JP7525397B2 - ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用 - Google Patents

ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用 Download PDF

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ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に対する抗体並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するためのそれらの使用に関連する技術が提供される。
身体の免疫系が自己抗体を産生した場合に発生する自己免疫疾患は、残念ながら一般的である。例えば、２，３００万人を超える米国人が自己免疫疾患に罹患していると推定されている。現在、８０種を超える自己免疫疾患が認識されている。自己免疫疾患の特定の例としては、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬及び関節リウマチが挙げられる。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、関節の痛み、リンパ節の腫れ及び頬の蝶型紅斑を特徴とする。ＳＬＥでは、健常組織に対する自己抗体が患者の免疫系を攻撃し、炎症を生じさせる。細胞レベルでは、ＳＬＥ患者は、樹状細胞によって駆動される自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞を有する（Ｐａｌｕｃｋａ Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）８０：４８４－４８８）。シェーグレン症候群は、外分泌器官の全身性慢性炎症を特徴とし、最終的に臓器機能不全を生じさせる（Ｈｏｌｄｇａｔｅ Ｎ．ａｎｄ Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ Ｅ．Ｗ．，Ｆ１０００ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１４１２ １０．１２６８８／ｆ１０００ ｒｅｓｅａｒｃｈ．８３５２．１）。
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳及び脊髄内の神経細胞の脱髄並びに中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症を特徴とする。乾癬は、赤い斑点、敏感肌として出現する自己免疫疾患である。関節リウマチ（ＲＡ）は、持続性滑膜炎並びに関節内の軟骨及び骨の破壊を特徴とする関節滑膜組織の炎症性障害である。損傷は、進行して多くの身体系に衝撃を与え得る。ループス腎炎は、全身性エリテマトーデスに関連しており、腎臓の炎症を生じさせる。炎症が発生すると、腎臓は、タンパク質を漏出し、最終的に腎不全に至り得る。ブドウ膜炎は、目の組織を攻撃し、破壊して失明を引き起こし得る炎症性疾患の群である。
更に、急性及び慢性の前炎症状態は、個体における無数の疾患と関連付けられており、それらの原因となり得る。特定の疾患の例は、１型及び２型糖尿病、例えば糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたＣＫＤを含む慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む慢性炎症；動脈硬化症、アルツハイマー病、癌並びに心疾患、高血圧、貧血症、心膜炎、腎性骨ジストロフィー等を含むそのような疾患の関連合併症と関連すると考えられている。自己免疫疾患と同様に、慢性炎症に関連している疾患では、身体は、衰弱及び頻回に致死的併存疾患をもたらし得る過度の継続的前炎症反応を高めていくと思われる。
自己免疫疾患の原因は、明確には理解されていない。メカニズム的に、基礎にある各自己免疫疾患は、自己反応性免疫細胞に継続的に活力を与える複雑な調節系によって促進される（且つ／又は阻害されない）進行中の自己免疫反応である。類似の機構が非自己免疫性慢性炎症性疾患においても機能すると思われる。このため、自己免疫疾患における且つ慢性炎症のための治療的介入は、無数の調節系、シグナル伝達カスケード及びそれらの構成成分を標的としてきた。
１つのクラスの推定治療標的としては、別個の成長因子とタンパク質とを結合して細胞恒常性を調節する膜貫通受容体であるチロシンキナーゼ受容体（ＴＫＲ）が挙げられる。５０種を超える公知のヒトＴＫＲは、それらの遺伝系統によって定義される２０の別個のクラスに分類される（Ｒｏｂｉｎｓ Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２０００）１９：５５４８－５５５７；Ｌｅｍｍｏｎ Ｍ．Ａ．及びＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｊ．Ｃｅｌｌ．（２０１０）１４１：１１１７－１１３４）。ＴＫＲクラスＩＩＩは、７０～１００個の親水性残基を含有する細胞外区域内の５～７個の免疫グロブリン様ドメインの存在を特徴とする。クラスＩＩＩのＴＫＲ内では、ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体（ＦＬＴ３）は、ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、単核白血球並びにミクログリア上で発現する膜結合受容体である。