CN116802497A - 乳腺癌的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒 - Google Patents

乳腺癌的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种乳腺癌的诊断辅助方法，其包括下述工序：测定工序，测定试样中的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量；和，信息提供工序，基于测得的所述层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息。一种乳腺癌检查试剂盒，其包含抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。

Description

乳腺癌的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒
技术领域
本发明涉及乳腺癌的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒。
背景技术
作为乳腺癌的检查方法，主要使用视诊/触诊、乳腺X射线摄影检查、超声波检查等。通过这些检查，对怀疑罹患癌症的被检者采集病变的一部分并进行基于细胞学诊断、组织学诊断(活检)的病理检查(非专利文献1：乳腺癌、检查·诊断、亚型分类[令和2年10月5日检索]因特网<URL:https://ganjoho.jp/public/cancer/breast/diagnosis.html>及非专利文献2：Nover AB,Jagtap S,Anjum W,Yegingil H,Shih WY,Shih WH,Brooks AD.IntJBiomed Imaging.2009,902326)。
关于乳腺癌的亚型分类，提出了通过基因检查来进行分类的方法(非专利文献3：Garrido-Castro AC,Lin NU,Polyak K.Cancer Discov.2019,9(2):176-198)。但是，基因检查由于费用高昂而难以实用化。目前，作为基因检查的替代方案，对活检、手术中采集的癌细胞进行免疫染色而在临床病理学上适用于基因分析的分类。免疫染色对象为激素受体(雌激素受体(ER)及孕激素受体(PgR))、HER2及Ki67。这些为与癌细胞增殖相关的蛋白。乳腺癌的亚型分类在已诊断为乳腺癌时进行。三阴型乳腺癌进展快、预后也比其它亚型差，因此通过血液检查早期确定为三阴型乳腺癌是有用的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:乳腺癌、检查·诊断、亚型分类[令和2年10月5日检索]因特网<URL:https://ganjoho.jp/public/cancer/breast/diagnosis.html>
非专利文献2:Nover AB,Jagtap S,Anjum W,Yegingil H,Shih WY,Shih WH,Brooks AD.Int J Biomed Imaging.2009,902326
非专利文献3:Garrido-Castro AC,Lin NU,Polyak K.Cancer Discov.2019,9(2):176-198
发明内容
发明要解决的问题
为了早期发现乳腺癌并进行适当的治疗，期望可简便地进行乳腺癌检查。本发明的目的在于，提供用于诊断乳腺癌的新的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒。
用于解决问题的方案
本发明涉及一种乳腺癌的诊断辅助方法，其包括下述工序：测定工序，测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量；和，信息提供工序，基于测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息。
本发明涉及一种乳腺癌检查试剂盒，其包含抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。
发明的效果
根据本发明，提供用于诊断乳腺癌的新的诊断辅助方法及乳腺癌检查试剂盒。
附图说明
图1为说明层粘连蛋白的结构的图。
图2为示出本发明的乳腺癌检查试剂盒的一例的图。
图3为示出本发明的乳腺癌检查试剂盒的应用的一例的图。
图4为示出实施例的实验2中乳腺癌来源细胞株的层粘连蛋白5的表达量的图。
图5的左图为实施例的实验3中通过免疫层析法检测乳腺癌患者及健康者的血浆中的层粘连蛋白5及CD9(外泌体标志物)的量的结果。右图为示出根据左图的免疫层析结果将层粘连蛋白5的表达量用CD9的表达量标准化而得的值(层粘连蛋白5/CD9)的图。
图6为示出实施例的实验4中将HER2型乳腺癌患者及三阴型乳腺癌患者的血浆中的层粘连蛋白5的量用CD9的量标准化而得的值(层粘连蛋白5/CD9)的图。
图7A为示出实施例的实验5中将乳腺癌患者及健康者的层粘连蛋白5的量用CD9的量标准化而得的值(层粘连蛋白5/CD9)的图。
图7B为实施例的实验5中的、示出层粘连蛋白5的乳腺癌患者识别能力的ROC曲线。
图8A为示出实施例的实验5中将早期乳腺癌患者及健康者的层粘连蛋白5的量用CD9的量标准化而得的值(层粘连蛋白5/CD9)的图。
图8B为实施例的实验5中的、示出层粘连蛋白5的早期乳腺癌患者的识别能力的ROC曲线。
图9A为示出实施例的实验6中将乳腺癌患者及健康者的层粘连蛋白5的量用CD9的量标准化而得的值(层粘连蛋白5/CD9)的图。
图9B为实施例的实验6中的、示出层粘连蛋白5的乳腺癌患者的识别能力的ROC曲线。
具体实施方式
＜乳腺癌的诊断辅助方法＞
本发明的一方式所涉及的乳腺癌的诊断辅助方法包括下述工序：
测定工序，测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量；和
信息提供工序，基于测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息。
根据本发明的乳腺癌的诊断辅助方法，能够简便地提供用于诊断乳腺癌的信息。本发明的诊断辅助方法不包括由医师进行的判断工序，不属于对人类进行诊断的方法。
以下对各工序进行详细说明。
本发明的乳腺癌的诊断辅助方法首先测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。以下也将该工序称为“测定工序”。
