KR100997463B1 - 난소암 진단용 조성물, 그 키트 및 진단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 조성물과 그 키트, 및 상기 항원에 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계 및 상기한 항원-항체 복합체의 형성량을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 내의 난소암 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 난소암을 더욱 정확하게 조기에 진단할 수 있다.
CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1, 난소암

Description

난소암 진단용 조성물, 그 키트 및 진단 방법{Composition, kit and methods for diagnosing ovarian cancer}
도 1은 정상과 난소암 환자를 구별하기 위한 순서도로서, 정상인 환자(1) 및 난소암 환자(2)로 분류된 환자의 아포지방단백질 A1의 발현 2572.5ng/ml를 기준으로 상기 발현량보다 낮으면 최종 난소암으로 진단하고, 높으면 다시 트랜스타이레틴의 발현량 80.5ng/ml을 기준으로 이보다 작으면 최종적으로 난소암으로 진단하고, 이보다 높으면 최종적으로 정상인 환자로 진단하는 과정을 나타낸다.
도 2는 정상 또는 난소난종 환자와 난소암 환자를 구별하기 위한 순서도로서, 정상인 환자(1) 및 난소암 환자(2)로 분류된 환자의 CA125 발현 105.25㎍/ml를 기준으로 이보다 낮으면 정상 또는 난소낭종으로, 이보다 높으면 난소암으로 구별하고, 정상 또는 난소낭종으로 판별된 상기 환자에서 트랜스타이레틴의 발현 81.25ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 정상 또는 난소낭종으로, 이보다 높으면 난소암으로 최종 진단하고, 또한 상기 정상 또는 난소낭종 환자의 CA125 발현 32.65㎍/ml를 기준으로 이보다 낮으면 정상 또는 난소낭종으로 진단하고, 이보다 높으면 난소암으로 진단한다. 또한 상기 CA125 발현 105.25㎍/ml를 기준으로 이보다 높아 난소암으로 진단된 환자에서 CA125 발현 210.75㎍/ml를 기준으로 이보다 낮으면 정상 또는 난소낭종으로 진단하고, 이보다 높으면 난소암으로 진단하는 한편, 상기 정상 또는 난소낭종으로 진단된 환자에서 아포지방단백질 A1의 발현 1947.5ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 최종 정상 또는 난소낭종 환자로, 이보다 높으면 난소암 환자로 진단하는 과정을 나타낸다.
도 3은 난소낭종 환자와 난소암 환자를 구별하기 위한 순서도로서, 난소난종(1) 및 난소암(2)로 분류된 환자의 CA125의 발현 105.25㎍/ml를 기준으로 이보다 낮으면 난소낭종으로, 이보다 높으면 난소암으로 구별하고, 난소낭종으로 구별된 환자에서 CA125의 발현 10.25㎍/ml를 기준으로 이보다 낮으면 난소낭종으로 최종 진단하고, 이보다 높으면 난소암으로 최종 진단하는 한편, 상기 CA125의 발현이 105.25㎍/ml보다 높을 경우 다시 CA125의 발현 210.75㎍/ml를 기준으로 이보다 높으면 난소암으로 최종 진단하고, 이보다 낮으면 다시 아포지방단백질 A1의 발현 1947.5ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 최종 난소난종으로, 이보다 높으면 난소암으로 최종 진단하는 과정을 나타낸다.
도 4는 정상인 환자와 난소낭종인 환자를 구별하기 위한 순서도로서, 정상(1) 및 난소낭종(2)으로 분류된 환자의 아포지방단백질 A1의 발현 2540ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 다시 아포지방단백질 A1의 발현 1300ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 최종적으로 난소낭종으로 진단하고, 이보다 높으면 다시 CA125 발현 20.85㎍/ml를 기준으로 낮을 경우 최종적으로 정상인 환자로 진단하고, 높을 경우에는 난소낭종 환자로 최종적으로 진단하는 한편, 상기 아포지방단백질 발현 2540ng/ml 보다 높을 경우 다시 헤모글로빈 발현 2122.5ng/ml를 기준으로 이보다 높으면 최종적으로 난소낭종 환자로 진단하고, 이보다 낮으면 다시 트랜스타이레틴 의 발현 81.25ng/ml를 기준으로 이보다 낮으면 정상인 환자로 최종 진단하고, 이보다 높으면 난소낭종 환자로 최종 진단하는 과정을 나타낸다.