ＦＬＴ３は、活性化Ｔ細胞、活性化内皮及び骨髄間質細胞を含む複数の細胞型によって発現する造血サイトカインであるＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に結合する。ＦＬＴ３Ｌは、細胞表面及び分泌ホモダイマーの両方として発現し、その同族受容体であるＦＬＴ３を通してシグナル伝達する。ＦＬＴ３は、モノマーとして細胞表面上で発現し、ＦＬＴ３Ｌとライゲーションすると活性化される。ＦＬＴ３Ｌのライゲーション後、ＦＬＴ３は、二量化し、自己リン酸化し、ＲＡＳ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ホスファチジルイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びシグナル伝達物質並びに転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３及び５を含むシグナル伝達経路を活性化する。自己リン酸化後、二量化ＦＬＴ３は、内在化及び分解される。
ＦＬＴ３Ｌは、炎症シグナル、特に□－鎖サイトカイン：ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５に反応して生成され、ＦＬＴ３との相互作用は、主としてＤＣの分化、増殖及び生存におけるその役割を通して炎症プロセスを駆動する。更に、受容体を一過性でアップレギュレートすると報告された両方の細胞型を用いると、活性化後のＴ細胞及びＢ細胞生存にＦＬＴ３シグナル伝達が役割を果たすことも推定されている（Ａｓｔｉｅｒ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０ ｖ１８４：６８５－９３及びＴｏｂｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．２０１０；６２（１１）：３４４７－５６）。更に、ＮＫ細胞生存は、ＤＣに由来するＩＬ－１５に対する要求を介してＦＬＴ３Ｌに間接的に依存すると考えられるが、この観察所見は、マウスのデータ（Ｇｕｉｍｏｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１０；１８４：２７６９－７５）に基づくものであり、ヒトでは依然として証明されていない。
ＤＣは、それらが炎症部位からリンパ節に移動し、最終的に自己免疫疾患を生成するために必要とされる適応的免疫反応を開始する免疫系の前哨であるため、炎症では特に重要である。概して、ＤＣには２つのサブセット：骨髄／古典的樹状細胞（ｃＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）がある。ｃＤＣは、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮＩ－ＩＩＩ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＩＬ－１□）を産生し、共刺激に関連してＴ細胞に抗原を提示し、炎症部位に細胞を動員するケモカインを分泌し、臨界的細胞－細胞相互作用の必要に応じてそれらが共局在化することを保証する。これらのメカニズムを通して、ｃＤＣは、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激して、結果としてＮＥＴｏｓｉｓ、自己抗体産生、ＩＬ－１７産生及び追加の炎症性サイトカイン産生を生じさせる。ｐＤＣは、免疫系の全アームの活性化を増強する生得的反応における重要なサイトカインであるＩ型ＩＦＮの主要な起源である。
シェーグレン症候群患者由来の唾液腺は、浸潤性Ｂ細胞上でＦＬＴ３及びＦＬＴ３Ｌの発現を示す（Ｔｏｂｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．（２０１０）６２（１１）：３４４７－３４５６）。更に、シェーグレン症候群患者は、循環中のＦＬＴ３を発現するＢ細胞の頻度上昇を示し、それらの生存率は、ＦＬＴ３Ｌを発現するヒト唾液腺細胞と共培養した場合に増強される。ＭＳを有する個体は、慢性及び活性病変並びに灰白質及び白質においてＦＬＴ３タンパク質を発現する（ＤｅＢｏｙ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．（２０１０）；８９（２）：１０９－１１６）。更に、ＦＬＴ３は、ＭＳを有する個体の脳内へのＦＬＴ３陽性ＤＣの浸潤を示している血管周囲脳内で未熟ＤＣと共局在化している（Ｄｅｂｏｙ ｅｔ ａｌ．）。ＲＡでは、滑液中ＦＬＴ３Ｌレベルは、健常個体と比較して増大する。更に、ＲＡ患者由来の単核白血球、ＮＫ細胞及びＤＣは、高レベルのＦＬＴ３Ｌを発現する（Ｒａｍｏｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．（２０１３）１５（６）：Ｒ２０９）。
更に、血清中及び炎症部位中ＦＬＴ３Ｌのレベルの増加は、ＳＬＥ、筋炎、原発性シェーグレン症候群、ＭＳ、ブドウ膜炎及びＲＡについて報告されている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７：ｅ４７６６８；ＤｅＢｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｐａｔｈ（２０１０）８９：１０９－１６）。
このため、（例えば、ｐＤＣ及びｍＤＣを介する）ＦＬＴ３媒介性前炎症生存は、健常個体における有益な生理学的反応であるが、これは、自己免疫疾患において有害な作用を有する可能性が高い。従って、ＦＬＴ３／ＦＬＴ３Ｌシグナル伝達経路の崩壊及び減衰は、自己免疫疾患及び他の炎症性疾患に対処し、且つ炎症を低減させるための重要なツールであることを証明することができた。
