以下であることが好ましく、各スポットの直径は、５０～５０００μｍであり、３００～３０００μｍであることが好ましく、スポット間の間隔は、３０～１０００μｍであり、１００～５００μｍであることが好ましい。
細胞の付着抑制能を有する基板上に、細胞が接着し得る独立したマイクロサイズの領域（スポット）を、このように高密度で、好ましくは規則的に配することにより、均一なサイズのスフェロイドを一つの基板（容器）で一度に複数形成できる。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞凝集塊のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。
前記共重合体からなるスポットは、共重合体、好ましくは前記共重合体を含む下地剤を塗布することにより形成することができる。下地剤は、前記共重合体に、それ自体公知の方法にて含水溶液を混合させることで調製できる。そのような下地剤は、細胞凝集塊形成促進用として有用である。
含水溶液とは、水、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液などの塩含有水溶液、あるいは水又は塩含有水溶液とアルコールとを組み合わせた混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素原子数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（＝ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよい。
さらに下地剤は、前記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られる下地膜の性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、ｐＨ調整剤、架橋剤、防腐剤、界面活性剤、容器又は基板との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。
下地剤の塗布の方式としては、例えばインクジェット法、スクリーン印刷法、スリットコート法、ロール・トゥー・ロール法等を用いることが出来るが、好ましくはインクジェット法又はスクリーン印刷等の印刷技術で行われる。
別の塗布方法としては、例えば場合によりスポットの非形成箇所を保護した基板を上記下地剤に浸漬する、下地剤を場合によりスポットの非形成箇所を保護した基板（容器）に添加し、所定の時間静置する等の方法が用いられるが、基板、一態様として細胞培養容器の場合は、下地剤を場合によりスポットの非形成箇所を保護した容器に添加し、所定の時間静置する方法によって行われる。添加は、例えば、容器の全容積の０．５乃至１倍量の下地剤を、シリンジ等を用いて添加することによって行うことができる。静置は、容器又は基板の材質や細胞培養の下地剤の種類に応じて、時間や温度を適宜選択して実施されるが、例えば、１分から２４時間、好ましくは５分から３時間、１０乃至８０℃で実施される。これにより、細胞凝集塊製造用基板を製造することができる。
また、かかる方法により得られる基板の表面のスポットは、乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いての洗浄後に、細胞凝集塊製造用基板として使用することができる。
すなわち、基板の表面のスポットの形成後、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、さらに好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、さらに好ましくは３時間以内、さらに好ましくは１時間以内に乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等、特に好ましくは培地（例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地））を用いての洗浄後に、細胞凝集塊製造用基板として使用することができる。
細胞凝集塊製造用基板は、乾燥工程に付してもよい。乾燥工程は、大気下又は真空下にて、好ましくは、温度－２００℃乃至２００℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記下地剤中の溶媒を取り除くことで、基体へ完全に固着する。
スポットは、例えば室温（１０℃乃至３５℃、好ましくは２０℃乃至３０℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にスポットを形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。乾燥温度が－２００℃未満であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃超であると、共重合体の熱分解が生じる。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２０℃乃至１５０℃である。
本発明で使用される細胞凝集塊製造用基板は、以上の簡便な工程を経て製造される。
また、スポット（塗布膜）に残存する不純物、未反応モノマー等を除去するために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。
スポット（塗布膜）の膜厚は、最大膜厚と最小膜厚が１～１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５～５００ｎｍの範囲である。
