JP7698653B2 - トール様受容体７（ＴＬＲ７）アゴニストとしての１Ｈ－ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリミジン化合物 - Google Patents

Description

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１月２７日に提出された米国仮出願シリアル番号第６２／９６６１１１号の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、トール様受容体７（「ＴＬＲ７」）アゴニストおよびその複合体、ならびに調製方法、並びにそのようなアゴニストおよびその複合体の使用に関する。

トール様受容体（「ＴＬＲｓ」）は、特定の種類の病原体に保存される小分子モチーフである病原体関連分子パターン（「ＰＡＭＰｓ」）を認識する受容体である。ＴＬＲは、細胞の表面上または細胞内のいずれかに存在し得る。同種のＰＡＭＰの結合によるＴＬＲの活性化は、宿主内の関連病原体の存在－すなわち感染を伝え、宿主の免疫系を刺激して感染と闘わせる。ヒトには１０のＴＬＲｓがあり、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３などと名付けられている。

アゴニストによるＴＬＲの活性化－ＴＬＲ７のものが最も研究されている－は、実際の病原体感染以外の様々な病態の治療において、免疫応答を全体的に刺激することにより、ワクチンおよび免疫療法剤の作用に対して良い効果を及ぼし得る。それゆえ、ワクチンアジュバントとしての、またはがん免疫療法におけるエンハンサーとしてのＴＬＲ７アゴニストの使用に大きな関心がある。例えば、Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ａｎｄ Ｔｏｍａｉ ２０１３，Ｓａｔｏ－Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｓｍｉｔｓ ｅｔ ａｌ．２００８，およびＯｔａ ｅｔ ａｌ．２０１９を参照されたい。

ＴＬＲ７は、エンドソームの膜上に位置する細胞内受容体であり、一本鎖ＲＮＡウイルスと関連するＰＡＭＰsを認識する。その活性化は、ＩＦＮαおよびＩＦＮβなどのＩ型インターフェロンの分泌を誘導する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＴＬＲ７には２つの結合部位があり、一つは一本鎖ＲＮＡリガンド（Ｂｅｒｇｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）との、一つはグアノシンなどの小分子（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６）との結合部位である。

ＴＬＲ７は、グアノシン様合成アゴニスト、例えば１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン骨格を基にしているイミキモド、レシキモド、およびガーディキモド（gardiquimod）などに結合し、活性化されることがある。小分子ＴＬＲ７アゴニストのレビューについてはＣｏｒｔｅｚ ａｎｄ Ｖａ ２０１８を参照されたい。

ベサトリモドが挙げられるように、プテリジノン分子骨格を基にする合成ＴＬＲ７アゴニストもまた既知である（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。

プリン様骨格を基にする他の合成ＴＬＲ７アゴニストは開示されており、しばしば下記の一般式（Ａ）：

［式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ”は、構造的な可変要素であり、Ｒ”は一般に非置換または置換された芳香またはヘテロ芳香環を含む］で示される。

プリン様骨格を有する生物活性分子および線維症、炎症性疾患、がん、または病原性感染などの病態の治療におけるその使用の開示には：Ａｋｉｎｂｏｂｕｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１５および２０１６；Ｂａｒｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６、２０１７ａ、および２０１７ｂ；Ｇｒａｕｐｅ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｈｏｌｌｄａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００９ａおよび２０１２；Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１９ａおよび２０１９ｂ；Ｐｒｙｄｅ ２０１０；ならびにＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９が挙げられる。

基Ｒ”は、ピリジルであり得る：Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ａおよび２０１５ｂ；Ｈａｌｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．２０１５；Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．２００２、２００４、２００６、２００９ａ、２００９ｂ、２０１１、および２０１２；Ｋａｓｉｂｈａｔｌａ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｏｇａ－Ｙａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｕｓｍｕｃａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎａｋａｍｕｒａ ２０１２；Ｏｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．２００７；ならびにＹｕ ｅｔ ａｌ．２０１３。

式（Ａ）の６，５縮合環系－ピリミジン６員環とイミダゾール５員環が縮合した－が改変された関連分子の開示がある。（ａ）Ｄｅｌｌａｒｉａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０および２０１２、ならびにＰｉｌａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１７は、ピリミジン環がピリジン環に置換された化合物を開示する。（ｂ）Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｃｏｅ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｐｏｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０２０ａおよび２０２０ｂ、ならびにＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８は、イミダゾール環がピラゾール環に置換された化合物を開示する。（ｃ）Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７および２０１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８；ならびにＭｃＧｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ａ、２０１６ｂ、および２０１７は、イミダゾール環がピロール環に置換された化合物を開示する。

Ｂｏｎｆａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５ｂおよび２０１６ならびにＰｕｒａｎｄａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１９は、プリン部分の２つの環が大環状分子により架橋されたＴＬＲ７モジュレーターを開示する。

ＴＬＲ７アゴニストは、パートナー分子に結合されることがあり、それは、例えば、リン脂質、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、抗体、または別のＴＬＲ（一般にＴＬＲ２）であり得る。代表的な開示には：Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３、２０１５、および２０１６、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．２００９および２０１１、Ｃｏｒｔｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｇａｄｄ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｍａｊ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ｖｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４、ならびにＺｕｒａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２が挙げられる。主な結合部位は、式（Ａ）のＲ”基である。

Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５は、ＴＬＲ７アゴニストの送達のためのカチオン性脂質ビークルの使用を開示する。

レシキモドなどのいくつかのＴＬＲ７アゴニストは、ＴＬＲ７/ＴＬＲ８デュアルアゴニストである。例えば、Ｂｅｅｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｅｍｂｒｅｃｈｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｌｉｏｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１６、およびＶｅｒｎｅｊｏｕｌ ｅｔ ａｌ．２０１４を参照されたい。

筆頭著者または発明者および発行年により本明細書に引用される文書についての完全な引用が、本明細書の末尾に記載される。

本明細書は、１Ｈ－ピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジン芳香族系を有する、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性がある化合物に関する。

一つの態様において、下記の式（Ｉ）：

［式中、
Ｗは、Ｈ、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、

であり；
各Ｘは、独立してＮまたはＣＲ^２であり；
Ｒ^１は、（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
（Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル）、
（Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
（Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（５－６員ヘテロアリール）、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１フェニル、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルカンジイル）（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
または
（Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
各Ｒ^２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｓ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、Ｏ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
Ｓ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
Ｒ^３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、
ＮＨ_２、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_８ビシクロアルキル）、
Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、
Ｎ［Ｃ_１－Ｃ_３アルキル］Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、
ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
６員の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、
５員のヘテロ芳香族部分、または
下記の構造：

を有する部分であり；
Ｒ^４は、ＮＨ_２、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
または
下記の構造：

を有する部分であり；
Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル、Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル、
ハロ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、フェニル、
ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、５もしくは６員ヘテロアリール、

であり；
Ｒ^６は、ＮＨ_２、
（ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
（ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
（ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
（ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
または
下記の構造：

を有する部分であり；
Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、あるいはＲ^ｘおよびＲ^ｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
ｎは、１、２、または３であり；
ｐは、０、１、２、または３であり；
ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６において、
アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルカンジイル、ビシクロアルキル、スピロアルキル、環状アミン、６員の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、５員のヘテロ芳香族部分または下記の式：

で示される部分は、
ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）
から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
アルキル、アルケニル、アルカンジイル、シクロアルキル、ビシクロアルキル、スピロアルキル、または下記の式：

で示される部分は、
Ｏ、ＳＯ_２、ＣＦ_２、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨ、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
Ｎ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_３アルカンジイル）_０－１［Ｃ（＝Ｏ）］ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
または
Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）
に置換されるＣＨ_２基を適宜有してもよいが；
ただし、Ｒ^１およびＷの少なくとも一つは、スピロアルキルまたはスピロアルカンジイル部分を含み、式（Ｉ）の化合物は、

以外である］
で示される構造を有する化合物が提供される。

本明細書に開示される化合物は、ＴＬＲ７アゴニストとしての活性を有し、いくつかは、目的とする作用の標的組織または臓器への標的化送達のための抗体に結合されることがある。それらはＰＥＧ化され、その医薬特性が調節されることもある。

本明細書に開示される化合物、またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体は、免疫系の活性化による治療に適している病態を患う患者に対して、治療的有効量の、そのような化合物またはその複合体あるいはそのＰＥＧ化誘導体を、特にワクチンまたはがん免疫療法剤と併用して投与することによって、そのような患者を治療するのに使用され得る。

化合物
一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉａ）で示され、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^５、およびＷは、式（Ｉ）について定義される通りであり：

Ｒ^２は、好ましくはＯＭｅである。

もう一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉｂ）で示され、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^５は、式（Ｉ）について定義される通りであり：

Ｒ^２は、好ましくはＯＭｅである。

もう一つの態様において、本開示の化合物は、下記の式（Ｉｃ）で示され、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、式（Ｉ）について定義される通りであり：

Ｒ^２は、好ましくはＯＭｅである。

もう一つの態様において、本開示は、下記の式（Ｉｄ）：

［式中、
Ｒ^１は、

であり；
Ｗは、

である］
で示される構造を有する化合物を提供する。

もう一つの態様において、本開示は、下記の式（Ｉｅ）：

［式中、
Ｗ’は、

であり；
Ｒ^９は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、（ＣＨ_２）_１－_２（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）、または

である］
で示される構造を有する化合物を提供する。

Ｗ’の具体例には、

が挙げられる。

適当な基Ｒ^１の例には：

が挙げられる。

好ましくは、Ｒ^１は、

からなる群から選択される。

Ｒ^２は、好ましくはＯＭｅまたはＯＣＨＦ_２、より好ましくはＯＭｅである。

Ｒ^５は、好ましくはＨ、ＣＨ_２ＯＨ、またはＭｅ、より好ましくはＨである。

Ｗが

で、ｎが１である例には、

が挙げられる。

好ましくは、

は、

からなる群から選択される。

Ｗが

である例には、

が挙げられる。

好ましくは、

は、

からなる群から選択される。

一つの態様において、Ｗは、

である。

一つの態様において、Ｗは、

である。

もう一つの態様において、
Ｒ^３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、
ＮＨ_２、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０スピロアルキル）、
Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
Ｎ［Ｃ_１－Ｃ_３アルキル］Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、
６員の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、
５員のヘテロ芳香族部分、または
下記の構造：

を有する部分である。

一つの態様において、Ｒ^１およびＷのそれぞれは、スピロアルキルまたはスピロアルカンジイル部分を含む。

一つの態様において、Ｒ^１は、スピロアルキル部分を含み、Ｗは、ビシクロアルキルまたはビシクロアルカンジイル部分を含む。

一つの態様において、Ｒ^１は、スピロアルキル部分を含み、Ｗは、スピロアルキルまたはスピロアルカンジイル部分を含まない。

一つの態様において、Ｗは、スピロアルキルまたはスピロアルカンジイル部分を含み、Ｒ^１は、スピロアルキル部分を含まない。

例示であって限定ではないが、下記の式：

で示される部分には、

が挙げられる。

例示であって限定ではないが、スピロアルキル基には、

が挙げられる。

例示であって限定ではないが、下記の式：

で示される部分には、

が挙げられる。

例示であって限定ではないが、ビシクロアルキル基には、

が挙げられる。

例示であって限定ではないが、下記の式：

で示される部分には、

が挙げられる。

上記の代表的なスピロアルキルおよびビシクロアルキル基ならびに下記の式：

で示される部分のいくつかは、任意の置換基を有する、および／または上記の「発明の概要」に記載されるように、Ｏ、ＳＯ_２などに置換される一つ以上のＣＨ_２基を適宜有してもよい。

本明細書に開示される化合物の具体例を以下の表Ａに示す。表は、以下に提供される手順を通じて割り出された、生物学的活性：ヒトＴＬＲ７レポーターアッセイおよび／またはヒト全血におけるＣＤ６９遺伝子の誘導に関するデータも提供する。最も右の列に解析データ（マススペクトル、ＬＣ／ＭＳ保持時間、およびＮＭＲ）を記載する。一つの実施形態において、本開示の化合物は、（ａ）１，０００ｎＭ未満のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）レポーターアッセイＥＣ_５０値および（ｂ）１，０００ｎＭ未満のヒト全血（ｈＷＢ）ＣＤ６９誘導ＥＣ_５０値を有する。（アッセイが複数回行われた場合、報告される値は平均値である。）

医薬組成物および投与
もう一つの態様において、薬学的に許容される担体または添加剤とともに製剤化される、本明細書に開示されるような化合物、またはその複合体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、一つ以上の追加の薬学的活性成分、例えば生物学的製剤または小分子薬剤などを適宜含んでもよい。医薬組成物は、別の治療剤、特に抗がん剤との併用療法で投与され得る。

医薬組成物は、一つ以上の添加剤を含むことがある。使用されることがある添加剤には、担体、界面活性剤、増粘または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、風味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、防腐剤、等張化剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適当な添加剤の選択および使用は、Gennaro編，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第２０版（Lippincott Williams ＆ Wilkins 2003）に記載されている。

好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適する。投与経路に応じて、活性化合物は、物質でコーティングされ、化合物を不活化することがある酸および他の自然条件の作用から保護されることがある。「非経口投与」という語句は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非非経口経路（non-parenteral route）で、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下または局所的に投与され得る。

医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌水分散液の形であり得る。それらは、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度を達成するのに適当な他の秩序構造中で製剤化されることもある。組成物は、投与前に水で再調製する凍結乾燥物の形でも提供され得る。

担体物質と結合して単一剤形を生成し得る活性成分の量は、治療を受ける患者および特定の投与方法によって異なり、一般的には治療効果をもたらす組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、薬学的に許容される担体との併用で活性成分の約１パーセントから約３０パーセントに及ぶであろう。

投与計画は、治療反応を提供するように調整される。例えば、単回のボーラス投与を行ってもよく、用量をいくつかに分けて時間をかけて投与してもよく、状況の緊急性に応じて比例的に用量を増減させてもよい。投与の簡便性および用量の均一性にとって、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。「用量単位形態」は、治療を受ける患者に対する単一の用量として適当な、物理的に別々の単位を指し；各単位には、望ましい治療反応をもたらすように計算された、予め決められた量の活性化合物が、必要な医薬担体とともに含まれる。

用量は、宿主の体重に対して、約０.０００１から１００ｍｇ/ｋｇ、より一般的には０．０１から５ｍｇ/ｋｇに及ぶ。例えば、用量は、０．３ｍｇ/ｋｇ体重、１ｍｇ/ｋｇ体重、３ｍｇ/ｋｇ体重、５ｍｇ/ｋｇ体重または１０ｍｇ/ｋｇ体重であってもよく、１－１０ｍｇ/ｋｇ、あるいは０．１から５ｍｇ/ｋｇの範囲内であってもよい。代表的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または３から６か月に１回の投与である。好ましい投与計画には、以下の投薬スケジュール：（ｉ）４週間ごとに６用量を投与し、次に３か月ごとに投与；（ｉｉ）３週間ごとに投与；（ｉｉｉ）３ｍｇ/ｋｇ体重で１回投与し、続いて１ｍｇ/ｋｇ体重で３週間ごとに投与のうちの一つを用いて、１ｍｇ/ｋｇ体重または３ｍｇ/ｋｇ体重で静脈内投与する方法が挙げられる。いくつかの方法において、用量は、約１－１０００μｇ/ｍＬの、いくつかの方法においては約２５－３００μｇ/ｍＬの血漿中抗体濃度を達成するように調整される。

本発明の化合物の「治療有効量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の減少、疾患の無症状期間の回数および持続期間の上昇、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。例えば、がんを有する患者の治療については、「治療有効量」は、治療を受けていない患者と比較して、好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらに好ましくは少なくとも約60%、さらに好ましくは少なくとも約80%、腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療化合物は、腫瘍の大きさを減少させるか、そうでなければ、患者における症状を寛解させることがあり、患者は、一般にはヒトであるが、別の哺乳動物であってもよい。２つ以上の治療剤が併用療法で投与される場合、「治療有効量」は、個々の薬剤としてではなく、全体としての組み合わせの有効性をいう。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの放出制御または徐放性製剤であり得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R. Robinson編，Marcel Dekker社，ニューヨーク，1978を参照されたい。

治療組成物は、（１）無針皮下注射器具；（２）マイクロ注入ポンプ；（３）経皮デバイス；（４）注入デバイス；および（５）浸透圧装置などの医療機器を用いて投与され得る。

ある実施形態において、医薬組成物は、インビボにおいて適切な分布を確保するように製剤化されることがある。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を通過することを確実にするために、それらはリポソーム中で製剤化されることがあり、リポソームは、標的化部分をさらに含み、特定の細胞または臓器への選択的輸送を増強することがある。

産業上の利用可能性および用途
本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニスト化合物は、ＴＬＲ７の活性化により寛解し得る疾患または病態の治療のために使用され得る。

一つの実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、抗がん免疫療法剤－別名を免疫抗がん剤という－と組み合わせて使用される。抗がん免疫療法剤は、がん細胞を攻撃し、破壊する体の免疫系を刺激することにより、特にＴ細胞の活性化を介して効果を発揮する。免疫系には、それによる正当な標的細胞への攻撃、およびそれによる健康で正常な細胞への攻撃の抑止のバランスの維持を助ける、多数のチェックポイント（調節）分子がある。いくつかは刺激因子（上方調節因子）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を促進し、免疫応答を増強するということを意味する。他は阻害因子（下方制御因子またはブレーキ）であり、それらの関与はＴ細胞活性化を阻害し、免疫応答を弱めるということを意味する。アゴニスト免疫療法剤の、刺激性チェックポイント分子への結合は、後者の活性化およびがん細胞に対する免疫応答の増強をもたらし得る。交換的に、アンタゴニスト免疫療法剤の、抑制性チェックポイント分子への結合は、後者による免疫系の下方制御を防ぎ、がん細胞に対する活発な応答の維持を助け得る。刺激性チェックポイント分子の例は、B7－1、B7－2、CD28、4－1BB （CD137）、4－1BBL、ICOS、CD40、ICOS－L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、ＤＲ３およびCD28Hである。抑制性チェックポイント分子の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、PD－L2、LAG－3、TIM－3、ガレクチン９、CEACAM－1、BTLA、CD69、ガレクチン－1、CD113、ＧＰＲ５６、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、ＬＡＩＲ１、TIM－1、CD96およびTIM－4である。

どちらの抗がん免疫療法剤の作用機序においても、その有効性は、ＴＬＲ７の活性化などの全身的な免疫系の上方制御により上昇し得る。それゆえ、一つの実施形態において、本明細書は、がんを患う患者に、抗がん免疫療法剤および本明細書に開示されるようなＴＬＲ７アゴニストの治療的に有効な組み合わせを投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供する。投与のタイミングは、同時でも、連続的でも、交互であってもよい。投与方法は、全身的であっても、局所的であってもよい。ＴＬＲ７アゴニストは、対象を絞った方法で、複合体を用いて送達されることがある。

上記のような併用療法により治療され得るがんには、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、胆管癌、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、へアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝臓癌、下咽頭癌、膵臓癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性骨髄性白血病、口唇および口腔癌（lip and oral cavity cancer）、肺癌、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、口腔癌（mouth cancer）、口腔癌（oral cancer）、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、および外陰癌が挙げられる。

本明細書に開示されるような併用療法に使用され得る抗がん免疫療法剤には、AMG 557、AMP－224、アテゾリズマブ、アベルマブ、BMS 936559、セミプリマブ、CP－870893、ダセツズマブ、デュルバルマブ、エノブリツズマブ、ガリキシマブ、IMP321、イピリムマブ、ルカツムマブ、MEDI－570、MEDI－6383、MEDI－6469、ムロモナブ－CD3、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、スパルタリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、ウトミルマブ、バルリルマブ、ボンレロリズマブが挙げられる。それらの代替名（商標名、旧名、研究コード、または同義語）およびそれぞれの標的チェックポイント分子を以下の表Ｂに示す。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法の一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。がんは、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌であり得る。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、好ましくはイピリムマブである。