本明細書では、自己免疫疾患並びに他の急性及び／又は慢性炎症性疾患を制御するための新規なＦＬＴ３Ｌ結合抗体が提供される。
第１の態様では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の組：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８のアミノ酸配列を含む。
第１の態様の１つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ配列番号１及び配列番号２；又は（ｂ）それぞれ配列番号３及び配列番号４；又は（ｃ）それぞれ配列番号５及び配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。別実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、（ａ）それぞれ配列番号１及び配列番号２；又は（ｂ）それぞれ配列番号３及び配列番号４；又は（ｃ）それぞれ配列番号５及び配列番号６を含む。別の実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号６１を含む重鎖領域及び配列番号６２を含む軽鎖領域；又は（ｂ）配列番号６５を含む重鎖領域及び配列番号６６を含む軽鎖領域；又は（ｃ）配列番号６９を含む重鎖領域及び配列番号７０を含む軽鎖領域を含む。１つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＦＬＴ３のＦＬＴ３Ｌ媒介性活性化を阻害する。別の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、構造的に類似のＴＫＲリガンド分子と交差反応しない。１つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＳＣＦ及びｈｕＣＳＦ１の少なくとも１つと交差反応しない。更なる実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、ｈｕＳＣＦ又はｈｕＣＳＦ１の何れとも交差反応しない。１つの実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。１つの実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、（ａ）ＩｇＡ定常ドメイン；（ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン；（ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン；（ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン；（ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン；（ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン；（ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン；及び（ｈ）ＩｇＭ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。１つの実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ１定常ドメインを含む。別の実施形態では、単離抗体又は抗原結合断片は、（ａ）Ｉｇκ定常ドメイン；及び（ｂ）Ｉｇλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン及びヒトλ定常ドメインを含む。１つの実施形態では、ＩｇＧ１定常ドメインは、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６３：７８－８５（１９６９））。
第２の態様では、本開示は、第１の態様及び／又はその実施形態に従った単離抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子を提供する。第２の態様の１つの実施形態では、核酸分子は、制御配列に操作可能に連結されている。
第３の態様では、本開示は、第２の態様及び／又はその実施形態に従った核酸分子を含むベクターを提供する。
第４の態様では、本開示は、第２の態様及び／若しくはその実施形態に従った核酸分子又は第３の態様に従ったベクターを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
第５の態様では、本開示は、第１～第４の態様の何れか又はそれらの実施形態の抗体又は抗原結合断片を産生するハイブリドーマを提供する。
第６の態様では、本開示は、第１～第５の態様及び／又はそれらの実施形態の抗体又は抗原結合断片を産生する単離宿主細胞を提供する。
第７の態様では、本開示は、第１～第６の態様又はそれらの実施形態の何れかに従った抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、（ａ）前記抗体又は抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ或いは第３の態様若しくはその実施形態の宿主細胞又は第４の態様に従ったハイブリドーマを培養するステップ；及び（ｂ）前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法を提供する。