本発明で使用される細胞凝集塊製造用基板は、細胞の付着抑制能を有する基板を用いて製造される。そのような基板として、市販の細胞低接着処理済みの細胞培養皿、細胞の付着抑制能を有する細胞培養器等を使用してもよく、例えば特開２００８－６１６０９号公報に記載されている細胞培養容器が使用できるが、これに限定されるものではない。あるいは前記スポット（塗布膜）の形成前に、基板が細胞の付着抑制処理を施されたものであってよい。細胞の付着抑制能を有する基板は、例えば公知の細胞の付着抑制能を持つコーティング膜形成用組成物を塗布する工程を経て製造出来る。細胞の付着抑制能を有するコーティング膜形成組成物としては、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：

［式中、
Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含むことが好ましい。前記コーティング膜は、基板表面の少なくとも一部に含めばよいが、細胞凝集塊を製造する表面（すなわち本願のスポットが存在する表面）全体に渡って、あるいは基板表面全体に渡って塗布されていることが好ましい。
炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基は、上述のものと同一である。
前記コーティング膜形成用組成物は例えば、国際公開第２０１４／１９６６５０に記載されているコーティング膜形成用組成物が使用できる。
前記コーティング膜形成用組成物の塗布方法としては、特に制限は無く、通常のスピンコート、ディップコート、溶媒キャスト法等の塗布法が用いられる。
前記コーティング膜の乾燥工程は、大気下又は真空下にて、温度－２００℃乃至１８０℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、上記共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。
前記コーティング膜は、例えば室温（１０℃乃至３５℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にコーティング膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。またフリーズドライ法による極低温～低温（－２００℃乃至－３０℃前後）での乾燥工程を用いてもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールを混合媒体（－７８℃）、液体窒素（－１９６℃）等が挙げられる。
乾燥温度が－２００℃以下であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃以上であると、コーティング膜表面のイオン結合反応が進みすぎて該表面が親水性を失い、生体物質付着抑制能が発揮されない。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。
乾燥後、前記コーティング膜上に残存する不純物、未反応モノマー等を無くすため、さらには膜中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる１以上の溶媒で流水洗浄又は超音波洗浄等で洗浄することが望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。形成されたコーティング膜は生体物質が付着してもその後水洗等にて容易に除去することができ、前記コーティング膜が形成された基体表面は、生体物質の付着抑制能を有する。
前記コーティング膜の膜厚は、好ましくは５～１０００ｎｍであり、さらに好ましくは５～５００ｎｍである。
細胞の付着抑制能を有するとは、例えばＷＯ２０１６／０９３２９３の実施例に記載した方法で行う蛍光顕微鏡によるコーティング膜無し、又は細胞低吸着処理無しと比較した場合の相対吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）（％）（（実施例の吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ））／（比較例の吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）））が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。
工程（２）
工程（２）では、前記細胞凝集塊製造用基板に、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞を播種する。
「多能性幹細胞」とは、自己複製能と他の複数系統の細胞に分化する能力（多分化能）とを併せ持つ細胞を意味し、また「前駆細胞」とは、幹細胞から最終の分化先である機能細胞へ分化する途中にある細胞を意味する。したがって、多能性幹細胞由来のヒト軟骨前駆細胞とは、多能性幹細胞を原料細胞として分化誘導され、かつ最終の分化先である軟骨細胞へと分化する途中にある細胞を意味する。ここで多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの万能性細胞（あらゆる体細胞及び生殖系列の細胞に分化する能力を有する細胞）が挙げられる。
さらに本発明において「ヒト軟骨前駆細胞」は、ＰＲＲＸ１タンパク質陽性である。ＰＲＲＸ１（Paired related homeobox 1）タンパク質とは、ホメオドメインを有する転写因子の一つであり、発生過程において側板中胚葉由来の肢芽や、沿軸中胚葉由来の頭部中胚葉で特異的に発現することが知られている。