도 5는 도 1의 정상과 난소암의 환자를 구별하는 과정에서 사용된 아포지방단백질 A1 및 트랜스타이레틴의 ROC curve를 나타내는 그림이다(Apo A1: 아포지방단백질 A1, TTR: 트랜스타이레틴).
도 6은 도 2의 정상 또는 난소낭종 환자와 난소암 환자를 구별하는 과정에서 사용된 아포지방단백질 A1, CA125 및 트랜스타이레틴의 ROC curve를 나타내는 그림이다(Apo A1: 아포지방단백질 A1, TTR: 트랜스타이레틴, CA125).
도 7은 도 3의 난소낭종 환자와 난소암 환자를 구별하는 과정에서 사용된 아포지방단백질 A1 및 CA125의 ROC curve를 나타내는 그림이다(Apo A1: 아포지방단백질 A1, CA125).
도 8은 도 4의 정상과 난소낭종 환자를 구별하는 과정에서 사용된 아포지방단백질 A1, CA125, 헤모글로빈 및 트랜스타이레틴의 ROC curve를 나타내는 그림이다(Apo A1: 아포지방단백질 A1, TTR: 트랜스타이레틴, Hemo: 헤모글로빈, CA125).
본 발명은 난소암 진단에 관한 것으로서, 구체적으로는 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 조성물 및 진단 키트, 및 난소암 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
난소암은 부인암 발생율의 24%를 차지하는 부인과에서 가장 심각한 질병중 하나이며, 난소암으로 인한 부인암 사망률은 47%에 다다르고 있다. 더욱 심각한 문제는 치료 결과가 20년 전보다 더 나아진 게 없다는 사실이며, 조기진단과 예방이 유일한 희망이지만, 그나마 조기진단법의 확립이 이루어지지 않고 있으며, 예방대책에 대해서도 논란이 많다. 따라서 난소의 악성종양은 점점 더 심각한 문제가 되어가고 있으며, 이로 인한 사망률은 다른 생식기 종양에 의한 사망률보다 높다. 현재 난소암의 원인은 아직도 정확히 밝혀지지 않고 있으며, 지난 반세기 동안 사망률은 감소되지 않은 상태로 남아 있다.
현재 진행된 난소암 환자의 치료로는 종양축소수술 (cytoreductive surgery) 및 항암 화학요법 후 치료 상태 판정과 잔여 종양의 제거 등을 위해 2차 추시 개복술을 시행하지만 2년 생존율은 50%, 5년 생존율을 20% 미만에 머물고 있다 (Bertelsen et al., 1986). 또한 난소암의 경우 2기 이내 진단 시 5년 생존율은 85% 수준인 반면, 3기 진단 시 5년 생존율은 50 % 이하로 떨어지며, 4기에 발견되면 생존율은 급격히 낮아진다. 따라서 효과적인 암 치료를 위해서는 적절한 진단 표지물질을 이용한 조기진단이 필수적이라 하겠다.
악성종양의 진단, 치료 결과의 평가 및 추적관찰 등에서 종양 표지 물 질(Tumor marker)은 임상적으로 매우 유용한 검사 중의 하나이다. 이상적인 종양 표지물질은 종양 세포에서 생성되어 체액 내에 쉽게 유리되어야 하고, 악성과 양성을 구별할 수 있는 높은 특이도를 지녀야 하며, 조기 발견에 도움이 되어야 한다. 또한 집단검사 시 유용하여야 하며 종양의 진행정도 및 치료 결과를 반영할 수 있어야 한다. 현재 CA-125가 상피성 난소암에 가장 유용한 것으로 알려져 있으며, CA-125 단독 또는 다른 종양 표지 물질과 복합적으로 측정하여 조기 진단의 목적에 이용하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다.