层粘连蛋白是构成作为胞外基质的基底膜的巨大蛋白，参与多细胞体制及组织构建及其维持、细胞粘附、细胞移动、细胞增殖促进等。如图1所示，层粘连蛋白呈现出α链、β链及γ链这3条多肽链通过二硫键结合的异三聚体结构。人类存在5种α链(α1、α2、α3、α4、α5)、3种β链(β1、β2、β3)和3种γ链(γ1、γ2、γ3)，目前已经鉴定出它们的组合彼此不同的至少17种层粘连蛋白。层粘连蛋白5也被称为层粘连蛋白-332，由α3链、β3链及γ2链构成。层粘连蛋白β3在目前已报道的层粘连蛋白中仅包含在层粘连蛋白5中。层粘连蛋白5的量与层粘连蛋白β3的量可能相关。一般认为，试样中所含的层粘连蛋白β3包含形成了三聚体的复合体的层粘连蛋白β3和未形成复合体的层粘连蛋白β3。
测定层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3的量的方法没有特别限定，可以使用能够高精度地定量测定蛋白质的公知方法。作为测定方法，可列举免疫学测定法、质谱分析法等。测定方法也可以适当组合使用。
免疫学测定法为利用抗原抗体反应的测定方法，可列举例如免疫层析法、酶免疫测定法(Enzyme Immunoassay：EIA(酶免疫测定)、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ELISA(酶联免疫吸附试验))、化学发光酶免疫测定法、荧光免疫测定法、放射线免疫测定法、免疫比浊法、免疫浊度法、胶乳凝集法、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、亲和层析法、流式细胞术、使用金属标记抗体和质谱分析的免疫测定法等。从测定的迅速性及简便性优异的观点出发，优选免疫层析法。
免疫学测定法中使用的抗体包括抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。抗层粘连蛋白5抗体及抗层粘连蛋白β3抗体可分别用于检测层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3。从检测灵敏度及特异性优异的观点出发，在免疫学测定法中优选使用抗层粘连蛋白5抗体。
免疫学测定法中使用的抗体可以用适合于检测的物质进行标记。作为标记，可列举金属颗粒、酶、荧光物质、放射性物质、亲和性物质等。作为金属颗粒，可列举金纳米颗粒、银纳米颗粒、金纳米棒、银纳米棒、金纳米板、银纳米板等以及覆盖有异种金属的各种形状的金属纳米颗粒。作为酶，可列举过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β半乳糖苷酶等。作为荧光物质，可列举异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)、Cy色素、AlexaFluor色素、罗丹明、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、其它荧光蛋白等。作为放射性物质，可列举3H、14C、32P、35S、125I等。作为亲和性物质，可列举生物素及链霉亲和素等。标记可以添加于抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体，也可以添加于特异性识别这些一抗的二抗。从可高灵敏度检测的观点出发，抗体优选用金属颗粒或酶进行了标记。底物被酶催化而进行化学发光时，信号被放大，检测灵敏度提高。用金属颗粒进行了标记的抗体发生凝集时，吸收波长会改变，因此可以以肉眼可检测到的颜色变化形式确认层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。颜色变化可以通过公知的图像处理装置进行数值化。用金属颗粒进行了标记的抗体也可通过电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)来检测，即使层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3为少量也能够高灵敏度地测定。抗体的检测可以使用通常用于检测各标记的装置来进行。
作为基于免疫学测定法的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的测定方法的一例，可以进行免疫层析而展开并捕捉试样后，通过可见光(吸光)、ICP-MS、化学发光或荧光来检测被标记的抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。
作为基于质谱分析法的层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3的量的测定方法，可列举如下方法；通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)法、电喷雾电离(ESI)法等离子化法使蛋白离子化，基于通过蛋白离子的质/荷比(m/z)而分解出的每个峰的信号的强弱来进行定量分析。另外，可以用胰蛋白酶等蛋白酶对试样进行酶消化处理，将得到的肽片段利用液相色谱(LC)进行分离、浓缩，利用可进行质谱分析的液相色谱-质谱分析法(LC-MS)通过肽定量来进行目标蛋白的定量分析。作为质谱分析仪，除了通常的单独型的质谱分析仪以外，还可以优选使用三重四极杆型(QqQ型)质谱分析仪、四极杆飞行时间型(Q-TOF型)质谱分析仪、串联时间飞行型(TOF-TOF型)质谱分析仪、四极杆离子阱型(QIT型)质谱分析仪、四极杆离子阱飞行时间型(QIT/TOF型)质谱分析仪等串联质谱分析仪。LC-MS/MS中，也可以使用三重四极杆型质谱分析仪进行多重反应监测(MRM：multiple reaction monitoring)。三重四极杆型质谱分析仪的定量性优异。MRM中，在装置内进行与夹杂离子的分离，因此能够进一步降低噪声水平，也能够进行微量肽的定量分析。
在利用质谱分析法进行层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的测定时，可能发生蛋白复合体的分离、蛋白的碎片化，因此优选测定层粘连蛋白β3的量。
试样可以为培养细胞、培养组织或其培养上清，优选为从被检体采集的生物试样。作为生物试样，可以为由动物得到的血液，也可以为生物体组织、尿、粪便、汗、唾液、淋巴液、羊水、母乳、胸水、腹水、脑脊液、泪液等。血液可以为全血，优选为血浆或血清。试样可以用生理盐水、缓冲液等进行稀释。生物试样的采集可以根据生物试样的种类适当通过公知方法进行。作为被检体，优选为人类个体，例如为乳腺癌患者、怀疑罹患乳腺癌者、健康者。通过使用从被检体采集的生物试样作为试样，可以提供用于诊断被检体的乳腺癌的信息。试样优选为从人类个体采集的血液。通过使用从人类个体采集的血液作为试样，能够高精度、并且简便地提供用于诊断人乳腺癌的信息。