ヒト(Homo sapiens)のＰＲＲＸ１遺伝了のｃＤＮＡの塩基配列及びＰＲＲＸ１タンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ; National Center for Biotechnology Information）が提供するＧｅｎＢａｎｋに、下記のアクセッション番号で登録されている。なお複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。
- ヒトＰＲＲＸ１遺伝子: NM_006902 (NM_006902.5)、NM_022716 (NM_022716.4)
- ヒトＰＲＲＸ１タンハク質: NP_008833 (NP_008833.1)、NP_073207 (NP_073207.1)
細胞がＰＲＲＸ１タンパク質陽性であることは、公知の手法により検出することができる。例えば、ＰＲＲＸ１遺伝子の転写プロモーター配列により発現が制御されるレポーター遺伝子による検出、ＰＲＲＸ１タンパク質に対する特異的な抗体を用いた免疫染色による検出等が挙げられる。
ＰＲＲＸ１タンパク質陽性の軟骨前駆細胞は、例えば以下の工程を含む手法により製造することができる：
- 多能性幹細胞から側板中胚葉細胞を分化誘導する工程、
- 前記工程により分化誘導された細胞を、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下で培養し、肢芽間葉系細胞を調製する工程、
- 前記工程により調製された肢芽間葉系細胞を、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下で培養し、軟骨前駆細胞を調製する工程。
前記手法において、原料細胞として用いる多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などを使用することができる。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、新規に作製したもの、又は既に確立されたものを使用することができる。
前記手法において、まず多能性幹細胞から側板中胚葉細胞を分化誘導する。多能性幹細胞から側板中胚葉細胞を分化誘導する手段としては、公知の手段を用いることができる。例えば、文献：Loh et al, 2016, Cell, 451-467に記載の方法に準じた方法を採用することができる。具体的には多能性幹細胞からまず原始線条（Mid-primitive streak）へと分化誘導を行い、次いで原始線条から側板中胚葉細胞への分化誘導を行う。
側板中胚葉細胞が分化誘導されたことは、例えば側板中胚葉細胞の特異的マーカーであるＨＡＮＤ１タンパク質の発現を検出することにより確認することができる。
次いで、分化誘導された側板中胚葉細胞を、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下で培養し、ＰＲＲＸ１タンパク質陽性である、側板中胚葉由来ＰＲＲＸ１陽性細胞へ分化誘導する。なお、前の培養環境の影響を低減するために、ＰＢＳ緩衝液等での洗浄を適宜行った上でＷｎｔシグナルを活性化する環境下での培養を行うことが好ましい。
側板中胚葉細胞から肢芽間葉系細胞への分化誘導はまた、ＦＧＦ２などのＦＧＦシグナル活性化剤の非存在下で行うことが好ましく、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下に行い、かつＴＧＦβシグナル抑制剤、ＢＭＰシグナル抑制剤及びヘッジホッグシグナル抑制剤からなる群から選ばれる１種、２種又は３種の存在下に行うことがより好ましく、ＴＧＦβシグナル抑制剤、ＢＭＰシグナル抑制剤、ＴＧＦβシグナル抑制剤、及びヘッジホッグシグナル抑制剤の存在下に行うことがさらにより好ましい。
Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下での培養は、例えば有効量のＷｎｔシグナル活性化剤の存在下で培養をすることで行うことができる。Ｗｎｔシグナル活性化剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達（特に、カノニカルＷｎｔ経路）を増強するものである。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔファミリータンパク質などが挙げられる。例えば、ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile）、ＸＡＶ９３９（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、ＬｉＣ１などが挙げられる。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その添加量は例えば、０．１～２０μM程度、好ましくは１～１０μMとすることができる。
ＢＭＰシグナル抑制剤は、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を抑制（阻害）するものである。ＢＭＰシグナル抑制剤としては、ＬＤＮ１９３１８９（4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline）又はその塩（例えば、塩酸塩）、ＤＭＨ－１などが挙げられ、その添加量は例えば、０．１～１０μM程度、好ましくは０．２～５μＭとすることができる。
ＴＧＦβシグナル抑制剤は、ＴＧＦβにより媒介されるシグナル伝達を抑制（阻害）するものである。ＴＧＦβシグナル活性化剤としては、Ａ－８３－０１（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）、ＳＢ４３１５４２などが挙げられ、その添加量は例えば、０．１～１０μM程度、好ましくは０．２～５μMとすることができる。