ＴＬＲ７アゴニストとの併用療法のもう一つの実施形態において、抗がん免疫療法剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、好ましくはニボルマブまたはペムブロリズマブである。

本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストは、ワクチンアジュバントとしても有用である。

本発明の実施は、限定ではなく実例として提供される以下の実施例を参照することによりさらに理解され得る。

解析手順
ＮＭＲ
プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを得るために以下の条件を用いた：溶媒および内部標準としてＤＭＳＯ－ｄ６またはＣＤＣｌ_３のいずれかを用いて、４００Ｍｚまたは５００ＭｈｚのＢｒｕｋｅｒ装置のいずれかでＮＭＲスペクトルを得た。ＡＤＣ ＬａｂｓのＡＣＤ Ｓｐｅｃｔｒｕｓバージョン２０１５－０１またはＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアのいずれかを用いることにより、生のＮＭＲデータを解析した。

化学シフトは、内部のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）から、または重水素化ＮＭＲ溶媒により推測されるＴＭＳの位置を基準に、低磁場側が百万分率（ｐｐｍ）で報告される。明らかな多重度は：一重線－ｓ、二重線－ｄ、三重線－ｔ、四重線－ｑ、または多重線－ｍとして報告する。広幅化を示すピークをｂｒとしてさらに表す。積分値は近似値である。積分強度、ピーク形状、化学シフトおよび結合定数は、溶媒、濃度、温度、ｐＨ、および他の因子に依存し得るということに注意すべきである。さらに、ＮＭＲスペクトルにおいて水または溶媒ピークと重複するか、または交換が起こるピークは、信頼できる積分強度を提供しないことがある。場合によっては、ＮＭＲスペクトルは、水ピーク抑制を用いて得られることがあるが、重複するピークが目に見えなくなるか、またはその形状および／もしくは積分値が変化することがある。

液体クロマトグラフィー
以下のプレパラティブおよび分析（ＬＣ／ＭＳ）液体クロマトグラフィー法を用いた：

ＬＣＭＳ手順Ａ：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分間保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）

ＬＣＭＳ手順Ｂ：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．１％ＴＦＡ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分間保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）

ＬＣＭＳ手順Ｃ：カラム：Waters XBridge BEH C18 XP（50 x 2.1 mm）2.5 μｍ；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０－１００％Ｂ；流速：１．１ｍＬ/分

ＬＣＭＳ手順Ｄ：カラム：Ascentis Express C18（50 x 2.1 mm）2.7 μｍ；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０－１００％Ｂ；流速：１．１ｍＬ/分

ＬＣＭＳ手順Ｅ：カラム：BEH C18 2.1 x 50 mm；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有アセトニトリル；温度：５０℃；グラジエント：１．７分かけて２－９８％Ｂ；流速：０．８ｍＬ/分

ＬＣＭＳ手順Ｆ：カラム：Waters XBridge C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０％Ｂから１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５０分間保持；流速：１ｍＬ/分；検出：ＭＳおよびＵＶ（２２０ｎｍ）。この方法は、超高速液体クロマトグラフィー（UPLC(商標)法である。

合成－一般的な手順
一般的に、本明細書に開示される手順は、ピラゾロピリミジン環系の１Ｈまたは２Ｈ位置でアルキル化された位置異性体の混合物をもたらす（それぞれＮ１およびＮ２位置異性体とも呼ばれ、アルキル化された窒素に言及している）。簡略化のために、Ｎ２位置異性体は、便宜上示されないが、初期に生成される混合物中に存在し、例えばプレパラティブＨＰＬＣにより、後で分離されるということが理解されるべきである。

位置異性体の混合物を合成の初期段階に分離し、１Ｈ位置異性体を用いて残りの合成段階を実行してもよく、あるいは、必要に応じて、位置異性体の混合物を用いて合成を進め、後期に分離を実行してもよい。

本開示の化合物は、有機合成化学の当業者に周知の多数の方法により調製され得る。これらの方法は、以下に記載される方法、またはそのバリエーションを含む。好ましい方法には、下記のスキームに記載される方法が挙げられるが、これらに限らない。
スキーム１

Ｒ^ａは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、例えば、

、または他の適当な部分であり得る。Ｒ^ｂは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、例えば、Ｃ_１－Ｃ_３アルキルである。Ｒ^ｃＮＨＲ^ｄは、スキーム１およびそれが登場する他の事例において、第一級または第二級アミンである。Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、および／またはＲ^ｄは、合成過程の間の適切な時点で取り除かれる保護基により覆われた官能基を有してもよい。

化合物１１は、上記のスキーム１に図示される合成順序により調製され得る。ニトロピラゾール１の還元により化合物２が得られ、次いで１，３－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレアとの環化によりヒドロキシピラゾロピリミジン３が得られる。ＢＯＰ/ＤＢＵカップリング条件を用いてアミンＲ^ａＮＨ_２が導入され、次いで、ＮＢＳを用いる臭素化またはＮＩＳを用いるヨウ素化（ステップ４）によりブロモまたはヨード－ピラゾロピリミジン５が得られる。ベンジルハライド６を用いるアルキル化によりＮ１およびＮ２生成物の混合物が得られ、分離することでＮ１中間体７が得られる。接触水素化（ステップ６）の後、ワンポットでＬｉＡｌＨ_４還元およびカルバメート加水分解を行うことで、中間体アルコール９が得られる。アルコール９を塩化ベンジルに変換し、次いでそれを適当なアミンで置換することで化合物１１が得られる（ステップ５における臭素化中間体５のアルキル化の方が、非臭素化中間体４のアルキル化と比較して、より好ましい比率でＮ１/Ｎ２生成物が得られる）。
スキーム２

あるいは、中間体９は、上記のスキーム２に記載される経路を用いて得られることがある。ＮＢＳまたはＮＩＳを用いて中間体３を臭素化またはヨウ素化し、次いでアルキル化することで中間体エステル１２が得られる。次にＢＯＰカップリング条件を用いてアミノ化することで中間体７が得られる。接触水素化の後、アルコールへのＬｉＡｌＨ_４還元およびメチルカルバメート脱保護を行うことで中間体９が得られる。
スキーム３

中間体８への代替経路は、ベンジルハライド６を用いるニトロピラゾール１のアルキル化から始まり、ベンジルピラゾール１３が得られる。ニトロ基の還元の後、１，３－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレアとの環化によりヒドロキシピラゾロピリミジン１５が得られ、ＢＯＰ/ＤＢＵ条件を用いて適切なアミン誘導体８に変換される。これが上記のスキーム３に図示される。
スキーム４

標的化合物への別の代替経路は、上記のスキーム４に示される。中間体１５のエステル基を還元し、ＮａＯＨを用いてメチルカルバメートを取り除くとアルコール１６が得られる。アルコール１６を塩化物に変換し、次いで適当なアミンで置換すると１７が得られ、続いてＢＯＰ/ＤＢＵ条件を用いてアミノ化すると標的分子１１が得られる。
スキーム５

上記のスキーム５において、７/８または１５中のメチルエステルの加水分解、次いでアミド形成により、対応するアミド７ａ/８ａまたは１５ａを得ることができる。７ａの接触水素化、次いでカルバメート脱保護により、化合物７ｂが生成される。８ａのカルバメート脱保護により化合物８ｂが得られる。最後に、１５ａのアミン導入、次いでカルバメート脱保護により、化合物１５ｂが得られる。

合成－具体例
上記の内容をさらに説明するために、以下の限定されない代表的な合成スキームが含まれる。請求項の範囲内にあるこれらの実施例のバリエーションは、当業者の範囲内であり、本開示の範囲内にあると見なされる。読者は、本開示を提供された、関連技術に熟練した当業者であれば、網羅的な実施例がなくとも、本明細書に開示される化合物を調製し、使用することができるであろうということを認識するであろう。

１００以上の番号がつけられた化合物についての解析データは、表Ａで見つけることができる。
実施例１－化合物１０１

（S）－3－（（1－（4－（（2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）メチル）－2－メトキシベンジル）－5－アミノ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－7－イル）アミノ）ヘキサン－1－オール １（US 2020/0038403 A1；31 mg、0.065 mmol）のＤＭＦ（1 mL）溶液をＡｃ_２Ｏ（6.09 μＬ、0.065 mmol）で処理し、ＲＴで１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＤＭＦ（1 mL）中に溶解した。以下の条件を用いて、粗製残留物をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：４％Ｂで０分保持、２０分かけて４－４４％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、５ｍｇの化合物１０１を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１０６、化合物１０７、化合物２１５（ホルムアルデヒドで化合物１を還元的アミノ化することにより作成）、および化合物２１６（アセトンで化合物１を還元的アミノ化することにより作成）。
実施例２－化合物１１０

1－（4－（（2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）メチル）－2－メトキシベンジル）－N7－ブチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミン ２（US 2020/0038403 A1；32 mg、0.073 mmol）およびシクロブタンカルボン酸（7.01 μL、0.073 mmol）のＤＭＦ（0.5 mL）溶液をヒューニッヒ塩基（0.064 mL、0.366 mmol）およびＨＡＴＵ（33.4 mg、0.088 mmol）で処理し、３０分間攪拌した。塩基を蒸発させ、シリンジ濾過した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１２％Ｂで０分保持、２０分かけて１２－５２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１１０を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１０４、化合物１０５、および化合物１１１。
実施例３－化合物１０２

N7－ブチル－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミン ３（US 2020/0038403 A1；15 mg、0.04 mmol）の２ｍｌ ＤＭＦ溶液を6,6－ジフルオロ－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン（10.6 mg、0.08 mml）で処理し、８０℃で１時間加熱した。ＬＣＭＳが反応の完了を示した。反応物をシリンジ濾過した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：２１％Ｂで０分保持、２０分かけて２１－６１％Ｂ、次いで１００％Ｂで４分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１０２を得た。

化合物１０３を類似的に調製した。
実施例４－化合物１１２

メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート ４（US 2020/0038403；20 mg、0.028 mmol）の１ｍＬ ＤＭＦ溶液を1－オキサ－6－アザスピロ［3.3］ヘプタン（13 mg、0.14 mmol）で処理し、８０℃で１時間加熱した。反応混合物をトリエチルアミン－トリヒドロフルオライド（23 μL、0.14 mmol）で処理し、ＲＴで３時間攪拌した。粗生成物をＮａＯＨ（112 μL、0.559 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。６Ｍ ＨＣｌ水溶液で、反応混合物をｐＨ７に中和した。ロータリーエバポレーター中で溶媒を蒸発させた。残留物を１ｍＬ ＤＭＦ中に溶解し、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１１２を得た。

化合物１１３および化合物１１４を類似的に調製した。
実施例５－化合物１０８

ステップ１．メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート ５（US 2020/0038403 A1；300 mg、0.835 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（139 mg、1.252 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.378 mL、2.505 mmol）で処理した。ＢＯＰ（554 mg、1.252 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱した。反応混合物をＮａＯＨ（0.835 mL、4.17 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCOで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/ＭｅＣＮ（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて生成物を直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、化合物１６６を白色固体として得た。

ステップ２．（4－（（5－アミノ－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール １６６（300 mg、0.760 mmol）のＴＨＦ（２ mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.111 mL、1.521 mmol）で処理し、ＲＴで３０分間攪拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーター中で蒸発させ、３０ｍｇの粗製塩化物をＤＭＳＯ（0.5 mL）中に溶解し、1－（2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）エタン－1－オン（51 mg、0.363 mmol）およびヒューニッヒ塩基（0.127 mL、0.727 mmol）で処理した。反応混合物を８０℃で３時間加熱した。過剰な塩基を蒸発させ、以下の条件を用いて、粗生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１２％Ｂで０分保持、２０分かけて１２－５２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。化合物１０９を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１０８を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１０９（ステップ１において、スピロ［2.2］ペンタン－1－イルメタンアミンをスピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミンの代わりに用いた）、化合物１２９、化合物１３０、化合物１３１、化合物１３２、化合物１３３、化合物１３４、化合物１３５、化合物１４５、化合物１４６、化合物１４７、化合物１４８、化合物１５２（ステップ１において、（3－シクロプロピルシクロブチル）メタンアミンをスピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミンの代わりに用いた）、化合物１６７、化合物１６８、化合物１６９、化合物１７０、化合物１８３、および化合物２４１。
実施例６－化合物１１５

ステップ１．メチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート ７（US 2020/0038403 A1；100 mg、0.278 mmol）、（1－フルオロスピロ［2.3］ヘキサン－5－イル）メタンアミン（71.9 mg、0.557 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.126 mL、0.835 mmol）で処理した。ＢＯＰ（185 mg、0.417 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱した。反応混合物をＮａＯＨ（0.278 mL、1.391 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/ＭｅＣＮ（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて生成物を直接精製し、目的のフラクションを凍結乾燥させ、８４ｍｇの化合物８を白色固体として、ジアステレオマーの混合物として得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４６９.１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.34（s，1H），7.88（s，1H），7.75（d，J = 1.8 Hz，1H），6.98（s，1H），6.86－6.74（m，2H），5.71（s，2H），4.67－4.58（m，1H），4.45（d，J = 3.6 Hz，3H），3.75（d，J = 3.2 Hz，5H），2.80（s，1H），2.18（q，J = 9.1 Hz，1H），2.05－1.90（m，2H），1.85－1.76（m，1H），0.74（ddd，J = 21.0，11.2，5.9 Hz，2H）

ステップ２．ＳＯＣｌ_２（0.030 mL、0.407 mmol）を、化合物８（84 mg、0.204 mmol）のＴＨＦ（1 mL）溶液に添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーター中で蒸発させて粗製塩化物を得て、さらなる精製は行わずに次のステップに進んだ。２０ｍＬ密封バイアル中の、１２ｍｇの塩化物およびシクロブチルアミン（3.96 mg、0.056 mmol）の０．５ ｍＬ ＤＭＦ溶液を７０℃で１時間加熱した。過剰の塩基を蒸発させ、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：２％Ｂで０分保持、２３分かけて２－４２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、６ｍｇの化合物１１５をジアステレオマーの混合物として得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１１６、化合物１１７、化合物１１８、化合物１１９、化合物１２０、化合物１２１、化合物１２４、化合物１２５、化合物１２６、化合物１２７、および化合物１２８。
実施例７－化合物１３６

ステップ１．化合物７（200 mg、0.557 mmol）、（1,1－ジフルオロスピロ［2.3］ヘキサン－5－イル）メタンアミン（164 mg、1.113 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.252 mL、1.670 mmol）で処理した。ＢＯＰ（369 mg、0.835 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱した。反応混合物をＮａＯＨ（0.557 mL、2.78 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリルで溶出させて反応物を直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、白色固体として目的物を得た。
ＬＣ／ＭＳ予測 Ｃ_２１Ｈ_２４Ｆ_２Ｎ_６Ｏ_２＝４３１．４ 実測［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４３１．２

ステップ２．化合物１０（142 mg、0.330 mmol）のテトラヒドロフラン（2 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.048 mL、0.660 mmol）で処理し、１時間攪拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーター中で蒸発させ、粗生成物を次のステップに進めた。０．５ ｍＬ ＤＭＦ中、粗製塩化物およびシクロブチルアミン（11.8 mg、0.167 mmol）の混合物を８０℃で１時間加熱した。過剰なアミンを蒸発させ、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１５％Ｂで０分保持、２０分かけて１５－５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、４．２ｍｇの化合物１３６を得て、ジアステレオマーの混合物として単離した。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１２２、化合物１２３、化合物１３７、化合物１３８、化合物１３９、化合物１４０、化合物１４１、化合物１４２、化合物１４３、および化合物１４４。
実施例８－化合物１７３

ステップ１．化合物１１（US 2020/0038403 A1；350 mg、0.904 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（151 mg、1.355 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.409 mL、2.71 mmol）で処理した。ＢＯＰ（599 mg、1.355 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱した。反応混合物をＮａＯＨ（0.904 mL、4.52 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCOで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて反応物を直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、白色固体として化合物１２を得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３９５．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） 12.34（s，1H），8.32（t，J = 5.7 Hz，1H），7.86（s，1H），7.80（s，1H），7.53－7.43（m，2H），6.79（d，J = 7.9 Hz，1H），5.81（s，2H），3.84（s，3H），3.72（t，J = 6.5 Hz，3H），2.77－2.65（m，1H），1.82（dd，J = 12.0，6.3 Hz，3H），1.66（s，1H），0.36（s，4H）

ステップ２．化合物１２（40 mg、0.098 mmol）および2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン（11 mg、0.098 mmol）の０．５ ｍＬ ＤＭＦ溶液をヒューニッヒ塩基（１μＬ、0.294 mmol）およびＨＡＴＵ（44 mg、0.118 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで３０分間攪拌した。過剰な塩基を蒸発させ、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて、粗生成物を逆相ISCOにより精製し、フラクションを凍結乾燥させ、化合物１７３を白色固体として得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１７１、化合物１７２、化合物１７４、化合物１７５、化合物１７６、化合物１７７、化合物１７８、化合物１７９、化合物１８４、化合物１９０、化合物１９２、化合物１９３、化合物１９４、化合物１９５、化合物１９６、化合物１９７、化合物２０１、化合物２２２、化合物２２５、化合物２２６、化合物２２７、化合物２２８、化合物２３０、化合物２３１、化合物２３４、化合物２３５、化合物２３６、化合物２３７、化合物２３８、化合物２３９、および化合物２４０。
実施例９－化合物１４９。

ステップ１．化合物１１（100 mg、0.258 mmol）、（1,1－ジフルオロスピロ［2.3］ヘキサン－5－イル）メタンアミン（76 mg、0.516 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.117 mL、0.774 mmol）で処理した。ＢＯＰ（171 mg、0.387 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱し、ＮａＯＨ（0.258 mL、1.291 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱し、逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、９１ｍｇの化合物１４を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ－Ｈ］^＋＝４４３．２

ステップ２．化合物１４（15 mg、0.034 mmol）および2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン（3.8 mg、0.034 mmol）の０．５ ｍＬ ＤＭＦ溶液をヒューニッヒ塩基（１８μＬ、0.1 mmol）およびＨＡＴＵ（15.4 mg、0.041 mmol）で処理した。反応物をＲＴで２０分間攪拌した。過剰なアミンを蒸発させ、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：８％Ｂで０分保持、２０分かけて８－４８％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物１４９を白色固体として得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１５０、化合物１５１、化合物１５９、化合物１６０、化合物１６１、化合物１６２、化合物１６３、化合物１６４、および化合物１６５。
実施例１０－化合物１５３

ステップ１．化合物７（100 mg、0.278 mmol）、スピロ［3.3］ヘプタン－2－イルメタンアミン（69.7 mg、0.557 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.126 mL、0.835 mmol）で処理した。ＢＯＰ（185 mg、0.417 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱し、ＮａＯＨ（0.278 mL、1.391 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱し、逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/ＭｅＣＮ（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、化合物１６を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０９．３

ステップ２．化合物１６（190 mg、0.465 mmol）のＴＨＦ（1 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.068 mL、0.930 mmol）で処理し、３０分間攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗製塩化物を次のステップに進めた。前記塩化物（15 mg、0.035 mmol）およびシクロブチルアミン（12 mg、0.176 mmol）の溶液を０．５ ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、７０℃で１時間加熱した。シクロブチルアミンを蒸発させ、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、７．９ｍｇの化合物１５３を得た。

この実施例を通じて、以下の化合物を類似的に調製した：化合物１５４、化合物１５５、化合物１５６、化合物１５７、化合物１５８、化合物１８５、および化合物１８６。化合物１８５および化合物１８６の例において、ステップ１で（6,6－ジフルオロスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）メタンアミンをスピロ［3.3］ヘプタン－2－イルメタンアミンの代わりに使用した。
実施例１１－化合物２００