1981년 Bast 등에 의하여 처음 개발된 CA125는 상피성 난소암에서 추출된 단세포군 항체 OC125에 의하여 측정되는 분자량 200 KDa의 고분자 세포표면 당단백으로 난소암의 진행정도를 잘 반영하여 민감도 및 특이도가 높은 (Bast et al., 1983) 대표적 종양표지물질로서, Niloff 등(Niloff et al., 1986)이 난소암의 치료효과의 판정 및 예후인자로서의 CA125의 가치에 대해 보고한 이래로 최근까지 수많은 연구보고가 이루어지고 있다(Cohen et al., 1994 ; Gard & Houghton, 1994 ; Pearl et al., 1994). CA125는 난소암 환자의 82%, 특히 장액성 난소 종양에서 높은 양성률을 보이고 CA125 항원의 증감은 환자의 90%에서 병의 호전 및 악화와 직접적인 연관성이 있음을 보이고 있다. 그러나 CA125는 종양 용적이 적거나 현미경적 암일 경우 위음성률이 높으며, 최근에는 CA125 항원이 난소의 상피세포암에 특이 항원이 아니며 부인과 영역 이외의 양성 또는 악성질환에서도 정상치인 35 U/ml 이상의 양성반응을 보여 높은 위양성률이 문제점으로 지적되고 있다(Kabawat et al., 1983; Niloff et al., 1984).
암 진단에 있어서 한 종류의 표지 물질을 사용하는 경우 민감도 및 특이도가 여러 표지 물질을 사용하는 경우보다 상대적으로 낮아 위양성 혹은 위음성의 오류를 범할 확률이 상대적으로 높다. 발굴된 암세포 혹은 조직에 특이적인 표지물질이 조기 진단에 사용되기 위해서는 몇 가지 제약 조건이 있다. 우선 표지물질의 농도의 문제인데, 암 조직에서 발현된 표지 물질이 혈장 혹은 척수액 같은 용액에 방출되면 지나치게 희석되어 진단표지물질로 사용하는데 있어 어려움이 있다. 따라서 조직에서 발견된 표지 물질을 체액에서 검출하기는 무리가 따르고, 조직 자체를 조사할 경우 표지 물질의 의미를 상당히 상실하게 된다. 또한 체액에서 발현의 차이를 보이는 물질과 암 혹은 다른 병변 조직에서 변화하는 물질과 일치 하지 않을 가능성이 있다. 조직 내의 변화가 캐스케이드(cascade)에 따라 체액에 도달하면 전혀 다른 표지 물질로 나타날 수도 있고, 서로 다른 암 조직이라도 공통의 표지 물질을 나타낼 수 있다. 따라서 다중 바이오마커(multiplex biomarker)를 이용한 암의 진단은 향후 진단의 방향이 될 것으로 예상되고, 난소암 진단 시스템이 개발되면 이의 파급효과는 상당히 클 것으로 예측된다. 이러한 추세는 암 이외에도 면역 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 및 신경 질환 같은 대부분의 질환에도 공통적으로 응용될 것으로 예측된다.
이에 본 발명자는 난소암 진단 마커로서의 헤모글로빈에 대한 항체를 포함하 는 조성물 및 이를 포함하는 난소암 진단 키트에 대하여 연구를 하고 대한민국 등록특허 제0559374호로 등록을 받았으며, 또한 헤모글로빈을 포함하여 난소암 조기 진단의 민감도 및 특이성이 더욱 뛰어난 마커 등에 관하여 연구를 계속한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기한 항원-항체 복합체의 형성량을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 난소암 진단 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 CA125는 상피성 난소암에서 추출된 단세포군 항체 CA125에 의하여 측정되는 분자량 200KDa의 고분자 세포표면 당단백질이다. 헤모글로빈(hemoglobin)은 본 발명자의 대한민국 등록특허 제0559374호에 개시된 바와 같이, 알파 및 베타 서브유닛의 다량체로서, 이들 서브유닛은 함께 또는 개별적으로 본 발명의 난소암 진단 마커로서 작용할 수 있다. 아포지방단백질 A1(apolipoprotein)은 지방단백질 복합물(lipoprotein complex)의 구성성분으로서, 28KDa의 single polypeptide이다. 아포지방단백질 A1은 콜레스테롤의 에스테르화를 촉진시키는 HDL 복합체내의 LCAT를 활성화 시켜 그 결과 가용성 콜레스테롤-HDL복합체를 형성하여 HDL의 콜레스테롤 수송능력을 증가시켜 간에서 점차적으로 제거되도록 하는 기능을 한다. 또한 트랜스타이레틴(transthyretin)은 127개의 아미노산으로 구성된 프라즈마 단백질로서 레티놀(retinol)과 티록신(thyroxine)에 결합하고, 이의 유전자는 염색체 18q11.2-q12.1위치에 존재하며, 산성 전분(acidic starch) 겔에서 알부민(albumin) 보다 빠르게 이동하므로 프리알부민(prealbumin)으로 불리기도 한다.