ヘッジホッグシグナル抑制剤は、ヘッジホッグにより媒介されるシグナル伝達を抑制（阻害）するものである。ヘッジホッグシグナル活性化剤としては、ビスモルデギブ（Vismordegib）、シクロパミン、ソニデジブなどが挙げられ、その添加量は例えば、１０nM～１μM程度、好ましくは５０nM～５００nM程度とすることができる。
培養は、約３７℃程度及び二酸化炭素濃度約５％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されない。上記条件での培養は、例えば公知のＣＯ２インキュベータを用いて温度及びＣＯ２濃度を制御しながら行なうことができる。
培養は二次元細胞培養(平面培養)で行うことができる。二次元細胞培養は、培養器具を必要に応じて細胞の接着を促進するコーティング処理して行うことができる。
Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下での培養を行う期間は、特に限定されるものではないが、例えば、６時問～４日程度、好ましくは１日間～３日間程度、より好ましくは２日間程度（４８時間程度）とすることができる。必要に応じて、培地交換を行うことができる。培養条件は、常法に準じることが好ましい。
培養においては、必要に応じて継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前又は直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、培地を適宜交換することもできる。
培地としてＩＭＤＭ培地、Ｆ１２培地、又はその混合培地などの無血清培地を用いることが好ましい。動物由来成分不含の状態で分化誘導並びに維持培養が可能である。また前記無血清培地に、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ-２７６３２（(R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide・2HCl））、インスリンなどのホルモン、トランスフェリン、アルブミンなどのタンパク質、脂質、ポリビニルアルコール、モノチオグリセロール等の各種培地添加物を添加することができる。
次いで、調製された肢芽間葉系幹細胞を、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下で培養し、ＰＲＲＸ１タンパク質陽性である、軟骨前駆細胞へと分化誘導する。なお、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下とは、上記と同義である。また肢芽間葉系細胞から軟骨前駆細胞への分化誘導はさらに、ＦＧＦ２などのＦＧＦシグナル活性化剤の存在下で行うことが好ましい。
このようにして、ＰＲＲＸ１タンパク質陽性の軟骨前駆細胞が製造される。具体的な実施態様は、後述の実施例に記載のとおりである。また国際公開第２０２１／０５４４４９号の記載を参照することもできる。また、このように得られた軟骨前駆細胞は、同一ロットにおいて拡大培養が可能であり、一定の品質管理条件下でストック可能である。
ヒト軟骨前駆細胞の前記細胞凝集塊製造用基板への播種は、細胞を培地、例えば続く工程（３）における培養で使用される培地に懸濁した細胞懸濁液とし、これを前記細胞凝集塊製造用基板に添加する等、それ自体公知の方法で実施される。
工程（３）
工程（３）では、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞を培養し細胞凝集塊を作成する。
培養は、前記ヒト軟骨前駆細胞から細胞凝集塊を作成しうる手法であれば特に限定されず、ヒト軟骨前駆細胞の性質等に応じて適宜選択される。
例えば、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性のヒト軟骨前駆細胞の培養は、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下、及び／又は、ＴＧＦβシグナルを抑制する環境下で行うことが好ましい。
Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下での培養は、例えば有効量のＷｎｔシグナル活性化剤の存在下で培養をすることで行うことができる。Ｗｎｔシグナル活性化剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達（特に、カノニカルＷｎｔ経路）を増強するものである。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔファミリータンパク質などが挙げられる。例えば、ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile）、ＸＡＶ９３９（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、ＬｉＣ１などが挙げられる。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その添加量は例えば、０．１～２０μM程度、好ましくは１～１０μMとすることができる。
ＴＧＦβシグナルを抑制する環境下での培養は、例えば有効量のＴＧＦβシグナル抑制剤の存在下で培養をすることで行うことができる。ＴＧＦβシグナル抑制剤は、ＴＧＦβにより媒介されるシグナル伝達を抑制（阻害）するものである。ＴＧＦβシグナル抑制剤としては、Ａ－８３－０１（3-(6-methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazol-1-carbothioamide）、ＳＢ４３１５４２（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）などが挙げられる。ＴＧＦβシグナル抑制剤としてＡ－８３－０１を用いる場合、その添加量は例えば、０．１～１０μM程度、好ましくは０．２～５μMとすることができる。