ステップ１．化合物７（100 mg、0.258 mmol）、スピロ［3.3］ヘプタン－2－イルメタンアミン（48.5 mg、0.387 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.117 mL、0.774 mmol）で処理した。ＢＯＰ（171 mg、0.387 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱し、ＮａＯＨ（0.258 mL、1.291 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて、反応生成物を直接精製し、フラクションを凍結乾燥させ、化合物１８を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４２２．３
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.59（s，1H），7.22（s，1H），7.05（d，J = 7.8 Hz，1H），6.46（s，0H），6.37（d，J = 7.8 Hz，1H），5.66（d，J = 12.0 Hz，4H），4.31（s，2H），4.08（s，2H），3.89（s，3H），3.53（s，1H），3.38（t，J = 6.4 Hz，1H），3.31（d，J = 7.6 Hz，1H），3.24（d，J = 7.5 Hz，1H），3.01（d，J = 4.4 Hz，0H），2.31（q，J = 7.7 Hz，1H），2.17（s，3H），1.93－1.86（m，2H），1.85（td，J = 12.7，11.5，3.7 Hz，4H），1.80（d，J = 7.3 Hz，3H），1.72（q，J = 7.7 Hz，2H），1.57－1.50（m，2H）

ステップ２．化合物１８（20 mg、0.047 mmol）のＤＭＦ（0.5 mL）溶液を2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン（5.31 mg、0.047 mmol）で、続いてＨＡＴＵ（21.60 mg、0.057 mmol）およびヒューニッヒ塩基（0.025 mL、0.142 mmol）で処理した。ＬＣＭＳは、３０分後に反応の完了を示した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１１％Ｂで０分保持、２０分かけて１１－５１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２００を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物１８０、化合物１８１、化合物１８２、化合物１８７、化合物１８８、化合物１８９、化合物２０２、化合物２０３、化合物２０４、および化合物２０５。化合物１８７の例において、ステップ１で（6,6－ジフルオロスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）メタンアミンをスピロ［3.3］ヘプタン－2－イルメタンアミンの代わりに使用した。
実施例１２－化合物２１０

ステップ１．化合物７（100 mg、0.278 mmol）および（5－メチルイソキサゾール－3－イル）メタンアミン（62 mg、0.557 mmol）のＤＭＳＯ（2 mL）溶液をＤＢＵ（0.210 mL、1.391 mmol）で処理した。ＢＯＰ（185 mg、0.417 mmol）を添加した。反応混合物を４０℃で１時間加熱し、ＮａＯＨ（0.278 mL、1.391 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。逆相ISCで、50 g C－18カラムを用いて、０－５０％ 水/アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて、反応混合物を直接精製した。フラクションを凍結乾燥させ、化合物２０（白色固体）を得た。
ＬＣ／ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］＋＝３９６．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.80（t，J = 5.9 Hz，1H），7.84（s，1H），7.70（s，1H），6.88（s，1H），6.81－6.71（m，2H），6.11（s，1H），5.62（s，2H），4.73（d，J = 5.8 Hz，2H），4.39（s，2H），4.13（d，J = 5.9 Hz，0H），3.61（s，3H），2.29（d，J = 4.0 Hz，3H），1.56－1.43（m，1H），0.59－0.50（m，1H）

ステップ２．化合物２０（70 mg、0.177 mmol）のＴＨＦ（0.5 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.026 mL、0.354 mmol）で処理し、ＲＴで３０分間攪拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーター中で蒸発させ、粗製塩化物を次のステップに進めた。粗製塩化物（18 mg、0.043 mmol）および2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン（21 mg、0.217 mmol）を０．５ｍＬのＤＭＳＯ中で混合し、反応混合物を８０℃で１時間加熱した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、７．４ｍｇの化合物２１０を白色固体として得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２１１、化合物２１２、および化合物２１３。
実施例１３－化合物２１４

ステップ１．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（300 mg、0.774 mmol）のＤＭＳＯ（3.9 mL）溶液を（5－メチルイソキサゾール－3－イル）メタンアミン（174 mg、1.55 mmol）、ＢＯＰ（411 mg、0.929 mmol）およびＤＢＵ（233 μL、1.549 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏで洗浄した（３回）。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（（5－メチルイソキサゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（353 mg、収率９５％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.80（s，1H），7.99－7.93（m，1H），7.77（t，J=5.9 Hz，1H），7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.45（dd，J=7.8，1.5 Hz，1H），6.62（d，J=7.9 Hz，1H），6.10（d，J=0.9 Hz，1H），5.80（s，2H），4.73（d，J=5.9 Hz，2H），3.84（s，3H），3.82（s，3H），3.64（s，3H），2.31（s，3H） ＬＣ／ＭＳ条件：カラム：Aquity UPLC BEH C18、2.1 mm x 50 mm、1.7 μｍ 粒子；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有１００％水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有１００％アセトニトリル；グラジエント：１分かけて２％Ｂから９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５０分保持；流速：０．８ｍＬ/分 ＬＣ ＲＴ：０．６７分 ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４８２．３

ステップ２．メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（（5－メチルイソキサゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（125 mg、0.260 mmol）のジオキサン（1.3 mL）溶液をＮａＯＨ（１０Ｍ水溶液、0.2 mL、2.0 mmol）で処理し、７５℃に加熱した。２時間後、反応混合物をＲＴに冷まし、ＨＣｌ（４Ｍ ジオキサン中、0.52 mL、2.1 mmol）で処理した。得られた溶液を減圧濃縮した。残留物をＭｅＯＨ/ＤＣＭ中に再溶解し、再度減圧濃縮して、粗製4－（（5－アミノ－7－（（（5－メチルイソキサゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸を得た。この粗生成物（40 mg）のＤＭＦ（４６９μＬ）溶液を2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン・２ＨＣｌ（17 mg、0.094 mmol）、ＤＩＥＡ（57 μl、0.33 mmol）および2,4,6－トリプロピル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリホスホリナン－2,4,6-トリオキシド（５０％ ＥｔＯＡｃ溶液、55.8 μL、0.094 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。反応混合物をＤＭＦ（1 mL）およびＨ_２Ｏ（0.2 mL）で希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２０分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２１４（13.7 mg、収率５８％）を得た。
実施例１４－化合物１９８

ステップ１．メチル 4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（5 g、29.2 mmol）のＤＭＦ（30 mL）攪拌溶液にＣｓ_２ＣＯ_３（11.42 g、35.1 mmol）を添加した。氷浴で冷却後、メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（7.57 g、29.2 mmol）のＤＭＦ（20 mL）溶液を複数回に分けて、５分かけて添加した。ゆっくりと室温に温まるまで反応物をそのままにし、終夜攪拌し、水（150 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 70 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（220 g ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から５０％ＥｔＯＡｃ）により、メチル 1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.012 g、2.90 mmol、収率９．９２％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３５０．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.40（s，1H），7.57（d，J=7.6 Hz，1H），7.50（s，1H），7.27（d，J=7.9 Hz，1H），5.53（s，2H），3.96（s，3H），3.86（s，3H），3.82（s，3H）

ステップ２．メチル 1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（2 g、5.73 mmol）をエタノール（100 mL）中に懸濁した。１０％パラジウム炭素（100 mg）を添加し、反応槽を真空にし、水素で６回パージした。水素雰囲気下で反応混合物を終夜攪拌し、ＥｔＯＨ（100 mL）で洗浄しながらＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過した。濾液を蒸発乾固させ、メチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.764 g、5.52 mmol、収率９６％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３２０．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.50（s，1H），7.46（d，J=7.7 Hz，1H），7.18（s，1H），6.42（d，J=7.9 Hz，1H），5.55（s，2H），5.14（s，2H），3.91（s，3H），3.84（s，3H），3.70（s，3H）

ステップ３．メチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.75 g、5.48 mmol）をＭｅＯＨ（60 mL）中に懸濁した。1,3－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（1.243 g、6.03 mmol）、続いてＨＯＡｃ（1.882 mL、32.9 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。２ｍＬのＴＦＡを添加し、反応混合物を終夜攪拌した。ＮａＯＭｅ（23.69 g、110 mmol、重量２５％）を添加し、次にＲＴで４時間攪拌した。沈殿物を濾過し、ＭｅＯＨ（50 mL）中に懸濁した。ＮａＯＭｅ（3 g、13.88 mmol、重量２５％）を添加し、反応物をＲＴで１時間攪拌した。反応混合物をＡｃＯＨで酸性化し、１０分間攪拌した後、反応物を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、固体メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（670 mg、1.730 mmol、収率３２％）を得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ 388.1 ^１
Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.92（s，1H），7.52（s，1H），7.47（d，J=7.6 Hz，1H），6.70（d，J=7.7 Hz，1H），5.76（s，2H），3.90（s，3H），3.85（s，3H），3.76（s，3H）

ステップ４．２０ｍＬシンチレーションバイアルにメチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（180 mg、0.465 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（103 mg、0.697 mmol）、ＢＯＰ（308 mg、0.697 mmol）およびＤＭＳＯ（1 mL）を入れた。ＤＢＵ（0.245 mL、1.626 mmol）を添加した。反応混合物を６０℃で２時間攪拌し、冷却し、濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（50 g Ｃ_１８カラム、０．０５％ ギ酸含有水中、０から６５％ ＭｅＣＮ）を用いて精製し、メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエートを得た（165 mg、0.343 mmol、収率７３．９％、白色固体）。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４８１．２

ステップ５．メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（165 mg、0.343 mmol）をジオキサン（4 mL）中に溶解した。ＮａＯＨ（1.030 mL、5.15 mmol）を添加し、反応物を８０℃で２時間加熱した。冷却後、反応混合物をＨＣｌで酸性化し、蒸発乾固させ、生成物を精製せずに次に使用した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４０９．３

ステップ６．２０ｍＬシンチレーションバイアルに4－（（5－アミノ－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸（100 mg、0.086 mmol）、ＨＢＴＵ（39.0 mg、0.103 mmol）、1－メチルピペリジン－4－アミン（19.57 mg、0.171 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.045 mL、0.257 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２５分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。フラクション化合物１９８（16.4 mg、0.032 mmol、収率３８％）

化合物１９９を類似的に調製した。
実施例１５－化合物２０７、ジトリフルオロアセテート

ステップ１．メチル 4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（10 g、58.4 mmol）のＥｔＯＨ（100 mL）攪拌溶液に１０％パラジウム炭素（0.622 g、0.584 mmol）を添加した。反応物を真空にし、水素で６回パージし、次いで水素雰囲気下で２日間攪拌した。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、ＥｔＯＨ（100 mL）で洗浄した。濾液を蒸発乾固させ、エーテル/ヘキサンでトリチュレートし、メチル 4－アミノ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（8.012 g、56.8 mmol、収率９７％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ １４２．１

ステップ２．メチル 4－アミノ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（4 g、28.3 mmol）をＭｅＯＨ（75 mL）中に溶解し、1,3－ビス（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（6.43 g、31.2 mmol）、続いて酢酸（6.49 mL、113 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで５時間攪拌した。ＮａＯＭｅ（36.7 g、170 mmol、重量２５％）を添加した。反応混合物をＲＴで終夜攪拌し、ＡｃＯＨで酸性化し、濾過し、水（100 mL）、ＴＨＦ（100 mL）およびエーテル（100 mL）で洗浄し、メチル （7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（5.098 g、24.37 mmol、収率８６％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２１０．０

ステップ３．メチル （7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（5.1 g、24.38 mmol）をＤＭＦ（100 mL）中に懸濁した。ＮＢＳ（4.34 g、24.38 mmol）を添加し、反応物をＲＴで１時間攪拌した。反応混合物を水（100 mL）でクエンチし、１０分間攪拌し、次いで濾過し、水（100 mL）、ＴＨＦ（2 x 50 mL）およびエーテル（2 x 50 mL）で洗浄し、メチル （3－ブロモ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（8.32 g、23.11 mmol、収率９５％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２８８．０，２９０．０

ステップ４．メチル （3－ブロモ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（2.50 g、8.68 mmol）のＤＭＦ（35 mL）攪拌溶液にＣｓ_２ＣＯ_３（3.11 g、9.55 mmol）、続いてメチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（2.249 g、8.68 mmol）のＤＭＦ（15 mL）攪拌溶液を添加した。反応混合物をＲＴで終夜攪拌し、水（400 mL）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（3 x 150 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 100 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。ＤＣＭ/エーテル/ヘキサンを用いてトリチュレートし、メチル 4－（（3－ブロモ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.791 g、3.07 mmol、収率３５．４％）を得た。ＬＣＭＳによると生成物は８０％純粋であった（残りの２０％はＮ２位置異性体であった）。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４６６．１，４６８．１

ステップ５．２０ｍＬマイクロウェーブバイアルにメチル 4－（（3－ブロモ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（500 mg、1.072 mmol）（純度約８０％でＮ２位置異性体が混入している）、2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（ＴＭＢ、269 mg、2.145 mmol）、［1,1'－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（II）（235 mg、0.322 mmol）、Ｋ_２ＣＯ_３（296 mg、2.145 mmol）、ジオキサン（12 mL）および水（3 mL）を入れた。反応混合物を電子レンジ内で、１２０℃で１時間加熱し、蒸発乾固させた。ＤＭＳＯ（3 mL）を残留物に添加した。混合物を濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（100 g Ｃ_１８カラム、０．０５ ＴＦＡ含有水中、０から５０％ アセトニトリル）を用いて精製し、メチル 4－（（5－アミノ－7－ヒドロキシ－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（117 mg、0.341 mmol、収率３１．８％）をオフホワイト固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ３４４．１

ステップ６．２０ｍＬシンチレーションバイアルにメチル 4－（（5－アミノ－7－ヒドロキシ－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（130 mg、0.379 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（84 mg、0.568 mmol）、ＢＯＰ（251 mg、0.568 mmol）およびＤＭＳＯ（2 mL）を入れた。ＤＢＵ（0.200 mL、1.325 mmol）を添加した。反応混合物を５０℃で１時間攪拌し、冷却し、水（1 mL）で希釈し、濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（50 g Ｃ_１８カラム、０．０５％ ＴＦＡ含有水中、０から６０％ アセトニトリル）を用いて精製し、メチル 4－（（5－アミノ－3－メチル－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（80 mg、0.183 mmol、収率４８．４％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４３７．３
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.29（br t，J=5.6 Hz，1H），7.80（br s，2H），7.53－7.46（m，2H），6.79（d，J=7.7 Hz，1H），5.74（s，2H），3.85（s，6H），3.71（br t，J=6.5 Hz，2H），2.78－2.64（m，1H），2.31（s，3H），2.03－1.93（m，2H），1.82（dd，J=12.1，6.4 Hz，2H），0.35（s，4H）

ステップ７．２０ｍＬシンチレーションバイアルにメチル 4－（（5－アミノ－3－メチル－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（75 mg、0.172 mmol）、ジオキサン（2 mL）およびＮａＯＨ（0.412 mL、2.062 mmol）を入れた。反応混合物を２時間、８０℃に加熱し、冷却し、５Ｎ ＨＣｌで中和し、蒸発乾固し、4－（（5－アミノ－3－メチル－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸（190 mg、0.157 mmol、収率９２％）を固体として得て、精製せずに使用した。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４２３．３

ステップ８．２０ｍＬシンチレーションバイアルに4－（（5－アミノ－3－メチル－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸（100 mg、0.083 mmol、純度３５％）、ＨＡＴＵ（37.8 mg、0.099 mmol）、1－メチルピペリジン－4－アミン（18.92 mg、0.166 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.043 mL、0.249 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２０７（43.3 mg、0.058 mmol、収率７０％）を得た。

化合物２０８および化合物２１７を類似的に調製した。
実施例１６－化合物２１８

ステップ１．水酸化カリウム（5N、24.07 mL、120 mmol）の水溶液を、メチル 3－ヒドロキシ－4－メチルベンゾエート（4 g、24.07 mmol）のアセトニトリル（150 mL）冷却（氷浴）溶液に添加した。０℃で５分間攪拌した後、ジエチル （ブロモジフルオロメチル）ホスホネート（12.85 g、48.1 mmol）を添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、１６時間攪拌した。さらにＫＯＨ溶液（5N、16 mL、80 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴでさらに３０分間攪拌し、水（200 mL）で希釈、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（2 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－メチルベンゾエート（2.552 g、11.80 mmol、収率４９．０％）を油として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２１７．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.76（dd，J=7.8，1.7 Hz，1H），7.68（br．s，1H），7.51－7.10（m，2H），3.87（s，3H），2.31（s，3H）

ステップ２．ＮＢＳ（1.811 g、10.18 mmol）およびベンゾイルペルオキシド（0.448 g、1.850 mmol）をメチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－メチルベンゾエート（2 g、9.25 mmol）の四塩化炭素（20 mL）攪拌溶液に添加した。反応物を７５℃で４時間、次いでＲＴで終夜攪拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１５％ ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、メチル 4－（ブロモメチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（1.561 g、5.29 mmol、収率５７．２％）を油として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ２９５．０，２９７．０
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ 7.88（dd，J=8.1，1.5 Hz，1H），7.80（s，1H），7.52（d，J=8.1 Hz，1H），6.64（t，J=73.0 Hz，1H），4.57－4.51（m，2H），3.98－3.90（m，3H）

ステップ３．メチル （3－ブロモ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（1.269 g、4.41 mmol）およびＣｓ_２ＣＯ_３（1.579 g、4.85 mmol）のＤＭＦ（30 mL）攪拌懸濁液を氷浴で冷却した。メチル 4－（ブロモメチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（1.3 g、4.41 mmol）のＤＭＦ（5 mL）溶液を添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、３時間攪拌した。反応混合物を水（400 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 150 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 80 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、メチル 4－（（3－ブロモ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（1.69 g、3.37 mmol、収率７６％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５０２．１，５０４．０
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 11.72（br s，1H），11.45（br s，1H），7.80（dd，J=7.9，1.3 Hz，1H），7.74（s，1H），7.35（t，J=73.2 Hz，1H），7.26－7.18（m，1H），5.82（s，2H），3.87（s，3H），3.76（s，3H）

ステップ４．メチル 4－（（3－ブロモ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（1.6 g、3.19 mmol）のエタノール（150 mL）攪拌懸濁液に１０％パラジウム炭素（0.16 g）を添加した。反応混合物を真空にし、水素で６回パージし、水素雰囲気下で２４時間攪拌し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過した。生成物のほとんどが、パラジウムとともにＣＥＬＩＴＥ（商標）に詰まったので、全ての固体物質をＣＥＬＩＴＥ（商標）からこそぎ落として水（100 mL）に入れ、ＥｔＯＡｃ（3 x 70 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（2 x 50 mL）で洗浄し、再度ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過した。この濾液を最初の濾液と合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過、濃縮し、メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（1.2 g、2.83 mmol、収率８９％）をオフホワイト固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４２４．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 11.16（br s，1H），7.93（s，1H），7.77（d，J=8.5 Hz，1H），7.73（s，1H），7.36（t，J=73.2 Hz，1H），7.04（d，J=7.9 Hz，1H），5.84（s，2H），3.87（s，3H），3.76（s，3H）

ステップ７．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（1.250 g、2.95 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（0.654 g、4.43 mmol）、ＢＯＰ（1.959 g、4.43 mmol）およびＤＭＳＯ（15 mL）を入れた。ＤＢＵ（1.558 mL、10.33 mmol）を添加し、反応物を５０℃で３時間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（80 g ＳｉＯ_２カラム、ＣＥＬＩＴＥ（商標）充填、ヘキサン中、０から１００％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（338 mg、0.654 mmol、収率２２．１６％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５１７．３

