JP7720060B2 - 乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット - Google Patents

乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット

Info

Publication number
JP7720060B2
JP7720060B2 JP2022568266A JP2022568266A JP7720060B2 JP 7720060 B2 JP7720060 B2 JP 7720060B2 JP 2022568266 A JP2022568266 A JP 2022568266A JP 2022568266 A JP2022568266 A JP 2022568266A JP 7720060 B2 JP7720060 B2 JP 7720060B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
laminin
breast cancer
amount
antibody
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022568266A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2022124266A1 (ja
Inventor
研治 田村
一起 須藤
尚久 松田
太樹 山地
康司 岡本
真 渡辺
宏隆 藤本
孝明 佐藤
雄太 宮澤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Dai Nippon Toryo Co Ltd
National Cancer Center Japan
Original Assignee
Shimadzu Corp
Dai Nippon Toryo Co Ltd
National Cancer Center Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp, Dai Nippon Toryo Co Ltd, National Cancer Center Japan filed Critical Shimadzu Corp
Publication of JPWO2022124266A1 publication Critical patent/JPWO2022124266A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7720060B2 publication Critical patent/JP7720060B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

本発明は、乳がんの診断補助方法および乳がん検査キットに関する。
乳がんの検査方法としては、主に視診・触診、マンモグラフィ検査、超音波検査等が用いられる。これらの検査により、がんの罹患が疑われる検診者については、病変の一部を採取して細胞診や組織診（生検）による病理検査が行われる（非特許文献１：乳がん、検査・診断、サブタイプ分類［令和２年１０月５日検索］インターネット<URL:https://ganjoho.jp/public/cancer/breast/diagnosis.html>および非特許文献２：Nover AB, Jagtap S, Anjum W, Yegingil H, Shih WY, Shih WH, Brooks AD. Int J Biomed Imaging. 2009,902326）。
乳がんのサブタイプ分類は、遺伝子検査によって分類する方法が提唱されている（非特許文献３：Garrido-Castro AC, Lin NU, Polyak K. Cancer Discov. 2019, 9(2):176-198）。しかし、遺伝子検査は費用がかかるため実用化は難しいとされている。現時点では、遺伝子検査の代わりに生検や手術で採取されたがん細胞を免疫染色することで、臨床病理学的に遺伝子解析の分類に当てはめている。免疫染色の対象は、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰｇＲ））、ＨＥＲ２およびＫｉ６７である。これらは、がん細胞の増殖に関わるタンパク質である。乳がんのサブタイプ分類は、乳がんと診断された場合に行われる。トリプルネガティブ型乳がんは進行が早く予後もほかのサブタイプに比べると不良なために、血液検査で早期にトリプルネガティブ型乳がんとわかることは有用である。
乳がん、検査・診断、サブタイプ分類［令和２年１０月５日検索］インターネット<URL:https://ganjoho.jp/public/cancer/breast/diagnosis.html> Nover AB, Jagtap S, Anjum W, Yegingil H, Shih WY, Shih WH, Brooks AD. Int J Biomed Imaging. 2009,902326 Garrido-Castro AC, Lin NU, Polyak K. Cancer Discov. 2019, 9(2):176-198
乳がんを早期発見し、適切な治療を行うために、乳がんの検査が簡便に行われることが望まれる。本発明は、乳がんを診断するための新たな診断補助方法および乳がん検査キットを提供することを目的とする。
本発明は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する測定工程と、測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、乳がんを診断するための情報を提供する情報提供工程とを含む、乳がんの診断補助方法に関する。
本発明は、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を含む、乳がん検査キットに関する。
本発明によれば、乳がんを診断するための新たな診断補助方法および乳がん検査キットが提供される。
ラミニンの構造を説明する図である。 本発明に係る乳がん検査キットの一例を示す図である。 本発明に係る乳がん検査キットの使用の一例を示す図である。 実施例の実験２において、乳がん由来細胞株のラミニン５発現量を示すグラフである。 左図は、実施例の実験３において、乳がん患者および健常者の血漿中のラミニン５およびＣＤ９（エクソソームマーカー）の量をイムノクロマトグラフィ法により検出した結果である。右図は、左図のイムノクロマトグラフィの結果から、ラミニン５の発現量をＣＤ９の発現量で標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を示すグラフである。 実施例の実験４において、ＨＥＲ２型乳がん患者およびトリプルネガティブ型乳がん患者の血漿中のラミニン５の量をＣＤ９の量で標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を示すグラフである。 実施例の実験５において、乳がん患者および健常者のラミニン５の量をＣＤ９の量で標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を示す図である。 実施例の実験５において、ラミニン５による乳がん患者の識別能を示すＲＯＣ曲線である。 実施例の実験５において、早期乳がん患者および健常者のラミニン５の量をＣＤ９の量で標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を示す図である。 実施例の実験５において、ラミニン５による早期乳がん患者の識別能を示すＲＯＣ曲線である。 実施例の実験６において、乳がん患者および健常者のラミニン５の量をＣＤ９の量で標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を示す図である。 実施例の実験６において、ラミニン５による乳がん患者の識別能を示すＲＯＣ曲線である。
＜乳がんの診断補助方法＞
本発明の一態様に係る乳がんの診断補助方法は、
試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する測定工程と、
測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、乳がんを診断するための情報を提供する情報提供工程とを含む。
本発明に係る乳がんの診断補助方法によれば、乳がんを診断するための情報を簡便に提供することが可能となる。本発明に係る診断補助方法は、医師による判断工程を含まず、人間を診断する方法には該当しない。
以下、各工程について詳細に説明する。
本発明に係る乳がんの診断補助方法は、まず試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する。以下、この工程を「測定工程」ともいう。