培養は、約３７℃程度及び二酸化炭素濃度約５％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されない。上記条件での培養は、例えば公知のＣＯ２インキュベータを用いて温度及びＣＯ２濃度を制御しながら行なうことができる。
培養を行う期間は、特に限定されるものではないが、例えば、６時問～４日程度、好ましくは１日間～３日間程度、より好ましくは２日間程度（４８時間程度）とすることができる。必要に応じて、培地交換を行うことができる。培養条件は、常法に準じることが好ましい。
培地としてＩＭＤＭ培地、Ｆ１２培地、又はその混合培地などの無血清培地を用いることが好ましい。動物由来成分不含の状態で分化誘導並びに維持培養が可能である。また前記無血清培地に、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）、ＥＧＦ、ＦＧＦなどの細胞増殖因子、インスリンなどのホルモン、トランスフェリン、アルブミンなどのタンパク質、脂質、ポリビニルアルコール、モノチオグリセロール等の各種培地添加物を添加することができる。
このようにして、ヒト軟骨前駆細胞から細胞凝集塊が製造される。具体的な実施態様は、後述の実施例に記載のとおりである。
工程（１）で提供される、特定の共重合体からなる複数のスポットを備える細胞凝集塊製造用基板を利用することで、スポットに細胞を接着させた後に剥離させて細胞凝集塊を形成させることが可能である。なお細胞凝集塊とは、細胞が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞凝集塊のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。
工程（４）
工程（４）では、前記工程で得られた細胞凝集塊を培養し軟骨組織体を作成する。
培養は、前記細胞凝集塊から軟骨組織体を作成しうる手法であれば特に限定されず、前記ヒト軟骨前駆細胞から得られる細胞凝集塊の性質等に応じて適宜選択される。
例えば、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性のヒト軟骨前駆細胞から得られる細胞凝集塊の培養は、Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下で培養する工程を含む方法で行うことが好ましい。
Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下での培養は、例えば有効量のＷｎｔシグナル活性化剤の存在下で培養をすることで行うことができる。Ｗｎｔシグナル活性化剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達（特に、カノニカルＷｎｔ経路）を増強するものである。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔファミリータンパク質などが挙げられる。例えば、ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile）、ＸＡＶ９３９（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、ＬｉＣ１などが挙げられる。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その添加量は例えば、０．１～２０μM程度、好ましくは１～１０μMとすることができる。
また培養は、多段階で行うことが好ましい。具体的には、
（ｉ）Ｗｎｔシグナル活性剤の存在下かつＦＧＦシグナル活性化剤の存在下で培養をする工程、次いで
（ii）ＦＧＦシグナル活性化剤の存在下で（かつ好ましくは、Ｗｎｔシグナル活性化剤の非存在下で）培養をする工程、次いで
（iii）好ましくは、Ｗｎｔシグナル活性化剤の非存在下かつＦＧＦシグナル活性化剤の非存在下で培養する工程
の３段階で行うことが好ましい。
ＦＧＦシグナルを活性化する環境下での培養は、例えば有効量のＦＧＦシグナル活性化剤の存在下で培養をすることで行うことができる。ＦＧＦシグナル活性化剤は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達を増強するものである。ＦＧＦシグナル活性化剤としては、ＦＧＦ１／ａＦＧＦ、ＦＧＦ２／ｂＦＧＦなどが挙げられる。ＦＧＦシグナル活性化剤としてＦＧＦ２を用いる場合、その添加量は例えば、０．１～１００ng/mL程度、好ましくは１～５０ng/mLとすることができる。
前記３段階での培養を行う場合、工程（ｉ）及び工程（ii）は二次元細胞培養（平面培養）又は三次元培養で行うことができる。二次元細胞培養は、培養器具を必要に応じて細胞の接着を促進するコーティング処理して行うことができる。工程（iii）は、三次元培養で行うことが好ましい。なお、各段階の培養の間において、前の培養環境の影響を低減するために、ＰＢＳ緩衝液等での洗浄を適宜行った上で培養を行うことが好ましい。
培養は、細胞及び培地を格納するための適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約３７℃程度及び二酸化炭素濃度約５％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されない。上記条件での培養は、例えば公知のＣＯ２インキュベータを用いて温度及びＣＯ２濃度を制御しながら行なうことができる。