본 발명에서 사용된 용어, “항체”는 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 암호화된 폴리펩타이드 리간드를 의미한다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제에 의한 절단으로 생성된 당해 분야에 매우 잘 공지된 다수의 단편으로서 존재할 수 있다. 이러한 단편들은 항체 분야의 숙련자들에게는 자명할 것이다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. 또한, 완전한 분자뿐만 아니라 에피토프 결정소와 결합할 수 있는 단편을 포함한다.
다클론 항체는 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 체혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler, G. et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor, D. et al., J. Immunol. Methods 81:31-42, 1985; Cote, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030, 1983; 및 Cole, S,P. et al., Mol. Cell Biol. 62:109-120, 1984).
또한 CA125, 헤모글로빈, 아포지방단백질 A1 및 트란스타이레틴에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 또한 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “진단”은 병리학적 상태의 존재 또는 특성을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 이의 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)에서 상이하다. 진단 분석법의 민감도는 포지티브로 시험된 질병에 걸린 개체의 백분율로서 표시된다. 질병에 걸린 개체가 상기 분석법에 의해 검출되지 않는 경우에는 “위 네가티브(false negative)”라고 한다. 질병에 걸리지 않고 분석법에서도 네가티브로 시험된 개체는 “진정 네가티브(true negative)”라고 한다. 진단 분석법의 특이도는 “1-위 포지티브율”로서 표시된다. 특정 진단 방법이 환자 상태에 대한 정확한 진단을 제공하지 못한다고 하더라도, 이러한 방법이 진단을 보조하는 긍정적인 지표를 제공하는 경우에는 이로써 진단 방법으로서의 가치가 충분하다.
이상적인 종양 표지자가 되기 위해서는 치료율이 높은 조기의 난소암에서 높은 민감도를 보여야 할 뿐만 아니라 양성 질환에 대해서는 증가를 나타내지 않아야 하는 높은 특이도를 보여야 한다. 그러나 현재 그런 높은 민감도와 특이도를 가진 종양 표지자는 없는 실정이다. 대부분의 종양 표지자는 항원을 이용하여 측정하기 때문에 조기의 난소암의 경우 종양 크기가 작고 이에 따라 항원이 적어 50% 정도에서만 높은 수치의 항체를 보여 진행된 병변보다 낮은 민감도를 보이며, 특정 종양이 아닌 다양한 악성 질환에서 항원 수치의 증가가 관찰되는데 심지어는 정상 조직에서도 항원이나 그에 상응하는 항체가 발견되기 때문에 특이도도 만족스럽지 못하다. 따라서 이와 같은 단점을 보완하고자 현재까지 가장 널리 이용되고 있는 종양 표지자인 CA125 이외에 다른 종양 표지자를 함께 사용하게 되었다.
종양 표지자를 한 가지만 측정하는 것보다는 다른 종양 표지자를 함께 측정하여 정확한 진단 및 추적 관찰에 이용한 연구 결과가 보고 되고 있는데, Negishi 등은 난소암 환자 88명을 대상으로 종양 표지자를 측정한 결과 CA125의 양성 하한치를 35 U/ml, CA19-9를 37 U/ml로 하였을 때 CA125는 79.9%, CA19-9는 42.7%의 양성률을 보인다고 하였으며, CA125와 CA19-9를 진단에 병용하면 더 높은 정확성을 가질 수 있을 것이라고 하였다(Negishi et al., 1987). Fioretti 등은 40명의 악성 난소 종양 및 108명의 양성 난소 종양 환자를 대상으로 CA125와 CA19-9 수치를 측정하였는데(Fioretti et al., 1988) 그들은 CA125의 양성 하한치를 60 U/ml, CA19-9는 40 U/ml로 설정하였을 때 악성 종양에서 CA125는 67.5%, CA19-9는 37.5%의 민감도를 보인다고 하였다. 특히 CA125와 CA19-9는 비점액성 암에서 각각 71.9% 및 25%, 점액성 암에서는 각각 50% 및 87.5% 상승한 소견을 보였으며, 그러므로 여러 종양 표지자를 측정한 후 초음파 등의 다른 방법을 같이 사용하면 난소암 진단에 더 높은 정확성을 가질 수 있을 것으로 추정하였다.