ステップ６．メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（330 mg、0.639 mmol）のジオキサン（3600μＬ）攪拌溶液にＮａＯＨ（1278μＬ、6.39 mmol）を添加した。反応物を２時間、８０℃で攪拌した。冷却後、５Ｎ ＨＣｌ（1.28 mL）を用いて反応混合物を中和し、蒸発乾固させた。残留物をＤＭＳＯ（2 mL）中に懸濁し、水（35 mL）を添加し、生成物を濾過し、水（30 mL）で洗浄して、4－（（5－アミノ－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）安息香酸（126 mg、0.284 mmol、収率４４．４％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４４５．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.71（s，1H），7.67（d，J=7.9 Hz，1H），7.63（s，1H），7.37（t，J=73.5 Hz，1H），6.80（br t，J=5.4 Hz，1H），6.55（d，J=7.9 Hz，1H），5.92（br s，2H），5.81（s，2H），3.57－3.51（m，2H），2.72－2.57（m，1H），1.98－1.88（m，2H），1.77－1.69（m，2H），0.37－0.25（m，4H）

ステップ７．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、4－（（5－アミノ－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）安息香酸（30 mg、0.068 mmol）、ＨＡＴＵ（30.8 mg、0.081 mmol）、（3aR,6aS）－2－メチルオクタヒドロピロロ［3,4－c］ピロール（12.78 mg、0.101 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.035 mL、0.203 mmol）を添加した。反応物をＲＴで終夜攪拌し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２５分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２１８（30.3 mg、収率８１％）を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２１９、化合物２２０、化合物２２１、および化合物２２４。
実施例１７－化合物２２３

ステップ１．Ｃｓ_２ＣＯ_３（1329 mg、4.08 mmol）をメチル （3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（700 mg、2.040 mmol）のＤＭＦ（5 mL）攪拌溶液に添加した。氷浴で冷却後、メチル 4－（ブロモメチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（572 mg、1.938 mmol）のＤＭＦ（2 mL）溶液を添加した。ＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、３時間攪拌した。水（20 mL）を添加し、ＥｔＯＡｃ（3 x 5 mL）で反応混合物を抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 10 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２カラム、ＤＣＭ充填、ヘキサン中、０から６０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4－（（3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（275 mg、0.493 mmol、収率２４．１９％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５５７．１，５５９．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.89（s，1H），7.82－7.69（m，2H），7.61－7.14（m，2H），6.87（d，J=7.9 Hz，1H），5.88（s，2H），3.87（s，3H），3.64（s，3H），3.54－3.45（m，2H），1.58－1.46（m，2H），1.19（dq，J=15.0，7.4 Hz，2H），0.83（t，J=7.3 Hz，3H）

ステップ２．メチル 4－（（3－ブロモ－7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（275 mg、0.493 mmol）をエタノール（15 mL）中に溶解した。１０％ Ｐｄ/Ｃ（27 mg）を添加した。反応槽を真空にし、水素で６回パージした。反応混合物をＨ_２雰囲気下で２時間攪拌し、濾過し、蒸発乾固させた。残留物をジオキサン（2 mL）中に溶解した。ＮａＯＨ（0.564 mL、2.82 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、冷却し、５Ｎ ＨＣｌで中和し、蒸発乾固させた。残留物をＭｅＯＨ/水（1：1，8 mL）中に溶解した。メタノールを蒸発により除去した。残った水性懸濁液を濾過し、水で洗浄し、4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）安息香酸（54 mg、0.133 mmol、収率２７％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０７．２２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.50（br s，1H），7.84（s，2H），7.79－7.68（m，2H），7.63－7.05（t，J=73.2 Hz 1H），6.97（d，J=7.9 Hz，1H），5.94（s，2H），3.54（q，J=6.4 Hz，2H），1.54（quin，J=7.2 Hz，2H），1.19（dq，J=14.9，7.3 Hz，2H），0.84（t，J=7.3 Hz，3H）

ステップ３．２０ｍＬシンチレーションバイアルに4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）安息香酸（50 mg、0.123 mmol）、ＨＡＴＵ（56.1 mg、0.148 mmol）、tert－ブチル 2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート（24.39 mg、0.123 mmol）およびＤＭＦ（2 mL）を入れた。ＤＩＰＥＡ（0.064 mL、0.369 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（10 mL）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（3 x 5 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 5 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残留物をＤＣＭ（1.5 mL）中に溶解し、ＴＦＡ（0.5 mL）を添加した。反応物をＲＴで３０分間攪拌し、次いで蒸発乾固させた。粗製物質をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－３７％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２２３（20.9 mg、0.043 mmol、収率３５％）を得た。
実施例１８－化合物２４２、トリ－ＴＦＡ塩

ステップ１．２０ｍＬシンチレーションバイアルに、メチル 4－（（3－ブロモ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（750 mg、1.493 mmol）、スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメタンアミン ヒドロクロライド（500 mg、2.370 mmol）、ＢＯＰ（991 mg、2.240 mmol）およびＤＭＳＯ（7.5 mL）を入れた。ＤＢＵ（0.788 mL、5.23 mmol）を添加した。反応混合物を５０℃で終夜攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（80 g ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から６０％ ＥｔＯＡｃ）により、メチル 4－（（3－ブロモ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（286 mg、0.480 mmol、収率32.2％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５９５．１，５９７．１
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.91（s，1H），7.78－7.71（m，2H），7.44（t，J=5.4 Hz，1H），7.38（t，J=73.2 Hz，1H），6.86（d，J=7.9 Hz，1H），5.89（s，2H），3.86（s，3H），3.70－3.59（m，5H），2.76（br t，J=7.2 Hz，1H），2.15－2.03（m，2H），1.80（dd，J=12.1，6.4 Hz，2H），0.32（s，4H）

ステップ２．メチル 4－（（3－ブロモ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－（ジフルオロメトキシ）ベンゾエート（286 mg、0.480 mmol）のエタノール（15 mL）攪拌溶液に１０％パラジウム炭素（28 mg）を添加した。反応混合物を真空にし、水素で６回パージし、次いで水素雰囲気下で１時間攪拌した。反応混合物を濾過し、蒸発乾固させて、メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（290 mg、0.477 mmol、収率９９％）を白色固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５１７．３
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 11.93（br s，1H），8.92（br s，1H），8.17（s，1H），7.80（d，J=7.9 Hz，1H），7.77（s，1H），7.42（t，J=73.0 Hz，1H），7.11（d，J=7.9 Hz，1H），6.04（s，2H），3.92（s，3H），3.90（s，3H），3.82（br t，J=6.5 Hz，2H），2.89－2.75（m，1H），2.03（dd，J=12.1，8.4 Hz，2H），1.92（dd，J=12.2，6.7 Hz，2H），0.40（s，4H）

ステップ３．メチル 3－（ジフルオロメトキシ）－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（250 mg、0.484 mmol）のＴＨＦ（10 mL）攪拌溶液に、０℃で、ＬｉＡｌＨ_４（1.065 mL、1.065 mmol）を複数回に分けて、１０分かけて添加した。反応混合物を３０分間、０℃で攪拌し、次いでロッシェル塩（10 mL、20 w/v）でクエンチした。１０分間攪拌した後、反応混合物を50 mLの水が入った分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（3 x 30 mL）で抽出した。合わせた有機物をブライン（3 x 30 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（24 g ＳｉＯ_２カラム、ＤＣＭ充填、ＤＣＭ中、０から１０％ ＭｅＯＨ）により、メチル （1－（2－（ジフルオロメトキシ）－4－（ヒドロキシメチル）ベンジル）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（117 mg、0.240 mmol、収率４９．５％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４８９．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.65（s，1H），7.88（s，1H），7.43－6.98（m，4H），6.62（d，J=7.9 Hz，1H），5.79（s，2H），5.29（t，J=5.6 Hz，1H），4.46（d，J=5.5 Hz，2H），3.68－3.59（m，5H），2.78（dt，J=15.0，7.3 Hz，1H），2.00（dd，J=12.0，8.5 Hz，2H），1.83（dd，J=12.2，6.3 Hz，2H），0.35（s，4H）

ステップ４．メチル （1－（2－（ジフルオロメトキシ）－4－（ヒドロキシメチル）ベンジル）－7－（（スピロ［2.3］ヘキサン－5－イルメチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（55 mg、0.113 mmol）をＤＣＭ（2 mL）中に溶解し、ＳＯＣｌ_２（0.025 mL、0.338 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで３０分間攪拌し、次いで蒸発乾固させた。残留物をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、tert－ブチル 2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート（33.5 mg、0.169 mmol）、続いてＤＩＰＥＡ（0.059 mL、0.338 mmol）を添加した。反応混合物を５０℃で４時間、次いでＲＴで終夜攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（10 mL）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（3 x 4 mL）で抽出した。合わせた有機相をブライン（3 x 5 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残留物をＤＣＭ（2 mL）中に溶解し、ＴＦＡ（0.4 mL）を添加した。反応物をＲＴで１時間攪拌し、次いで蒸発乾固させ、ジオキサン（2 mL）中に再溶解した。ＮａＯＨ（0.338 mL、1.689 mmol、5N）を添加し、反応物を８０℃で１時間攪拌し、冷却、５Ｎ ＨＣｌを用いて中和し、蒸発乾固させた。残留物をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：２％Ｂで０分保持、２０分かけて２－４２％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２４２、３ＴＦＡ塩（21.1 mg、0.025 mmol、収率２１．７％）を得た。

化合物２４３を類似的に調製した。
実施例１９－化合物２０６

ステップ１．ＤＢＵ（0.856 mL、5.68 mmol）を、メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（550 mg、1.420 mmol；ＮａＯＨ処理前の実施例２のステップ６を参照）および（S）－3－アミノヘキサン－1－オール ヒドロクロライド ２（327 mg、2.130 mmol）のＤＭＳＯ（5 mL）懸濁液に添加した。反応混合物をＲＴで１０分間攪拌すると、混合物は透明な溶液になった。ＢＯＰ（1256 mg、2.84 mmol）を添加し、反応混合物を７０℃で２時間攪拌してからＬＣＭＳにかけたところ、出発物質は全く検出されなかった。この溶液を５Ｍ ＮａＯＨ（5 mL、25.00 mmol）溶液で処理し、７０℃で０．５時間攪拌した。冷却後、反応混合物をシリンジフィルターディスクに通して濾過した。プレパラティブ逆相C18カラム（150g）で、アセトニトリル：水（０．０５％ ＴＦＡ調整剤を含む）＝０－５０％で溶出させて濾液を精製し、目的のフラクションを凍結および凍結乾燥させて、（S）－4－（（5－アミノ－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸（860.8 mg、1.246 mmol、収率８８％）を得た。
ＬＣＭＳ ＥＳＩ：計算値 Ｃ_２０Ｈ_２７Ｎ_６Ｏ_４＝４１５．２（Ｍ＋Ｈ^＋）、実測値 ４１５．２（Ｍ＋Ｈ^＋）

ステップ２．ＤＭＦ（1 mL）中、（S）－4－（（5－アミノ－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸（60 mg、0.145 mmol）、2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン，２ＨＣｌ（53.6 mg、0.290 mmol）の混合物をヒューニッヒ塩基（0.126 mL、0.724 mmol）、続いてＢＯＰ（96 mg、0.217 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで３時間攪拌した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：５％Ｂで０分保持、２５分かけて５－４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２０６（15.5 mg、0.030 mmol、収率２０．８８％）を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２０９、化合物２２９、化合物２３２、および化合物２３３。
実施例２０－化合物２４４

ステップ１．tert－ブチル ヒドラジンカルボキシレート（12.75 g、96 mmol）およびＤＩＰＥＡのＤＭＦ（24 mL）溶液をＲＴで、２４ｍＬのＤＭＦ中、メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（5 g、19.30 mmol）を滴下漏斗で１時間かけて滴下することで処理した。反応混合物をＲＴで終夜攪拌した。ＥｔＯＡｃ（135 mL）およびＨ_２Ｏ（75 mL）を添加し、二相混合物を３０分間攪拌した。反応混合物を分液漏斗に注ぎ、水層を除去した。有機層をＨ_２Ｏ（75 mL）でさらに２回、１０％ ＬｉＣｌ溶液（75 mL）で２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（Isco、220 g ＳｉＯ_２、０％ ＣＨ_２Ｃｌ_２（５分）、次いで１５％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２）により、tert－ブチル 2－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）ヒドラジン－1－カルボキシレートを透明な油（3.85 g）として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ３１１．２；ＬＣ ＲＴ＝０．８０分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 7.64（dd，J=7.7，1.5 Hz，1H），7.56（d，J=1.5 Hz，1H），7.37（d，J=7.7 Hz，1H），6.08－5.87（m，1H），4.07（s，2H），3.94（d，J=4.6 Hz，6H），1.50－1.40（m，9H）

ステップ２．tert－ブチル 2－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）ヒドラジン－1－カルボキシレート（25.4 g、82 mmol）をＭｅＯＨ（164 mL）中にＲＴで溶解した。４Ｎ ＨＣｌ－ジオキサン（123 ml、59.5 mmol）を添加し、反応物をＲＴで終夜攪拌した。白色沈殿を濾過により回収し、乾燥させてメチル 4－（ヒドラジニルメチル）－3－メトキシベンゾエート，ジヒドロクロライド（20 g）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ２１１．１；ＬＣ ＲＴ＝０．５１分（手順Ｆ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 9.12（br s），7.62－7.55（m，1H），7.53－7.47（m，2H），4.10（s，2H），3.88（s，3H），3.87（s，3H）

ステップ３．（E）－N,N－ジメチル－2－ニトロエテン－1－アミン（46.4 g、400 mmol）およびピリジン（420 ml、5195 mmol）のＣＨ_２Ｃｌ_２（799 ml）溶液を－１０℃に冷却し、エチル 2－クロロ－2－オキソアセテート（51.4 ml、460 mmol）でゆっくりと処理した。２５℃に温まるまで２時間の間、反応混合物をそのままにし、終夜攪拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２を回転蒸発により除去し、メチル 4－（ヒドラジニルメチル）－3－メトキシベンゾエート ジヒドロクロライド（31.7 g、112 mmol）を一度に添加した。溶液を２時間、ＲＴで攪拌し、溶媒を真空下で除去した。残留物を水、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解し、ショートシリカゲルカラムに通し、エタノールから再結晶させて、エチル 1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（29.4 g）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ） ３８６．０；ＬＣ ＲＴ＝０．９８分（手順Ｆ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 8.06（s，1H），7.64（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.56（d，J=1.5 Hz，1H），7.13（d，J=7.8 Hz，1H），5.53（s，2H），4.45（q，J=7.2 Hz，2H），3.94（s，3H），3.88（s，3H），1.37（t，J=7.2 Hz，3H）

ステップ４．ギ酸アンモニウム（1.41 g、22.4 mmol）および亜鉛（0.915 g、14.0 mmol）をエチル 1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－4－ニトロ－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（2.03 g、5.60 mmol）のＴＨＦ（4.67 ml）/ＭｅＯＨ（4.7 ml）溶液に、ＲＴで添加した。反応物をＲＴで２時間攪拌し、追加量のギ酸アンモニウム（0.353 g、5.60 mmol）および亜鉛（0.229 g、4.67 mmol）を添加した。１時間後、反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（商標）のパッドに通して濾過し、濾液を減圧濃縮して白色固体を得た。前記固体をＥｔＯＡｃ中に懸濁し、３０分間攪拌し、濾過した。次に、有機濾液を減圧濃縮し、エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.83 g、９８％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.50－7.49（m，1H），7.48－7.44（m，1H），7.18（s，1H），6.39（d，J=7.8 Hz，1H），5.53（s，2H），5.10（s，2H），4.14（q，J=7.1 Hz，2H），3.90（s，3H），3.83（s，3H），1.13（t，J=7.1 Hz，3H）
ＬＣ／ＭＳ条件：カラム：Aquity UPLC BEH C18，2.1 mm x 50 mm，1.7 μｍ 粒子；移動相Ａ：０．０５％ ＴＦＡ含有１００％水；移動相Ｂ：０．０５％ ＴＦＡ含有１００％アセトニトリル；グラジエント：１分かけて２％Ｂから９８％Ｂ、次いで９８％Ｂで０．５０分保持；流速：０．８ｍＬ/分 ＬＣ ＲＴ：０．８６分 ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３３４．２

ステップ５．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.65 g、4.95 mmol）をＣＨＣｌ_３（49.5 ml）中に溶解し、０℃に冷却した。ＮＢＳ（0.925 g、5.20 mmol）を混合物に、一度に添加した。１５分後、反応物をＣＨＣｌ_３で希釈し、１０％ Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液とともに１０分間、勢いよく攪拌した。有機相を分離し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から５０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により精製し、エチル 4－アミノ－3－ブロモ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.32 g）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４１２．２/４１４．２；ＬＣ ＲＴ＝１．０２分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.61－7.41（m，2H），6.55（d，J=8.3 Hz，1H），5.56（s，2H），5.02（s，2H），4.20（q，J=7.1 Hz，2H），3.90（s，3H），3.85（s，3H），1.15（t，J=7.1 Hz，3H）

ステップ６．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741.2 mg、収率６７．１％）、Ｋ_２ＣＯ_３（1.098 g、7.94 mmol）および2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（３．５Ｍ ＴＨＦ中）（1.816 ml、6.36 mmol）をジオキサン（26.5 ml）：水（5.30 ml）（5：1）中に懸濁した。Ｎ_２気流で反応混合物を５分間通気した後、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、さらに４分間通気し続けた後、反応物を密閉し、９０℃に加熱した。３時間後、追加量の2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（３．５Ｍ ＴＨＦ中）（0.908 ml、3.18 mmol）およびＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、反応物を１００℃で１６時間攪拌した。冷却した反応混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、ＥｔＯＡｃでさらに洗浄した。粗生成物を4 g ＣＥＬＩＴＥ（商標）上で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から３０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２ グラジエント溶出）により、期待される生成物、エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ３４８．２；ＬＣ ＲＴ＝０.８９分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.46（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），6.40（d，J=7.8 Hz，1H），5.48（s，2H），4.94－4.86（m，2H），4.14（q，J=7.0 Hz，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），2.10（s，3H），1.15－1.08（m，3H）

ステップ７．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（742 mg、2.136 mmol）をＭｅＯＨ（10.800 mL）中に懸濁し、勢いよく攪拌しながら穏やかに加熱し、前記物質を可溶化した。1,3-ビス－（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（661 mg、3.20 mmol）、続いてＡｃＯＨ（0.611 mL、10.68 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１６時間攪拌した。追加量のＡｃＯＨを添加し（0.049 mL、0.854 mmol）、次いでＲＴでさらに７２時間攪拌した後、ＮａＯＭｅ（２５％ｗｔ ＭｅＯＨ中）を添加した（5.69 mL、25.6 mmol）。３時間攪拌した後、反応混合物をＡｃＯＨで再び酸性化した。生成物を濾過により回収し、１０分間風乾し、実験用乾燥機の中で完全に乾燥させて、メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（722.0 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４０２．３；ＬＣ ＲＴ＝０．８６分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 11.58－11.17（m，2H），7.51（d，J=1.4 Hz，1H），7.49－7.42（m，1H），6.67（d，J=7.9 Hz，1H），5.67（s，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），3.71（s，3H），2.31（s，3H）

