JP6010597B2 - 卵巣癌用のバイオマーカー - Google Patents
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Description
発明は一般的に、臨床診断、特に卵巣癌の臨床診断に関連したものである。
本発明は、卵巣癌を診断するのに有用な新規なバイオマーカー及びバイオマーカーの組み合わせ、更に卵巣癌の診断にバイオマーカーを使用する方法及びキットを提供することにより、これらの要望を満たすものである。
1. 緒言
バイオマーカーは、別の表現型状態(例:疾病なし)と比較して、ある表現型状態(例:疾病あり)の対象から採取したサンプルに特異的に存在する有機生体分子である。異なったグループにおけるバイオマーカーの発現の平均又は中央値が、統計学的に有意であると算定された場合には、バイオマーカーは異なった表現型状態に対して特異的に存在している。統計学的有意に対する一般的な検定は多くあるが、特に、t検定、ANOVA、クラスカル・ウォリス検定(Kruskal-Wallis)、ウィルコクソン検定(Wilcoxon)、マン・ホイットニー検定(Mann-Whiteney)及びオッズ比(odds ratio)が挙げられる。バイオマーカーは、それ自体又は他との併用で、対象がある表現型又は別の表現型の状態に属していることを示す相対危険率の指標を提供する。従って、バイオマーカーは、疾病(診断)、医薬品の治療効果(治療的診断法)及び薬剤の毒性のためのマーカーとして有用である。
1)ヘモグロビンα及びヘモグロビンβが、実施例でのSELDI検出アッセイで二重荷電されていることは注目されたい。
2)「悪性腫瘍での上方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌(LMP、不明確な疾患)に対して、卵巣癌及び他の悪性症状(転移性癌(例えば、胃癌の卵巣への転移)、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍のような)を上方制御することを意味する。
3)「LMPでの下方」は、バイオマーカーが、その他の3つのグループ(つまり、良性の卵巣疾患、卵巣癌(悪性)及び他の悪性症状)に対して、悪性度の低い見込みの卵巣癌を下方制御することを意味する。
4)「r/o良性」は、バイオマーカーの存在が、良性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、単独でその他の3つのグループ(卵巣癌LMP、卵巣癌(悪性)及び他の悪性症状)間の診断をするには適当ではない。
5)「r/o悪性」は、バイオマーカーの存在が、悪性の疾患の見込みであることを除くことを意味するが、それだけで良性の卵巣疾患の診断をするには適当ではない。
6)「悪性腫瘍の下方」は、バイオマーカーが、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌(LMP、不明確な疾患)に対して、卵巣癌及び他の悪性症状を上方制御することを意味する。
本発明のバイオマーカーはまた、それらのクロマトグラフィー表面への結合特性によっても特徴付けられる。本発明のバイオマーカーが結合するクロマトグラフィー表面の例として、これらに限定されないが、疎水性の吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)H50プロテインチップ(登録商標)アレイ)、陰イオン交換吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)Q10プロテインチップ(登録商標)アレイ)、陽イオン交換吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)CM10プロテインチップ(登録商標)アレイ)及び金属キレート吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)IMAC−30プロテインチップ(登録商標)アレイ)が挙げられる。数多くのバイオマーカーが、10%のアセトニトリルの結合及び洗浄緩衝液を用いて、疎水性吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)H50プロテインチップ(登録商標)アレイ)に結合する。幾つかのバイオマーカーは、50mMのトリス緩衝液(pH8.0)の結合及び洗浄緩衝液を用いて、陰イオン交換吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)Q10プロテインチップ(登録商標)アレイ)に結合する。数多くのバイオマーカーは、例えば、50mMのトリス緩衝液(pH8.0)/500mMのNaCl溶液の結合及び洗浄緩衝液を用いて、金属キレート吸着剤(例えば、銅と結合したCiphergen(登録商標)IMAC−30プロテインチップ(登録商標)アレイ)に結合する。殆どのバイオマーカーは、100mMの酢酸ナトリウム溶液(pH4)で洗浄後、陽イオン交換吸着剤(例えば、Ciphergen(登録商標)CM10プロテインチップ(登録商標)アレイ)に結合する。
タンパク質は、しばしば検出可能な異なった質量を特徴とする複数の異なった形態でサンプル中に存在する。これらの形態は、転写前及び転写後修飾の何れか又は両方の結果によるものである。転写前の修飾形態には、対立遺伝子多型、スプライス変異体及びRNA編集形態等がある。転写後の修飾形態には、タンパク質分解的切断(例えば、親タンパク質のフラグメント)、グリコシル化、リン酸化、リピド化、酸化、メチル化、システイン化、スルフォン化及びアセチル化等がある。サンプル中のタンパク質を検出又は測定する場合に、タンパク質の異なる形態間を区別する能力は、形態の異なる性質及び検出又は測定に用いる方法に依存する。例えば、モノクローナル抗体を用いる免疫学的測定は、抗原決定基を含有するすべてのタンパク質形態を検出し、それらを識別しない。しかしながら、タンパク質上の異なる抗原決定基を指向した2種類の抗体を使用するサンドイッチ免疫学的測定では、両抗原決定基を含有するタンパク質のすべての形態を検出するが、抗原決定基の一方のみを含有する形態は検出しない。診断アッセイでは、特別な方法を用いて検出された形態が、特別な形態として同等の良好なバイオマーカーであるならば、タンパク質の形態の識別ができなくとも殆ど問題にはならない。しかしながら、タンパク質の特別な形態(又は特別な形態のサブセット)が、特別な方法で同時に検出される異なった形態の集合体よりもバイオマーカーとして良好である場合には、アッセイの検出力は劣る可能性がある。この場合には、タンパク質の形態を相互に識別し、且つタンパク質の形態(複数を含む)を特異的に検出し、測定するアッセイを採用することが有効である。分析対象物の異なった形態を識別すること、又は分析対象物の特殊な形態を特異的に検出することを、分析対象物を「分離すること(resolving)」と称する。