지금까지 알려진 난소암 진단 마커는 상기에서 언급한 바와 같이 CA125 및 CA19-9 외에 CA15-3, CA72-4, CA195 등 수없이 많은 마커가 알려져 있다. 그러나 많은 마커를 동시에 사용하면 각 마커가 갖는 outlier(개인 차이에 의해 평균에서 크게 차이를 보이는 표지물질)를 효율적으로 제어하는 것이 어렵다. 따라서 이들 모든 마커를 난소암을 진단에 이용하는 것은 시간적 및 비용적으로 비효율적이다.
그러나, 본 발명의 cA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1을 마커로서 이용할 경우는 상기와 같은 문제를 해결할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1을 동시에 측정하여 난소암을 진단하는 경우 난소암의 병기 및 난소암 환자의 조직학적 분류에 따라 발현율에 있어 차이가 있었다. 따라서, 본 발명의 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1를 포함하는 조성물에 의하여 난소암을 조기에 효과적으로 진단할 수 있어 난소암을 초기부터 치료할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 포함하는 난소암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 진단 키트에는 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1을 선별적으로 인지하는 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약이 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1에 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기한 항원-항체 복합체의 형성량을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 난소암 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, “생물학적 시료”는 인체로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장 등을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, “항원-항체 복합체”는 혈청 내의 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
항원-항체의 결합물은 검출 표지체(detection label)를 통해 그의 형성이 확인되며, 이러한 검출 표지체는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되는 것은 아니다.
검출 표지체로 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스라디쉬(horseradish) 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라 텍스 등을 포함하며, 방사선 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bolton) 및 헌터(Hunter) 시약 등을 포함할 수 있다.
상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으며, 반드시 이들로만 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 다중 액상 분석법(multiplex liquid array system)으로 검출할 수 있다. 다중 액상 분석법(Multiplex liquid array system)은 복수의 시료를 빠른 시간에 정확하게 동시에 측정할 수 있는 분석법으로서, 서로 다른 종류의 1차 항체가 결합된 마이크로스피어(microsphere)에 항원을 결합시키고, 차례로 2차 항체와 스트렙트아비딘-R-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin)을 각각 결합시킨 후, 2 종류의 레이저를 이용하여 검출하는 방법이다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이로써 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 : 실시 대상
2001년 1월부터 2005년 7월까지 가톨릭의대병원을 내원하여 난소암 진단을 받은 118명 환자, 난소낭종 84명, 정상인 61명을 대상으로 실시하였다. 수술 및 항암요법 전에 혈청을 채취하여 실온에서 30분간 보관 한 후 원심 분리(3,000rpm) 하여 혈청을 분리하여 실험에 사용될 때까지 -70℃에서 보관하였다. 보관된 혈청은 얼림과 녹임을 반복하지 않도록 하였다. 의무기록을 이용하여 환자의 연령, FIGO 병기, 조직학적 유형, 조직학적 분화도 및 동위원소를 이용한 CA125 수치를 조사하였다. 난소암 환자 그룹의 평균 나이는 52.63세이며 각 병기별 환자수는 1 기 27 명(22.9%), 2 기 9 명(7.6%), 3 기 54 명 (45.8%), 4 기 15 명 (12.7%), 기타 13 명 (11.0%) 이었다(표 1).
난소암 환자의 임상적 특징
특성
연구 환자수 263
정상 61
난소낭종 84
난소암 118
연구 환자의 연령 (평균 ± S.D.) 45.81 ± 14.43
(범위) 12-84
난소암 환자의 FIGO 병기
I 27 (22.9%)
II 9 (7.6%)
III 54 (45.8%)
IV 15 (12.7%)
기타 13 (11.0%)
난소암 환자의 조직학적 분류
Serous 52 (44.1%)
Mucinous 15 (12.7%)
Endometrioid 8 (6.8%)
Clear Cell 8 (6.8%)
Granulosa Cell 4 (3.4%)
Others 31 (26.3%)
실시예 2 : 마이크로스피어(Microsphere)에 항체 결합
5 종류의 microsphere(1X106개, Biosource, Camarillo CA)를 20 초간 교반(vortex)과 초음파처리(sonication)를 차례로 실시하여 잘 현탁시킨 후 원심분리(8,000 rpm, 2 분)를 하였다. 이후, 상층액을 제거하고 100 ul의 증류수로 1 번 씻어 주었다. 80 ul의 Monobasic Sodium Phosphate(100 mM, pH 6.2, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN), Sulfo-NHS (50 mM, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) 및 EDC (50 mM, Pierce Biotechnology)을 각각 10 ul씩 넣어주고 20 분간 실온에서 반응시켰다. 반응 종료 후 원심분리(8,000rpm, 2분)하여 상층액을 제거하고, 250 ul의 MES 용액(50 mM, pH 5.0, Sigma-Aldrich)로 2 번 씻어주었다. 상층액을 제거하고, 500 ul의 MES 용액를 넣은 후 각각의 마이크로스피어(microsphere)에 CA125(CA125;Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA) 항체는 5ug, 헤모글로빈(hemoglobin; Biotec Hb1, Seoul,Korea,), 트란스타이레틴(transthyretin; Abnova, Taipei City, Taiwan), 아포지방단백질 A1 (Apolipoprotein A1; Biogenesis, Raleigh, NC) 항체는 각각 25ug씩 넣어 주었다. 2 시간 동안 교반기 위에서 차광하여 반응시키고, 반응 종료 후 원심분리(8,000rpm, 2분)하여 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후 500 ul의 1% BSA 완충액을 넣고 다시 30 분간 실온에서 반응시켰다. 반응 종료 후 1% BSA 완충액으로 2 번 씻어준 후 4 ℃에서 차광하여 보관하였다.