ステップ８．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（200 mg 、0.498 mmol）およびＢＯＰ（331 mg、0.747 mmol）をＤＭＦ（2491μｌ）中にＲＴで懸濁した。ブタン－1－アミン（64.0μｌ、0.648 mmol）、続いてＤＢＵ（３当量）（225 μl、1.495 mmol）を添加した後、反応混合物は均質になった。反応混合物を４０℃で１６時間攪拌した。追加量のブタン－1－アミン（64.0 μl、0.648 mmol）、ＢＯＰ（331 mg、0.747 mmol）およびＤＢＵ（３当量）（225 μl、1.495 mmol）を反応物に添加し、４０℃で２時間攪拌した後、ＲＴに冷ました。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび飽和ＮａＨＣＯ_３の間に分配した。有機層を除去し、水相を３回に分けてＥｔＯＡｃでさらに抽出した。合わせた有機物を１０％ ＬｉＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（24g ＳｉＯ_２、０から８０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）により精製し、メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（117.4 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４５７．４；ＬＣ ＲＴ＝０．８４分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 7.66（d，J=1.3 Hz，1H），7.64（dd，J=8.0，1.4 Hz，1H），7.11（d，J=7.8 Hz，1H），5.64（s，2H），4.04（s，3H），3.94（s，3H），3.86（s，3H），3.54－3.44（m，2H），2.43（s，3H），1.50（quin，J=7.3 Hz，2H），1.32－1.19（m，2H），0.94－0.87（m，3H）

ステップ９．メチル 4－（（7－（ブチルアミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（117 mg、0.256 mmol）をＴＨＦ（854 μl）中にＲＴで溶解した。ＬｉＡｌＨ_４（１Ｍ ＴＨＦ中）（256 μl、0.256 mmol）を滴下し、反応物をＲＴで２０分間攪拌した。ＬｉＡｌＨ_４（１Ｍ ＴＨＦ中）（256 μl、0.256 mmol）をさらに添加し、反応物をさらに２０分間攪拌した。反応混合物をＭｅＯＨでクエンチし、ロッシェル塩およびＥｔＯＡｃで希釈し、１６時間攪拌した。有機層を分離し、水相を３回に分けてＥｔＯＡｃでさらに抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮し、メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（86.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４２９．４；ＬＣ ＲＴ＝０．７４分（手順Ｅ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 7.04（s，1H），6.99（d，J=7.8 Hz，1H），6.91－6.86（m，1H），5.58（s，3H），4.70（s，2H），3.97（s，3H），3.81（s，3H），3.50（td，J=6.9，5.6 Hz，2H），2.54（s，3H），1.54－1.43（m，2H），1.31－1.22（m，2H），0.94－0.88（m，3H）

ステップ１０．メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（86 mg、0.201 mmol）をＴＨＦ（1004 μl）中にＲＴで溶解した。ＳＯＣｌ_２（73.2 μl、1.004 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、濃縮してメチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（57.1 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４４７．４；ＬＣ ＲＴ＝０．８９分（手順Ｅ）

ステップ１１．メチル （7－（ブチルアミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（28 mg、0.063 mmol）および1－（2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－イル）エタン－1－オン ヒドロクロライド（33.2 mg、0.188 mmol）をアセトニトリル（626 μl）中にＲＴで溶解した。ＤＩＰＥＡ（32.8 μl、0.188 mmol）を添加し、反応混合物を１６時間、５０℃に加熱した。反応混合物を濃縮し、残留物をジオキサン（0.7 mL）中に再溶解し、ＮａＯＨ溶液（10 M、125 μl、1.253 mmol）を添加した。反応混合物を３時間、８０℃に加熱し、ＲＴに冷まし、濃縮した。残留物をＤＭＦ：Ｈ_２Ｏ：ＡｃＯＨ（6：2：2、1 mL）中に溶解し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１０％Ｂで０分保持、２５分かけて１０－５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、０．８当量のＡｃＯＨを含む化合物２４４（4.7 mg）を得た。
実施例２１－化合物２６９

ステップ１．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.65 g、4.95 mmol）をＣＨＣｌ_３（49.5 ml）中に溶解し、０℃に冷却した。ＮＢＳ（0.925 g、5.20 mmol）を一度に添加した。１５分後、反応物をＣＨＣｌ_３で希釈し、１０％ Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液とともに１０分間勢いよく攪拌した。有機相を分離し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から５０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）で精製し、エチル 4－アミノ－3－ブロモ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.32 g）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４１２．２/４１４．２；ＬＣ ＲＴ＝１．０２分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.61－7.41（m，2H），6.55（d，J=8.3 Hz，1H），5.56（s，2H），5.02（s，2H），4.20（q，J=7.1 Hz，2H），3.90（s，3H），3.85（s，3H），1.15（t，J=7.1 Hz，3H）

ステップ２．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741.2 mg、収率６７．１％）、Ｋ_２ＣＯ_３（1.098 g、7.94 mmol）および2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（３．５Ｍ ＴＨＦ中）（1.816 ml、6.36 mmol）をジオキサン（26.5 ml）：水（5.30 ml）（5：1）中に懸濁した。Ｎ_２気流で反応混合物を５分間通気した後、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、さらに４分間通気し続けた後、反応槽を密閉し、９０℃に加熱した。３時間後、追加量の2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（ＴＭＢ、３．５Ｍ ＴＨＦ中；0.908 ml、3.18 mmol）およびＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、反応混合物を１００℃で１６時間攪拌した。冷却した反応混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、ＥｔＯＡｃでさらに洗浄した。粗生成物を4 g ＣＥＬＩＴＥ（商標）上で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から３０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２ グラジエント溶出）により、期待される生成物、エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ３４８．２；ＬＣ ＲＴ＝０．８９分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.46（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），6.40（d，J=7.8 Hz，1H），5.48（s，2H），4.94－4.86（m，2H），4.14（q，J=7.0 Hz，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），2.10（s，3H），1.15－1.08（m，3H）

ステップ３．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（742 mg、2.136 mmol）をＭｅＯＨ（10.800 mL）中に懸濁し、勢いよく攪拌しながら穏やかに加熱し、前記物質を可溶化した。1,3-ビス－（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（661 mg、3.20 mmol）、続いてＡｃＯＨ（0.611 mL、10.68 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１６時間攪拌した。追加量のＡｃＯＨを添加し（0.049 mL、0.854 mmol）、反応物をＲＴでさらに７２時間攪拌した後、ＮａＯＭｅ（２５％ｗｔ ＭｅＯＨ中）を添加した（5.69 mL、25.6 mmol）。３時間攪拌した後、酸性になるまで反応混合物をＡｃＯＨで再び酸性化した。生成物を濾過により回収し、１０分間風乾し、実験用乾燥機の中で完全に乾燥させてメチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（722.0 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４０２．３；ＬＣ ＲＴ＝０．８６分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 11.58－11.17（m，2H），7.51（d，J=1.4 Hz，1H），7.49－7.42（m，1H），6.67（d，J=7.9 Hz，1H），5.67（s，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），3.71（s，3H），2.31（s，3H）

ステップ４．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（300 mg 、0.747 mmol）、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）およびＢＯＰ（496 mg、1.121 mmol）をＤＭＦ（3737 μl）中にＲＴで懸濁した。ＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加した後、反応混合物は均質になり、これを４０℃に加熱した。１５分後、追加量のＤＢＵ（２当量）（225 μl、1.495 mmol）を添加し、反応物を４０℃で１６時間攪拌した。（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）、ＢＯＰ（496 mg、1.121 mmol）およびＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加し、反応物をさらに４８時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（2x）、および１０％ ＬｉＣｌ溶液（1x）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（24g ＳｉＯ_２、０から８０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２ グラジエント溶出）で精製し、次いでさらに精製（12g ＳｉＯ_２、０から７０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）し、メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（270.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ７３９．７；ＬＣ ＲＴ＝１．０４分（方法Ａ）

ステップ５．メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（500 mg、0.677 mmol）の乾燥ＴＨＦ（10 mL）およびＭｅＯＨ（3 mL）溶液に、ＬｉＢＨ_４（1.692 mL、3.38 mmol）を窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を４５℃で２４時間加熱した。反応混合物をＮＨ_４Ｃｌ水溶液およびＥｔＯＡｃの間に分配した。有機層を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をCombiFlashクロマトグラフィー（６０－１２０シリカゲル；石油エーテル中、１０－１００％ 酢酸エチル）で精製し、（S）－（4－（（5－アミノ－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（150 mg、0.230 mmol、収率34.０％）を淡黄色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ６５３．４

ステップ６：（S）－（4－（（5－アミノ－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（150 mg、0.230 mmol）のＴＨＦ（0.5 mL）攪拌溶液にＳＯＣｌ_２（0.1 ml、1.370 mmol）を添加した。反応混合物を０℃で１時間、窒素雰囲気下で攪拌し、次に減圧濃縮を行い、（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミンを淡黄色固体として得て、それ以上は精製せずに次のステップに移った。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ６７１．４

ステップ７：（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミン（150 mg、0.223 mmol）のＤＭＦ（2 mL）攪拌溶液に、2－メチル－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン－6－アミン，ＨＣｌ（72.7 mg、0.447 mmol）およびＫ_２ＣＯ_３（61.8 mg、0.447 mmol）を添加した。反応混合物を５０℃で３時間攪拌し、次いで濾過した。濾液を減圧濃縮し、（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（2－メトキシ－4－（（（2－メチル－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン－6－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミンを薄茶色がかった油として得て、それ以上は精製せずに次のステップに移った。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ７６１．５

ステップ８：（S）－N7－（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）－1－（2－メトキシ－4－（（（2－メチル－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン－6－イル）アミノ）メチル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミン（150 mg、0.197 mmol）のＭｅＯＨ（3 mL）攪拌溶液にＨＣｌ（0.3 mL、9.87 mmol）を添加した。反応混合物を０℃からＲＴで２時間、窒素雰囲気下で攪拌し、次いで減圧濃縮した。以下の条件を用いて、残留物をプレパラティブＨＰＬＣで精製し（カラム：Ascentis Express C18（50 x 2.1 mm），2.7 μｍ；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０－１００％Ｂ；流速：１．１ｍＬ/分 インジェクション２条件：カラム：Ascentis Express C18（50 x 2.1 mm），2.7 μｍ；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．１％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．１％ ＴＦＡ含有水；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０－１００％Ｂ；流速：１．１ｍＬ/分）、化合物２６９（14.6 mg、0.027 mmol、収率１３．７５％）を得た。
実施例２２－化合物２４５

ステップ１．メチル （7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（2 g、9.56 mmol）およびＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（商標）（10.16 g、28.7 mmol）をＭｅＣＮ（20 mL）中に懸濁した。酢酸（2 mL）を添加した。反応混合物を７０℃で２４時間攪拌し、冷却し、水（100 mL）に注いだ。得られた混合物をフリーザー（－２０℃）内に３０分間静置した。沈殿した生成物を濾過により回収し、水（40 mL）で洗浄し、メチル （3－フルオロ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（1311 mg、5.77 mmol、収率６０．４％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２２８．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ 13.69（s，1H），11.63（s，1H），11.26（s，1H），3.76（s，3H）

ステップ２．メチル （3－フルオロ－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（1.311 g、5.77 mmol）およびＣｓ_２ＣＯ_３（2.257 g、6.93 mmol）のＤＭＦ（5 mL）攪拌懸濁液を氷浴で冷却した。メチル 4－（ブロモメチル）－3－メトキシベンゾエート（1.495 g、5.77 mmol）のＤＭＦ（5 mL）溶液を添加した。ゆっくりとＲＴに温まるまで反応混合物をそのままにし、終夜攪拌し、濾過した。濾液をＧｅｎｅｖａｃ装置内で蒸発させた。沈殿物をＴＨＦ（100 mL）および水（100 mL）で洗浄し、濾液を別々に回収した。最終沈殿物をＤＭＦ濾液およびＴＨＦ濾液由来の乾燥物質と混ぜ合わせ、シリカ上で蒸発させ、次いでフラッシュクロマトグラフィー（80 g ＳｉＯ_２カラム、ＤＣＭ中、０から１０％ ＭｅＯＨ）を用いて精製し、メチル 4－（（3－フルオロ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1.03 g、2.54 mmol、収率４４．０％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０６．１

ステップ３．４０ｍＬシンチレーションバイアルに、メチル 4－（（3－フルオロ－7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（1013 mg、2.499 mmol）、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン（1333 mg、3.75 mmol）、ＢＯＰ（1658 mg、3.75 mmol）、ＤＢＵ（1.13 mL、7.5 mmol）およびＤＭＳＯ（10 mL）を入れた。反応混合物を６０℃で２時間攪拌し、冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（150 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 60 mL）中に抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 50 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（80 g ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から７０％ ＥｔＯＡｃ）を用いて粗製物質を精製し、メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（493 mg、0.664 mmol、収率２６．６％）を油として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝７４３．３

ステップ４．メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－フルオロ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（493 mg、0.664 mmol）のＴＨＦ（50 mL）溶液を氷浴で冷却した。ＬｉＡｌＨ_４（0.697 mL、1.394 mmol）を添加した。反応混合物を０℃で１５分間攪拌した。ロッシェル塩（20 mL、20 w/v）を添加し、１５分間ＲＴで攪拌した後、反応混合物を水（100 mL）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（3 x 50 mL）中に抽出した。合わせた有機相をブライン（3 x 40 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（24 g ＳｉＯ_２カラム、ヘキサン中、０から１００％ ＥｔＯＡｃ）を用いて粗製物質を精製し、メチル （S）－（3－フルオロ－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（125 mg、0.262 mmol、収率３９．５％）を固体として得た。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ，ｍ/ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４７７．２

ステップ５．メチル （S）－（3－フルオロ－7－（（1－ヒドロキシヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（40 mg、0.084 mmol）のＤＣＭ（2 mL）攪拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（0.044 mL、0.252 mmol）および塩化メタンスルホニル（0.013 mL、0.168 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで３０分間攪拌し、次いで蒸発乾固させた。残留物をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、tert－ブチル 2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート（33.3 mg、0.168 mmol）およびＤＩＰＥＡ（0.044 mL、0.252 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（10 mL）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（3 x 5 mL）中に抽出した。合わせた有機相をブライン（4 x 5 mL）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残留物をＤＣＭ（2 mL）中に溶解し、ＴＦＡ（0.4 mL）を添加した。反応混合物を終夜ＲＴで攪拌し、次いで蒸発乾固させた。次に残留物をジオキサン（2 mL）中に溶解した。ＮａＯＨ（0.420 mL、2.099 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で２時間攪拌し、冷却し、５Ｎ ＨＣｌで酸性化し、蒸発乾固させた。粗製物質をＤＭＦ（2 mL）中に溶解し、濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：４％Ｂで０分保持、２０分かけて４－４４％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２４５（6.1 mg、0.012 mmol、収率１４．１４％）を得た。
実施例２３－化合物２４６

ステップ１．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.65 g、4.95 mmol）をＣＨＣｌ_３（49.5 ml）中に溶解し、０℃に冷却した。ＮＢＳ（0.925 g、5.20 mmol）を反応混合物に、一度に添加した。１５分後、反応物をＣＨＣｌ_３で希釈し、１０％ Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液とともに１０分間勢いよく攪拌した。有機相を分離し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から５０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）で精製し、エチル 4－アミノ－3－ブロモ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（1.32 g）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ４１２．２/４１４．２；ＬＣ ＲＴ＝１．０２分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.61－7.41（m，2H），6.55（d，J=8.3 Hz，1H），5.56（s，2H），5.02（s，2H），4.20（q，J=7.1 Hz，2H），3.90（s，3H），3.85（s，3H），1.15（t，J=7.1 Hz，3H）

ステップ２．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741.2 mg、収率６７．１％）、Ｋ_２ＣＯ_３（1.098 g、7.94 mmol）および2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（３．５Ｍ ＴＨＦ中）（1.816 ml、6.36 mmol）をジオキサン（26.5 ml）：水（5.30 ml）（5：1）中に懸濁した。Ｎ_２気流で反応混合物を５分間通気した後、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、さらに４分間通気し続けた後、反応槽を密閉し、９０℃に加熱した。３時間後、追加量の2,4,6－トリメチル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン（３．５Ｍ ＴＨＦ中）（0.908 ml、3.18 mmol）およびＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（0.052 g、0.064 mmol）を添加し、反応混合物を１００℃で１６時間攪拌した。冷却した反応混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過し、ＥｔＯＡｃでさらに洗浄した。粗生成物を4 g ＣＥＬＩＴＥ（商標）上で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（80g ＳｉＯ_２、０から３０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２ グラジエント溶出）により、期待される生成物、エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（741 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ３４８．２；ＬＣ ＲＴ＝０．８９分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 7.49（d，J=1.5 Hz，1H），7.46（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），6.40（d，J=7.8 Hz，1H），5.48（s，2H），4.94－4.86（m，2H），4.14（q，J=7.0 Hz，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），2.10（s，3H），1.15－1.08（m，3H）

ステップ３．エチル 4－アミノ－1－（2－メトキシ－4－（メトキシカルボニル）ベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾール－5－カルボキシレート（742 mg、2.136 mmol）をＭｅＯＨ（10.800 mL）中に懸濁し、勢いよく攪拌しながら穏やかに加熱し、前記物質を可溶化した。1,3-ビス－（メトキシカルボニル）－2－メチル－2－チオシュードウレア（661 mg、3.20 mmol）、続いてＡｃＯＨ（0.611 mL、10.68 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１６時間攪拌した。追加量のＡｃＯＨを添加し（0.049 mL、0.854 mmol）、反応物をＲＴでさらに７２時間攪拌した後、ＮａＯＭｅ（２５％ｗｔ ＭｅＯＨ中）を添加した（5.69 mL、25.6 mmol）。３時間攪拌した後、酸性になるまで反応混合物をＡｃＯＨで再び酸性化した。生成物を濾過により回収し、１０分間風乾し、実験用乾燥機の中で完全に乾燥させてメチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（722.0 mg）をクリーム色の固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ(Ｍ＋Ｈ） ４０２．３；ＬＣ ＲＴ＝０．８６分（方法Ａ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ 11.58－11.17（m，2H），7.51（d，J=1.4 Hz，1H），7.49－7.42（m，1H），6.67（d，J=7.9 Hz，1H），5.67（s，2H），3.90（s，3H），3.84（s，3H），3.71（s，3H），2.31（s，3H）

ステップ４．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（300 mg、0.747 mmol）、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）およびＢＯＰ（496 mg、1.121 mmol）をＤＭＦ（3737 μl）中にＲＴで懸濁した。ＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加した後、反応混合物は均質になり、これを４０℃に加熱した。１５分後、追加量のＤＢＵ（２当量）（225 μl、1.495 mmol）を添加し、反応物を４０℃で１６時間攪拌した。（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ（381 mg、0.972 mmol）、ＢＯＰ（496 mg、1.121 mmol）およびＤＢＵ（４当量）（451 μl、2.99 mmol）を添加し、反応物をさらに４８時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（2x）、および１０％ ＬｉＣｌ溶液（1x）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（24g ＳｉＯ_２、０から８０％ ＥｔＯＡｃ－ＣＨ_２Ｃｌ_２ グラジエント溶出）で精製し、次いでさらに精製（12g ＳｉＯ_２、０から７０％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出）し、メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（270.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ７３９．７；ＬＣ ＲＴ＝１．０４分（方法Ａ）

ステップ５．メチル （S）－4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（270 mg、0.365 mmol）をＴＨＦ（3654 μl）中にＲＴで溶解した。ＬｉＡｌＨ_４（731 μl、0.731 mmol）を５分かけて滴下した。反応混合物を１５分間ＲＴで攪拌し、ＭｅＯＨおよびロッシェル塩でクエンチした。ＥｔＯＡｃを添加し、層が透明になるまで混合物を３時間攪拌した。有機相を除去し、水層を３回に分けてＥｔＯＡｃでさらに抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（12g ＳｉＯ_２、０から１００％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン グラジエント溶出、次いで０から２０％ ＭｅＯＨ－ＣＨ_２Ｃｌ_２）により、期待される物質、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシルメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（61.7 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ７１１．４；ＬＣ ＲＴ＝１．０８分（方法Ａ）

ステップ６．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（60 mg、0.084 mmol）をＣＨ_２Ｃｌ_２（844 μl）中にＲＴで溶解した。ＳＯＣｌ_２（30.8 μL、0.422 mmol）を添加し、反応物を 時間攪拌した。濃縮して、期待される生成物、メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（56.6 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ７２９．３；ＬＣ ＲＴ＝１．１８分（方法Ａ）