ラミニンは、細胞外マトリックスである基底膜を構成する巨大なタンパク質であり、多細胞体制および組織構築とその維持、細胞接着、細胞移動、細胞増殖促進等に関与する。図１に示すように、ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合によって結合したへテロ三量体構造をとる。ヒトでは５種類のα鎖（α１、α２、α３、α４、α５）、３種類のβ鎖（β１、β２、β３）とγ鎖（γ１、γ２、γ３）が存在し、それらの組み合わせが異なる少なくとも１７種類のラミニンがこれまで同定されている。ラミニン５は、ラミニン－３３２とも呼ばれ、α３鎖、β３鎖およびγ２鎖から構成される。ラミニンβ３は、これまで報告されたラミニンのうち、ラミニン５にのみ含まれる。ラミニン５の量とラミニンβ３の量は相関し得る。試料に含まれるラミニンβ３には、三量体の複合体を形成したラミニンβ３と、複合体を形成していないラミニンβ３とが含まれると考えられる。
ラミニン５およびラミニンβ３の量を測定する方法は特に限定されず、タンパク質を精度良く定量的に測定可能な公知の方法を用いることができる。測定方法としては、免疫学的測定法、質量分析法等が挙げられる。測定方法は、適宜組合わせて用いることもできる。
免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用する測定方法であり、例えばイムノクロマトグラフィ法、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射線免疫測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、アフィニティクロマトグラフィ法、フローサイトメトリー、金属標識抗体と質量分析とを用いた免疫測定法等が挙げられる。測定の迅速性および簡便性に優れる観点からは、イムノクロマトグラフィ法が好ましい。
免疫学的測定法に用いられる抗体は、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を含む。抗ラミニン５抗体および抗ラミニンβ３抗体は、それぞれラミニン５およびラミニンβ３の検出に用いられる。検出感度および特異性が優れる観点からは、免疫学的測定法には抗ラミニン５抗体を用いることが好ましい。
免疫学的測定法に用いられる抗体は、検出に適した物質で標識されていてもよい。標識としては金属粒子、酵素、蛍光物質、放射性物質、親和性物質等が挙げられる。金属粒子としては、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノロッド、銀ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレート等、さらに、異種金属で被覆された各種形状の金属ナノ粒子が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ローダミン、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、その他の蛍光タンパク質等が挙げられる。放射性物質としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等が挙げられる。親和性物質としては、ビオチンおよびストレプトアビジン等が挙げられる。標識は、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体に付加されていてもよく、これらの一次抗体を特異的に認識する二次抗体に付加されていてもよい。高感度の検出が可能である観点からは、抗体は金属粒子または酵素で標識されていることが好ましい。基質が酵素によって触媒されて化学発光すると、シグナルが増幅されて、検出感度が向上する。金属粒子で標識された抗体は、凝集すると吸収波長が変化するため、ラミニン５またはラミニンβ３の量を肉眼で検出可能な色の変化として確認することができる。色の変化は、公知の画像処理装置により数値化してもよい。金属粒子で標識された抗体は誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によっても検出が可能であり、ラミニン５またはラミニンβ３が少量であっても高感度に測定することができる。抗体の検出は、各標識を検出するために通常用いられる装置を用いて行えばよい。
免疫学的測定法によるラミニン５またはラミニンβ３の測定方法の一例として、イムノクロマトグラフィを行なって試料を展開、捕捉した後、標識された抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を可視光（吸光）、ＩＣＰ－ＭＳ、化学発光または蛍光により検出してもよい。
質量分析法によるラミニン５およびラミニンβ３の量の測定方法としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等のイオン化法によりタンパク質をイオン化させ、タンパク質イオンの質量／電荷比（ｍ／ｚ）により分解されたピークごとのシグナルの強弱をもって定量分析を行う方法が挙げられる。また、試料をトリプシン等のプロテアーゼによって酵素消化処理し、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）によって分離・濃縮し、質量分析を行う液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって、ペプチド定量により標的タンパク質の定量分析を行ってもよい。質量分析計としては、一般的なシングルタイプの質量分析計の他、トリプル四重極型（ＱｑＱ型）質量分析計、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分析計、タンデム時間飛行型（ＴＯＦ－ＴＯＦ型）質量分析計、四重極イオントラップ型（ＱＩＴ型）質量分析計、四重極イオントラップ飛行時間型（ＱＩＴ／ＴＯＦ型）質量分析計等のタンデム質量分析計を好適に用いることができる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおいて、トリプル四重極型質量分析計を用いて多重反応モニタリング（ＭＲＭ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を行ってもよい。トリプル四重極型質量分析計は、定量性に優れる。ＭＲＭでは、夾雑イオンとの分離を装置内で行うため、ノイズレベルを一層低くすることができ、微量なペプチドの定量分析も可能となる。
質量分析法によってラミニン５またはラミニンβ３の量の測定を行なう場合、タンパク質複合体の分離、タンパク質の断片化が起こり得ることから、ラミニンβ３の量を測定することが好ましい。
試料は、培養細胞、培養組織またはその培養上清であってもよいが、好ましくは被検体から採取された生体試料である。生体試料としては、動物から得た血液であってよく、生体組織、尿、糞便、汗、唾液、リンパ液、羊水、母乳、胸水、腹水、脳脊髄液、涙等であってもよい。血液は、全血であってもよいが、好ましくは血漿または血清である。試料は、生理食塩水、緩衝液等で希釈されてもよい。生体試料の採取は、生体試料の種類に応じ、適宜公知の方法で行えばよい。被検体としては、好ましくはヒト個体であり、例えば乳がん患者、乳がんの罹患が疑われる者、健常者である。試料として、被検体から採取された生体試料を用いることにより、被検体の乳がんの診断のための情報を提供することができる。試料は、好ましくはヒト個体から採取された血液である。試料として、ヒト個体から採取された血液を用いることにより、精度よく、また簡便にヒトの乳がんを診断するための情報を提供することが可能になる。
ラミニン５およびラミニンβ３の量の測定精度を上げるために、試料は、適宜精製または前処理されてもよく、ろ過、遠心分離、アフィニティ分離、透析、沈殿処理等の操作を行ってもよい。試料は、エクソソームの精製画分であってもよい。試料がエクソソームの精製画分であるとき、試料中の夾雑物を減らし、測定の精度を向上させることができる。エクソソームは、細胞から分泌される直径１００ｎｍ前後の小胞であり、血液、唾液、尿等の体液中に多量に存在する。エクソソームは、その表面に細胞膜由来の脂質およびタンパク質を含み、内部にはｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸およびタンパク質を含むことが知られている。エクソソームの精製は、市販の精製キット、遠心分離、密度勾配遠心、サイズ除去クロマトグラフィー、フィルター処理等の公知の方法によって行うことができる。
本発明に係る乳がんの診断補助方法は、測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、乳がんを診断するための情報を提供する工程を含む。以下、この工程を「情報提供工程」ともいう。
情報提供工程において、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量と所定の値とを対比し、乳がんを診断するための情報を得る。乳がんを診断するための情報は、例えば（１）乳がんであるかどうか、（２）乳がんサブタイプ、（３）乳がんのステージ、を診断するための情報等を含んでよい。これらのうち、１つまたは２つ以上の情報が同時に提供され得る。
（１）乳がんであるかどうか