실시예 3 : 2 차 항체에 바이오틴의 부착
2 차 항체에 바이오틴(biotin)의 부착은 단백질 바이오틴 부착키트(Alpha Diagnostics International Inc., San Antonio, TX)를 이용하여 실시하였다. 바이오틴을 부착시킬 CA125(Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA), 헤모글로빈(hemoglobin; Biotec Hb1, Korea, Seoul), 트란스타이레틴(transthyretin; Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA), 아포지방단백질 A1(Apolipoprotein A1; Abcam, Cambridge, UK) 항체를 각각 준비하고, 항체와 바이오틴의 비율이 1: 10이 되도록 바이오틴을 넣어주었다. 1 시간 동안 실온에서 차광하여 반응시키고, 반응 종료 후 PBS buffer (Sigma-Aldrich)로 투석을 실시하였다.
실시예 4 : 다중 액상 분석 시스템( Multiplex liquid array system )을 이용한 분석
정상 및 난소암 환자의 혈청을 3% Casein(Sigma-Aldrich), 0.05% tween 20(Sigma-Aldrich), 100ug/ml CBS-K(Chemicon, Temecula, CA) 가 포함된 50mM Tris(pH 7.8) 완충액을 사용하여 CA125측정용은 1/5, 헤모글로빈, 트란스타이레틴, 아포지방단백질 A1 측정용은 1/500으로 희석하였다. 희석된 혈청 50 ul를 1.2㎛ filter plate(Milipore Corp., Billerica, MA)에 넣고, 항체가 결합된 마이크로스피어를 각 2,500개/50㎕가 되도록 넣어 주었다. 이후, 혈청과 항체를 2시간 동안 차광하여 반응시켰다. 반응 종료 후에 0.05% tween 20이 포함된 50mM Tris(pH 7.8) 완충액으로 2번 세척하고, 바이오틴이 결합된 2차 항체를 0.4㎍/100㎕가 되도록 희석하여 넣어주었다. 다시 1시간 동안 암소에서 반응시킨 후 반응 종료 후에 0.05% tween 20이 포함된 50mM Tris(pH 7.8) 완충액으로 2번 씻어 주었다. 마지막으로 0.4㎍/100㎕의 스트렙트아비딘-R-피코에리트린(streptavidin-R- phycoerythrin; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후 0.05% tween 20이 포함된 50mM Tris(pH 7.8) 완충액으로 2번 씻어주고, Luminex 100 (Luminex Corp., Austin, Tx)을 이용하여 각각의 마이크로스피어를 측정하였으며, 그 실험 결과를 BeadView 프로그램(Upstate, Charlottesville, Virginia)을 이용하여 분석하였다. 각각의 실험은 3회 이상 반복하였다.
실시예 5 : 다중 액상 분석 시스템( Multiplex liquid array system )을 이용한 각각의 항체의 표준 곡선
표준 정량 곡선은 각각 정제된 CA125, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 헤모글로빈을 사용하여 측정하였으며, BeadView 프로그램 (Upstate)을 이용하여 분석하였다. 각각의 실험은 3회 이상 반복하였다.