为了提高层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3的量的测定精度，试样可以适当地进行纯化或预处理，可以进行过滤、离心分离、亲和分离、透析、沉淀处理等操作。试样可以为外泌体的纯化级分。试样为外泌体的纯化级分时，可以减少试样中的夹杂物、提高测定精度。外泌体是细胞分泌的直径100nm左右的囊泡，大量存在于血液、唾液、尿等体液中。已知外泌体在其表面包含细胞膜来源的脂质及蛋白、并且在内部包含mRNA、miRNA等核酸及蛋白。外泌体的纯化可以通过市售的纯化试剂盒、离心分离、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、过滤器处理等公知方法来进行。
本发明的乳腺癌的诊断辅助方法包括下述工序：基于测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息。以下也将该工序称为“信息提供工序”。
信息提供工序中，将试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量与规定值进行对比，得到用于诊断乳腺癌的信息。用于诊断乳腺癌的信息例如包括用于诊断(1)是否为乳腺癌、(2)乳腺癌亚型、(3)乳腺癌的分期的信息等。可同时提供这些中的1种或2种以上信息。
(1)是否为乳腺癌
由于分期越靠后则乳腺癌患者的5年生存率越低，因此优选尽量早期进行诊断。通过本实施方式的诊断辅助方法，即使是目前的检查中难以发现的初期乳腺癌，也能够非侵入性地简便地提供用于诊断是否为乳腺癌的信息。
层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量与规定值的对比可作为用于诊断是否为乳腺癌的有益信息来提供。规定值例如为非乳腺癌来源的培养细胞的培养上清的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量、健康者的体液(血浆、血清等)中的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。乳腺癌患者与健康者相比，有检测到较多的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的倾向。试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量高于规定值时，成为用于判断试样源自乳腺癌的有用信息。
(2)乳腺癌亚型
乳腺癌的亚型已知有鲁米那(Luminal)A型、鲁米那B型、HER2型及三阴型。三阴型乳腺癌是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PgR)及人表皮生长因子受体2(Human EpidermalGrowth Factor Receptor 2，HER2)均为阴性。作为乳腺癌治疗方法之一，采用下述方法：将乳腺癌分类为亚型，选择与癌细胞的特性相符的治疗方法，例如内分泌(激素)疗法、化学疗法、分子靶向治疗等。因此，为了对乳腺癌进行适当治疗，需要诊断出乳腺癌的亚型。
乳腺癌的亚型分类是在乳腺癌检查中怀疑患病情况下进行，因此难以应用于较早期的癌症患者。关于乳腺癌的亚型分类，提出了通过基因检查来进行分类的方法。但是，基因检查由于费用高昂而难以实用化。另一方面，三阴型乳腺癌进展快，晚期(分期III及IV)的三阴型乳腺癌患者的5年无复发生存率低。因此，需要进行在早期阶段对乳腺癌的亚型进行诊断。本实施方式的诊断辅助方法能够简便地提供用于诊断乳腺癌亚型的信息。
层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量与规定值的对比可作为用于诊断乳腺癌亚型、特别是三阴型乳腺癌的有益信息而提供。规定值例如为非乳腺癌来源的培养细胞或非三阴型乳腺癌来源的培养细胞的培养上清的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量、健康者或三阴型乳腺癌以外的乳腺癌患者的体液(血浆、血清等)中的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。三阴型乳腺癌患者与健康者及三阴型乳腺癌以外的乳腺癌患者相比，有检测到较多的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的倾向。试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量高于规定值时，成为判断试样来自三阴型乳腺癌的有用信息。
(3)乳腺癌的分期
关于乳腺癌的进展程度，可根据肿块的大小、向淋巴结或其它器官的转移情况而分为0、I、II(IIA、IIB)、III(IIIA、IIIB、IIIC)或IV的分期。治疗根据癌症进展程度而进行，因此需要对乳腺癌的分期进行诊断。本实施方式的诊断辅助方法能够简便地提供用于诊断乳腺癌的分期的信息。
层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量与规定值的对比可作为用于诊断乳腺癌的分期、特别是分期I及II的早期乳腺癌的有益信息来提供。此时，规定值例如为非乳腺癌来源的培养细胞或者分期III或分期IV的后期乳腺癌来源的培养细胞的培养上清的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量、健康者或者分期III或分期IV的后期乳腺癌患者的体液(血浆、血清等)中的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。早期乳腺癌患者与健康者或后期乳腺癌患者相比，有检测到较多的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的倾向。试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量高于规定值时，成为用于判断试样为早期乳腺癌来源的有用信息。