後期ステージになるほど乳がん患者の５年生存率は低下するため、できるだけ早期に診断が行われることが好ましい。本実施形態に係る診断補助方法においては、従来の検査では発見しにくい初期の乳がんであっても、乳がんであるかどうかを診断するための情報を非侵襲的に簡便に提供することができる。
ラミニン５またはラミニンβ３の量と所定の値との対比は、乳がんであるかどうかを診断するための有益な情報として提供され得る。所定の値は、例えば乳がん由来ではない培養細胞の培養上清のラミニン５またはラミニンβ３の量、健常者の体液（血漿、血清等）中のラミニン５またはラミニンβ３の量である。乳がん患者では、健常者に比べて、ラミニン５またはラミニンβ３が多く検出される傾向にある。試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値よりも高いとき、試料が乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
（２）乳がんサブタイプ
乳がんのサブタイプは、ルミナルＡ型、ルミナルＢ型、ＨＥＲ２型およびトリプルネガティブ型が知られている。トリプルネガティブ型乳がんは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）およびＨｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（ＨＥＲ２）のいずれもが陰性である。乳がんの治療方法のひとつとして、乳がんをサブタイプに分類し、がん細胞の特性に合わせた治療法、例えば内分泌（ホルモン）療法、化学療法、分子標的治療等を選択する方法が採用されている。したがって、乳がんの適当な治療を行うためには、乳がんのサブタイプが診断される必要がある。
乳がんのサブタイプ分類は、乳がんの検査で罹患が疑われた場合に行われるため、比較的早期のがん患者には適用され難い。乳がんのサブタイプ分類は、遺伝子検査によって分類する方法が提唱されている。しかし、遺伝子検査は費用がかかるため実用化は難しいとされている。一方、トリプルネガティブ型乳がんは進行が早く、後期（ステージＩＩＩおよびＩＶ）のトリプルネガティブ型乳がん患者の５年無再発生存率は低い。従って、できるだけ早期の段階で乳がんのサブタイプが診断される必要がある。本実施形態に係る診断補助方法においては、乳がんサブタイプを診断するための情報を簡便に提供することができる。
ラミニン５またはラミニンβ３の量と所定の値との対比は、乳がんサブタイプ、特にトリプルネガティブ型乳がんを診断するための有益な情報として提供され得る。所定の値は、例えば乳がん由来ではない培養細胞またはトリプルネガティブ型乳がん由来ではない培養細胞の培養上清のラミニン５またはラミニンβ３の量、健常者またはトリプルネガティブ型乳がん以外の乳がん患者の体液（血漿、血清等）中のラミニン５またはラミニンβ３の量である。トリプルネガティブ型乳がん患者では、健常者およびトリプルネガティブ型乳がん以外の乳がん患者に比べて、ラミニン５またはラミニンβ３が多く検出される傾向にある。試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値よりも高いとき、試料がトリプルネガティブ型乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
（３）乳がんのステージ
乳がんの進行の程度は、しこりの大きさ、リンパ節または他の臓器への転移の状況により、ステージ０、Ｉ、ＩＩ（ＩＩＡ、ＩＩＢ）、ＩＩＩ（ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ）またはＩＶに分類される。治療は、がんの進行の程度に応じて行われるため、乳がんのステージが診断される必要がある。本実施形態に係る診断補助方法においては、乳がんのステージを診断するための情報を簡便に提供することができる。
ラミニン５またはラミニンβ３の量と所定の値との対比は、乳がんのステージ、特にステージＩおよびＩＩの早期乳がんを診断するための有益な情報として提供され得る。このとき、所定の値は、例えば乳がん由来ではない培養細胞またはステージＩＩＩもしくはステージＩＶの後期乳がん由来である培養細胞の培養上清のラミニン５またはラミニンβ３の量、健常者またはステージＩＩＩもしくはステージＩＶの後期乳がん患者の体液（血漿、血清等）中のラミニン５またはラミニンβ３の量である。早期乳がん患者では、健常者または後期乳がん患者に比べて、ラミニン５またはラミニンβ３が多く検出される傾向にある。試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値よりも高いとき、試料が早期乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
情報提供工程において、ラミニン５またはラミニンβ３の量は、測定値そのものまたは試料中の濃度であってもよいが、試料に含まれるコントロールの量に対するラミニン５またはラミニンβ３の量であることが好ましい。コントロールは、例えばエクソソームであってもよい。コントロールとしてエクソソームを用いるとき、情報提供工程において、エクソソームの量でラミニン５またはラミニンβ３の量を標準化する。サンプル中に含まれるエクソソーム量はサンプルごとに異なり得るため、ラミニン５またはラミニンβ３の測定量をコントロールによって標準化することで、乳がんを診断するための情報の精度を向上させることができる。エクソソームの量は、エクソソームマーカーの量によって測定することができる。エクソソームマーカーとしては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等の表面抗原が挙げられる。
例えば試料に含まれるＣＤ９の量に対するラミニン５またはラミニンβ３の量比が、健常者の血漿中のＣＤ９の量に対するラミニン５またはラミニンβ３の量比よりも大きいとき、好ましくは２倍以上であるとき、試料はトリプルネガティブ型乳がんを含む乳がん由来である、および／または早期乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
エクソソームマーカーの量の測定は、公知の方法によって行うことができ、好ましくは上述のラミニン５またはラミニンβ３の量の測定方法と同じ方法によって行う。免疫学的測定法によってエクソソームマーカーの量を測定する場合、エクソソームマーカーに対する抗体を用いることにより、ラミニン５またはラミニンβ３と同じ方法で、エクソソームマーカーの量を測定できる。エクソソームマーカーに対する抗体が、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体とは異なる物質（異なる金属粒子、異なる蛍光物質等）で標識されている場合、同一の実験系内でラミニン５またはラミニンβ３とエクソソームマーカーとを検出することもできる。質量分析法を用いた場合、任意のタンパク質が検出可能であるため、エクソソームマーカーの量の測定と、ラミニン５またはラミニンβ３の量の測定とを一分析で行うことができる。
＜乳がん検査キット＞
本発明の一態様に係る乳がん検査キットは、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を含む。本発明に係る乳がん検査キットは、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定することにより、乳がんを診断するための情報を簡便に提供することが可能となる。乳がんを診断するための情報は、例えば（１）乳がんであるかどうか、（２）乳がんサブタイプ、（３）乳がんのステージ、を診断するための情報等を含んでよい。これらのうち、１つまたは２つ以上の情報が同時に提供され得る。
抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体は、上述のラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する方法において用いられる抗体と同じであってよい。抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体は、ラミニン５またはラミニンβ３の検出に用いられ、好ましくは金属粒子または酵素で標識されている。抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を検出するための二次抗体が標識されていてもよい。抗体が酵素で標識されているとき、基質の反応生成物由来のシグナルが検出されるため、反応時間や検出時間を長くすることで、高感度での検出が可能となる。また、金属粒子で標識された抗体は、凝集すると吸収波長が変化するため、ラミニン５またはラミニンβ３の量を可視光（吸光）で確認することができる。金属粒子で標識された抗体は、少量であっても誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によっても検出が可能であり、ラミニン５またはラミニンβ３の量を高感度に測定することもできる。
検査キットは、免疫学的測定法または質量分析法によって試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定できることが好ましい。測定の迅速性および簡便性に優れる観点からは、検査キットは好ましくはイムノクロマトグラフィ法を利用する。