第８の態様では、本開示は、第６の態様の方法に従って生成された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
第９の態様では、本開示は、第１～第８の態様の何れか又はそれらの実施形態の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、本医薬組成物は、医薬品として使用するために提供される。
第１０の態様では、本開示は、急性又は慢性炎症性疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、第１～第９の態様の何れか又はそれらの実施形態に従った単離抗体又はその断片を投与するステップを含む方法を提供する。１つの実施形態では、炎症性疾患は、例えば、糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたＣＫＤを含む慢性腎疾患（ＣＫＤ）を含む。
第１１の態様では、本開示は、自己免疫疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、第１～第１０の態様の何れか又はそれらの実施形態に従った単離抗体又はその断片を投与するステップを含む方法を提供する。１つの実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬又は関節リウマチを含む。
本開示のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の請求項と一緒に本開示の下記の詳細な説明からより詳細に理解されるであろう。請求項の範囲は、その中の詳述によって定義されており、本明細書に記載した特徴及び利点に関する特定の考察によって定義されるものではないことに留意されたい。
リード抗体の選択である。図１Ａは、ｈｕＦＬＴ３Ｌ及びｍｕＦＬＴ３Ｌを用いた交互パニングプロセス並びに結果として生じたＢＭＶ、ＣＳ、ＤＰ４７及びＤｙａｘファージライブラリーの濃縮を示す。図１Ｂは、パニングのアウトプットがそれによって下流競合ＨＴＲＦのためにベクター内にクローン化されたプロセスを示す。図１Ｃは、リード候補についての競合ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光法）の結果を示す。 細胞系内でのＦＬＴ３Ｌの発現である。図２Ａは、ＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ１３及びＭＶ４－１１細胞系と比較したＲＳ４；１１細胞系内でのＦＬＴ３の発現の増加を示す。図２Ｂは、組換えＦＬＴ３ＬがＲＳ４；１１細胞上のＦＬＴ３に用量依存法で結合することを確証する。図２Ｃは、ＲＳ４；１１細胞の表面上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションが、市販で入手できる抗ＦＬＴ３抗体を用いてフローサイトメトリー分析を使用して確実に検出できること及びこのダウンレギュレーションがＦＬＴ３Ｌとのライゲーションに反応して用量依存法で発生することを示す。 ＥＣ８０の誘導及びその後の試験である。図３Ａは、細胞表面ＦＬＴ３の８０％がＲＳ４；１１細胞上でダウンレギュレートされる濃度（ＥＣ８０）を誘導するために使用されたＦＬＴ３Ｌ滴定曲線を示す。図３Ｂは、市販で入手できる抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びさもなければＲＳ４；１１細胞上の細胞表面ＦＬＴ３の８０％のダウンレギュレーションを生じさせるであろう９６ｐＭの組換えＦＬＴ３Ｌに対するＦＬＴ３受容体（ＦＬＴ３－Ｆｃ）の組換え構築物の阻害プロファイルを示す。 ヒト及びｃｙｎｏ ｓＦＬＴ３のリード抗体候補の阻害である。図４Ａは、９６ｐＭのヒトＦＬＴ３Ｌに対する５つのリード候補の阻害プロファイルを示す。図４Ｂは、９６ｐＭのカニクイザルＦＬＴ３Ｌに対する５つのリード候補の阻害プロファイルを示す。図４Ｃは、マウスＦＬＴ３Ｌに対する５つのリード候補の阻害プロファイルを示す。 細胞表面ＦＬＴ３のリード候補の阻害である。図５Ａは、形質導入ＣＨＯ細胞系の表面上で発現したヒトＦＬＴ３Ｌにリード抗体が結合する能力を示す。図５Ｂは、細胞表面ｃｙｎｏ（カニクイザル）ＦＬＴ３Ｌに結合するリード抗体を示す。図５Ｃは、細胞表面マウスＦＬＴ３Ｌに結合するリード抗体を示す。 内在性ヒトＦＬＴ３Ｌに結合するリード候補である。図６Ａは、ＩＬ－２を用いた７日間の刺激後のヒト一次Ｔ細胞上のＦＬＴ３Ｌ発現を示す。図６Ｂは、クローン５Ｄ９を除いて、全てのリード候補がヒト一次Ｔ細胞上の内在性ＦＬＴ３Ｌに結合する能力を示す。図６Ｃは、一次Ｔ細胞とのインキュベーション前の二量化によるＣＡＴ５Ｄ９のアビディティの改良が、Ｔ細胞表面上の内在性ＦＬＴ３Ｌへのクローンの用量依存性結合の検出を可能にすることを示す。 リード候補による細胞表面シグナル伝達の阻害である。図７Ａは、ＲＳ４；１１細胞表面上のＦＬＴ３の８０％のダウンレギュレーションを誘導するための最適数としての１ウェル当たりの１０００ＣＨＯを決定する、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＨＯ細胞へのＲＳ４；１１細胞の用量反応曲線を示す。図７Ｂは、全リード候補がある程度までＣＨＯ細胞上の細胞表面ＦＬＴ３Ｌを阻害する能力を有することを示す。 ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化及び中和である。図８Ａは、ＦＬＴ３ＬによるＲＳ４；１１細胞内でのＥＲＫシグナル伝達活性化を証明している概念実証試験を示す。