Ｗｎｔシグナルを活性化する環境下での培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、２時間～１２日程度、４日間～８日間程度とすることができる。また培養を多段階で行う場合、例えば前記３段階での培養を行う場合、工程（ｉ）及び工程（ii）はそれぞれ、２時間～１２日程度、４日間～８日間程度とすることができ、工程（iii）は、２時間～６０日程度、８日間～５４日間程度とすることができる。必要に応じて、培養期間中に培地交換を行うことができる。培養条件は、常法に準じることが好ましい。
培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前又は直後に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。
工程（４）の培養で用いる培地は、特に限定されない。培地としてＩＭＤＭ培地、Ｆ１２培地、又はその混合培地などの無血清培地を用いることができ、さらにそれらにＬ－アスコルビン酸、ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム培地サプリメント）、ＧＤＦ５、及び／又はＢＭＰ４等を添加した公知の軟骨誘導培地を用いることができる。また、必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）、ＥＧＦ、ＴＧＦβなどの細胞増殖因子、インスリンなどのホルモン、トランスフェリン、アルブミンなどのタンパク質、脂質、ポリビニルアルコール、モノチオグリセロール等の公知の各種培地添加物を添加することもできる。
さらに工程（４）の培養で用いる培地は、好ましくは寒天又は寒天含有培地組成物を含有する。
寒天は、アガロースと、アガロースが部分的に硫酸エステル化され、又はメトキシ基、ピルビン酸基、カルボキシル基により置換されたアガロペクチンとにより構成されるが、これらの構成成分の比率に関して制限はなく、アガロースのみにて構成されてもよい。また、アガロースがヒドロキシエチル化された低融点アガロースや、原料海藻の選択により、又はヒドロキシエチル化を施す等により調製された低融点寒天、さらに温湯に対しても高い溶解性を示す即溶性寒天等も、本発明における「寒天」に含まれる。
本発明では、工業的に製造される粉末状、フレーク状又は固形状の寒天が、高純度で品質も均一であるため、好ましく用いられる。また、医薬品、食品等の分野で、一般的に使用される種々の性状、物性を有するものを用いることができ、重量平均分子量が１０，０００～６０，０００の低分子量の寒天、重量平均分子量が６０，０００を超え１００，０００以下程度で、ゲル強度の低い低強度寒天、重量平均分子量が２９０，０００程度の高分子量の寒天等を用いることができる。かかる寒天としては、市販されている製品を利用することができ、例えば、伊那食品工業株式会社から販売されている「ウルトラ寒天イーナ」、「ウルトラ寒天ＡＸ－３０」、「ウルトラ寒天ＡＸ－１００」、「Ｓ－６」、「Ｓ－７」等を用いることができる。
本発明においては、重量平均分子量が１０，０００～６０，０００であり、一般的な寒天よりも低分子量の寒天（以下、本明細書において「低分子寒天」と称することがある）を用いることが好ましい。低分子寒天の重量平均分子量は、上記の通り１０，０００～６０，０００であり、２０，０００～６０，０００であることがより好ましく、３０，０００～６０，０００であることがさらに好ましく、４０，０００～６０，０００であることがさらにより好ましく、４３，０００～６０，０００であることがより一層好ましく、４３，０００～５０，０００であることが特に好ましい。重量平均分子量が１０，０００未満である寒天を用いた場合には、細胞を分散する効果を得ることが困難な場合がある。一方、重量平均分子量が６０，０００を超える寒天を用いた場合には、細胞又は組織の培地中における分散が不均一となり、十分な増殖促進効果を得ることができない場合がある。
さらに、本発明で用いる低分子寒天としては、分子量分布が狭いものであることが好ましく、寒天の重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値として得られる分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１～８．０であることが好ましく、１．５～７．０であることがより好ましく、２．０～６．０であることがさらに好ましく、２．５～５．５であることがより一層好ましく、３．５～５．０であることが特に好ましい。
なお、寒天の上記重量平均分子量及び数平均分子量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル浸透クロマトグラフィー法により測定することができる。
前記低分子寒天は、通常の寒天の酸処理による低分子化、あるいは、テングサ、オゴノリ、オバクサ等の海藻からの抽出工程時に、又は前記抽出工程もしくはろ過工程のいずれかを経た寒天に対し、酸処理を行う等、公知の方法により製造することができるが、低分子寒天として市販されている製品、例えば上記した「ウルトラ寒天イーナ」（伊那食品工業株式会社製）等を用いることもできる。
前記寒天をそのまま培地添加物として、前記工程（４）で用いる培地に添加するか、又は前記寒天を含む培地組成物を、前記工程（４）で用いる培地で希釈して、培養を実施することができる。そのような寒天含有培地組成物として、例えば「SphereMAX（商標）」（日産化学株式会社製）等を用いることができる。また寒天及び寒天含有培地組成物のさらなる具体的態様は、国際公開第２０１６／１６７３７３号に記載されている。