실시예 6 : 난소암 환자 혈청에서의 단백질 변화 확인
난소암 종양표지물로 알려진 CA125은 단독으로 측정하고, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 헤모글로빈은 동시에 측정하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 정상 그룹과 난소암 환자 그룹에서 CA125, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 헤모글로빈의 발현은 각각 35± 20.1와 456± 57.9, 28,091± 3,305와 2,342.3± 481.7, 178± 9.4와 65.1± 4.5, 687± 121와 3856.5± 718.6 으로 나타났으며, 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다(**, P<0.01, ***,P<0.001).
난소암 환자 혈청에서의 단백질 변화
Analysts/patients 정상 대조군 난소암 환자 난소낭종
Apolipoprotein A1
(ng/㎖)		 mean± SE 28,091± 3,305 2,342.3± 481.7*** 3,350± 1,040***
Median(range) 12,400
(1,305-60,500)		 450(103.0-38,450) 830(109-60,500)
Hemoglobin
(㎍/㎖)		 mean± SE 687± 121 3856.5± 718.6* 5,216.6± 1,265.7***
Median(range) 53.5(53.5-7,150) 805(53.5-47,300.0) 1,335(53.5-92,500)
Transthyretin
(㎍/㎖)		 mean± SE 178± 9.4 65.1± 4.5*** 99.9± 8.0***
Median(range) 177(41.6-388.5) 52(3.435- 261.000) 90.3(11.5- 499.5)
CA125
(U/㎖)		 mean± SE 35± 20.1 456± 57.9*** 94.7± 46.4**
Median(range) 9.3(6.80-1230.) 200(6.80- 3,475) 28.2(7.10- 3,915)
(**, P<0.01, ***,P<0.001)
실시예 7 :통계
난소암 진단 마커의 분석에 사용되는 Biomarker pattern software는 classification and regression tree (CART)에 근거를 둔 supervised pattern classification 방법으로 대조군 과 시험군 사이의 두 그룹을 가장 잘 분류 하는 marker를 발굴 하는 방법이다. 그러나 통계 방법은 이에 제한을 두지 않고 Neural Network, Logistic Ragression, Discriminent, Random Forests등 두 그룹을 구별하는 어느 방법을 사용하여도 가능하다. 61명의 정상과 118명의 난소암 환자의 각 마커별 발현 양상을 조사한 후, CART법에 따라 난소암을 정상과 구별하는 것이다. 우선 아포지방단백질 A1의 발현 2572.2 ng/ml 을 기준으로 두 그룹으로 구별하게 된다. 2572.2 ng/ml보다 낮으면 난소암으로 높으면 다시 트랜스타이레틴의 발현을 조사한다. 트랜스타이레틴의 발현이 80.5ug/ml보다 작으면 난소암으로 진단하고, 트랜스타이레틴의 발현이 80.5ug/ml보다 큰 경우는 정상으로 진단한다(도 1). 정상과 난소암의 진단에 있어서 아포지방단백질 A1와 트랜스타이레틴의 민감도와 특이도는 각각 76.3%와 92.5% 그리고 74.6%와 95.1%로 나타나지만, 두 종류의 마커를 동시에 사용하여 진단할 경우에는 98.1%의 민감도와 100%의 특이도를 나타낸다 (표 3 및 도 5). 즉 하나의 분자로는 질병군과 대조군을 구별 할 수는 없으나 몇 개의 표지 물질을 이용하여 발현 양상을 조사하면 질병군과 대조군을 보다 정확히 구별 할 수 있음을 보여준다. 위와 같은 방법으로 정상과 난소 낭종 그룹과 난소암(도 2), 난소낭종과 난소암(도 3), 정상과 난소낭종(도 4)를 각각 구별할 수 있으며, 각각의 마커를 사용했을 때에 비해 민감도와 특이도가 증가함을 알 수 있다(표 3, 및 그림 5, 6, 7 및 8).