信息提供工序中，层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量可以为测定值本身或试样中的浓度，优选为相对于试样中所含的对照的量的、层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。对照例如可以为外泌体。使用外泌体作为对照时，在信息提供工序中，通过外泌体的量将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。样品中所含的外泌体量根据样品而可能不同，因此通过利用对照来将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的测定量标准化，可以提高用于诊断乳腺癌的信息的精度。外泌体的量可以通过外泌体标志物的量来测定。作为外泌体标志物，可列举CD9、CD63、CD81等表面抗原。
例如，当相对于试样中所含的CD9的量的、层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量比大于相对于健康者的血浆中的CD9的量的、层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量比时，优选为2倍以上时，成为用于判断试样来自包含三阴型乳腺癌的乳腺癌和/或来自早期乳腺癌的有用信息。
外泌体标志物的量的测定可以利用公知方法来进行，优选通过与上述的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的测定方法相同的方法来进行。在通过免疫学测定法来测定外泌体标志物的量时，可以通过使用针对外泌体标志物的抗体而利用与层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3相同的方法测定外泌体标志物的量。针对外泌体标志物的抗体用不同于抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体的物质(不同的金属颗粒、不同的荧光物质等)进行了标记的情况下，也可以在同一实验体系内检测层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3以及外泌体标志物。使用质谱分析法时，能够检测任意的蛋白，因此可以在一次分析中进行外泌体标志物的量的测定以及层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的测定。
＜乳腺癌检查试剂盒＞
本发明的一方式所涉及的乳腺癌检查试剂盒包含抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。本发明的乳腺癌检查试剂盒能够通过测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来简便地提供用于诊断乳腺癌的信息。用于诊断乳腺癌的信息例如可以包括用于诊断(1)是否为乳腺癌、(2)乳腺癌亚型、(3)乳腺癌的分期的信息等。可同时提供这些中的1种或2种以上信息。
抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体可以与上述的测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的方法中使用的抗体相同。抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体被用于层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的检测中，优选用金属颗粒或酶进行了标记。也可以是对用于检测抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体的二抗进行了标记。抗体用酶进行了标记时，是对底物的反应产物来源的信号进行检测，因此反应时间、检测时间变长，由此能够以高灵敏度进行检测。另外，用金属颗粒进行了标记的抗体发生凝集时吸收波长会改变，因此能够通过可见光(吸光)来确认层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。用金属颗粒进行了标记的抗体即使为少量也能够利用电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)来检测，也能够高灵敏度地测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
检查试剂盒优选可以通过免疫学测定法或质谱分析法来测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。从测定的迅速性及简便性优异的观点出发，优选检查试剂盒利用免疫层析法。
检查试剂盒可以还包含：用于进行免疫层析的免疫层析试纸、用于检测对照的抗体、捕捉层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的因子或抗体、层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的标准品、处理说明书等。将本发明的检查试剂盒中所含的免疫层析试纸的一例示于图2。免疫层析试纸10通常与膜11和吸水垫12连接(图2的A)。膜11上固定化有捕捉抗体13，可形成检测线。捕捉抗体13可以为捕捉层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的因子或抗体、或者捕捉外泌体标志物的因子或抗体。膜11例如为硝酸纤维素膜。吸水垫12是用于快速吸收试样的部分。免疫层析试纸10可以还具有样品垫14(图2的B)、样品垫14及结合垫15(图2的C)。样品垫14是作为样品供给部的部分，具有吸收液体试样并允许液体和检测对象物透过的性质。结合垫15包含检测抗体，能够向膜11释放检测抗体。检测抗体可以为用于捕捉层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的因子或抗体、或用于捕捉外泌体标志物的因子或抗体。作为对照，可以使用外泌体。外泌体可以利用作为标志物蛋白之一的CD9来检测。捕捉层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的因子或抗体可以为固定化于膜上的抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。需要说明的是，在检测外泌体中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3时，捕捉层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的因子或抗体可以为固定化在膜上的捕捉外泌体标志物的抗体，例如可以为抗CD9抗体。