本発明のバイオマーカーは、すべての適切な方法により検出可能である。検出法の例として、光学的方法、電気化学的方法(ボルタンメトリー及び電流測定法)、原子間力顕微鏡及び例えば多極共鳴スペクトロスコピー等の高周波法がある。共焦点及び非共焦点の顕微鏡検査に加えて、光学的方法の実例としては、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率(例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティングカプラ導波管法(grating coupler waveguide method)又は干渉分光法)による検出がある。
好ましい態様では、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出するための質量分析計を用いる方法である、質量分析により検出される。質量分析計の例としては、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオン・トラップ型、イオンサイクロトロン共鳴、静電場型(electrostatic sector)分析計及びこれらの複合型がある。
本発明において使用される好ましい質量分析技術は、例えば、US特許第5,719,060号及び同第6,225,047号(共に「Hutchens et al.」)に記載されているように「表面増強レーザー脱離イオン化質量分析法」又は「SELDI」である。これは、分析対象物(ここでは、1つ又はそれ以上のバイオマーカー)がSELDI質量分析計プローブの表面に捕捉されている、脱離/イオン化気相イオン分析計(例えば、質量分析計)の方法を意味する。
レーザー脱離質量分析計を用いた別の方法は、表面増強Neat脱離法(SEND)と称される。SENDには、プローブの表面に化学的に結合するエネルギー吸収分子から成るプローブ(SENDプローブ)の使用が含まれる。「エネルギー吸収分子」(EAM)という語句は、レーザー脱離/イオン化源からエネルギーを吸収でき、続いてその後直ちに接触して分析対象物分子の脱離及びイオン化に寄与できる分子を意味する。EAMカテゴリーには、しばしば「マトリックス」と称されるMALDIに使用される分子が含まれ、実例として桂皮酸誘導体、シナピン酸(SPA)、シアノ水酸化桂皮酸(CHCA)及び二水酸化安息香酸、フェルラ酸及び水酸化アセトフェノン誘導体がある。ある態様においては、エネルギー吸収分子は、例えばポリメタクリレート等の直鎖又は架橋ポリマーに組み込まれている。例えば、その組成物が、α-シアノ-4-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びアクリレートの共重合体である場合もある。別の態様では、その組成物は、α-シアノ-4-メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリレート及び3−(トリエトキシ)シリルプロピルメタクリレートの共重合体である。また、別の態様では、その組成物は、α-シアノ-4-メタクリロイルオキシ桂皮酸及びオクタデシルメタクリレート(C18SEND)の共重合体である。SENDは更に、US特許第6,124,137号及びPCT国際特許公開第WO03/64594号(キタガワらの「分析対象物の脱離/イオン化に使用するエネルギー吸収部位を有するモノマー及びポリマー」2003年8月7日)に記載されている。
LDIの別のバージョンは、表面増強感光付加及び脱離(Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release)(SEPAR)と称される。SEPARには、分析対象物と共有結合でき、続いて光(例えば、レーザー光(US特許第5,719,060号を参照されたい))に曝露された後その部分の光に不安定な結合が開裂することにより分析対象物を脱離する、表面に付着する部分を有するプローブの使用が含まれる。SEPAR及びその他のSELDIの形態は、本発明に従ってバイオマーカー又はバイオマーカー・プロフィールを検出するのに容易に適応する。
MALDIは、タンパク質及び核酸のような生体分子を分析するために使用されるレーザー脱離/イオン化の従来からの方法である。MALDIの一方法において、サンプルをマトリックスと混合し、直接MALDIチップ上に置く。しかしながら、血清又は尿のような生体サンプルの複雑性により、サンプルを予め分別しない場合にはこの方法は最適とはならない。従って、ある態様では、生体特異的な物質(例えば抗体)又は樹脂のような固体担体に結合したクロマトグラフィー材料(例えば、スピンカラムで)で、バイオマーカーを先ず捕捉させる。本発明のバイオマーカーに結合する特異的な親和性物質に関しては、上述の通りである。親和性物質上での精製後、バイオマーカーを溶出し、続いてMALDIにより検出する。
別の方法では、バイオマーカーを、LC−MS又はLC−LC−MSにて検出する。この方法には、液体クロマトグラフィーを1回又は2回通過させてサンプル中のタンパク質を分離し、次いで一般的にはエレクトロスプレーイオン化にて質量分析する過程が含まれる。
飛行時間型質量分析法による分析対象物の分析では、飛行時間スペクトルが得られる。最終的に解析された飛行時間スペクトルは一般的に、サンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからのシグナルを示すのではなく、複数のパルスからのシグナルの総計を示している。これによりノイズが減少し、ダイナミックレンジが高くなる。次にこの飛行時間型データを、データ処理にかける。Ciphergenのプロテインチップ(登録商標)ソフトウエアでは、データ処理にはマススペクトル作成のためのTOF-to-M/Z変換処理、機器オフセットを除外するためのベースラインの減算処理及び高周波数雑音を減少させるための高周波数雑音フィルター処理が含まれる。