図８Ｂは、市販で入手できる抗体によるＦＬＴ３Ｌ誘導性ＥＲＫ活性化の阻害を示す。 ＭＥＫ １／２及びＥＲＫの下流シグナル伝達のリード候補によるブロッキングである。図９Ａは、一次ＣＤ１３３＋ヒト幹細胞内のヒトＦＬＴ３Ｌ誘導性ＭＥＫ １／２リン酸化に対するリードクローン候補の機能的活性を示す。図９Ｂは、読み出しとしてのＥＲＫリン酸化を使用して、一次ＣＤ１３３＋ヒト幹細胞内でのＦＬＴ３Ｌ誘導性シグナル伝達に対するリードクローンの機能的活性の追加の確証を提供する。 リード候補の標的特異性及び結合動態である。図１０Ａは、クローン５Ｄ９に対するリードクローン候補及びＦＬＴ３－Ｆｃの第ＩＩＩ期ビニングを示す。図１０Ｂは、ＣＡＴ５Ｄ９以外の全クローンの代表としての、ＣＡＴ８に対する全リードクローン及びＦＬＴ３－Ｆｃの第ＩＩＩ期ビニングを示す。 ｈｕＳＣＦ及びｈｕＣＳＦへのリード候補の交差反応性である。図１１Ａは、リード候補が構造的ホモログｈｕＳＣＦに結合しないことを示す。図１１Ｂは、リード候補が構造的ホモログｈｕＣＳＦに結合しないことを示す。 クローンの最適化である。図１２Ａは、読み出しとしてのＲＳ４；１１ ＦＬＴ３のダウンレギュレーションアッセイを使用して、親ＣＡＴ５Ｄ９をクローン６（Ｃ０６）と比較する第１ラウンドのクローンの最適化の結果を示す。図１２Ｂは、親ＣＡＴ５Ｄ９をクローン６（Ｃ０６）並びに最終リード候補であるＡＭ４０及びＳＣ４０１７と比較した第２ラウンドのクローンの最適化の結果を示す。 内在性細胞表面ＦＬＴ３Ｌの効果的な中和である。図１３Ａは、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の連続希釈物に反応したＲＳ４：１１ ＦＬＴ３のダウンレギュレーションを示す。図１３Ｂは、リードクローンがＣＤ４＋ Ｔ細胞上の細胞表面ＦＬＴ３Ｌの活性を完全に中和することを示す。 健常カニクイザルにおけるＦＬＴ３Ｌの中和に関する試験の概略である。３群の雄性カニクイザル（１群当たりｎ＝４）に、指示したように１カ月間にわたり週５回の投与で０．０３、１又は３０ｍｇ／ｋｇのＡＭ４０（ＭＥＤＩ１１１６）を投与した。最終投与後の８週間のフォローアップ期間を使用して、投与された抗体の持続及び循環中ＤＣ集団に及ぼすその作用を決定した。 抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＡＭ４０／ＭＥＤＩ１１１６）の投与後の血清中ＦＬＴ３Ｌタンパク質及び循環中ＤＣの頻度である。図１５Ａは、０．０３、１．０及び３０ｍｇ／ｋｇでの投与後の遊離血清中ＦＬＴ３Ｌレベルを測定して、ＭＥＤＩ１１１６によるターゲットエンゲージメントを示す。毎日の血清測定値を第１～８日から入手した後、第８５日まで週１回の測定を実施した。図１５Ｂは、ＭＥＤＩ１１１６を用いた治療後、ベースラインに対するパーセンテージとして測定した、循環中ＣＤ１ｃ＋（古典的ＤＣ）の頻度（左）及び形質細胞様ＤＣの頻度（右）の減少及び回復を示す。 Ｔ細胞の血清測定値及びフローサイトメトリー分析を比較する、ＳＬＥ患者におけるＦＬＴ３Ｌ発現とＳＬＥＤＡＩスコアとの相関の測定である。図１６Ａは、健常ドナー（ＨＤ）及びＳＬＥ患者の血清中のＦＬＴ３Ｌレベルを示す。図１６Ｂは、血清中ＦＬＴ３ＬとＳＬＥＤＡＩスコアとの相関を示す。図１６Ｃは、健常ドナー（ＨＤ）及びＳＬＥ患者における循環中ＦＬＴ３Ｌ＋Ｔ細胞の頻度を示す。図１６Ｄは、ＦＬＴ３Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞とＳＬＥＤＡＩスコアとの間の相関を示す。 ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット内のＦＬＴ３Ｌ発現及びＳＬＥＤＡＩスコアである。図１７Ａは、ＨＤ及びＳＬＥ患者においてＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ Ｔｎａｉｖｅ細胞のパーセントを示す。下方のパネルは、ＳＬＥＤＡＩスコアに対するＳＬＥ患者におけるＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ Ｔｎａｉｖｅ細胞の相関を示す。図１７Ｂは、ＨＤ及びＳＬＥ患者におけるＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ ＴＭＥＭ細胞のパーセントを示す。下方のパネルは、ＳＬＥＤＡＩスコアに対するＳＬＥ患者におけるＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ ＴＭＥＭ細胞の相関を示す。図１７Ｃは、ＨＤ及びＳＬＥ患者においてＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ ＴＣＭ細胞のパーセントを示す。下方のパネルは、ＳＬＥＤＡＩスコアに対するＳＬＥ患者におけるＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ Ｔｎａｉｖｅ細胞の間の相関を示す。 筋炎を有する個体からのＰＢＭＣ ＣＤ４サブセット内でのＦＬＴ３Ｌ発現である。図１８Ａは、ＨＤ及び筋炎患者においてＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ Ｔｎａｉｖｅ細胞のパーセントを示す。図１８Ｂは、ＨＤ及び筋炎患者においてＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ ＴＭＥＭ細胞のパーセントを示す。図１８Ｃは、ＨＤ及び筋炎患者においてＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４ ＴＣＭ細胞のパーセントを示す。 