検査キットは、イムノクロマトグラフィを行うためのイムノクロマト試験紙、コントロールを検出するための抗体、ラミニン５またはラミニンβ３を捕捉する因子または抗体、ラミニン５またはラミニンβ３の標準品、取り扱い説明書等をさらに含んでいてもよい。本発明に係る検査キットに含まれるイムノクロマト試験紙の一例を図２に示す。イムノクロマト試験紙１０は、一般的にメンブレン１１と吸水パッド１２とが連接されている（図２Ａ）。メンブレン１１には、捕捉抗体１３が固定化され、検出ラインを形成し得る。捕捉抗体１３は、ラミニン５またはラミニンβ３を捕捉する因子または抗体、あるいはエクソソームマーカーを捕捉する因子または抗体であってもよい。メンブレン１１は、例えばニトロセルロース膜である。吸水パッド１２は、試料を速やかに吸収するための部分である。イムノクロマト試験紙１０は、さらにサンプルパッド１４を有してもよく（図２Ｂ）、サンプルパッド１４およびコンジュゲートパッド１５を有してもよい（図２Ｃ）。サンプルパッド１４は、サンプル供給部を担う部分であり、液体の試料を吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができる性質を有する。コンジュゲートパッド１５は、検出抗体を含み、メンブレン１１へ検出抗体を放出することができる。検出抗体は、ラミニン５またはラミニンβ３を捕捉する因子または抗体、あるいはエクソソームマーカーを捕捉するための因子または抗体であってもよい。コントロールとしては、エクソソームを用いることができる。エクソソームは、マーカータンパク質のひとつであるＣＤ９によって検出することができる。ラミニン５またはラミニンβ３を捕捉する因子または抗体は、メンブレン上に固定化された抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体であってもよい。なお、エクソソームに含まれるラミニン５またはラミニンβ３を検出する場合、ラミニン５またはラミニンβ３を捕捉する因子または抗体は、メンブレン上に固定化されたエクソソームマーカーを捕捉する抗体であってもよく、例えば抗ＣＤ９抗体であってもよい。
イムノクロマト試験時の捕捉抗体１３と検出抗体とは、例えば表１に記載の組合わせで用いることができる。パターン１に示すように、捕捉抗体としてエクソソームマーカーを捕捉する抗体、検出抗体としてエクソソームマーカーを捕捉する抗体を用いれば、試料中に存在するエクソソームを検出することができ、コントロールとしてエクソソームを定量することができる。パターン２に示すように、捕捉抗体として抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体、検出抗体として抗ラミニンβ３抗体または抗ラミニンβ３抗体を用いれば、試料中に存在するラミニン５またはラミニンβ３を検出することができ、ラミニン５またはラミニンβ３を定量することができる。パターン３に示すように、捕捉抗体としてエクソソームマーカーを捕捉する抗体、検出抗体として抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を用いれば、試料中に存在するラミニン５またはラミニンβ３を有するエクソソームを検出することができ、エクソソームに発現するラミニン５またはラミニンβ３を定量することができる。パターン４に示すように、捕捉抗体として抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体、検出抗体としてエクソソームマーカーを捕捉する抗体を用いれば、試料中に存在するラミニン５またはラミニンβ３を有するエクソソームを検出することができ、エクソソームに発現するラミニン５またはラミニンβ３を定量することができる。
検査に供する試料は、上述のラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する方法において用いられる試料と同じであってもよい。試料は、好ましくは血液、血漿、血清またはこれらのエクソソーム精製画分である。試料は、好ましくはヒト個体から採取された血液である。
本発明に係る検査キットの使用の一例を図３に示す。図３に記載の検査キットはイムノクロマト試験紙１０を含む。イムノクロマト試験紙１０のメンブレン１１の検出ライン上には、捕捉抗体１３が固定化されている。イムノクロマト試験紙１０の吸水パッド１２とは反対側の端部から吸収された試料は、毛細管現象により、メンブレン１１に展開され、吸水パッド１２に吸収される（Ｓｔｅｐ１）。このとき、試料に含まれる検出対象物１６（ラミニン５もしくはラミニンβ３またはこれらを含むエクソソーム）が捕捉される。試料の展開後または試料の展開と同時に金属粒子で標識された検出抗体１７を展開する（Ｓｔｅｐ２）。検出抗体１７が金属粒子で標識されている場合、検出ライン上に検出抗体１７が集合することで、検出ラインにおける着色を目視で確認することができる。金属粒子で標識された検出抗体１７は、ＩＣＰ－ＭＳで検出されてもよい。検出抗体１７が酵素または蛍光で標識されている場合、基質を添加して生じた化学発光または蛍光により検出抗体１７を検出できる。
ラミニン５またはラミニンβ３をより定量的に評価するために、コントロールとしてＣＤ９の量を測定し、試料に含まれるＣＤ９の量でラミニン５またはラミニンβ３の量を標準化してもよい。ＣＤ９の量は、抗ＣＤ９抗体を捕捉抗体および検出抗体として用いたイムノクロマトグラフィ法によって測定できる。ＣＤ９の量の測定は、本発明に係る検査キットと同じキットを用いて行ってもよいし、異なるキットを用いて行ってもよい。ＣＤ９と、ラミニン５またはラミニンβ３とは、同一メンブレン上の捕捉抗体によって捕捉されたエクソソームを、異なる標識がされた抗ＣＤ９抗体と、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体とを用いて同時に検出してもよい。
検査キットにより測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量を、所定の値と比較する。所定の値は、＜乳がんの診断補助方法＞で挙げられた値であってよく、例えば乳がん由来ではない培養細胞、トリプルネガティブ型乳がん由来でない培養細胞または後期乳がん由来である培養細胞の培養上清のラミニン５またはラミニンβ３の量、健常者またはトリプルネガティブ型乳がん以外の乳がん患者または後期ステージ乳がん患者の体液（血漿、血清等）中のラミニン５またはラミニンβ３の量である。検査キットにより、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値よりも多く検出されたとき、試料はトリプルネガティブ型乳がんを含む乳がん由来である、および／または早期乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
検査キットにより測定された、コントロールの量に対するラミニン５またはラミニンβ３の量比が、健常者の血漿中のコントロールの量(任意)に対するラミニン５またはラミニンβ３の量比よりも大きいとき、好ましくは２倍以上であるとき、試料はトリプルネガティブ型を含む乳がん由来である、および／または早期乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
＜乳がん診断マーカー＞
本発明の一態様に係る乳がん診断マーカーは、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３からなる。本発明に係る乳がん診断マーカーによれば、乳がんを診断するための情報を提供することができ、乳がんであるかどうか、乳がんサブタイプおよび乳がんのステージを診断するための有用な情報が簡便に提供される。
試料およびラミニン５またはラミニンβ３は、上述したものであってよい。本発明に係る診断マーカーを検出する方法は特に限定されず、例えば上述の方法によってラミニン５またはラミニンβ３の量を測定することができる。試料が乳がん由来であるか、トリプルネガティブ型乳がん由来であるかおよび早期乳がん由来であるかは、測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、上述の基準により判断できる。
＜測定方法＞
本発明の一態様に係る測定方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する。本発明に係る測定方法によれば、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が求められる。ラミニン５またはラミニンβ３の量は、乳がんを診断するための情報を提供することができ、乳がんであるかどうか、乳がんサブタイプおよび乳がんのステージを診断するための情報として用いることができる。試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値以上であるとき、試料がトリプルネガティブ型乳がんを含む乳がん由来である、および／または早期乳がん由来であると判断するための有用な情報となる。