本発明のバイオマーカーの検出に関する好ましいプロトコールは、以下の通りである。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液等の検査される生体サンプルは、SELDI分析の前に予備分別することが好ましい。この予備分別工程が、サンプルを簡素化し、感度を向上させる。予備分別の好ましい方法には、Q HyperD(BioSepra, SA)のような陰イオン交換クロマトグラフィー材料にサンプルを接触させることが含まれる。続いて結合物質を、pH9、pH7、pH5及びpH4の緩衝液を用いて段階的なpHでの溶出を実施する。(バイオマーカーが溶出される画分も、表1に示した。) バイオマーカーを含有している種々の画分を採取する。別な態様では、例えば、卵巣嚢胞液サンプル等の検査される生体サンプルは、予備分別の工程を経ずに、分別しないままでチップ結合工程に使用される。
本発明の別な態様において、本発明のバイオマーカーは、質量分析又はバイオマーカーの質量測定に基づく方法以外によって、測定される。別な態様では、本発明のバイオマーカーは、免疫学的測定により測定される。免疫学的測定では、バイオマーカーを捕捉するために、抗体のような生体特異的な捕捉剤が必要である。抗体は、例えば動物をバイオマーカーで免疫化する等の、当該技術分野において広く知られた方法により作成可能である。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいてサンプルから単離可能である。あるいは、ポリペプチド・バイオマーカーのアミノ酸配列が既知の場合には、ポリペプチドは合成可能であり、当該技術分野で良く知られている方法により抗体の産生に利用できる。
本発明のバイオマーカーは、例えば卵巣癌を診断するために対象における卵巣癌の症状を評価するための診断検査に使用できる。「卵巣癌の症状」という語句は、疾患のすべての識別可能な徴候が含まれる。例えば、卵巣癌の症状には、疾患の有無(例えば、卵巣癌(悪性)、悪性レベルの低い見込みの卵巣癌、良性の卵巣疾患、他の悪性症状のそれぞれの比較)、疾患の進行リスク、疾患の段階、疾患の経過(例えば、経時的な疾患の悪化又は緩解)及び疾患治療に対する有効性又は応答が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような症状をベースにして、追加の診療検査又は治療手段を含む、更なる治療方法を示すことができる。
症状を正しく予測する診断検査の検出力は、アッセイの感度、アッセイの特異性又は受診者動作特性(ROC)分析曲線下面積として通常測定される。感度は、陽性であると検査で予測される真陽性の割合であるが、特異性は、陰性であると検査で予測される真陰性の割合である。ROC曲線は、(1−特異性)の関数として検査の感度を与える。ROC曲線下面積が大きければ大きいほど、検査の予測値はより正確となる。検査の効用に関する他の有用な尺度は、陽性予測値及び陰性予測値である。陽性予測値は検査で陽性であり、実際に陽性であった人の割合である。陰性予測値は検査で陰性であり、実際に陰性であった人の割合である。
個々のバイオマーカーは有用な診断バイオマーカーであるが、バイオマーカーの組み合わせは、単一のバイオマーカーを単独で使用するよりも特定の症状に対してより大きな予測値を与えることが見出されている。具体的には、サンプル中の多数のバイオマーカーの検出により、検査の感度及び/又は特異性を増加させることができる。少なくとも2つのバイオマーカーの組み合わせは、場合によっては「バイオマーカー・プロフィール」又は「バイオマーカー・フィンガープリント」と称される。表1、3及び4で説明のバイオマーカーの組み合わせが検出することができる。同様に、表1、3及び4で説明のバイオマーカーの1つ又はそれ以上が、CA125のような他の公知の卵巣癌のバイオマーカーと組み合わせて検出することができる。本発明のバイオマーカーと組み合わせて有用な公知の卵巣癌バイオマーカーの例では、これらに限定されないが、PCT国際特許公開第WO03/057014号公報及び同第WO2004/012588号公報に記載のものが挙げられ、これらの両方共を、全ての目標のために本明細書に参照して取り込む。
卵巣癌症状を判定するには、診断検査結果に基づき2又はそれ以上のグループ(症状)の一つに個体を通常分類する。本明細書に記述した診断検査は、幾つかの異なった症状に分類するのに用いることができる。
一態様では、本発明は、対象における卵巣癌の存在又は非存在(症状:卵巣癌対悪性レベルの低い見込みの卵巣癌又は良性の卵巣疾患)を判定する方法を提供する。卵巣癌の存在又は非存在は、関連のバイオマーカー(複数を含む)を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び/又はパターンと比較することにより判定される。
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の発症リスクを判定する方法を提供する。バイオマーカー量又はパターンは、種々なリスク状態(例えば、高い、中程度又は低い)の特性である。発症のリスクは、関連のバイオマーカー(複数を含む)を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参考量及び/又はパターンと比較することにより判定される。
一態様では、本発明は、対象に於ける疾患の段階を判定する方法を提供する。疾患の各段階において、バイオマーカーの特徴的な量又はバイオマーカーのセット(パターン)の相対量が存在する。疾患の段階は、関連バイオマーカー(複数を含む)を測定し、次いで分類アルゴリズムを適用するか又は特定の段階と関連するバイオマーカーの参考量及び/又はパターンと比較することにより判定される。例えば、初期卵巣癌と、非卵巣癌又はステージIの卵巣癌、ステージIIの卵巣癌及びステージIIIの卵巣癌とを区別をすることができる。
一態様では、本発明は、対象での疾患の経過を判定する方法を提供する。疾患の経過とは、疾患の進行(悪化)、緩解(改善)を含む経時的変化を言う。時間の経過と共に、バイオマーカーの量又は相対的な量(例えば、パターン)が変化する。そこで、これらのマーカーの傾向(例えば、疾患又は無疾患に関連して経時的に増加又は減少のどちらか)が、疾患の経過を示すことになる。従って、この方法では、対象での1つ又はそれ以上のバイオマーカーを少なくとも2つの異なる時点(例えば、1回目、2回目)で測定し、変化が存在すればそれを比較する。疾患の経過は、これら比較に基づいて判定される。