免疫层析试验时的捕捉抗体13和检测抗体例如可以使用表1记载的组合。如果如方案1所示使用捕捉外泌体标志物的抗体作为捕捉抗体、使用捕捉外泌体标志物的抗体作为检测抗体，则可以检测试样中存在的外泌体，可以对作为对照的外泌体进行定量。如果如方案2所示使用抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体作为捕捉抗体、使用抗层粘连蛋白β3抗体或抗层粘连蛋白β3抗体作为检测抗体，则可以检测试样中存在的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3，可以对层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3进行定量。如果如方案3所示使用捕捉外泌体标志物的抗体作为捕捉抗体、使用抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体作为检测抗体，则可以检测试样中存在的具有层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的外泌体，可以对外泌体中表达的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3进行定量。如果如方案4所示使用抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体作为捕捉抗体、使用捕捉外泌体标志物的抗体作为检测抗体，则可以检测试样中存在的具有层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的外泌体，可以对外泌体中表达的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3进行定量。
[表1]
供于检查的试样可以与上述测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的方法中使用的试样相同。试样优选为血液、血浆、血清或这些的外泌体纯化级分。试样优选为从人类个体采集的血液。
将本发明的检查试剂盒的应用的一例示于图3。图3记载的检查试剂盒包含免疫层析试纸10。免疫层析试纸10的膜11的检测线上固定化有捕捉抗体13。从免疫层析试纸10的与吸水垫12处于相反侧的端部吸收的试样通过毛细管现象在膜11中展开，被吸水垫12吸收(步骤1)。此时，试样中所含的检测对象物16(层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3或包含这些的外泌体)被捕捉。试样展开后或在试样展开的同时，用金属颗粒进行了标记的检测抗体17也被展开(步骤2)。检测抗体17用金属颗粒进行了标记的情况下，检测抗体17聚集在检测线上，从而能够通过目视确认检测线的着色。用金属颗粒进行了标记的检测抗体17可以通过ICP-MS来进行检测。检测抗体17进行酶标记或荧光标记的情况下，可以通过添加底物而产生的化学发光或荧光对检测抗体17进行检测。
为了进一步定量性地评价层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3，可以测定作为对照的CD9的量，并且用试样中所含的CD9的量将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。CD9的量可以通过使用抗CD9抗体作为捕捉抗体及检测抗体的免疫层析法来测定。CD9的量的测定可以使用与本发明的检查试剂盒相同的试剂盒来进行，也可以使用不同的试剂盒来进行。对于CD9与层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3，可以使用施加了不同标记的抗CD9抗体以及抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体同时对同一膜上的捕捉抗体所捕捉到的外泌体进行检测。
将利用检查试剂盒测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量与规定值进行比较。规定值可以是＜乳腺癌的诊断辅助方法＞中列举的值，例如可以为非乳腺癌来源的培养细胞、非三阴型乳腺癌来源的培养细胞或晚期乳腺癌来源的培养细胞的培养上清的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量、健康者或三阴型乳腺癌以外的乳腺癌患者或分期靠后的乳腺癌患者的体液(血浆、血清等)中的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。当利用检查试剂盒检测到的、试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量比规定值多时，成为用于判断试样来自包含三阴型乳腺癌的乳腺癌、和/或来自早期乳腺癌的有用信息。
利用检查试剂盒测得的、相对于对照的量的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量比大于相对于健康者的血浆中的对照的量(任意)的、层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量比时，优选为2倍以上时，成为用于判断试样来自包含三阴型的乳腺癌和/或来自早期乳腺癌的有用信息。
＜乳腺癌诊断标志物＞
本发明的一方式所涉及的乳腺癌诊断标志物由试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3构成。根据本发明的乳腺癌诊断标志物，可以提供用于诊断乳腺癌的信息，可以简便地提供用于诊断是否为乳腺癌、乳腺癌亚型及乳腺癌的分期的有用信息。
试样及层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3可以为上述所述者。检测本发明的诊断标志物的方法没有特别限定，例如可以通过上述方法测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。试样是否来自乳腺癌、是否来自三阴型乳腺癌及是否来自早期乳腺癌可以基于测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量通过上述基准来进行判断。
＜测定方法＞