測定方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定できる方法であれば特に限定されず、上述の測定工程の欄に記載の方法と同じであってよい。試料および所定の値とは、上述したものであってよい。
＜乳がんの診断方法＞
本発明の一態様に係る乳がんの診断方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値以上であるときに、試料が乳がん由来であると判断する工程を含む。また、試料の乳がんサブタイプおよび乳がんのステージを診断することもできる。本発明に係る乳がんの診断方法によれば、試料が乳がん由来であるか、トリプルネガティブ型乳がん由来であるか、および早期乳がん由来であるかを簡便に診断することができる。
試料および所定の値とは、上述したものであってよい。試料が被検体から採取された生体試料であるとき、本発明に係る乳がんの診断方法によって、被検体が乳がん患者であるかどうか、乳がんサブタイプおよび乳がんのステージを簡便に判断することができる。本発明に係る乳がんの診断方法は、上述の測定工程および情報提供工程を含んでもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実験１＞
トリプルネガティブ型乳がんとそれ以外の乳がんとのタンパク質発現の違いを調べるためにタンパク質の網羅的解析を行なった。まず、ヒトトリプルネガティブ型乳がん細胞株（ＭＭ２３１）の培養上清およびルミナルＡ型乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の培養上清から超遠心法によって、それぞれエクソソーム画分を精製した。エクソソームの精製画分を酵素消化後、質量分析（Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計）によるショットガンプロテオミクス解析に供し、エクソソーム画分に含まれていたタンパク質を検出した。ラミニンβ３は、トリプルネガティブ型乳がん細胞株では高濃度で検出されたが、ルミナルＡ型乳がん細胞株では低濃度であった。ラミニンβ３は、ラミニン５にのみ含まれるため、トリプルネガティブ型乳がん細胞株ではラミニン５が多く発現し、また、エクソソーム中に多く含まれていることが示唆された。
＜実験２＞
他のヒトトリプルネガティブ型乳がん細胞株を用いて、ラミニン５の発現を確認した。１１種のヒトトリプルネガティブ型乳がん細胞株およびルミナルＡ型乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の培養上清から超遠心法でエクソソーム画分をそれぞれ精製し、ラミニン５およびＣＤ９の発現量をイムノクロマト法により検出した。
（ＣＤ９発現量の検出）
ニトロセルロースメンブレンを備えたハーフストリップのイムノクロマト試験紙の中央部に、マウス抗ＣＤ９抗体（メーカー：Ｈａｎｓａ Ｂｉｏ Ｍｅｄ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号：ＨＢＭ－ＣＤ９－１００）を固定化した。その後、このメンブレンを水溶性高分子およびＢＳＡでブロッキングした。このイムノクロマト試験紙の吸水パッドが取り付けられていない方の端を、１×１０９個のエクソソームを含む溶液に浸し、イムノクロマト試験紙に展開させた。なお、エクソソーム溶液は上記実験１の精製により得られたエクソソーム画分を１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで希釈して調製した。次に、Ａｂ－１０ Ｒａｐｉｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（メーカー：株式会社同仁化学研究所製、製品番号：ＬＫ３３）を用いてＨＲＰ標識したマウス抗ＣＤ９抗体を含む展開液を展開した。そして、イムノスター（登録商標）ＬＤ（メーカー：富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号：２９０‐６９９０４）により発光させて、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００により発光を検出した。
（ラミニン５発現量の検出）
上記の抗体をウサギ抗ＬＡＭ５抗体（メーカー：アブカム株式会社、製品番号：ａｂ１４５０９）に代え、同様の手順で１×１０１０個のエクソソームを含む溶液を展開した。次に、Ａｂ－１０ Ｒａｐｉｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（メーカー：株式会社同仁化学研究所製、製品番号：ＬＫ３３）を用いてＨＲＰ標識したウサギ抗ＬＡＭ５抗体を含む展開液を展開した。そして、イムノスター（登録商標）ＬＤにより発光させて、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００により発光を検出した。
（検出強度（輝度差）の測定）
イムノクロマト試験紙上の抗体を固定した部分周辺の合計輝度と、発光していない同面積部分の合計輝度をＩｍａｇｅＪで測定して、それらの差（輝度差）より、ＣＤ９とラミニン５それぞれの発現量を求めた。ラミニン５の発現量をＣＤ９の発現量で割って標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を図４に示す。トリプルネガティブ型乳がん由来ではない細胞株（ＭＣＦ７）と比べて、検討した１１種全てのトリプルネガティブ型乳がん細胞株でラミニン５／ＣＤ９が亢進していた。
＜実験３＞
トリプルネガティブ型乳がん患者由来の生体試料において、ラミニン５の発現が上昇しているかを検証した。乳がん患者３検体（ＨＥＲ２型、トリプルネガティブ型、ルミナルＢ型）および健常者３検体の血漿を試料として、イムノクロマトグラフィ法によりラミニン５およびＣＤ９を検出した。
（ＣＤ９発現量の検出）
イムノクロマト試験紙は、上記の実験２と同様の方法でマウス抗ＣＤ９抗体を固定化し、メンブレンを水溶性高分子およびＢＳＡでブロッキングしたものを用いた。このイムノクロマト試験紙に、血漿を１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３倍希釈し、孔径が０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過した溶液９μＬを展開した。次に、実験２と同様の方法でＨＲＰ標識したマウス抗ＣＤ９抗体を含む展開液を展開した。そして、イムノスター（登録商標）ＬＤ（品番：２９０‐６９９０４、製造元：富士フイルム和光純薬株式会社）により発光させて、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００により発光を検出した。
（ラミニン５発現量の検出）
イムノクロマト試験紙は、上記の実験２と同様の方法でウサギ抗ＬＡＭ５抗体を固定化し、メンブレンを水溶性高分子とＢＳＡでブロッキングしたものを用いた。このイムノクロマト試験紙に、血漿を１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３倍希釈し、孔径が０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過した溶液９０μＬを展開した。次に、実験２と同様の方法でＨＲＰ標識したウサギ抗ＬＡＭ５抗体を含む展開液を展開した。そして、イムノスター（登録商標）ＬＤ（品番：２９０‐６９９０４、製造元：富士フイルム和光純薬株式会社）により発光させて、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００により発光を検出した。
その結果、図５の左図に示すように、ラミニン５およびＣＤ９が検出された。イムノクロマト試験紙上の抗体を固定した部分周辺の合計輝度と、発光していない同面積部分の合計輝度をＩｍａｇｅＪで測定して、それらの差（輝度差）よりラミニン５およびＣＤ９の発現量を求めた。ラミニン５の輝度をＣＤ９の輝度で割った値を図５の右図に示す。乳がん患者の血漿中のラミニン５／ＣＤ９は健常者のラミニン５／ＣＤ９よりも高く、トリプルネガティブ型乳がん患者のラミニン５／ＣＤ９は他のサブタイプの乳がん患者よりも高値を示していた。
＜実験４＞
さらに、ＨＥＲ２型乳がん患者５検体およびトリプルネガティブ型乳がん患者１０検体について、ＣＤ９の発現量およびラミニン５の発現量を測定した。実験方法は実験３と同じである。ラミニン５の輝度をＣＤ９の輝度で割った値を図６に示す。ＨＥＲ２型乳がん患者の血漿中のラミニン５／ＣＤ９に対して、トリプルネガティブ型乳がん患者の血漿中のラミニン５／ＣＤ９は１０検体中６検体で２倍以上高くなっていた。また、ラミニン５の量に基づいて、乳がん患者のサブタイプ（トリプルネガティブ型）を特異度１００％、感度６０％で診断することができた。ラミニン５を乳がんサブタイプの診断マーカーとして使用できることが示唆された。
＜実験５＞
乳がん患者および健常者の検体数を増やして、乳がん患者のラミニン５の発現が上昇しているかを検証した。健常者２０検体および乳がん患者４５検体の血漿中のＣＤ９およびラミニン５の発現量を測定した。測定方法は、実験３と同じである。乳がん患者のサブタイプおよびステージを表２および表３に示す。