同様に、疾患の進行(又は、緩解)の変化の違いがバイオマーカー量(例えば、表1のペプチドのバイオマーカー)を、異なった時点で測定し、そしてバイオマーカー量の変化の速度を計算することによりモニターできる。疾患の症状又は疾患の進行の速度を測定できることは、治療を通して疾患の進行を緩める又は停止させることが目的の治療薬剤の検討に重要である。
本発明の追加の態様は、アッセイ結果若しくは診断結果の何れか又はそれらの両方を、例えば技師、医者又は患者に伝えることに関する。ある態様では、アッセイ結果又は診断結果の何れか又はそれらの両方を、関心を有する者、例えば医者とその患者に伝えるのにコンピュータが用いられる。幾つかの態様では、結果又は診断が報告される国又は法域とは異なった国又は法域で、アッセイ又はアッセイ結果の分析が行われる。
卵巣癌症状を認定する方法のある態様では、症状に応じて対象の治療を管理することが方法に含まれる。そのような管理には、卵巣癌症状の判定に続いて取られる医師又は臨床医の活動が含まれる。例えば、医者が卵巣癌の診断をすれば、例えば、処方又は抗化学療法薬剤の投与のようなある特定の治療が実施される。あるいは、卵巣癌LMP又は良性の卵巣疾患の診断では、患者が罹っている特定の疾患を判定するために更に検査が行われる。また、診断検査で卵巣癌であるとの結論が得られない際は、更なる検査が必要となる。
別な態様では、本発明は、製剤の治療効果を判定する方法を提供する。これらの方法は、薬剤の臨床治験の実施、更にその薬剤の投与を受けている患者の進行をモニターするのに有用である。治療又は臨床治験では、薬剤を特定の投薬計画に基づき投与する。投薬計画としては、薬剤の単回投与量、又はある期間にわたる反復投与量が含まれうる。医者又は臨床研究者が、投与期間中の患者又は対象に対する薬の効果をモニターする。薬剤が、症状に薬理効果を有するならば、本発明のバイオマーカーの量又は相対量(例えば、パターン、又はプロフィール)は、疾患ではないプロフィールへと変化する。例えば、ApoCI及びヘモグロビンのバイオマーカーは、疾患と共に増大し、M32600のバイオマーカーは疾患と共に減少する。そこで、治療期間中に対象でのこれらバイオマーカー量の経過をフォローできる。従って、この方法では、薬剤治療を受けている対象での1つ又はそれ以上のバイオマーカーを測定し、対象の病状とバイオマーカー量を関連付けることが含まれる。本方法の一態様では、薬剤治療期間中の少なくとも2つの異なる時点(例えば、1回目及び2回目)での複数のバイオマーカーのレベルを判定し、バイオマーカー量の変化(もしあるとすれば)を比較する。例えば、複数のバイオマーカーを、薬剤投与の前後で、又は薬剤投与の2つの異なる時点で測定する。治療の効果は、これら比較に基づき判定する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。もし治療が効果をあげているならば、複数のバイオマーカーは正常に向かい、もし治療効果がなければ、複数のバイオマーカーは疾患を示す方向に変化する。
ある態様では、「公知のサンプル」のようなサンプルを用いて得られたスペクトル(例えば、マススペクトル又は飛行時間型スペクトル)から得られたデータは、分類モデルを「トレーニングする(train)」ために利用できる。「公知のサンプル」とは、前もって分類されたサンプルである。スペクトルから得られ、そして分類モデルを作成するために用いられるデータは、「トレーニングデータセット」と称する。一旦トレーニングされると、分類モデルは、未知のサンプルから得られたスペクトルから導かれたデータのパターンを認識できる。そこで、分類モデルは、未知のサンプルをクラスに分類するのに用いられる。これは、例えば、ある特別な生体サンプルをある特定の生体の状態に関連しているか又はそうでないのか(疾患対疾患でない)を、予想するに有用である。
陽電子放出型断層撮影(PET)又は単光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)の画像のような非侵襲性の医療画像法は、癌、冠動脈疾患及び脳疾患の検出に有効である。PET及びSPECTの画像は、他の画像技術(X線、CT及びMRIのような)が構造を示すのに比べて、器官及び組織の化学的な機能を示す。PET及びSPECTの画像の利用は、アルツハイマー病のような脳疾患の発症を認定したり、モニターすることへの利用が増加している。幾つかの事例では、PET及びSPECTの画像の利用で、アルツハイマー病をその発症より数年早く検出することが可能となる。例えば、Vassaux及びGroot−wassinkの「遺伝子治療のためのインビボ非侵襲性画像」(J. Biomedicine and Biotechnology, 2: 92-101 (2003))を参照されたい。
他の態様として、本発明は、本発明のバイオマーカーをベースにした物質の組成物を提供する。
別な態様として、本発明は、卵巣癌の症状を認定するためのキットを提供し、そのキットは本発明によるバイオマーカーの検出に用いられる。一態様では、キットは、捕捉剤が付着したチップ、マイクロタイタープレート、ビーズ又は樹脂のような固体担体からなり、ここにおいて、捕捉剤は本発明のバイオマーカーを結合する。従って、例えば、本発明のキットは、プロテインチップ(登録商標)アレイのようなSELDI用の質量分析プローブを包含できる。生体特異的な捕捉剤の場合、キットは、反応性表面を有する固体担体及び生体特異的な捕捉剤を包含する容器を含んでなる。
本発明の方法には、更に他の適用もある。例えば、バイオマーカーは、インビトロ又はインビボでのバイオマーカーの発現を調節する化合物のスクリーニングに用いられ、この化合物は、患者の卵巣癌の治療又は防止に有用である。別の例では、バイオマーカーは、卵巣癌に対する治療の応答をモニターするために使用できる。他の実施例では、バイオマーカーは、対象が卵巣癌を発症するリスクがあるかを判定する遺伝検討に用いることができる。
12. 実施例
サンプル
卵巣嚢胞液サンプルは、ケンタッキー大学より入手した。サンプルは、患者の手術中に採取され、−80℃に保存された。サンプルの分布は以下の通りである:侵襲性の卵巣癌(OvCa) 12症例;悪性度の低い見込み(不明確な)卵巣癌 13症例;他の悪性腫瘍 6症例;及び良性 39症例。