ステップ７．メチル （S）－（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（45 mg、0.02 mmol）をアセトニトリル（620 μL）中にＲＴで溶解した。tert－ブチル 2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート，ＨＣｌ（29.0 mg、0.123 mmol）、続いてＤＩＰＥＡ（21.55 μl、0.123 mmol）を添加した。反応混合物を８０℃で１６時間加熱し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（4g ＳｉＯ_２、０－５％ ＭｅＯＨ－ＣＨ_２Ｃｌ_２グラジエント）で精製した。いくつかの副生成物をカラムに通し、部分的に精製されたtert－ブチル （S）－6－（4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンジル）－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート（42 mg）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ） ８９２．７；ＬＣ ＲＴ＝０．９９５分（方法Ａ）

ステップ８．tert－ブチル （S）－6－（4－（（7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－3－メチル－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンジル）－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート（42 mg、0.047 mmol）をＣＨ_２Ｃｌ_２（471 μl）中にＲＴで溶解した。ＴＦＡ（100 μL）を添加した。２時間後、反応物をＮ_２気流下で濃縮し、ジオキサン（470 μL）中に再溶解した。トリエチルアミントリヒドロフルオライド（16.79 μL、0.103 mmol）を添加し、反応物を７０℃に加熱した。４５分後、１０Ｍ ＮａＯＨ水溶液（61.3 μl、0.613 mmol）を添加した。反応混合物を７０℃で１６時間攪拌し、ＡｃＯＨ（54 μL）でクエンチし、Ｎ_２気流下で濃縮し、ＤＭＦ－Ｈ_２Ｏで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１％Ｂで０分保持、２０分かけて１－４１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。生成物を含むフラクション－収集はＭＳシグナルによりトリガーされた－を混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２４６（2.9 mg）を得た。
実施例２４－化合物２４７

ステップ１．メチル 4－（（7－ヒドロキシ－5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（510 mg、1.32 mmol；US 2020/0038403 A1、図２Ａ、化合物１６）のＤＭＳＯ（6.6 mL）溶液を（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（236 mg、1.58 mmol）、ＢＯＰ（698 mg、1.58 mmol）およびＤＢＵ（595 μL、3.95 mmol）で処理した。反応物をＲＴで攪拌した。１６時間後、追加量の（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（50 mg、0.33 mmol）、ＢＯＰ（50 mg、0.11 mmol）およびＤＢＵ（200 μL、1.33 mmol）を添加し、反応物をＲＴで２時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（4x）で洗浄した。有機層をＣＥＬＩＴＥ（商標）上に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（100g C18 gold column；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；流速：６０ｍＬ/分、２０－６０％グラジエント）で精製した。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、ＨＣｌ（１Ｍ Ｈ_２Ｏ中、2 mL、2 mmol）で処理し、減圧濃縮して、メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（382 mg、収率６０％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ 9.72－9.70（m，1H），7.96－7.94（m，1H），7.83－7.76（m，1H），7.49（d，J=1.4 Hz，1H），7.46（dd，J=7.8，1.5 Hz，1H），6.74（d，J=7.8 Hz，1H），5.79（s，2H），4.86（d，J=5.8 Hz，2H），3.86（s，3H），3.84（s，3H），3.60（s，3H），2.54（s，3H）
ＬＣ ＲＴ：０．６４分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４８３．３（方法Ｅ）

ステップ２．メチル 3－メトキシ－4－（（5－（（メトキシカルボニル）アミノ）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）ベンゾエート（382 mg、0.791 mmol）のジオキサン（9.0 mL）溶液をＮａＯＨ（１０Ｍ 水溶液、0.32 mL、3.2 mmol）で処理し、４０℃に加熱した。３０分後、温度を６０℃に上昇させた。追加量のＮａＯＨ（１０Ｍ水溶液、450 μL、3 mmol）およびＭｅＯＨ（1 mL）を６時間かけて反応混合物に添加した。反応混合物をＲＴに冷まし、ＨＯＡｃで中和し、減圧濃縮した。粗生成物をＭｅＯＨ中に溶解し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＨＰＬＣで精製した：カラム：Axia C18 100 mm x 30 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：10：90 メタノール：０．１％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：90：10 メタノール：０．１％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：１５％Ｂで０分保持、１０分かけて１５－３０％Ｂ、次いで３０％Ｂで４分保持；流速：４０ｍＬ/分；２２０ｎｍでＵＶ検出；カラム温度：２５℃。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、ＨＣｌ（１Ｍ Ｈ_２Ｏ中、2 mL、2 mmol）で処理し、減圧濃縮して、4－（（5－アミノ－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸・ＨＣｌ（98.9 mg、収率２８％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 13.23－12.93（m，1H），12.67－12.43（m，1H），9.06－8.92（m，1H），8.03－7.87（m，2H），7.83（s，1H），7.51－7.46（m，2H），6.98（d，J=8.2 Hz，1H），5.80（s，2H），4.91（d，J=5.7 Hz，2H），3.82（s，3H），2.57（s，3H） ＬＣ ＲＴ：０．５２分
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４１１．３（方法Ｅ）

ステップ３．4－（（5－アミノ－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシ安息香酸・ＨＣｌ（25 mg、0.056 mmol）のＤＭＦ（0.6 mL）溶液を、2－メチル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン・２ＨＣｌ（20.7 mg、0.112 mmol）、ＤＩＥＡ（68 μL、0.39 mmol）および2,4,6－トリプロピル－1,3,5,2,4,6-トリオキサトリホスホリナン－2,4,6-トリオキシド（ＥｔＯＡｃ中、５０％溶液、67 μL、0.11 mmol）で処理した。反応物をＲＴで攪拌した。１６時間後、反応混合物をＤＭＦ（1 mL）およびＨ_２Ｏ（0.2 mL）で希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２６分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２４７をビスＴＦＡ塩として得た（20.5 mg、収率７２％）。

化合物２４８を類似的に調製した。
実施例２５－化合物２５４

ステップ１：メチル（7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（700 mg、1.95 mmol；US 2020/0038403 A1；図７、化合物６４）のＤＭＳＯ（9.7 mL）溶液を、（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（379 mg、2.53 mmol）、ＢＯＰ（129 mg、2.92 mmol）およびＤＢＵ（1.0 mL、6.8 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、ＤＣＭで希釈し、Ｈ_２Ｏで洗浄した。有機層をＨ_２Ｏ（6x）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。残留物をＤＣＭ/ＭｅＯＨ中に溶解し、ＣＥＬＩＴＥ（商標）上に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（100g C18 gold column；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；流速：６０ｍＬ/分、１０－５０％グラジエント）で精製した。精製した生成物をＤＣＭ中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、メチル （1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（372 mg、収率４２％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.69－9.66（m，1H），7.89（s，1H），7.76（t，J=5.8 Hz，1H），6.95（s，1H），6.81－6.77（m，1H），6.76－6.70（m，1H），5.69（s，2H），5.17（t，J=5.7 Hz，1H），4.89（d，J=5.7 Hz，2H），4.45（d，J=5.8 Hz，2H），3.77（s，3H），3.60（s，3H），2.56（s，3H）
ＬＣ ＲＴ：０．５６分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ４５５．３（方法Ｅ）

ステップ２：メチル （1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（372 mg、0.818 mmol）のＤＣＭ（8.2 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（179 μL、2.46 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで１０分間攪拌し、減圧濃縮した。残留物をＤＣＭ中に再溶解し、減圧濃縮して、メチル （1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（387 mg、１００％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 11.82－11.60（m，1H），9.40－9.21（m，1H），8.12－8.08（m，1H），7.10（s，1H），7.04－6.95（m，2H），5.81（s，2H），5.02（br d，J=5.3 Hz，2H），4.74（s，2H），3.80（s，3H），3.75（s，3H），2.60（s，3H） ＬＣ ＲＴ：０．７０分
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４７３．３（方法Ｅ）

ステップ３：メチル （1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（45 mg、0.095 mmol）のＤＭＦ（1.9 mL）溶液を、ＤＩＥＡ（83 μL、0.48 mmol）および2－チア－6－アザスピロ［3.3］ヘプタン 2,2－ジオキシド・ＨＣｌ（26.2 mg、0.143 mmol）で処理した。反応混合物を６０℃で６時間攪拌し、減圧濃縮した。残留物をジオキサン（0.7 mL）中に溶解し、ＮａＯＨ（１０Ｍ 水溶液、76 μL、0.76 mmol）で処理し、６０℃に５時間加熱した。反応混合物をＲＴで、ＨＯＡｃで中和し、減圧濃縮した。粗生成物をＤＭＦおよびＨ_２Ｏ中に溶解し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１％Ｂで０分保持、２０分かけて１－４１％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。以下の条件を用いて、分離した生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳでさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２５４（11.7 mg、１６％）を得た。
実施例２６－化合物２６３

ステップ１．メチル 4－（（5－（（tert－ブトキシカルボニル）アミノ）－7－ヒドロキシ－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシベンゾエート（685 mg、1.59 mmol；US 2020/0038403 A1、図８、化合物７１）のＴＨＦ（16 mL）溶液を０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ_４（１Ｍ ＴＨＦ中、2.8 mL、2.8 mmol）で処理した。反応混合物を１５分間、０℃で攪拌し、Ｈ_２Ｏおよびロッシェル塩（飽和水溶液）でクエンチし、ＲＴで３時間攪拌した。有機層をＣＥＬＩＴＥ（商標）上に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（24g ＳｉＯ_２；０から２０％ ＭｅＯＨ－ＤＣＭ グラジエント溶出）で精製し、tert－ブチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（460 mg、収率７２％）を得た。
^１Ｈ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 11.69－11.43（m，1H），10.95－10.62（m，1H），7.87－7.79（m，1H），6.97（s，1H），6.77（d，J=7.7 Hz，1H），6.59（d，J=7.8 Hz，1H），5.66（s，2H），5.16（t，J=5.8 Hz，1H），4.45（d，J=5.8 Hz，2H），3.79（s，3H），1.49（s，9H）
ＬＣ ＲＴ：０．７７分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４０２．２（方法Ｅ）

ステップ２．tert－ブチル （7－ヒドロキシ－1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（460 mg、1.15 mmol）のＤＭＳＯ（5.7 mL）溶液を、（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メタンアミン・ＨＣｌ（223 mg、1.49 mmol）、ＢＯＰ（760 mg、1.72 mmol）およびＤＢＵ（0.69 mL、4.6 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで２時間攪拌し、ＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏ（2x）で洗浄した。有機層をＣＥＬＩＴＥ（商標）上に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（100g C18 gold column；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；流速：６０ｍＬ/分、３０－５０％グラジエント）で精製した。精製した生成物をＤＣＭ中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、tert－ブチル （1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（190 mg、収率３３％）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 9.24－9.15（m，1H），7.87（s，1H），7.72（t，J=5.8 Hz，1H），6.95（s，1H），6.82－6.75（m，1H），6.73－6.68（m，1H），5.68（s，2H），5.17（t，J=5.7 Hz，1H），4.87（d，J=5.7 Hz，2H），4.44（d，J=5.7 Hz，2H），3.76（s，3H），2.55（s，3H），1.43（s，9H）
ＬＣ ＲＴ：０．７５分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４９７．２（方法Ｅ）

ステップ３．tert－ブチル （1－（4－（ヒドロキシメチル）－2－メトキシベンジル）－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（91.5 mg、0.184 mmol）のジオキサン（0.6 mL）溶液をＨＣｌ（４Ｍ ジオキサン中、0.69 mL、2.8 mmol）で処理し、４０℃で９０分間攪拌し、濃縮した。残留物をＤＣＭ中に溶解し、減圧濃縮して、（4－（（5－アミノ－7－（（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール（73.1 mg、収率１００％）を得た。
ＬＣ ＲＴ：０．６５分 ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３９７．１（方法Ｅ）

ステップ４．1－（4－（クロロメチル）－2－メトキシベンジル）－N7－（（5－メチル－1,2,4－オキサジアゾール－3－イル）メチル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5,7－ジアミン（27 mg、0.065 mmol）のＤＭＳＯ（1.3 mL）溶液を、ＤＩＥＡ（57 μL、0.33 mmol）および2－イソプロピル－2,6－ジアザスピロ［3.3］ヘプタン（14 mg、0.098 mmol）で処理した。反応混合物を６５℃で３０分間攪拌し、ＤＭＳＯで希釈し、ＰＴＦＥフリットに通して濾過し、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２６３（13.7 mg、３５％）を酢酸塩として得た。

化合物２６４を類似的に調製した。
実施例２７－化合物２４９

ＤＭＦ（1 mL）中、化合物８３５（20 mg、0.042 mmol）およびアセトアルデヒド（183 mg、0.083 mmol）の混合物を、酢酸（0.024 mL、0.416 mmol）および２０ｍｇの４Åモレキュラーシーブ、続いてナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（35.3 mg、0.166 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌した。酢酸（0.024 mL、0.416 mmol）を蒸発させた。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：３％Ｂで０分保持、２５分かけて３－４３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。以下の条件を用いて、前記物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳでさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２５分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的の化合物２４９を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。

化合物２５２および化合物２５３を類似的に調製した。
実施例２８－化合物２５５

ステップ１．（4－（（5－アミノ－7－（ブチルアミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－1－イル）メチル）－3－メトキシフェニル）メタノール ８１８（400 mg、1.122 mmol）のＴＨＦ（2 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.164 mL、2.244 mmol）で処理し、ＲＴで１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗製塩化物２をそれ以上は精製せずに次のステップに移った。

ステップ２．塩化物２のＤＭＳＯ溶液をアミン３（市販されている、ＣＡＳ：２３６４０６－５５－６）で処理し、８０℃で２時間加熱してからＬＣＭＳにかけたところ、反応の完了を示した。反応混合物をＴＦＡで処理し、１時間攪拌した。ＴＦＡを蒸発させた。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳでさらに精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：４％Ｂで０分保持、２０分かけて４－４４％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的の化合物２５５を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２５６、化合物２５７、化合物２５８、化合物２６５、および化合物２６６。
実施例２９－化合物２５９

化合物２５５（18 mg、0.039 mmol）のＤＭＦ（0.5 mL）溶液をＫ_２ＣＯ_３（16.06 mg、0.116 mmol）／2－ブロモエタン－1－オール（5.49 μl、0.077 mmol）で処理し、５０℃で２時間加熱した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：０．０５％ ＴＦＡ含有水；グラジエント：０％Ｂで０分保持、２０分かけて０－４０％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的の化合物２５９を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２６０、化合物２６１、化合物２６２、化合物２６７、および化合物２６８。
実施例３０－化合物２７０

ステップ１．（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メタノール（Sigma－Aldrich）（2.462 g、11.29 mmol）の、０℃のＣＨ_２Ｃｌ_２（113 ml）溶液にＳＯＣｌ_２（1.235 ml、16.94 mmol）を滴下した。反応物をＲＴで１時間攪拌し、減圧濃縮した。残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２と混合し、減圧濃縮して（2x）、粗製5－ブロモ－2－（クロロメチル）－3－メトキシピリジンを得た。この物質をそれ以上は精製せずに使用した。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ２３６/２３８［Ｍ＋Ｈ］^＋

ステップ２．メチル （7－ヒドロキシ－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（3.44 g、10.26 mmol）の、ＲＴのＤＭＦ（45.6 ml）懸濁液にＣｓ_２ＣＯ_３（13.37 g、41.0 mmol）を添加した。混合物を０℃で１０分間攪拌し；次いでステップ１由来の粗製物質のＤＭＦ（22.80 ml）溶液を添加した。反応混合物を０℃で１時間攪拌した。冷却槽を取り除き、ＲＴで２０時間攪拌し続けた。反応混合物をＨ_２Ｏ（250 mL）に添加し、得られた混合物をＲＴで静置した。固体を真空濾過により回収し、Ｈ_２Ｏ（3 x 15 mL）、ＭｅＯＨ（2 x 15 mL）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（15 mL）、およびヘキサン（15 mL）で洗浄し、メチル （1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－ヒドロキシ－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（4.431 g、８１％）を得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ５３５/５３７［Ｍ＋Ｈ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－d_６）δ 13.19－12.96（m，1H），8.95－8.80（m，1H），8.06（s，1H），7.71（s，1H），5.87－5.65（m，2H），3.89（s，3H），3.53（br s，3H）

ステップ３．メチル （1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－ヒドロキシ－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.990 g、1.850 mmol）の、ＲＴのＤＭＳＯ（12.33 ml）懸濁液に、（S）－1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－アミン，ＨＣｌ塩（0.870 g、2.220 mmol）（US 2020/0038403 A1、図８、化合物７１ａ）、続いて1,8－ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ－7－エン（1.245 ml、8.33 mmol）および（ベンゾトリアゾール－1－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（0.982 g、2.220 mmol）を添加した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、ＥｔＯＡｃ（100 mL）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（100 mL）で洗浄した。分液操作を行い、水層をＥｔＯＡｃ（100 mL）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液（100 mL）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィー（80 g シリカゲル；リニアグラジエント ０－１００％ ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）により精製し、メチル （S）－（1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（810 mg、５０％）を黄色の泡沫として得た。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ８７２/８７４［Ｍ＋Ｈ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－d_６）δ 9.69（s，1H），7.92（d，J=1.8 Hz，1H），7.79（d，J=1.8 Hz，1H），7.57－7.53（m，2H），7.50－7.46（m，2H），7.42－7.31（m，4H），7.25－7.20（m，2H），7.12（d，J=8.3 Hz，1H），5.78－5.69（m，2H），4.64－4.55（m，1H），3.91（s，3H），3.70－3.64（m，2H），3.58（s，3H），1.90－1.82（m，2H），1.57－1.48（m，2H），1.25－1.13（m，2H），0.92（s，9H），0.81（t，J=7.3 Hz，3H）

ステップ４．ＭｅＯＨ（9.28 ml）およびＡｃＯＨ（9.28 ml）の混合物中、メチル （S）－（1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（0.810 g、0.928 mmol）の、０℃の溶液に亜鉛（0.607 g、9.28 mmol）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌し、ＭｅＯＨ（10 mL）およびＥｔＯＡｃ（50 mL）で洗浄しながらＣＥＬＩＴＥ（商標）に通して濾過した。濾液をＥｔＯＡｃ（200 mL）で希釈した。攪拌しながら、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（250 mL）を、この溶液にゆっくりと添加した（添加速度を調節してガス発生速度を制御した）。分液操作を行い、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液（250 mL）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、粗生成物、メチル （S）－（1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメートを得た。この物質をそれ以上は精製せずに使用した。
ＬＣ－ＭＳ ｍ/ｚ ７４６/７４８［Ｍ＋Ｈ］^＋

ステップ５．窒素ガスで、化合物５（500 mg、0.670 mmol）、化合物６（304 mg、0.870 mmol、ＣＡＳ ２２４０１８７-７８-２）およびＫ_２ＣＯ_３（370 mg、2.68 mmol）のＤＭＦ（2 mL）溶液を２分間通気した。ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（54.7 mg、0.067 mmol）を添加し、反応混合物をＮ_２で１分間、再度通気した。反応フラスコを密閉し、７０℃で５時間加熱した。50 g シリカゲルカラムで、０－５０％ ＭｅＯＨ/ＤＣＭで溶出させて精製し、４７６ｍｇの化合物７を得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝８８９．５
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 8.02（s，5H），7.92（d，J = 19.1 Hz，1H），7.63－7.50（m，3H），7.37－7.23（m，2H），7.22－7.14（m，2H），7.04（s，1H），6.62（d，J = 2.6 Hz，1H），5.64（dd，J = 14.7，1.4 Hz，1H），5.39（d，J = 14.9 Hz，1H），4.63（s，1H），3.95（d，J = 2.0 Hz，2H），3.82（d，J = 7.5 Hz，3H），3.57（s，1H），3.31－3.21（m，1H），2.96（s，7H），2.88（s，7H），2.49（s，1H），1.95（d，J = 17.4 Hz，1H），1.47（s，5H），1.52－1.36（m，2H），1.26（d，J = 13.9 Hz，5H），1.02（s，3H），1.04－0.90（m，2H）