本发明的一方式所涉及的测定方法中，测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。根据本发明的测定方法，可求出试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量可以提供用于诊断乳腺癌的信息，可以作为用于诊断是否为乳腺癌、乳腺癌亚型及乳腺癌的分期的信息来使用。试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量为规定值以上时，成为用于判断试样来自包含三阴型乳腺癌的乳腺癌和/或来自早期乳腺癌的有用信息。
关于测定方法，只要是能够测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的方法就没有特别限定，可以为与上述测定工序一栏中记载的方法相同。试样及规定值可以为上述所述者。
＜乳腺癌的诊断方法＞
本发明的一方式所涉及的乳腺癌的诊断方法包括下述工序：在试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量为规定值以上时，判断试样来自乳腺癌。另外，也可以对试样的乳腺癌亚型及乳腺癌的分期进行诊断。根据本发明的乳腺癌的诊断方法，可以简便地诊断试样是否来自乳腺癌、是否来自三阴型乳腺癌及是否来自早期乳腺癌。
试样及规定值可以为上述所述者。试样为从被检体采集的生物试样时，利用本发明的乳腺癌的诊断方法可以简便地判断被检体是否为乳腺癌患者、乳腺癌亚型及乳腺癌的分期。本发明的乳腺癌的诊断方法可以包括上述的测定工序及信息提供工序。
实施例
以下列举实施例更详细地说明本发明，但是本发明不受这些限定。
＜实验1＞
为了调查三阴型乳腺癌与其以外的乳腺癌的蛋白表达差异，进行了蛋白的全面分析。首先，从人三阴型乳腺癌细胞株(MM231)的培养上清及鲁米那A型乳腺癌细胞株(MCF7)的培养上清中通过超速离心法分别纯化外泌体级分。对外泌体的纯化级分进行酶消化后，供于利用质谱分析(Orbitrap质谱分析仪)的鸟枪法蛋白质组学分析，检测外泌体级分中所含的蛋白。层粘连蛋白β3在三阴型乳腺癌细胞株中以高浓度被检测到，在鲁米那A型乳腺癌细胞株中为低浓度。层粘连蛋白β3仅包含于层粘连蛋白5，因此表明三阴型乳腺癌细胞株表达较多的层粘连蛋白5，另外表明较多包含于外泌体中。
＜实验2＞
使用其它的人三阴型乳腺癌细胞株确认层粘连蛋白5的表达。从11种人三阴型乳腺癌细胞株及鲁米那A型乳腺癌细胞株(MCF7)的培养上清中，通过超速离心法分别纯化外泌体级分，通过免疫层析法检测层粘连蛋白5及CD9的表达量。
(CD9表达量的检测)
将小鼠抗CD9抗体(制造商：Hansa Bio Med LifeSciences、制品编号：HBM-CD9-100)固定化于具备硝酸纤维素膜的半条免疫层析试纸的中央部。然后，将该膜用水溶性高分子及BSA封闭。将该免疫层析试纸的未安装吸水垫的一端浸渍于包含1×109个外泌体的溶液，使其在免疫层析试纸中展开。需要说明的是，外泌体溶液是将上述实验1的通过纯化而得到的外泌体级分用含有1％的BSA、0.05％的Tween20的PBS稀释而制备的。然后，使用Ab-10Rapid Peroxidase Labeling Kit(制造商：株式会社同仁化学研究所制、制品编号：LK33)将包含HRP标记小鼠抗CD9抗体的展开液进行展开。然后用ImmunoStar(注册商标)LD(制造商：富士胶片和光纯药株式会社、制品编号：290-69904)使其发光，通过Image QuantLAS4000来检测发光。
(层粘连蛋白5表达量的检测)
将上述抗体替换为兔抗LAM5抗体(制造商：Abcam公司、制品编号：ab14509)，通过同样的步骤将包含1×1010个外泌体的溶液展开。然后，使用Ab-10 Rapid PeroxidaseLabeling Kit(制造商：株式会社同仁化学研究所制、制品编号：LK33)将包含HRP标记兔抗LAM5抗体的展开液进行展开。然后，用ImmunoStar(注册商标)LD使其发光，利用ImageQuant LAS4000检测发光。
(检测强度(亮度差)的测定)
用ImageJ测定免疫层析试纸上固定有抗体的部分的周边的合计亮度以及与不发光的等面积部分的合计亮度，由它们的差(亮度差)求出CD9和层粘连蛋白5各自的表达量。图4示出将层粘连蛋白5的表达量除以CD9的表达量而标准化的值(层粘连蛋白5/CD9)。与非三阴型乳腺癌来源的细胞株(MCF7)相比，所研究的全部11种三阴型乳腺癌细胞株中层粘连蛋白5/CD9均亢进。
＜实验3＞
对于三阴型乳腺癌患者来源的生物试样中层粘连蛋白5的表达是否上调这一点进行了验证。将乳腺癌患者的3份血浆检体(HER2型、三阴型、鲁米那B型)及健康者的3份血浆检体作为试样，通过免疫层析法检测层粘连蛋白5及CD9。
(CD9表达量的检测)
免疫层析试纸使用了通过与上述实验2同样的方法固定化小鼠抗CD9抗体、将膜用水溶性高分子及BSA封闭而得的试纸。对于该免疫层析试纸，将血浆用包含1％的BSA、0.05％的Tween20的PBS稀释3倍，用孔径0.22μm的注射器式过滤器过滤，将所得溶液9μL展开。然后，通过与实验2同样的方法将包含HRP标记小鼠抗CD9抗体的展开液进行展开。然后，用ImmunoStar(注册商标)LD(产品编号：290-69904、制造商：富士胶片和光纯药株式会社)使其发光，利用Image Quant LAS4000来检测发光。
(层粘连蛋白5表达量的检测)
免疫层析试纸使用了通过与上述实验2同样的方法固定化兔抗LAM5抗体、将膜用水溶性高分子及BSA封闭而得的试纸。对于该免疫层析试纸，将血浆用包含1％的BSA、0.05％的Tween20的PBS稀释3倍，用孔径0.22μm的注射器式过滤器过滤，将所得溶液90μL展开。然后，通过与实验2同样的方法将包含HRP标记兔抗LAM5抗体的展开液进行展开。然后，用ImmunoStar(注册商标)LD(产品编号：290-69904、制造商：富士胶片和光纯药株式会社)使其发光，利用Image Quant LAS4000来检测发光。
其结果如图5的左图所示，检测到了层粘连蛋白5及CD9。用ImageJ测定免疫层析试纸上固定有抗体的部分的周边的合计亮度以及与不发光的等面积部分的合计亮度，由它们的差(亮度差)求出层粘连蛋白5及CD9的表达量。图5的右图示出将层粘连蛋白5的亮度除以CD9的亮度而得的值。显示出乳腺癌患者的血浆中的层粘连蛋白5/CD9高于健康者的层粘连蛋白5/CD9、三阴型乳腺癌患者的层粘连蛋白5/CD9的值也高于其它亚型的乳腺癌患者。
＜实验4＞