卵巣嚢胞プロファイリングは、直接のチップ結合方法及び陰イオン交換分別後のチップ結合方法の両方を用いて実施した。プロファイリングするサンプルを含むランダム化テンプレートが、Ciphergen Expressソフトウェアプログラムを用い作成された。サンプルを氷上で解凍し、96個のウェルプレートに加えて(アレンジメント用テンプレートに従い)、4000rpmで20分間遠心分離した。嚢胞液のアリコートを、新しい96個のウェルプレートに入れ、使用まで−80oCで保存した。血清サンプルは、2004年10月6日にIMAC−Cu++、及び2004年10月14日にQ10(以下のプロトコールを参照されたい)よりトリプリケート(3組)のプロテインチップアレイでプロファイリングした。同一日に全ての複製を調製し、PCS4000で読み込んだ。アレイは、Biomek2000又はTecan Aquariusロボットを用い、サンプルで処理した。
1.5μlのサンプルを、7.5μlのU9緩衝液で変性する
2.4℃にて20分間振って混合する
3.50mMのトリス(pH9)緩衝液112.5μlを加えて、最終容量を125μlとする
4.5μlの変性サンプルを4つのチップタイプの全てに適用する
チップ結合:
IMAC30:IMAC30プロテインチップアレイは銅と結合させる。結合及び洗浄緩衝液は、50mMのトリス(pH8.0)/500mMのNaCl溶液である。
CM10:結合及び洗浄緩衝液は、100mMの酢酸ナトリウム(pH4.0)溶液である。
H50:結合及び洗浄緩衝液は、10%のアセトニトリル緩衝液である。
Q10:結合及び洗浄緩衝液は、50mMのトリス緩衝液(pH8.0)である。
結合処理時間:室温で60分間である。
マトリックスは、シナピニン酸である。
緩衝液リスト:
1.U9(9Mの尿素、2%のCHAPS、50mMのトリス−HCl、pH9)
2.U1(1Mの尿素、0.22%のCHAPS、50mMのトリス−HCL、pH9)
3.0.1%のOGPを有する50mMのトリス−HCl(pH9)(洗浄緩衝液1)
4.0.1%のOGPを有する50mMのHepes(pH7)(洗浄緩衝液2)
5.0.1%のOGPを有する100mMの酢酸ナトリウム溶液(pH5)(洗浄緩衝液3)
6.0.1%のOGPを有する100mMの酢酸ナトリウム溶液(pH4)(洗浄緩衝液4)
7.0.1%のOGPを有する50mMのクエン酸ナトリウム溶液(pH3)(洗浄緩衝液5)
8.33.3%のイソプロパノール/16.7%のアセトニトリル/0.1%のトリフルオロ酢酸(洗浄緩衝液6)
注意:洗浄緩衝液5が樹脂に適用されるまでは、洗浄緩衝液6を緩衝液トレイに等分しない。これにより、揮発性の有機溶媒の蒸発が問題にならない。
フィルタープレート
F1〜F6に標識された6vのウェルの96個ウェル皿
HyperQ DF樹脂を50mMのトリス−HCl溶液(pH9)の5倍のベッド容量で3回洗浄して樹脂を準備する。その後50mMのトリス−HCL溶液(pH9)中に50%の懸濁状態で保存する。
冷凍血清を解凍し、4℃にて20000gで10分間遠心分離する
96個のウェルプレートのそれぞれのウェルに20μlの血清を等分する
30μlのU9をそれぞれのサンプルに加える
4℃にて20分間よく攪拌する
180μl(ラット血清に対しては240μl)のHyperQ DFをフィルタープレート中のそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
200μlのU1をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
200μlのU1をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
200μlのU1をそれぞれのウェルに加える
緩衝液をろ過する
各ウェルから50μlのサンプルをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
50μlのU1をサンプルプレートのそれぞれのウェルに加える
5回混合する
サンプルプレートの各ウェルから50μlをピペットでフィルタープレート中の対応するウェルに加える
「この工程は、ロボットでピペット採取する場合デッド容量がある(ロボットが最初にサンプルを採取する時、全ての物質を採取しない)ために含まれる。50μlのU1を加えて混合することにより、残留物を得て最初の50μlに加えることができる。」
4℃にて30分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF1のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF1に通過液を採取する
100μlの洗浄緩衝液1をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF1にpH9の流出液を採取する
画分1は通過液とpH9の流出液を含む
100μlの洗浄緩衝液2をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF2のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF2に画分2を採取する
100μlの洗浄緩衝液2をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF2に画分2の残りを採取する
画分2はpH7の流出液を含む
100μlの洗浄緩衝液3をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF3のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF3に画分3を採取する
100μlの洗浄緩衝液3をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF3に画分3の残りを採取する
画分3はpH5の流出液を含む
100μlの洗浄緩衝液4をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF4のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF4に画分4を採取する
100μlの洗浄緩衝液4をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF4に画分4の残りを採取する