ラミニン５の輝度をＣＤ９の輝度で割って標準化した値(ラミニン５／ＣＤ９)を図７Ａに示す。乳がん患者のラミニン５／ＣＤ９は、健常者のラミニン５／ＣＤ９よりも統計学的有意に（ｐ＝０．００１１）高くなっていた。乳がん患者のラミニン５／ＣＤ９による識別能を示すＲｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）曲線を図７Ｂに示す。曲線下面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）は、０．８０であった。これらのことは、ラミニン５は乳がん患者において発現が亢進しており、乳がんの識別能が高いことを示唆する。
乳がん患者のうち、早期乳がん患者（ステージＩおよびＩＩ）３２検体と健常者２０検体のラミニン５の発現量を比較した。図８Ａに示すように、早期乳がん患者のラミニン５／ＣＤ９は、健常者のラミニン５／ＣＤ９よりも統計学的有意に（ｐ＝０．０００７）高くなっていた。早期乳がん患者のラミニン５／ＣＤ９による識別能を示すＲＯＣ曲線を図８Ｂに示す。ＡＵＣは、０．８２であった。ラミニン５は早期乳がん患者において発現が亢進しており、早期乳がんの識別能も高いことが示唆された。
＜実験６＞
実験５とは異なる集団の検体（乳がん患者２０検体および健常者２０検体）を用いて、早期乳がんの診断マーカーとしてのラミニン５の性能を検証した。乳がん患者のステージを表４に示す。乳がん患者および健常者の血漿中のラミニン５およびＣＤ９の発現量を測定した。測定方法は実験５と同じである。算出されたラミニン５／ＣＤ９を図９Ａに示す。乳がん患者においては、健常者と比較して統計学的有意（ｐ＝０．０００３）にラミニン５の発現が亢進していた。乳がん患者のＲＯＣ曲線におけるＡＵＣは０．８９であり（図９Ｂ）、ラミニン５が早期乳がんの識別にも優れていることが確認された。以上より、ラミニン５は早期乳がんの識別マーカーとしても高い性能を有することが示された。
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）
一態様に係る乳がんの診断補助方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する測定工程と、測定されたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、乳がんを診断するための情報を提供する情報提供工程とを含む。
第１項に記載の診断補助方法によれば、乳がんを診断するための情報を簡便に提供することが可能となる。
（第２項）
第１項に記載の診断補助方法において、乳がんを診断するための情報は、乳がんであるかどうかを診断するための情報を含む。
第２項に記載の診断補助方法によれば、乳がんであるかどうかを診断するための情報を簡便に提供することができる。
（第３項）
第１項または第２項に記載の診断補助方法において、乳がんを診断するための情報は、乳がんサブタイプを診断するための情報を含む。
第３項に記載の診断補助方法によれば、乳がんサブタイプを診断するための情報を簡便に提供することができる。
（第４項）
第１項～第３項に記載の診断補助方法において、乳がんを診断するための情報は、乳がんのステージを診断するための情報を含む。
第４項に記載の診断補助方法によれば、乳がんのステージを診断するための情報を簡便に提供することができる。
（第５項）
第１項～第４項に記載の診断補助方法において、測定工程では、免疫学的測定法または質量分析法によって、ラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する。
第５項に記載の診断補助方法によれば、ラミニン５およびラミニンβ３の量を精度良く測定することができる。
（第６項）
第５項に記載の診断補助方法において、免疫学的測定法はイムノクロマトグラフィ法である。
第６項に記載の診断補助方法によれば、迅速かつ簡便にラミニン５およびラミニンβ３の量を測定することができる。
（第７項）
第５項または第６項に記載の診断補助方法において、免疫学的測定法に用いられる抗体は、金属粒子または酵素で標識されている。
抗体が酵素で標識されているとき、ラミニン５またはラミニンβ３の量を高感度に測定することができる。また、抗体が金属粒子で標識されているとき、ラミニン５またはラミニンβ３の量を可視光（吸光）により検出することが可能である。
（第８項）
第７項に記載の診断補助方法において、金属粒子を誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって検出する。
第８項に記載の診断補助方法によれば、金属粒子が少量であっても検出が可能であるため、ラミニン５またはラミニンβ３の量を高感度に測定することができる。
（第９項）
第１項～第８項に記載の診断補助方法において、情報提供工程では、エクソソームの量でラミニン５またはラミニンβ３の量を標準化する。
第９項に記載の診断補助方法によれば、乳がんを診断するための情報の精度を向上させることができる。
（第１０項）
第９項に記載の診断補助方法において、エクソソームの量をＣＤ９によって測定し、ラミニン５またはラミニンβ３の量を標準化する。
第１０項に記載の診断補助方法によれば、乳がんを診断するための情報の精度をより向上させることができる。
（第１１項）
第１項～第１０項に記載の診断補助方法において、試料は、被検体から採取された生体試料である。
第１１項に記載の診断補助方法によれば、被検体の乳がんを診断するための情報を提供することが可能になる。
（第１２項）
第１項～第１１項に記載の診断補助方法において、試料は、ヒト個体から採取された血液である。
第１２項に記載の診断補助方法によれば、ヒトの乳がんを診断するための情報を提供することが可能になる。
（第１３項）
第１項～第１２項に記載の診断補助方法において、試料は、エクソソームの精製画分である。
第１３項に記載の診断補助方法によれば、試料中の夾雑物を少なくすることができるため、測定の精度を向上させることができる。
（第１４項）
一態様に係る乳がん検査キットは、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体を含む。
第１４項に記載の乳がん検査キットによれば、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定することにより、乳がんを診断するための情報を簡便に提供することが可能となる。
（第１５項）
第１４項に記載の検査キットにおいて、抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体は、金属粒子または酵素で標識されている。
酵素で標識された抗体は、ラミニン５またはラミニンβ３の量を高感度に測定することができる。また、金属粒子で標識された抗体は、ラミニン５またはラミニンβ３を可視光（吸光）により検出することができる。
（第１６項）
第１４項または第１５項に記載の検査キットにおいて、イムノクロマト試験紙を含む。
第１６項に記載の検査キットによれば、ラミニン５またはラミニンβ３の量を迅速かつ簡便に測定することができる。
（第１７項）
一態様に係る乳がん診断マーカーは、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３からなる。
第１７項に記載の診断マーカーによれば、乳がんを診断するための有用な情報が簡便に提供される。
（第１８項）
一態様に係る測定方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する。
第１８項に記載の測定方法によれば、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が求められる。ラミニン５またはラミニンβ３の量は、試料が乳がん由来であるかを判断するための情報として用いることができる。
（第１９項）
一態様に係る乳がんの診断方法は、試料に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量が所定の値以上であるときに、試料が乳がん由来であると判断する工程を含む。
第１９項に係る乳がんの診断方法によれば、試料が乳がん由来であるかを簡便に診断することができる。
（第２０項）
一態様に係る抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体の使用は、乳がんを診断するためのものである。
第２０項に記載の使用によれば、乳がんを診断することまたは診断するための情報を提供することが可能となる。
（第２１項）
一態様に係る抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体の使用は、乳がん検査キットを製造するためのものである。
第２１項に記載の使用によれば、乳がん検査キットを製造することができる。
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
１０ イムノクロマト試験紙、１１ メンブレン、１２ 吸水パッド、１３ 捕捉抗体、１４ サンプルパッド、１５ コンジュゲートパッド、１６ 検出対象物、１７ 検出抗体。