민감도와 특이도
Analysts/
patients		 % 정상대조군과 난소암환자군 정상대조군 및 난소낭종군 과 난소암환자군 난소낭종군과 난소암환자군 정상대조군과 난소낭종군
Apolipoprotein A1 Sensitivity 76.3 42.8 41.4 76.3
Specificity 92.5 86.8 84.7 92.5
Hemoglobin Sensitivity 73.8
Specificity 80.3
Transthyretin Sensitivity 76.4 58.2 65.0
Specificity 95.1 83.5 86.0
CA125 Sensitivity 72.5 68.5 42.9
Specificity 71.4 86.5 92.9
Total Sensitivity 98.1 71.8 72.8 88.5
Specificity 100 74.8 62.8 92.9
본 발명의 방법에 따라 혈청 내의 CA125, 헤모글로빈, 트랜스타이레틴 및 아포지방단백질 A1를 다중 액상 분석법 등에 의해 동시에 측정함으로써, 난소암 진단의 민감도 및 특이성을 현저하게 증가시킬 수 있다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (a) CA125, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 및 헤모글로빈 각각에 특이적인 항체를 동시에 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 형성된 항원-항체 복합체의 형성량을 다중 액상 분석법(multiplex liquid array system)으로 검출하여 CA125, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 및 헤모글로빈의 발현양을 측정하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 측정된 발현양에 대해서
    i) 아포지방단백질 A1의 발현양이 2572.5ng/ml 미만이거나, 아포지방단백질 A1의 발현양이 2572.5ng/ml 이상이고 트랜스타이레틴의 발현양이 80.5ng/ml 미만이면 난소암으로 판정하고, 아포지방단백질 A1의 발현양이 2572.5ng/ml 이상이고 트랜스타이레틴의 발현양이 80.5ng/ml 이상이면 정상으로 판정하는 단계;
    ii) CA125 발현양이 105.25㎍/ml 미만이고 트랜스타이레틴의 발현양이 81.25ng/ml 이상이거나, CA125 발현양이 105.25㎍/ml 미만이고 트랜스타이레틴의 발현양이 81.25ng/ml 미만이고 CA125 발현양이 32.65㎍/ml 이상이거나, CA125 발현양이 105.25㎍/ml 이상 210.75㎍/ml 미만이고 아포지방단백질 A1의 발현양 1947.5ng/ml 이상이거나, 또는 CA125 발현양이 210.75㎍/ml 이상이면 난소암으로 판정하고,
    트랜스타이레틴의 발현양이 81.25ng/ml 미만이고 CA125 발현양이 32.65㎍/ml 미만이거나, CA125 발현양이 105.25㎍/ml 이상 210.75㎍/ml 미만이고 아포지방단백질 A1의 발현양 1947.5ng/ml 미만이면 정상 또는 난소낭종으로 판정하는 단계;
    ⅲ) CA125 발현양이 10.25㎍/ml 미만이거나, CA125 발현양이 105.25㎍/ml 이상 210.75㎍/ml 미만이며 아포지방단백질 A1의 발현양이 1947.5ng/ml 미만이면 난소낭종으로 판정하고, CA125 발현양이 10.25㎍/ml 이상이고 105.25㎍/ml 미만이거나, CA125 발현양이 210.75㎍/ml 이상이거나, CA125 발현양이 105.25㎍/ml 이상 210.75㎍/ml 미만이며 아포지방단백질 A1의 발현양이 1947.5ng/ml 이상이면 난소암으로 판정하는 단계; 및
    ⅳ) 아포지방단백질 A1의 발현양이 1300ng/ml 미만이거나, 아포지방단백질 A1의 발현양이 1300ng/ml 이상 2540ng/ml 미만이고 CA125 발현양이 20.85㎍/ml 이상이거나, 아포지방단백질 발현양이 2540ng/ml 이상이고 헤모글로빈 발현양이 2122.5ng/ml 이상이거나, 또는 아포지방단백질 발현양이 2540ng/ml 이상이고 헤모글로빈 발현양이 2122.5ng/ml 미만이고 트랜스타이레틴의 발현양 81.25ng/ml 이상이면 난소낭종으로 판정하고,
    아포지방단백질 A1의 발현양이 1300ng/ml 이상 2540ng/ml 미만이고, CA125 발현양이 20.85㎍/ml 미만이거나, 또는 아포지방단백질 발현양이 2540ng/ml 이상이고 헤모글로빈 발현양이 2122.5ng/ml 미만이고 트랜스타이레틴의 발현양 81.25ng/ml 미만이면 정상으로 판정하는 단계;를 포함하는 CA125, 아포지방단백질 A1, 트란스타이레틴, 및 헤모글로빈 각각에 특이적인 4가지 항체를 이용하여 항원-항체 복합체의 형성량을 다중 액상 분석법(multiplex liquid array system)으로 한번에 검출하는데 특징이 있는 정상, 난소낭종, 및 난소암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 삭제
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