进而对于HER2型乳腺癌患者的5个检体及三阴型乳腺癌患者的10个检体，测定CD9的表达量及层粘连蛋白5的表达量。实验方法与实验3相同。将层粘连蛋白5的亮度除以CD9的亮度而得的值示于图6。相对于HER2型乳腺癌患者的血浆中的层粘连蛋白5/CD9而言，三阴型乳腺癌患者的血浆中的层粘连蛋白5/CD9的10个检体中，有6检体高2倍以上。另外，基于层粘连蛋白5的量，可以以特异度100％、灵敏度60％来诊断乳腺癌患者的亚型(三阴型)。表明可以使用层粘连蛋白5作为乳腺癌亚型的诊断标志物。
<实验5>
增加乳腺癌患者及健康者的检体数，来验证乳腺癌患者的层粘连蛋白5的表达是否上调。测定了健康者的20个血浆检体及乳腺癌患者的45个血浆检体中的CD9及层粘连蛋白5的表达量。测定方法与实验3相同。将乳腺癌患者的亚型及分期示于表2及表3。
[表2]
亚型 人数 比例(％)
鲁米那A 20 44.5
鲁米那B 8 17.8
Her2 6 13.3
三阴 11 24.4
[表3]
分期 人数 比例(％)
I 16 35.5
II 16 35.5
III 5 11.2
IV 8 17.8
图7A示出将层粘连蛋白5的亮度除以CD9的亮度而标准化的值(层粘连蛋白5/CD9)。乳腺癌患者的层粘连蛋白5/CD9与健康者的层粘连蛋白5/CD9相比在统计学上显著(p＝0.0011)变高。图7B示出表示利用层粘连蛋白5/CD9识别乳腺癌患者的能力的受试者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲线。曲线下面积(AUC：Area undercurve)为0.80。这些表明层粘连蛋白5在乳腺癌患者中表达亢进，乳腺癌识别能力高。
比较了乳腺癌患者中的早期乳腺癌患者(分期I及II)32个检体和健康者20个检体的层粘连蛋白5的表达量。如图8A所示，早期乳腺癌患者的层粘连蛋白5/CD9与健康者的层粘连蛋白5/CD9相比在统计学上显著(p＝0.0007)高。将表示利用层粘连蛋白5/CD9识别早期乳腺癌患者的能力的ROC曲线示于图8B。AUC为0.82。表明层粘连蛋白5在早期乳腺癌患者中表达亢进、早期乳腺癌的识别能力也高。
<实验6>
使用与实验5不同的群体的检体(乳腺癌患者20个检体及健康者20个检体)，验证层粘连蛋白5作为早期乳腺癌的诊断标志物的性能。将乳腺癌患者的分期示于表4。测定乳腺癌患者及健康者的血浆中的层粘连蛋白5及CD9的表达量。测定方法与实验5相同。将计算出的层粘连蛋白5/CD9示于图9A。乳腺癌患者与健康者相比，层粘连蛋白5的表达在统计学上显著(p＝0.0003)亢进。乳腺癌患者的ROC曲线中的AUC为0.89(图9B)，确认层粘连蛋白5对早期乳腺癌的识别也优异。综上，表明层粘连蛋白5作为早期乳腺癌的识别标志物也具有高性能。
[表4]
分期 人数 比例(％)
I 10 50
II 6 30
III 3 15
IV 1 5
[方式]
本领域技术人员可理解，上述的多个例示性的实施方式及实施例为以下方式的具体例。
(第1项)
一方式所涉及的乳腺癌的诊断辅助方法包括下述工序：测定工序，测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量；和，信息提供工序，基于测得的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息。
根据第1项所述的诊断辅助方法，能够简便地提供用于诊断乳腺癌的信息。
(第2项)
在第1项所述的诊断辅助方法中，用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断是否为乳腺癌的信息。
根据第2项所述的诊断辅助方法，能够简便地提供用于诊断是否为乳腺癌的信息。
(第3项)
在第1项或第2项所述的诊断辅助方法中，用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断乳腺癌亚型的信息。
根据第3项所述的诊断辅助方法，能够简便地提供用于诊断乳腺癌亚型的信息。
(第4项)
在第1项～第3项所述的诊断辅助方法中，用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断乳腺癌的分期的信息。
根据第4项所述的诊断辅助方法，能够简便地提供用于诊断乳腺癌的分期的信息。
(第5项)
在第1项～第4项所述的诊断辅助方法中，测定工序中通过免疫学测定法或质谱分析法来测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
根据第5项所述的诊断辅助方法，能够高精度地测定层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3的量。
(第6项)
在第5项所述的诊断辅助方法中，免疫学测定法为免疫层析法。
根据第6项所述的诊断辅助方法，能够迅速且简便测定层粘连蛋白5及层粘连蛋白β3的量。
(第7项)
在第5项或第6项所述的诊断辅助方法中，免疫学测定法中使用的抗体用金属颗粒或酶进行了标记。
抗体用酶进行了标记时，能够高灵敏度地测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。另外，抗体用金属颗粒进行了标记时，能够通过可见光(吸光)来检测层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
(第8项)
在第7项所述的诊断辅助方法中，通过电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)来检测金属颗粒。
根据第8项所述的诊断辅助方法，即使金属颗粒为少量也能够进行检测，因此能够高灵敏度地测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
(第9项)
在第1项～第8项所述的诊断辅助方法中，在信息提供工序中，用外泌体的量将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。
根据第9项所述的诊断辅助方法，能够提高用于诊断乳腺癌的信息的精度。
(第10项)
在第9项所述的诊断辅助方法中，通过CD9来测定外泌体的量，将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。
根据第10项所述的诊断辅助方法，能够进一步提高用于诊断乳腺癌的信息的精度。
(第11项)
在第1项～第10项所述的诊断辅助方法中，试样为从被检体采集的生物试样。
根据第11项所述的诊断辅助方法，能够提供用于诊断被检体的乳腺癌的信息。
(第12项)