ステップ６－７．固体化合物７（476 mg、0.535 mmol）を、ＲＴで２時間攪拌しながらジオキサン（1.338 mL、5.35 mmol）中、ＨＣｌで処理し、次いでＬＣ／ＭＳにかけたところ、反応の完了を示した。Ｖ－１０エバポレーターを用いてＨＣｌを蒸発させた。粗生成物８を１ｍＬジオキサン中に溶解し、ＮａＯＨ水溶液（1.071 mL、10.71 mmol）とともに２時間加熱し、次いでＬＣ／ＭＳにかけたところ、反応の完了を示した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：３％Ｂで０分保持、２０分かけて３－４３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。化合物２７２（（3S）－3－（{5－アミノ－1－［（5－{7－アザスピロ［3.5］ノン－1－エン－2－イル}－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル］－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－7－イル}アミノ）ヘキサン－1－オール）を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。

ステップ８．化合物２７２（40 mg、0.081 mmol）、テトラヒドロ－4H－ピラン－4－オン（37.5 μl、0.406 mmol）のＤＭＡ（1 mL）溶液を、酢酸（46.5 μL、0.812 mmol）、続いて５０ｍｇの顆粒４Åモレキュラーシーブおよびナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（86 mg、0.406 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで終夜攪拌し、シリンジ濾過した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：７％Ｂで０分保持、２０分かけて７－４７％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２７３ （（3S）－3－{［5－アミノ－1－（{3－メトキシ－5－［7－（オキサン－4－イル）－7－アザスピロ［3.5］ノン－1－エン－2－イル］ピリジン－2－イル}メチル）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－7－イル］アミノ}ヘキサン－1－オール）を得た。

ステップ９．水素ガスで、化合物２７３（18 mg、0.026 mmol）のＭｅＯＨ（1 mL）溶液およびＰｄ/Ｃ（2.73 mg、0.026 mmol）を１分間通気した。反応混合物を６０℃で、水素バルーンの雰囲気下で２時間加熱した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：７％Ｂで０分保持、２０分かけて７－４７％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、化合物２７を得た。

以下の化合物を類似的に調製した：化合物２７４、化合物２７５、および化合物２７８。
実施例３１－化合物２７１

ステップ１．メチル （S）－（1－（（5－ブロモ－3－メトキシピリジン－2－イル）メチル）－7－（（1－（（tert－ブチルジフェニルシリル）オキシ）ヘキサン－3－イル）アミノ）－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート（552 mg、0.739 mmol）、tert－ブチル 7－（4,4,5,5－テトラメチル－1,3,2－ジオキサボロラン－2－イル）－2－アザスピロ［3.5］ノン－6－エン－2－カルボキシレート １（336 mg、0.961 mmol；ＣＡＳ ２３５２７６－１３－４）およびＫ_２ＣＯ_３（409 mg、2.96 mmol）のＤＭＦ（5 mL）溶液をＮ_２で２分間通気した。ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）－ＣＨ_２Ｃｌ_２付加物（60.4 mg、0.074 mmol）を添加し、再度Ｎ_２で１分間通気した。反応槽を密閉し、７０℃で５時間加熱した。50 g シリカゲルカラムで、０－５０％ ＭｅＯＨ/ＤＣＭで溶出させて精製し、４７７ｍｇの化合物２を得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝８８９．５
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ 8.70（d，J = 8.1 Hz，1H），8.04－7.95（m，1H），7.87（s，1H），7.65－7.58（m，2H），7.58－7.51（m，2H），7.40－7.31（m，1H），7.33－7.24（m，3H），7.21－7.12（m，3H），7.08（s，1H），6.02（s，1H），5.63（d，J = 14.9 Hz，1H），5.40（d，J = 15.0 Hz，1H），4.58（s，1H），3.94（s，3H），3.85－3.74（m，4H），3.73－3.64（m，2H），3.62（d，J = 8.3 Hz，2H），3.49（s，2H），2.95（s，1H），2.88（s，1H），2.41（d，J = 4.3 Hz，4H），2.02（dd，J = 13.0，6.2 Hz，0H），1.95（s，1H），1.91（d，J = 5.7 Hz，1H），1.45（s，6H），1.45－1.36（m，1H），1.24（s，6H），1.04（d，J = 8.8 Hz，0H），1.03（s，6H），1.02（s，1H），0.94（t，J = 7.3 Hz，3H）

ステップ２．化合物２（90 mg、0.101 mmol）をＴＦＡ（0.078 mL、1.012 mmol）で処理した。反応混合物をＲＴで３０分間攪拌した。ＴＦＡをＶ－１０エバポレーター中で蒸発させた。残留物をＤＭＡ（0.5 mL）中に溶解し、テトラヒドロ－4H－ピラン－4－オン（0.028 mL、0.506 mmol）、酢酸（0.029 mL、0.506 mmol）、５０ｍｇの４Åモレキュラーシーブ、および最後にナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（107 mg、0.506 mmol）で処理した。ＲＴで１時間撹拌した後、反応混合物をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（0.165 mL、1.012 mmol）で処理し、ＲＴで２時間攪拌した。50 g 逆相ISCOで、０－５０％ ＭｅＣＮ/水（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて、反応混合物を直接精製し、化合物３を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝６３５．３

ステップ３、パート１．化合物（58 mg、0.091 mmol）のＤＭＳＯ（0.5 mL）溶液をＮａＯＨ（0.091 mL、0.914 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱して、脱カルバモイル化した化合物３を得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝５７７．３

ステップ３、パート２．脱カルバモイル化した化合物３（12 mg、0.021 mmol）の、Ｐｄ－Ｃ（2.214 mg、0.021 mmol）含有ＭｅＯＨ（1 mL）溶液をＨ_２で１分間通気した。反応混合物を水素バルーン雰囲気下で、６０℃で２時間加熱した。以下の条件を用いて、粗生成物をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、４．７ｍｇの化合物２７１を得た。

化合物２７７を類似的に調製した。
実施例３２－化合物２５０

ステップ１．ベンジル 6－ヒドロキシ－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン－2－カルボキシレート １（ＣＡＳ＃１３６３３８３－３２－７；3 g、12.13 mmol）のＤＣＭ（20 mL）溶液を、トリエチルアミン（2.029 mL、14.56 mmol）、ＤＭＡＰ（0.296 g、2.426 mmol）およびトシル－Ｃｌ（2.54 g、13.34 mmol）で、０℃で処理した。２時間かけて反応を進行させた。反応物を５０ｍＬの水でクエンチし、５０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ水溶液、ブライン（50 mL）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗製トシル化中間体を黄色がかった残留物として得た。これをＤＭＳＯ（20 mL）中に溶解し、ヨウ化ナトリウム（5.46 g、36.4 mmol）で処理した。１２０℃で２時間にわたって加熱した後、反応混合物を５０ｍＬのＥｔＯＡｃ中に溶解し、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（50 mL）、水（50 mL）、ブライン（50 mL）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。濾過、濃縮し、80 g シリカゲルカラムで、０－５０％ ＥｔＯＡｃ/ヘキサンで溶出させて精製し、化合物２を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３５７．９
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.42－7.27（m，5H），5.01（s，2H），4.43（p，J = 7.9 Hz，1H），3.96（s，4H），2.92（ddd，J = 10.4，7.5，3.1 Hz，2H），2.74－2.61（m，2H）

ステップ２．化合物２（1649 mg、4.62 mmol）の４ｍＬ ＴＨＦ溶液を、乾燥機で乾燥させた丸底フラスコ内のＴＨＦ（12.08 mL、9.23 mmol）中、Ｒｉｅｋｅ亜鉛に、Ｎ_２下で添加した。フラスコの温度が上昇し、亜鉛試薬３の生成を示した。反応混合物をＲＴで１時間攪拌し、今後の使用のためにＮ_２下に保った

ステップ３．5－ブロモ－2－（（（tert－ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）－3－メトキシピリジン（1.4 g、4.21 mmol）、1,1'－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（II） ジクロロメタン錯体（0.308 g、0.421 mmol）およびヨウ化銅（Ｉ）（0.160 g、0.843 mmol）のＤＭＦ（10 mL）溶液を、Ｎ_２で１分間通気した。（2－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－2－アザスピロ［3.3］ヘプタン－6－イル）亜鉛（II） アイオダイド ３（17.49 mL、5.06 mmol）を添加した。反応混合物を７０℃で 時間加熱した。この溶液をトリエチルアミントリヒドロフルオライド（1.372 mL、8.43 mmol）で処理し、終夜攪拌した。ＬＣＭＳは化合物５（167 mg、0.453 mmol、収率１０．７６％）の生成を示した。150 g 逆相Ｃ－１８カラムで、０－５０％ ＭｅＣＮ/水（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて反応物を直接精製し、目的のフラクションを収集し、化合物５を淡黄色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３６９．２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 8.08（s，1H），7.81（s，1H），7.43－7.28（m，5H），5.04（s，2H），4.71（s，2H），4.11（s，2H），3.66－3.56（m，3H），3.61－3.48（m，1H），2.58（ddt，J = 10.6，8.4，2.5 Hz，2H），2.41（td，J = 9.5，2.9 Hz，2H），1.84－1.70（m，3H）

ステップ４－５．化合物５（167 mg、0.453 mmol）のＴＨＦ（1 mL）溶液をＳＯＣｌ_２（0.066 mL、0.907 mmol）で処理し、ＲＴで３０分間攪拌した。溶媒をＶ－１０エバポレーターで蒸発させた。１ｍＬ ＤＭＦ中の粗生成物６を、メチル （7－ヒドロキシ－3－ヨード－1H－ピラゾロ［4,3－d］ピリミジン－5－イル）カルバメート ７（152 mg、0.453 mmol）およびＣｓ_２ＣＯ_３（295 mg、0.907 mmol）の、１ｍＬのＤＭＦ溶液に添加した。６０℃で２時間加熱した後、反応物を濾過し、50 g 逆相Ｃ－１８カラムで、０－５０％ ＭｅＣＮ/水（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて直接精製した。目的のフラクションを凍結乾燥し、化合物８を淡黄色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝８８６．１

ステップ６－７．化合物８（140 mg、0.204 mmol）および（S）－3－アミノヘキサン－1－オール ９（47.9 mg、0.408 mmol）のＤＭＳＯ（1 mL）溶液をＤＢＵ（0.092 mL、0.613 mmol）、続いてＢＯＰ（135 mg、0.306 mmol）で処理した。４０℃で１時間加熱した後、ＬＭＣＳにかけたところ反応の完了を示し、中間体１０を得た。反応混合物をＮａＯＨ（0.204 mL、2.042 mmol）で処理し、８０℃で２時間加熱した。50 g Ｃ－１８逆相カラムで、０－５０％ ＭｅＣＮ/水（０．０５％ ＴＦＡ）で溶出させて、反応混合物を直接精製した。目的のフラクションを凍結乾燥し、化合物１１を淡黄色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝５９３．１

ステップ８．化合物１１（30 mg、0.051 mmol）のＭｅＯＨ（1 mL）溶液を、Ｐｄ－Ｃ（5.39 mg、0.051 mmol）とともに、Ｈ_２（10.21 mg、5.06 mmol）で１分間通気した。反応混合物を５０℃で、Ｈ_２バルーン下で２時間加熱した。以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：６％Ｂで０分保持、２０分かけて６－４６％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、７．６ｍｇの化合物１２を得た。
ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４６６．９
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ 7.93（s，2H），7.90（d，J = 1.6 Hz，1H），7.51（d，J = 7.6 Hz，1H），7.43（d，J = 8.6 Hz，1H），5.96（s，1H），5.71－5.59（m，3H），4.43（s，2H），4.11（s，1H），3.90（d，J = 6.9 Hz，3H），2.68（d，J = 9.9 Hz，0H），2.57（d，J = 22.7 Hz，2H），2.35（d，J = 14.2 Hz，2H），2.24（s，1H），1.92（s，1H），1.78（d，J = 6.3 Hz，2H），1.77－1.69（m，2H），1.58（s，4H），1.29（s，2H），0.91－0.84（m，3H）

ステップ９．化合物１２（30 mg、0.064 mmol）およびテトラヒドロ－4H－ピラン－4－オン（0.012 mL、0.129 mmol）のＤＭＦ（0.5 mL）溶液を、２滴の酢酸および５０ｍｇの４Åモレキュラーシーブ並びにナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（54.5 mg、0.257 mmol）で処理した。ＲＴで１時間撹拌した後、以下の条件を用いて、粗製物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳで精製した：カラム：XBridge C18、200 mm x 19 mm、５μｍ粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：１３％Ｂで０分保持、２０分かけて１３－５３％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳおよびＵＶシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させた。以下の条件を用いて、前記物質をプレパラティブＬＣ／ＭＳでさらに精製した：カラム：XBridge Phenyl、200 mm x 19 mm、５μｍ 粒子；移動相Ａ：5：95 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；移動相Ｂ：95：5 アセトニトリル：ＮＨ_４ＯＡｃ含有水；グラジエント：９％Ｂで０分保持、２０分かけて９－４９％Ｂ、次いで１００％Ｂで０分保持；流速：２０ｍＬ/分；カラム温度：２５℃。フラクション収集はＭＳシグナルによりトリガーされた。目的物を含むフラクションを混ぜ合わせ、遠心蒸発で乾燥させ、１．９ｍｇの化合物２５０を得た。

化合物２５１を類似的に調製した。
実施例３３－出発物質および中間体

下記のチャートは、本明細書に開示されるＴＬＲ７アゴニストの調製用の出発物質または中間体として有用なことがある化合物を作成するためのスキームを示す。スキームは、出発物質または中間体として使用されることがある他の類似化合物の作成に適用され得る。使用される試薬は当技術分野において周知であり、多くの場合、その使用は前述の実施例に示されている。
チャート１

チャート２

チャート３

生物学的活性
ＴＬＲ７アゴニストとして本明細書に開示される化合物の生物学的活性は、以下の手順により定量されることがある。

ヒトＴＬＲ７アゴニスト活性アッセイ
この手順は、本明細書に開示される化合物のヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）アゴニスト活性を定量する方法を説明する。

ヒトＴＬＲ７分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータートランスジーンを有する改変ヒト胚性腎臓ブルー細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、非選択培地（１０％ウシ胎児血清（Sigma）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Invitrogen））中に懸濁した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ７細胞を３８４ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し（１ウェルあたり１５，０００細胞）、１６－１８時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ細胞が入ったウェルに化合物（100 nl）を添加し、処置した細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。処理から１８時間後、１０マイクロリットルの新たに調製したＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）試薬（Invivogen）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ_２）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＯＤ＝６２０ｎｍ）を用いてＳＥＡＰレベルを測定した。半数効果濃度値（ＥＣ_５０；アッセイ基準値および最大値の中間の応答を引き起こす化合物濃度）を算出した。

ヒト血液におけるＩ型インターフェロン遺伝子（ＭＸ－１）およびＣＤ６９の誘導
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）ＭＸ－１遺伝子およびＢ細胞活性化マーカーＣＤ６９の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答におけるそれらの誘導を測定するヒト全血アッセイである。

ヘパリン処置したヒト全血をヒト患者から回収し、１ｍＭで、ＴＬＲ７アゴニスト試験化合物で処置した。血液をＲＰＭＩ １６４０培地で希釈し、Ｅｃｈｏを使用して１ウェルあたり１０ｎＬプレドット（predot）し、最終濃度を１μＭとした（１０μＬの血液中に１０ｎＬ）。３０秒間振盪機で混合した後、プレートを覆い、３７℃のチャンバー内に終夜＝１７時間置いた。固定／溶解バッファーを調製し（Ｈ_２０中５ｘ→１ｘ、３７℃で温める；Ｃａｔ＃ ＢＤ ５５８０４９）、後で使用するためにパームバッファーを（氷上で）維持した。

表面マーカー染色（ＣＤ６９）のために表面抗体を調製した：０．０４５μｌ ｈＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ＭＨＣＤ１４０１）＋０．６μｌ ｈＣＤ１９－ｅｆ４５０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ ＃ ４８－０１９８－４２）＋１．５μｌ ｈＣＤ６９－ＰＥ（ｃａｔ＃ ＢＤ５５５５３１）＋０．８５５μｌ ＦＡＣＳバッファー。３μｌ/ウェルで添加し、１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、氷上に３０分間置いた。３０分後、７０μＬの予め温めた１ｘ固定／溶解バッファーで刺激を停止させ、Feliex mateを用いて再懸濁し（１５回、プレートごとにチップを変えた）、３７℃で１０分間インキュベートした。

２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＨＣＳプレートウォッシャーで吸引し、振盪機で３０秒間混合し、次いで７０μＬのｄＰＢＳで洗浄し、ペレット状にすること２回（２０００ｒｐｍ、５分間）、５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ペレット状にすること１回（２０００ｒｐｍ、５分間）を行った。振盪機で３０秒間混合した。細胞内マーカー染色（ＭＸ－１）については：５０μｌのＢＤ ＰｅｒｍバッファーＩＩＩを添加し、振盪機で３０秒間混合した。氷上で３０分間インキュベートした（遮光）。５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）、続いて振盪機で３０秒間混合した。ＭＸ１抗体（(4812)－Ａｌｅｘａ ６４７：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃ＮＢＰ２－４３７０４ＡＦ６４７）を含む２０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁した（２０μｌ ＦＡＣＳバッファー＋０．８ｕｌ ｈＩｇＧ＋０．０４μｌ ＭＸ－１）。１０００ｒｐｍで１分間遠心し、振盪機で３０秒間混合し、サンプルをＲＴで、暗所で４５分間インキュベートし、続いて２ｘＦＡＣＳバッファーで洗浄した（透過処理後２３００ｒｐｍで５分間遠心）。２０μｌのＦＡＣＳバッファーで再懸濁し（１ウェルあたり合計３５μＬ）、ホイルで覆い、４℃に置き、翌日に読み取った。プレートをｉＱｕｅＰｌｕｓで読み取った。結果をツールセットにロードし、カーブマスターでＩＣ５０曲線を作成した。ｙ軸の１００％は１μＭのレシキモドに設定されている。

マウス血液におけるＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導
ＴＮＦ－アルファおよびＩ型ＩＦＮ応答遺伝子の誘導は、ＴＬＲ７経路の活性化で起こる下流のイベントである。以下は、ＴＬＲ７アゴニストに対する応答における、マウス全血中のそれらの誘導を測定するアッセイである。

ヘパリン処置したマウス全血を、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ １６４０培地で、５：４の比率で希釈した（５０μＬの全血および４０μＬの培地）。体積９０μＬの希釈血液をＦａｌｃｏｎ平底９６ウェル組織培養プレートのウェルに移し、プレートを４℃で１時間インキュべートした。１００％ ＤＭＳＯストック中の試験化合物を、濃度応答アッセイのために同じ培地で２０倍希釈し、次いで１０μＬの希釈した試験化合物をウェルに添加し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした。コントールウェルに、５％ ＤＭＳＯを含む１０μＬの培地を添加した。次にプレートを３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１７時間インキュベートした。インキュベート後、１００μＬの培地を各ウェルに添加した。プレートを遠心し、１３０μＬの上清を除去し、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦα産生のアッセイに使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号 ８８－７３２４ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）に由来する、ＤＴＴを含む体積７０μＬのｍＲＮＡキャッチャー溶解バッファー（１ｘ）を、ウェル中の残りの７０μＬサンプルに添加し、ピペッティングにより５回混合した。次にプレートをＲＴで５－１０分間振盪し、続いて２μＬのプロテイナーゼＫ（20 mg/mL）を各ウェルに添加した。次にプレートを１５－２０分間、ＲＴで振盪した。次に、さらに処理するまでの間、プレートを－８０℃で保存した。