Claims (10)

  1. 乳がんを診断する被検体から採取された血液に含まれるラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する工程と、
    測定された前記ラミニン５またはラミニンβ３の量を前記血液に含まれるエクソソームの量で標準化して得られたラミニン５またはラミニンβ３の量に基づいて、乳がんを診断するための情報を提供する工程とを含む、乳がんの診断補助方法であって、
    前記ラミニン５またはラミニンβ３の量を測定する工程は、イムノクロマトグラフィ法であることを特徴とする乳がんの診断補助方法。
  2. 前記乳がんを診断するための情報は、乳がんであるかどうかを診断するための情報を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記乳がんを診断するための情報は、乳がんサブタイプを診断するための情報を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記乳がんを診断するための情報は、乳がんのステージを診断するための情報を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記イムノクロマトグラフィ法に用いられる抗体は、金属粒子または酵素で標識されている、請求項１に記載の方法。
  6. 前記金属粒子を誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって検出する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記エクソソームの量をＣＤ９によって測定し、ラミニン５またはラミニンβ３の量を標準化する、請求項１に記載の方法。
  8. 抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体と、
    エクソソームマーカーを捕捉する抗体とを含む、乳がん検査キット。
  9. 前記抗ラミニン５抗体または抗ラミニンβ３抗体は、金属粒子または酵素で標識されている、請求項８に記載の検査キット。
  10. イムノクロマト試験紙を含む、請求項８または９に記載の検査キット。
JP2022568266A 2020-12-07 2021-12-06 乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット Active JP7720060B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020202742 2020-12-07
JP2020202742 2020-12-07
PCT/JP2021/044729 WO2022124266A1 (ja) 2020-12-07 2021-12-06 乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2022124266A1 JPWO2022124266A1 (ja) 2022-06-16
JP7720060B2 true JP7720060B2 (ja) 2025-08-07