寒天の含有量は、工程（４）で用いる培地の全量に対して０．００５（w/v）％以上２（w/v）％未満であることが好ましく、０．０３（w/v）％以上２（w/v）％未満であることがより好ましく、０．０３（w/v）％～１（w/v）％であることがさらに好ましく、０．０３（w/v）％～０．１（w/v）％であることがさらにより好ましい。培地中の寒天の含有量が０．００５（w/v）％以上であれば、過剰な大きさの細胞凝集塊を形成することなく増殖し、細胞の増殖促進効果が見られる。また、培地中の寒天の含有量が０．０３（w/v）％以上であれば、細胞又は組織の均一な分散が得られるため、より好ましい。一方、培地組成物中の寒天の含有量が２（w/v）％以上であると、室温でゲル化してしまう場合があるため、取扱いが困難となることがある。
このようにして、軟骨組織体が製造される。軟骨組織体が得られたことは、例えばサフラニンＯ染色、アルシアンブルー染色、サフラニンＯ染色、又はトルイジンブルー染色が陽性であることなどにより確認することができる。
＜軟骨組織体の使用＞
本発明はまた、ヒトの関節軟骨損傷の治療方法であって、本発明の製造方法により得られる軟骨組織体を関節軟骨の損傷又は欠損部位に移植することを特徴とする方法に関する。ここで、軟骨組織体の製造方法の具体的態様や好ましい態様は、上記のとおりである。また移植は、関節軟骨の損傷又は欠損部位に、本発明の製造方法により得られる軟骨組織体の１個又は複数個を入れることにより実施することができる。
［調製例１］
（細胞凝集塊製造用基板の調製）
細胞の付着抑制能を有する培養ディッシュ（直径：３５mm）（住友ベークライト株式会社、ＭＳ９０３５Ｘ）の培養表面の中央部の１．５cm四方の範囲に、２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体（全モノマーに対する２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル）メタクリレートのモル比率が９０％）の水溶液を液滴突出装置（MICROJET corporation、BioSpot BT600）を用いて適量ずつ格子状に上下左右に３００μmの間隔を空けて滴下した後、液滴を室温で１５分間乾燥して固着化させることで、細胞が接着し得る独立した直径１００～１０００μmの円形スポット領域を３５０個有する細胞凝集塊製造用基板を調製した。
［調製例２］
（ＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞の調製）
ヒトｉＰＳ細胞（３×１０４：京都大学ｉＰＳ細胞研究所から提供された414C2細胞株）を、１０μM CultureSure（登録商標）Y-27632（富士フイルム和光純薬（株））及び４μLのiMatrix-511（（株）ニッピ）を含有する１mLのStemFit（登録商標）（味の素ヘルシーサプライ（株））に懸濁し、３５mmの培養皿に加えた。翌日、培地を、Ｙ－２７６３２不含の新たなStemFit（登録商標）に交換した。２日間の培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、各段階で以下の組成を有する培地に交換することにより、原始線条（mid-primitive streak）、側板中胚葉細胞（ＬＰＭ）、肢芽間葉系細胞（ＬＢＭ）へと、順次、分化を誘導した。
・原始線条分化誘導培地組成：
無血清培地：５０％ＩＭＤＭ培地（Gibco）＋５０％Ｆ１２培地（Gibco）＋１mg/mLポリビニルアルコール（Sigma-Aldrich）＋１％（v/v）脂質濃縮物（Gibco）＋４５０μMモノチオグリセロール（Sigma-Aldrich）＋０．７μg/mLインスリン（Sigma-Aldrich）＋１５μg/mLトランスフェリン（Sigma-Aldrich）＋１％（v/v）ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）（以下、「CDM2 basal medium」と称す）
３０ng/mL アクチビンＡ
４０ng/mL ＢＭＰ４
６μM ＣＨＩＲ９９０２１
１００nM ＰＩＫ９０（フナコシ（株））
１０μM Ｙ－２７６３２
・側板中胚葉（ＬＰＭ）分化誘導培地組成：
CDM2 basal medium
１μM Ａ－８３－０１
３０ng/mL ＢＭＰ４
１μM Ｃ５９
１０μM Ｙ－２７６３２
・肢芽間葉系細胞（ＬＢＭ）分化誘導培地組成：
CDM2 basal medium
１μM Ａ－８３－０１
０．５μM ＬＤＮ－１９３１８９
３μM ＣＨＩＲ９９０２１
１５０nM ビスモデギブ
１０μM Ｙ－２７６３２
次いで、得られたＬＢＭ細胞を、Accutase（Thermo Fisher Scientific）を用いて剥離し、２×１０５の細胞を、１６μLのiMatrix-511（（株）ニッピ）を含有する、下記のヒト軟骨前駆細胞分化誘導培地に懸濁し、６０mmの培養皿に加えた。２日ごとに培地を新たなヒト軟骨前駆細胞分化誘導培地に交換し、ヒト軟骨前駆細胞へと分化誘導した。細胞は、サブコンフルエントに達する前に、同様に継代した。
・ヒト軟骨前駆細胞分化誘導培地組成：
CDM2 basal medium
１μM Ａ－８３－０１
３μM ＣＨＩＲ９９０２１
２０ng/mL ＦＧＦ２
２０ng/mL ＥＧＦ
１０μM Ｙ－２７６３２
［実施例１］
（細胞凝集塊の作成）
調製例１で得られた培養ディッシュに、１mLの培地（CDM2 basal medium＋３μM ＣＨＩＲ９９０２１＋１μM Ａ－８３－０１＋２０ng/mL ＥＧＦ＋２０ng/mL ＦＧＦ）で懸濁した、調製例２で得られた１×１０６個のヒト軟骨前駆細胞（以下、「ＥｘｐＬＢＭ細胞」とも称す）を播種し、３７℃で培養を行った。４時間後に培地交換を行った。培地交換２日後に細胞凝集塊が形成されていることが確認された。結果を図１に示す。