冷凍サンプルを解凍し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡ Ｃａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓキット（Ｃａｔ＃ Ｋ１５７０－０２）を用いて、製造業者の説明書に従ってｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出から得られたｍＲＮＡの半量を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｃａｔ＃ １１７５６５００）を使用して、２０μＬの逆転写酵素反応でｃＤＮＡを合成した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。全てのリアルタイムＰＣＲ反応を、市販のマウスＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＭＸ１およびＰＰＩＡ遺伝子発現用プレデザインＴａｑＭａｎアッセイ並びにＴａｑＭａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、２回繰り返して行った。ＰＰＩＡは、ハウスキーピング遺伝子として利用した。製造業者からの勧告に従った。全ての生データ（Ｃｔ）を平均ハウスキーピング遺伝子（Ｃｔ）で正規化し、次に比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を利用して、実験解析のために、相対的な遺伝子発現量（ＲＱ）を定量化した。

定義
「脂肪族」は、特定の数の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味し（例えば、「Ｃ_３脂肪族」、「Ｃ_１－５脂肪族」、「Ｃ_１－Ｃ_５脂肪族」、または「Ｃ_１からＣ_５脂肪族」のように。後者３つの表現は１から５個の炭素原子を有する脂肪族部分と同義である）、炭素原子の数が明確に特定されない場合は、１から４個の炭素原子（不飽和脂肪族部分の場合は２から４個の炭素）である。同様の理解が、他の種類における炭素の数、つまりＣ_２－４アルケン、Ｃ_４－Ｃ_７シクロ脂肪族などに適用される。同様に、「（ＣＨ_２）_１－３」などの用語は、下付き文字が１、２、または３であることの省略表現として理解されるべきであり、そのため、かかる用語は、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２を表すことになる。

「アルキル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う飽和脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル部分には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、t－ブチル、1－ブチル、2－ブチル、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。「アルカンジイル」（時として「アルキレン」とも呼ばれる）は、アルキル基の２価の対応物を意味し、例えば、

などがある。

「アルケニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_２－Ｃ_４アルケニル部分には、エテニル（ビニル）、2－プロペニル（アリルまたはプロプ－2－エニル）、シス－1－プロペニル、トランス－1－プロペニル、Ｅ－（またはＺ－）2－ブテニル、3－ブテニル、1,3－ブタジエニル（ブト－1,3－ジエニル）、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。

「アルキニル」は、適用可能な炭素原子の数を指定するための同じ慣習に従う、少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ_２－Ｃ_４アルキニル基には、エチニル（アセチレニル）、プロパルギル（プロプ－2－イニル）、1－プロピニル、ブト－2－イニル、および同類のものが挙げられる。

「シクロ脂肪族」は、１から３個の環を有し、各環が、３から８個（好ましくは３から６個）の炭素原子を有する、飽和または不飽和非芳香族炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和であるシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素二重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも一つの環が少なくとも一つの炭素－炭素三重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。実例として、シクロ脂肪族部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限らない。好ましいシクロ脂肪族部分は、シクロアルキル部分、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。「シクロアルカンジイル」（時として「シクロアルキレン」とも呼ばれる）は、シクロアルキル基の２価の対応物を意味する。同様に、「ビシクロアルカンジイル」（または「ビシクロアルキレン」）および「スピロアルカンジイル」（または「スピロアルキレン」）は、ビシクロアルキルおよびスピロアルキル（または「スピロシクロアルキル」）基の２価の対応物を指す。実例として、

部分の例は、

であり、

部分の例は、

である。

「ヘテロシクロ脂肪族」は、少なくとも一つのその環において、最大３個（好ましくは１から２個）の炭素が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子で置換されており、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、シクロ脂肪族部分を意味する。好ましいシクロ脂肪族部分は、５から６員の大きさの１つの環からなる。同様に、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、および「ヘテロシクロアルキニル」は、少なくとも一つのその環が、そのように修飾されている、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル部分をそれぞれ意味する。代表的なヘテロシクロ脂肪族部分には、アジリジニル、アゼチジニル、1,3－ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、1,3－ジオキソラニル、テトラヒドロ－1,1－ジオキソチエニル、1,4－ジオキサニル、チエタニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキル基の２価の対応物を意味する。

「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、および「アリールチオ」は、それぞれ、－Ｏ（アルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｓ（アルキル）、および－Ｓ（アリール）を意味する。例は、それぞれ、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、およびフェニルチオである。

「ハロゲン」または「ハロ」は、より狭い意味が指示されない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。

「アリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が芳香族である、単、二、または三環式環系（好ましくは単環式）を有する、炭化水素部分を意味する。環系中の環は、（ナフチルのように）互いに縮合していてもよく、（ビフェニルのように）互いに結合していてもよく、（インダニルまたはシクロヘキシルフェニルのように）非芳香環と縮合または結合していてもよい。さらなる実例として、アリール部分には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニル、およびアセナフチルが挙げられるが、これらに限らない。「アリーレン」は、アリール基の２価の対応物、例えば1,2－フェニレン、1,3－フェニレン、または1,4－フェニレンを意味する。

「ヘテロアリール」は、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも一つの環が、Ｎ、Ｏ、またはＳから独立して選択される１から４個のヘテロ原子を含む芳香環であり、ここでＮおよびＳは、適宜酸化されてもよく、Ｎは、適宜四級化されてもよい、単、二、または三環式環系（好ましくは５から７員の単環式）を有する部分を意味する。そのような少なくとも一つのヘテロ原子を含む芳香環は、（ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルのように）他の種類の環と縮合してもよく、（フェニルピリジルまたは2－シクロペンチルピリジルのように）他の種類の環と直接結合してもよい。さらなる実例として、ヘテロアリール部分には、ピロリル、フラニル、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、N－オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノザリニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニル、および同類のものが挙げられる。「ヘテロアリーレン」は、ヘテロアリール基の２価の対応物を意味する。

例えば「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」を用いる、つまり「非置換の、または置換されたＣ_１－Ｃ_５アルキル」あるいは「適宜置換されてもよいヘテロアリール」と表現するなどして、部分が置換されてもよいということが示される場合、かかる部分は、一つ以上の独立して選択される置換基、好ましくは数にして１から５個、より好ましくは数にして１から２個の置換基を有してもよい。置換基および置換パターンは、置換基が結合する部分を考慮して当業者により選択されることがあり、化学的に安定で、当技術分野で既知の技術、ならびに本明細書に記載される方法により合成され得る化合物を提供する。部分が、「非置換の、または置換された」あるいは「適宜置換されてもよい」ものとして特定される場合、好ましい実施形態において、かかる部分は非置換である。

「アリールアルキル」、「（ヘテロシクロ脂肪族）アルキル」、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アリール、ヘテロシクロ脂肪族、ビアリールなどで置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分を、場合によっては、例えば、ベンジル、フェネチル、N－イミダゾイルエチル、N－モルホリノエチル、および同類のもののように、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分で開いた（不満足な）原子価を有する部分を意味する。反対に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」、および同類のものは、場合によっては、アルキル、アルケニルなどで置換されたアリール、シクロアルキル、その他の部分、場合によっては、例えば、メチルフェニル（トリル）またはアリルシクロヘキシルのような部分を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」、および同類のものは、場合によっては、一つ以上の特定の置換基（場合によっては、ヒドロキシル、ハロなど）で置換されたアルキル、アリール、その他の部分を意味する。

例えば、許容される置換基には、アルキル（特にメチルまたはエチル）、アルケニル（特にアリル）、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ（特にフルオロ）、ハロアルキル（特にトリフルオロメチル）、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（特にヒドロキシエチル）、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）（特に－ＯＣＦ_３）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２、および同類のものが挙げられるが、これらに限らない。

置換される部分が脂肪族部分の場合、好ましい置換基は、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、－Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－Ｓ（シクロアルキル）、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２である。より好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（アリール）、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である。特に好ましい置換基は、フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ_１－Ｃ_４アルコキシ、Ｏ（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、およびＯ（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ハロである。

置換される部分がシクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリール部分の場合、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｏ（ハロアルキル）、－Ｏ（アリール）、－Ｏ（シクロアルキル）、－Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、アルキルチオ、アリールチオ、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、アジド、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＯＳＯ_２（アルキル）、－ＳＨ、－Ｓ（アルキル）、－Ｓ（アリール）、－Ｓ（シクロアルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）アルキル、－ＳＯ_２（アルキル）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（アルキル）、および－ＳＯ_２Ｎ（アルキル）_２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、－Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）_２、－ＮＨ（アリール）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）_２、および－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である。特に好ましい置換基は、Ｃ_１－Ｃ_４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロ、およびＣ_１－Ｃ_４アルコキシである。

「Ｃ_１－Ｃ_５アルキル」または「５から１０％」のように範囲が述べられる場合、かかる範囲は、範囲の終点、つまり第一の例においてはＣ_１およびＣ_５、並びに第二の例においては５％および１０％を含む。

（例えば、構造式中の関連する立体中心における価標を太線にするか、または破線にすることにより、構造式中で、二重結合をＥまたはＺ配置を有するものとして描くことにより、あるいは立体化学を指定する命名法または記号を用いることにより）特定の立体異性体が明確に指示されない限り、全ての立体異性体が、純粋化合物ならびにその混合物として本発明の範囲内に含まれる。特に断らない限り、ラセミ体、個々のエナンチオマー（光学的に純粋であろうと部分的に分割されていようと）、ジアステレオマー、幾何異性体、およびそれらの組み合わせ、並びにそれらの混合物は、本発明により全て包含される。

当業者は、化合物が、本明細書で使用される構造式に描かれるものと同等の互変異性体（例えば、ケトおよびエノール形）、共鳴構造、および双性イオン型を有することがあり、構造式は、そのような互変異性体、共鳴構造、双性イオン型を包含するということを認識するであろう。

「薬学的に許容されるエステル」は、インビボで（例えば人体内で）加水分解し、親化合物またはその塩を生成するか、あるいはそれ自体が親化合物の活性と類似のそれを有するエステルを意味する。適当なエステルには、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、Ｃ_２－Ｃ_５アルケニルまたはＣ_２－Ｃ_５アルキニルエステル、特にメチル、エチルまたはｎ－プロピルエステルが挙げられる。

「薬学的に許容される塩」は、医薬製剤に適する化合物の塩を意味する。化合物が一つ以上の塩基性基を有する場合、塩は、酸付加塩、例えば、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシル酸塩、および同類のものなどであり得る。化合物が一つ以上の酸性基を有する場合、塩は、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、4－フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、および同類のものなどの塩であり得る。多形結晶性形態および溶媒和物も本発明の範囲内に包含される。

「患者（subject）」は動物を指し、霊長類（例えば、ヒト）、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウスを含むが、これらに限らない。「患者（subject）」および「患者（patient）」という用語は、例えば、ヒトなどの哺乳動物の患者に関して、本明細書で互換的に使用される。

「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、および「治療（treatment）」という用語は、疾患または障害の治療の文脈において、障害、疾患、または病態、あるいは障害、疾患、もしくは病態に関連する症状のうちの一つ以上を軽減するか、または抑制すること；あるいは疾患、障害、または病態の、あるいは一つ以上のそれらの症状の進行、拡大または悪化を遅らせることを含むように意図される。「がんの治療」は、以下の効果のうちの一つ以上を指す：（１）（ｉ）遅延および（ｉｉ）完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍の大きさの維持；（４）腫瘍の大きさの減少；（５）末梢臓器への腫瘍細胞浸潤の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（６）転移の（ｉ）減少、（ｉｉ）遅延または（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害；（７）（ｉ）腫瘍の大きさの維持、（ｉｉ）腫瘍の大きさの減少、（ｉｉｉ）腫瘍の増殖の遅延、（ｉｖ）浸潤の減少、遅延または予防をもたらすことがある、抗腫瘍免疫応答の増強および／または（８）ある程度の、障害に関連する一つ以上の症状の重症度または数の軽減。

本明細書の式において、価標に対して横方向の波線（

）または価標の末端にあるアスタリスク（＊）は、共有結合部位を意味する。例えば、式

において、Ｒは

である、またはＲは

であるという記述は、

を意味する。

本明細書の式において、その２つの炭素の間で芳香環を横切る価標は、その価標に結合する基が、黙示的にそこにある（または、完全に書かれている場合、明示的にそこにある）水素の除去によって空きができる芳香環の位置のうちのどこにあってもよいということを意味する。実例として：

は、

を表し；

は、

を表し；

は、

を表す。

本開示は、本明細書に記載される化合物で生じる原子の全ての同位体を含む。同位体は、原子番号は同じだが異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例であり、限定ではないが、水素の同位体には重水素およびトリチウムが挙げられる。炭素の同位体には、^１３Ｃおよび^１４Ｃが挙げられる。同位体標識した本発明の化合物は、一般的に、他の場合に使用される非標識試薬の代わりに、同位体標識した適切な試薬を用いて、当業者に既知の従来の技術により、または本明細書に記載されるものと類似の工程により調製され得る。例として、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル基は、重水素化されていなくても、部分的に重水素化されていても、完全に重水素化されていてもよく、「ＣＨ_３」には、ＣＨ_３、^１３ＣＨ_３、^１４ＣＨ_３、ＣＨ_２Ｔ、ＣＨ_２Ｄ、ＣＨＤ_２、ＣＤ_３などが含まれる。一つの実施形態において、化合物中の様々な元素は、それらの天然の同位体存在度で存在する。

当業者は、特定の構造はどちらの互変異性体－例えば、ケトかエノールか－で描かれてもよく、その２つの形態は等価であるということを認識するであろう。

アクロニムおよび略語
表Ｃは、本明細書で使用されるアクロニムおよび略語の一覧をその意味とともに提供する。

参考文献
本明細書の初めの方で、筆頭著者（または発明者）および日付により省略された形で引用される以下の参考文献に対する完全な引用を以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

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前述の本発明の詳細な説明は、本発明の特定の部分または態様に、主にまたは排他的に関係する節を含む。これは、明確化のため、および便宜のためであり、特定の特徴は、それが開示される節だけでなくその他の節においても関連していることがあり、本明細書における開示は、異なる節に記載される情報の、全ての適切な組み合わせを含むことが理解されるべきである。同様に、本明細書における様々な図および説明は、本発明の特定の実施形態に関するが、具体的な特徴が、特定の図または実施形態の文脈で開示される場合、かかる特徴は、適切な範囲で、別の図または実施形態の文脈で、別の特徴と組み合わせて、または本発明一般においても使用され得るということが理解されるべきである。

さらに、本発明は、特定の好ましい実施形態について特に記載されているが、本発明は、かかる好ましい実施形態に限定されない。それどころか、本発明の範囲は、添付の請求項により定義される。

Claims (19)

1. 下記の式（Ｉ）：
   ［式中、
   Ｗは、Ｈ、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
   であり；
   各Ｘは、独立してＮまたはＣＲ^２であり；
   Ｒ^１は、（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   （Ｃ_２－Ｃ_５アルケニル）、
   （Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
   （Ｃ_１－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＯＨ、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（５－６員ヘテロアリール）、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１フェニル、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルカンジイル）（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）、
   または
   （Ｃ_２－Ｃ_８アルカンジイル）ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
   各Ｒ^２は、独立してＨ、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｓ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｃ_１－Ｃ_３アルキル、Ｏ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
   Ｓ（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル）、
   Ｃ_３－Ｃ_４シクロアルキル、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、または［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１ＮＲ^ｘＲ^ｙであり；
   Ｒ^３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、
   ＮＨ_２、
   ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
   ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
   ＮＨ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
   Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_８ビシクロアルキル）、
   Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、
   Ｎ［Ｃ_１－Ｃ_３アルキル］Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）、
   ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
   ＮＨ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   ６員の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、
   ５員のヘテロ芳香族部分、または
   下記の構造：
   を有する部分であり；
   Ｒ^４は、ＮＨ_２、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
   ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
   または
   下記の構造：
   を有する部分であり；
   Ｒ^５は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、またはハロであり；
   Ｒ^６は、ＮＨ_２、
   （ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）_２、
   （ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキル）、
   （ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_４－Ｃ_１０ビシクロアルキル）、
   （ＮＨ）_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_５－Ｃ_１０ スピロシクロアルキル）、
   Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_６シクロアルキル）_２、
   または
   下記の構造：
   を有する部分であり；
   Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_３アルキルであるか、あるいはＲ^ｘおよびＲ^ｙは、それらに結合している窒素と結合して３から７員のヘテロ環を形成し；
   ｎは、１、２、または３であり；
   ｐは、０、１、２、または３であり；
   ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６において、
   アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルカンジイル、ビシクロアルキル、スピロシクロアルキル、環状アミン、６員の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、５員のヘテロ芳香族部分または下記の式：
   で示される部分は、
   ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
   （Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）
   から選択される一つ以上の置換基で適宜置換されてもよく；
   アルキル、アルケニル、アルカンジイル、シクロアルキル、ビシクロアルキル、スピロシクロアルキル、または下記の式：
   で示される部分は、
   Ｏ、ＳＯ_２、ＣＦ_２、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨ、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_５アルキル）、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）ＣＦ_３、
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_２－Ｃ_４アルカンジイル）ＯＨ、
   Ｎ（ＳＯ_２）（Ｃ_１－Ｃ_３アルキル）、
   Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_３アルカンジイル）_０－１［Ｃ（＝Ｏ）］ＮＲ^ｘＲ^ｙ、
   または
   Ｎ［Ｃ（＝Ｏ）］_０－１（Ｃ_１－Ｃ_４アルカンジイル）_０－１（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）
   に置換されるＣＨ_２基を適宜有してもよいが；
   ただし、Ｒ^１およびＷの少なくとも一つは、スピロシクロアルキルまたはスピロシクロアルカンジイル部分を含み、式（Ｉ）の化合物は、
   以外である］
   で示される構造を有する化合物。
2. Ｗが、
   である、請求項１に記載の化合物。
3. Ｗが、
   である、請求項１に記載の化合物。
4. Ｒ^１およびＷのそれぞれが、スピロシクロアルキルまたはスピロシクロアルカンジイル部分を含む、請求項１に記載の化合物。
5. Ｒ^１が、スピロシクロアルキル部分を含み、Ｗが、ビシクロアルキルまたはビシクロアルカンジイル部分を含む、請求項１に記載の化合物。
6. Ｒ^１が、
   からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
7. Ｒ^２が、ＯＭｅまたはＯＣＨＦ_２ である、請求項１に記載の化合物。
8. Ｒ^５が、ＨまたはＭｅである、請求項１に記載の化合物。
9. 下記の式（Ｉａ）：
   で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
10. 下記の式（Ｉｂ）：
    で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
11. が、
    からなる群から選択される、請求項１０に記載の化合物。
12. 下記の式（Ｉｃ）：
    で示される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
13. が、
    からなる群から選択される、請求項１２に記載の化合物。
14. 下記の式（Ｉｄ）：
    ［式中、
    Ｒ^１は、
    であり；
    Ｗは、
    である］
    で示される構造を有する化合物。
15. 抗がん免疫療法剤および請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物を含む、がんを治療するための医薬組成物。
16. 前記抗がん免疫療法剤が、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記抗がん免疫療法剤が、イピリムマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブである、請求項１５に記載の医薬組成物。
18. 前記がんが、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫を含む）、皮膚癌（黒色腫およびメルケル皮膚癌を含む）、尿路上皮癌（膀胱癌を含む）、胃癌、肝細胞癌、または結腸直腸癌である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
19. 下記の式（Ｉｅ）：
    ［式中、
    Ｗ’は、
    であり；
    Ｒ^９は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル、（ＣＨ_２）_１－_２（Ｃ_３－Ｃ_５シクロアルキル）、または
    である］
    で示される構造を有する化合物。