画分4はpH4の流出液を含む
100μlの洗浄緩衝液5をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF5のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF5に通過液を採取する
100μlの洗浄緩衝液5をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF5に画分5の残りを採取する
画分5はpH3の流出液を含む
100μlの洗浄緩衝液6をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
フィルタープレートの下にプレートF6のv−ウェルの96個ウェルをおく
プレートF6に画分6を採取する
100μlの洗浄緩衝液6をフィルタープレートのそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で10分間よく攪拌する
プレートF6に画分6の残りを採取する
画分6は有機溶媒の流出液を含む
チップ結合のプロトコールを進めるまで冷凍する
緩衝液リスト:
IMAC30チップ:
1.100mMのリン酸ナトリウム+0.5MのNaCl溶液(pH7.0)
2.100mMのCuSO4
3.100mMの酢酸ナトリウム(pH4.0)
CM10チップ:
1.100mMの酢酸ナトリウム(pH4.0)
バイオ処理装置(bioprocessors)
IMAC30チップ
CM10チップ
バイオ処理装置にチップをおく
50μlのCuSO4をIMAC3チップ上の各々の部位に負荷する
バイオ処理装置を700rpmで1分間遠心分離する
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後CuSO4を除く
水洗浄する
50μlの酢酸ナトリウム(pH4.0)をIMAC3チップ上の各々の部位に負荷する
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後酢酸ナトリウムを除く
水洗浄する
150μlの適当なチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
CM10のためにバイオ処理装置を700rpmで1分間遠心分離する
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
150μlの適当な緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
各ウェルに90μlの対応する緩衝液を加える
10μlのQカラム画分を加える
CM10のためにバイオ処理装置を700rpmで1分間遠心分離する
室温(RT)で60分間よく攪拌する
攪拌後サンプルと緩衝液を除く
150μlの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
150μlの対応するチップ結合緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
150μlの対応する緩衝液をそれぞれのウェルに加える
室温(RT)で5分間よく攪拌する
攪拌後緩衝液を除く
2回水洗浄する
バイオ処理装置の上部とガスケットを除く
部位から水を真空下で除く
チップを10分間乾燥する
ペン(a pap pen)を用いて各スポットの周りに円を描く
SPAに対して
400μlの50%のACN、0.5%のTFAをSPAチューブに加える
室温(RT)で5分間よく攪拌する
1.0μlを各スポットに加える
10分間風乾する
1.0μlを各スポットに加える
風乾する
データは、CiphergenExpressを用いて得た。質量較正は、外部較正試薬を用いて実施し、強度の正規化は、外部の正規化要因を用いて、総イオン電流に基づき実施し、またベースラインを差し引くことを行った。ピーク検出は、ピークがシグナル/ノイズ比3:1を有し、スペクトルの20%に存在することを基準として用い、CiphergenExpressで実施した。統計解析は、マン・ホイットニー検定(2グループ、例えば、良性対卵巣癌に対して)又はクラスカル・ウォリス検定(多重グループ比較で、良性の卵巣疾患、卵巣癌、悪性度の低い見込みの卵巣癌(LMP)、他の悪性腫瘍(転移性癌(例えば、胃癌の卵巣への転移)、中皮腫、間質卵巣癌等を含む、侵襲性上皮卵巣癌以外の悪性腫瘍)のそれぞれの比較)を用い、CiphergenExpressで実施した。
クラスカル・ウォリス検定を用いて、4通りの比較を実施した。4つのグループは、良性の卵巣疾患、侵襲性上皮卵巣癌、不明確な卵巣癌(悪性度の低い見込みの卵巣癌とも呼ばれる)、及び他の悪性腫瘍(間質卵巣腫瘍、転移性疾患及び子宮癌を含む)である。
バイオマーカーは、ある範囲のBiosepra吸着剤を用いるクロマトグラフィー技術、そして続いてSDS−PAGEで処理する組み合わせで精製される。精製のスキームは、目的のバイオマーカーを追跡するプロテインチップ読み込み器(Reader)を用いてモニターされる。30kDaより小さいタンパク質に対しては、目的の無傷のバンドををゲルから抽出し、プロテインチッップ読取り器で再分析して元のバイオマーカーと一致するそれらの正確な質量を確認する。ゲル抽出のタンパク質は、溶液中でトリプシンで消化し、30kDaより大きいタンパク質はゲル中で消化される。トリプシンの消化物は、プロテインチップ読取り器を用いてペプチドマッピングし、PCI−1000プロテインチップ接触面を合わせたQ−STAR(Applied Biosysrtems)装置を用いるタンデムMSによって分析する。4kDaより小さいバイオマーカーは、クロマトグラフィー技術の組み合わせにより濃縮して、SDS−PAGE精製及び/又はトリプシン消化なしにタンデムMSで直接同定される。幾つかの事例(例えば、リゾチームC)では、バイオマーカーは、抗体を用いて同定される。
方法
タンパク質発現のプロファイリングは、卵巣腫瘍の74名の患者の卵巣嚢胞液(16症例の悪性、13症例の悪性度の低い見込み、45症例の良性)でプロテインチップバイオマーカーシステム(登録商標)(Ciphergen Biosystems)である表面増強レーザー脱離イオン化時間又は飛行型質量分析計を用いて実施した。卵巣嚢胞液は、無分別及び陰イオン交換分別後に分析した。各々の画分のアリコートは、NP20、IMAC30、CM10、H50及びQ10のプロテインチップアレイで2通り分析した。Ciphergen ExPress(登録商標)ソフトウェアは、m/zピークの同定及び診断のグループ間のピーク強度比較のために用いた。診断のグループ間のピーク強度の統計的に有意な違いは、クラスカル・ウォリス検定及びROC曲線分析により判定した。