Family

ID=81973266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022568266A Active JP7720060B2 (ja) 2020-12-07 2021-12-06 乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240027455A1 (ja)
EP (1) EP4257601A4 (ja)
JP (1) JP7720060B2 (ja)
CN (1) CN116802497A (ja)
WO (1) WO2022124266A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI131968B1 (en) * 2023-10-16 2026-03-17 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy ANTIBODY BINDINGS AS CANCER BIOMARKERS

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002148266A (ja) 2000-11-10 2002-05-22 Rohto Pharmaceut Co Ltd 検出装置及びその製造方法
US20020076736A1 (en) 2000-05-12 2002-06-20 Findell Paul R. Methods of affecting laminin 5 processing
US20020156263A1 (en) 2000-10-05 2002-10-24 Huei-Mei Chen Genes expressed in breast cancer
US20100105087A1 (en) 2006-10-31 2010-04-29 George Mason Intellectual Properties, Inc Biomarkers for breast cancer
JP2016211925A (ja) 2015-05-01 2016-12-15 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター がんにおいてドセタキセル又はパクリタキセルに対する耐性を評価する方法、がんの悪性化を評価する方法、及びそれら方法に用いられるキット
JP2017088519A (ja) 2015-11-05 2017-05-25 武 永安 Ｃｋ１９に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法
JP2017095744A (ja) 2015-11-19 2017-06-01 大日本塗料株式会社 金ナノロッドを含む被験物質を検出するための組成物及びその用途
CN109270269A (zh) 2018-09-05 2019-01-25 河南省生物工程技术研究中心 一种用于早期乳腺癌多联检测的荧光免疫层析检测卡、试剂盒
JP2020513549A (ja) 2016-11-24 2020-05-14 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 癌予後の決定法
WO2020241999A1 (ko) 2019-05-24 2020-12-03 고려대학교 세종산학협력단 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7256001B2 (en) * 2001-08-17 2007-08-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Reagent for determining laminin 5 antigen in biological sample and assay method
JP5754844B2 (ja) * 2010-03-09 2015-07-29 国立大学法人 東京大学 泌尿器科がんの検査方法及び検査用キット
US20220145376A1 (en) * 2019-05-17 2022-05-12 Shimadzu Corporation Method for detecting extracelluar vesicles

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020076736A1 (en) 2000-05-12 2002-06-20 Findell Paul R. Methods of affecting laminin 5 processing
US20020156263A1 (en) 2000-10-05 2002-10-24 Huei-Mei Chen Genes expressed in breast cancer
JP2002148266A (ja) 2000-11-10 2002-05-22 Rohto Pharmaceut Co Ltd 検出装置及びその製造方法
US20100105087A1 (en) 2006-10-31 2010-04-29 George Mason Intellectual Properties, Inc Biomarkers for breast cancer
JP2016211925A (ja) 2015-05-01 2016-12-15 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター がんにおいてドセタキセル又はパクリタキセルに対する耐性を評価する方法、がんの悪性化を評価する方法、及びそれら方法に用いられるキット
JP2017088519A (ja) 2015-11-05 2017-05-25 武 永安 Ｃｋ１９に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法
JP2017095744A (ja) 2015-11-19 2017-06-01 大日本塗料株式会社 金ナノロッドを含む被験物質を検出するための組成物及びその用途
JP2020513549A (ja) 2016-11-24 2020-05-14 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 癌予後の決定法
CN109270269A (zh) 2018-09-05 2019-01-25 河南省生物工程技术研究中心 一种用于早期乳腺癌多联检测的荧光免疫层析检测卡、试剂盒
WO2020241999A1 (ko) 2019-05-24 2020-12-03 고려대학교 세종산학협력단 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARPENTER, Philip M. et al.，Laminin 332 expression and prognosis in breast cancer，Human Pathology，2018年，Vol. 82，pp. 289-296，DOI: 10.1016/j.humpath.2018.08.003

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022124266A1 (ja) 2022-06-16
JPWO2022124266A1 (ja) 2022-06-16
CN116802497A (zh) 2023-09-22
EP4257601A1 (en) 2023-10-11
US20240027455A1 (en) 2024-01-25
EP4257601A4 (en) 2024-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6336957B2 (ja) 乳癌の判定法
TWI704228B (zh) 肝癌的檢查方法
CN106814187B (zh) 外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用
JP6343560B2 (ja) 乳癌の判定方法
CN106771258A (zh) 一种半乳糖凝集素‑3结合蛋白的检测试剂盒及其方法和应用
KR102047186B1 (ko) Maldi-tof 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속 질병 진단 시스템
US20150168414A1 (en) Methods and Compositions for Personalized Medicine by Point-of-Care Devices for FSH, LH, HCG and BNP
CN106066401B (zh) 生物标志物vwf和adamts13及其在肝硬化诊断试剂中的用途
JP7720060B2 (ja) 乳がんの診断補助方法および乳がん検査キット
CN117783514A (zh) 区分细菌感染和病毒感染的多重横向流测定物
US20150037824A1 (en) Urinary biomarker for urinary tract cancer and application of the same
WO2022153316A1 (en) Devices and methods for diagnosising thyroid medical conditions
CN108828229A (zh) 食管癌肿瘤标志物组合及其应用
WO2018030511A1 (ja) エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法
KR20200049647A (ko) 반려동물에서 종양질병의 보조적 진단을 위한 바이오마커 검사방법
CN113785202A (zh) 新病理标志物及其用途
US20140242726A1 (en) LUNG CANCER MARKER COMPLEMENT C3dg MOLECULE, AND METHOD FOR ANALYZING LUNG CANCER MARKER
CN119630966A (zh) 用于对膀胱癌进行风险分层和管理的方法和系统
JP6145650B2 (ja) 卵巣癌マーカー及び卵巣癌検出方法
US20200225220A1 (en) Lateral flow test strip assay for osteoporosis
CN111693703B (zh) Spondin 1和HE4联合用作早期卵巢癌生物标志物以及试剂盒
US20240027472A1 (en) METHODS AND DESIGN OF LUNG HEALTH DIAGNOSTIC (LHDx) TECHNOLOGY FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS-BASED INTERVENTION OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISORDER (COPD), EMPHYSEMA AND AGE-RELATED LUNG DISEASES
JP2023153065A (ja) 細胞外小胞新規大動脈瘤マーカーとしてのａｏｃ３
KR20180023563A (ko) 측방유동 면역 분석 기반의 항ccp 항체 및 류마티스인자를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법
WO2024210038A1 (ja) 膵臓がんを検出するためのバイオマーカー

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230829

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240625

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240823

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241021

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250204

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250325

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20250701

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250717

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7720060

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150