（軟骨組織体の作成）
得られた細胞凝集塊を剥離し、ultra low attachment plate (6 well)（Corning社製＃3471）へ移した。移した細胞凝集塊は、培地１にて６日間処理し（day０～day６：培地組成は下記に記載)、day６の時点にて培地２に切り替えて６日間処理し（day６～day１２：培地組成は下記に記載）、その後、培地３に切り替えて４２日間（day１２～day５４：培地組成は下記に記載）培養を行い、軟骨組織体を得た。結果を図２及び図３に示す。図２は実体顕微鏡写真であり、図３は倒立顕微鏡により明視野で撮影を行った写真である。
培地組成
培地１：CDM2 basal medium＋３μM ＣＨＩＲ９９０２１＋１０ng/mL ＦＧＦ２＋５０μg/mL アスコルビン酸＋１×ＩＴＳ＋４％低分子寒天含有培地組成物
培地２：CDM2 basal medium＋１０ng/mL ＦＧＦ２＋５０μg/mL アスコルビン酸＋３０ng/mL ＢＭＰ４＋１０ng/mL ＴＧＦβ１＋１０ng/mL ＧＤＦ５＋１×ＩＴＳ＋０．０４％低分子寒天含有培地組成物
培地３：CDM2 basal medium＋５０μg/mL アスコルビン酸＋３０ng/mL ＢＭＰ４＋１０ng/mL ＴＧＦβ１＋１０ng/mL ＧＤＦ５＋１×ＩＴＳ＋０．０４％低分子寒天含有培地組成物
前記低分子寒天含有培地組成物は、国際公開第２０１６／１６７３７３の試験例１０に従って調製した低分子寒天含有培地組成物である。
（軟骨組織体の観察）
形成された軟骨組織体を４％ＰＦＡで固定し、組織切片を作成してヘマトキシリン（ＨＥ）、アルシアンブルー及びサフラニンＯで染色を行った結果を図４に各々示す。染色条件は以下の通りである。
・ＨＥ染色条件
脱パラフィン後にEosinで１分間の染色を行い、次にヘマトキシリンで２０分標本を処理することで核染色を行った。
・アルシアンブルー染色条件
脱パラフィン後に標本を１％アルシアンブルー／３％酢酸で２０分処理し、３％酢酸で洗浄を行った後、ヘマトキシリンで２０分標本を処理することで核染色を行った。
・サフラニンＯ染色条件
脱パラフィン後にワイゲルト鉄へマトキシリン（Weigert’s iron hematoxylin）溶液で１０分間染色を行った。次にファストグリーン溶液で５分間染色を行った後、１％酢酸で洗浄を行った。次に０．１％サフラニンＯ溶液で５分間染色を行った。
［評価例１］
生検トレパンでＳＣＩＤラット（supplied by the National BioResource Project - Rat, Tokyo University (Tokyo, Japan)）の膝関節軟骨に穴（長径１．５mm、深さ約１mm）を空け、実施例１で作製した軟骨組織体（３個）を押し込んで移植した。移植４週間後に組織片を採取し、各種組織染色（ＨＥ染色、サフラニンＯ、トルイジンブルー染色）を行った。結果を図５に示す。図５に示すように、移植物の欠損部での生着が認められ、同部位で硝子軟骨が形成されていることが分かった。
本発明の製造方法は、品質管理された軟骨前駆細胞を原料とし、分化誘導処理することで軟骨組織とすることができるため、また作製した軟骨組織に軟骨細胞以外の細胞は含まれていないため、軟骨組織体を再生医療に安全に使用する上で有利である。さらに軟骨前駆細胞からの軟骨組織の作製を、所定の培養条件下で行うことにより、効率的な細胞増殖と共に、少数の細胞から大きな軟骨組織片の作成が可能となり、コストの面でも有利である。

Claims (6)

  1. 細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：

    ［式中、
    Ｕａ１及びＵａ２は、メチル基を表し、Ｒa１は、メチル基を表し、Ｒa２は、エチレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：

    ［式中、
    Ｒｂは、水素原子又はメチル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなる複数のスポットを備える細胞凝集塊製造用基板を提供する工程；該基板に、多能性幹細胞由来のＰＲＲＸ１タンパク質陽性であるヒト軟骨前駆細胞を播種する工程；該細胞を培養し細胞凝集塊を作成する工程；該凝集塊を培養し軟骨組織体を作成する工程、を含むことを特徴とする、軟骨組織体の製造方法。
  2. 式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：

    ［式中、
    Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 上記細胞の付着抑制能を有する基板が、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：

    ［式中、
    Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
    を含むコーティング膜をその表面の少なくとも一部に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 軟骨組織体を作成する工程における培養が寒天を含有する培地で実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 寒天の重量平均分子量が１０，０００～６０，０００であり、寒天の含有量が培地の全量に対して０．００５（w/v）％以上２（w/v）％未満である、請求項５に記載の製造方法。
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