在第1项～第11项所述的诊断辅助方法中，试样为从人类个体采集的血液。
根据第12项所述的诊断辅助方法，能够提供用于诊断人类的乳腺癌的信息。
(第13项)
在第1项～第12项所述的诊断辅助方法中，试样为外泌体的纯化级分。
根据第13项所述的诊断辅助方法，能够减少试样中的夹杂物，因此能够提高测定的精度。
(第14项)
一方式所涉及的乳腺癌检查试剂盒包含抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。
根据第14项所述的乳腺癌检查试剂盒，能够通过测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量而简便地提供用于诊断乳腺癌的信息。
(第15项)
在第14项所述的检查试剂盒中，抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体用金属颗粒或酶进行了标记。
用酶进行了标记的抗体能够高灵敏度地测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。另外，用金属颗粒进行了标记的抗体能够通过可见光(吸光)来检测层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3。
(第16项)
在第14项或第15项所述的检查试剂盒中，包含免疫层析试纸。
根据第16项所述的检查试剂盒，可以迅速且简便地测定层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
(第17项)
一方式所涉及的乳腺癌诊断标志物由试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3构成。
根据第17项所述的诊断标志物，能够简便地提供用于诊断乳腺癌的有用信息。
(第18项)
一方式所涉及的测定方法中，测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
根据第18项所述的测定方法，可求出试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量可以作为用于判断试样是否来自乳腺癌的信息来使用。
(第19项)
一方式所涉及的乳腺癌的诊断方法包括下述工序：当试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量为规定值以上时，判断试样来自乳腺癌。
根据第19项所涉及的乳腺癌的诊断方法，能够简便地诊断试样是否来自乳腺癌。
(第20项)
一方式所涉及的抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体的应用为用于诊断乳腺癌。
根据第20项所述的应用，能够诊断乳腺癌或提供用于诊断乳腺癌的信息。
(第21项)
一方式所涉及的抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体的应用为用于制造乳腺癌检查试剂盒。
根据第21项所述的应用，可以制造乳腺癌检查试剂盒。
应认为，此次公开的实施方式及实施例在全部方面均为例示性的、而非限制性的。本发明的范围并非由上述说明来示出，而是由权利要求书来示出，意图包括与权利要求书的范围的均等意义及范围内的全部变更。
附图标记说明
10免疫层析试纸、11膜、12吸水垫、13捕捉抗体、14样品垫、15结合垫、16检测对象物、17检测抗体。

Claims (16)

1.一种乳腺癌的诊断辅助方法，其包括下述工序：
测定试样中所含的层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量的工序；和
基于测得的所述层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量来提供用于诊断乳腺癌的信息的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断是否为乳腺癌的信息。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断乳腺癌亚型的信息。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述用于诊断乳腺癌的信息包括用于诊断乳腺癌的分期的信息。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在所述测定的工序中，通过免疫学测定法或质谱分析法来测定所述层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述免疫学测定法为免疫层析法。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述免疫学测定法中使用的抗体用金属颗粒或酶进行了标记。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，利用电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)来检测所述金属颗粒。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，在提供所述信息的工序中，利用外泌体的量将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，通过CD9来测定所述外泌体的量，将层粘连蛋白5或层粘连蛋白β3的量标准化。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述试样为从被检体采集的生物试样。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述试样为从人类个体采集的血液。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述试样为外泌体的纯化级分。
14.一种乳腺癌检查试剂盒，其包含抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体。
15.根据权利要求14所述的检查试剂盒，其中，所述抗层粘连蛋白5抗体或抗层粘连蛋白β3抗体用金属颗粒或酶进行了标记。
16.根据权利要求14或15所述的检查试剂盒，其包含免疫层析试纸。
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