卵巣嚢胞液からの100以上のタンパク質ピークは、良性、悪性及び悪性度の低い見込みの卵巣腫瘍の間でピーク強度が有意に異なった(下記の表2及び3を参照されたい)。これらの卵巣嚢胞液で、以下のものが、MS/MS又は免疫学的測定の評価を有するMS/MSにより同定される:アポリポタンパク質CI(m/z=6520、p=0.0003)、アポリポタンパク質AII(m/z=8690、p=0.00006)及びアポリポタンパク質CII(m/z=8918、p=0.0002);カルグラヌリンA(m/z=10840、P=0.00001)及びカルグラヌリンC(m/z=10430、P=0.00004);トランスサイレチン(二重荷電)(m/z=6880、P=0.00005);及びカルサイクリン(m/z=10210、P=0.00002)。
CM10プロテインチップアレイに吸収され、高いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のSELDI−TOF MS分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、35個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのP値(複数を含む)及びROC分析のAUC値を示した。
CM10プロテインチップアレイに吸収され、低いレーザー強度で読み込まれた個々の患者からの陰イオン交換分別した嚢胞液のSELDI−TOF MS分析値は、悪性の上皮卵巣腫瘍に対して良性及び悪性度の低い見込みの腫瘍を有する患者で違いのある、28個のバイオマーカーを同定した。クラスカル・ウォリスのP値(複数を含む)及びROC分析のAUC値を示した。
卵巣嚢胞液は、卵巣癌の診断のタンパク質バイオマーカーの豊富な供給源である。これらのバイオマーカーの幾つかが急性期反応物である。本明細書で実証したように、嚢胞液のタンパク質は、卵巣癌の診断検査に有用なバイオマーカーの優れた供給源である。
Claims (20)
- (a)対象からの生体サンプル中のApoA1、CA125、β2ミクログロブリン、トランスフェリン及びトランスサイレチンを測定すること;及び
(b)CA125及びβ2ミクログロブリンの上方制御、及びApoA1、トランスフェリン及びトランスサイレチンの下方制御を卵巣癌の症状と関連付けること:
を含んでなり、
前記卵巣癌の症状は、良性の卵巣疾患及び悪性度の低い見込みの卵巣癌に対する卵巣癌及び他の悪性症状であり、
前記トランスサイレチンは、トランスサイレチン(二重荷電)、非修飾トランスサイレチン及び修飾トランスサイレチンを含んでなる、
対象における卵巣癌の症状を認定するためのデータを収集する方法。 - ApoC1、ヘモグロビンα/β、ApoAII、ApoCII、カルグラヌリンC、カルグラヌリンC(切断型)、カルグラヌリンA、カルサイクリン及びIgG重鎖よりなる群から選ばれる少なくとも1つのバイオマーカーを測定することを更に含んでなる、請求項1に記載の方法。
- ハプトグロビン、ITIH4内部フラグメント、ヘプシジン、プロスタチン、オステオポンチン、エソイノフィル(esoinophil)由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、IGF−II、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる、少なくとも1つのバイオマーカーを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項1又は2に記載の方法。
- CA125II、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA195、腫瘍関連のトリプシン抑制剤(TATI)、CEA、胎盤のアルカリホスファターゼ(PLAP)、シアリルTN、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF、CSF−1)、リゾホスファチジン酸(LPA)、上皮成長因子受容体の細胞外領域の110kD成分(p110EGFR)、カリクレイン6、カリクレイン10(NES−1)、プロスタシン、HE4、クレアチンキナーゼB(CKB)、LASA、HER−2/neu、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Dianon NB70/K、組織ペプチド抗原(TPA)、SMRP、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子I及びインスリン様成長因子IIよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの少なくとも1つを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのバイオマーカーが、SELDIプローブの吸着体表面に当該バイオマーカーを捕捉して、レーザー脱離−イオン化質量分析計で捕捉のバイオマーカーを検出することにより測定される、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記吸着体が、疎水性の吸着剤、陰イオン交換吸着剤、陽イオン交換吸着剤及び金属キレート吸着剤からなる群より選ばれる部材である、請求項5に記載の方法。
- 前記吸着体が、陽イオン交換吸着剤である、請求項6に記載の方法。
- 少なくとも1つのバイオマーカーを、免疫学的測定で測定する、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、卵巣嚢胞液、血清、血液又は尿である、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- 前記関連付けが、ソフトウェアの分類アルゴリズムによって実施される、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- (c)対象に症状を報告すること、
を更に含んでなる、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。 - (c)具体的な媒体に症状を記録すること、
を更に含んでなる、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。 - (a)1回目に、対象からの生体サンプル中のApoA1、CA125、β2ミクログロブリン、トランスフェリン及びトランスサイレチンを測定すること、
(b)2回目に、対象からの生体サンプル中のApoA1、CA125、β2ミクログロブリン、トランスフェリン及びトランスサイレチンを測定すること、
(c)1回目の測定値と2回目の測定値を比較すること、
を含んでなり、
CA125及びβ2ミクログロブリンの経時的な増加、及びApoA1、トランスフェリン及びトランスサイレチンの経時的な減少が卵巣癌の進行を示し、CA125及びβ2ミクログロブリンの経時的な減少、及びApoA1、トランスフェリン及びトランスサイレチンの経時的な増加が卵巣癌の緩解を示し、
前記トランスサイレチンは、トランスサイレチン(二重荷電)、非修飾トランスサイレチン及び修飾トランスサイレチンを含んでなる、
卵巣癌の経過を判定するためのデータを収集する方法。 - ApoC1、ヘモグロビンα/β、ApoAII、ApoCII、カルグラヌリンC、カルグラヌリンC(切断型)、カルグラヌリンA、カルサイクリン及びIgG重鎖よりなる群から選ばれる、少なくとも1つのバイオマーカーを測定することを更に含んでなる、請求項13に記載の方法。
- ハプトグロビン、ITIH4内部フラグメント、ヘプシジン、プロスタチン、オステオポンチン、エソイノフィル(esoinophil)由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、IGF−II、ヘモグロビン及びそれらの修飾型よりなる群から選ばれる、少なくとも1つのバイオマーカーを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項13又は14に記載の方法。
- CA125II、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA195、腫瘍関連のトリプシン抑制剤(TATI)、CEA、胎盤のアルカリホスファターゼ(PLAP)、シアリルTN、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF、CSF−1)、リゾホスファチジン酸(LPA)、上皮成長因子受容体の細胞外領域の110kD成分(p110EGFR)、カリクレイン6、カリクレイン10(NES−1)、プロスタシン、HE4、クレアチンキナーゼB(CKB)、LASA、HER−2/neu、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Dianon NB70/K、組織ペプチド抗原(TPA)、SMRP、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子I及びインスリン様成長因子IIよりなる群から選ばれる、少なくとも1つのバイオマーカーを測定すること、そして関連付けることを更に含んでなる、請求項13〜15の何れか一項に記載の方法。
- コンピュータに、
a.サンプル中のApoA1、CA125、β2ミクログロブリン、トランスフェリン及びトランスサイレチンの測定値を包含する、サンプルに起因するデータにアクセスさせるコード、及び
b.サンプルの卵巣癌の症状を、測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行させるコード、
を含んでなり、
前記トランスサイレチンは、トランスサイレチン(二重荷電)、非修飾トランスサイレチン及び修飾トランスサイレチンを含んでなる、
コンピュータ読み取り可能な記録媒体。 - 前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ApoC1、ヘモグロビンα/β、ApoAII、ApoCII、カルグラヌリンC、カルグラヌリンC(切断型)、カルグラヌリンA、カルサイクリン及びIgG重鎖よりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として更に分類する、請求項17に記載のコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
- 前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、ハプトグロビン、ITIH4内部フラグメント、ヘプシジン、プロスタチン、オステオポンチン、エソイノフィル(esoinophil)由来の神経毒、レプチン、プロラクチン、IGF−II、ヘモグロビン及びそれらの修飾型であるバイオマーカーの各々の測定値の関数として更に分類する、請求項17又は18に記載のコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
- 前記分類アルゴリズムが、サンプルの卵巣癌の症状を、CA125II、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA195、腫瘍関連のトリプシン抑制剤(TATI)、CEA、胎盤のアルカリホスファターゼ(PLAP)、シアリルTN、ガラクトシル・トランスフェラーゼ、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF、CSF−1)、リゾホスファチジン酸(LPA)、上皮成長因子受容体の細胞外領域の110kD成分(p110EGFR)、カリクレイン6、カリクレイン10(NES−1)、プロスタシン、HE4、クレアチンキナーゼB(CKB)、LASA、HER−2/neu、尿ゴナドトロピン・ペプチド、Dianon NB70/K、組織ペプチド抗原(TPA)、SMRP、オステオポンチン、ハプトグロビン、レプチン、プロラクチン、インスリン様成長因子I及びインスリン様成長因子IIよりなる群から選ばれる、バイオマーカーの測定値の関数として更に分類する、請求項17〜19の何れか一項に記載のコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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