ＭＲＬマウスにおけるタンパク尿及び腎炎のスコアである。図１９Ａは、抗ＦＬＴ３Ｌ投与の１７週間後のタンパク尿の減少を示す。図１９Ｂは、抗ＦＬＴ３Ｌ投与の１８週間後の腎炎スコアを示す。 ＭＲＬマウスにおける脾臓中樹状細胞集団である。図２０Ａは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後のＣＤ１１＋ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋ｐＤＣの頻度の変化を示す。図２０Ｂは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ｍＤＣの頻度を示す。図２０Ｃは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋ｍＤＣの頻度を示す。 ＮＯＤ．Ｈ２ｈ４シェーグレン症候群マウスモデルにおける唾液腺の病理学スコアである。図２１Ａは、アイソタイプコントロールに対する、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の治療的投与後のＮＯＤ．Ｈ２ｈ４シェーグレン症候群マウスモデルにおける唾液腺病理の変化を示す。図２１Ｂは、アイソタイプコントロールに対する、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の予防的投与後のＮＯＤ．Ｈ２ｈ４シェーグレン症候群マウスモデルにおける唾液腺病理の変化を示す。 抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後の樹状細胞の存在の変化である。図２２Ａ及び２２Ｂは、フローサイトメトリー（Ａ）及び定量法（Ｂ）によって証明された、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後の形質細胞様ＤＣの頻度（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋）における変化を示す。図２２Ｃ及び２２Ｄは、フローサイトメトリー（Ｃ）及び定量法（Ｄ）によって証明された、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体後の古典的ＤＣの頻度（Ｂ２２０ｎｅｇＣＤ１１ｃＨＩ）における変化を示す。 カニクイザルにおける抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）のＰＫは、ｐＤＣの抑制及び回復によって確証されたように、ＦＬＴ３Ｌの機能的中和と相関する。矢印によって示されたように、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）は、週１回、第１、８、１５、２２、２９日にカニクイザルに投与された。図２３Ａは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）のＰＫを示す。図２３Ｂは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）を０．０３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合の可溶性ＦＬＴ３Ｌレベルを示す。図２３Ｃは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）を０．０３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合のベースラインに対するパーセンテージとして測定したｐＤＣの頻度を示す。 抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）についてのヒト投与モデルは、Ｑ４Ｗ投与を投影する。図２４Ａは、カニクイザルにおける抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）のＰＫを示す。図２４Ｂは、カニクイザルにおける抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）のＰＤを示す。図２４Ｃは、ヒトにおける予測抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＭＥＤＩ１１１６）のＰＤを示す。 抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（ＬＦＣ－１）は、治療の経過を通してＦＬＴ３Ｌを効果的に中和して循環中薬物／リガンド複合体の蓄積を生じさせる。図２５Ａは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後の遊離血清中ＦＬＴ３Ｌレベルを示す。遊離ＦＬＴ３Ｌレベルは、捕捉試薬としてのＦＴ３Ｌ－ＩｇＧ及び検出試薬としてのスルホ標識抗マウスＦＬＴ３Ｌポリクローナル抗体を使用して測定した。図２５Ｂは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後の全（遊離及び結合）血清中ＦＬＴ３Ｌレベルを示す。全ＦＬＴ３Ｌレベルは、捕捉及び検出のためにポリクローナル抗マウスＦＬＴ３Ｌ抗体を使用して測定した。 ＦＬＴ３Ｌの遮断は、高齢ＮＯＤ－Ｈ２ｈ４マウスの脾臓及びＳＧ流入領域リンパ節（ＬＮ）におけるＴ細胞活性化を抑制する。抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（ＬＦＣ－１）を用いたＦＬＴ３Ｌの遮断は、脾臓及び唾液腺流入領域ＬＮにおいて抗原を経験したＣＤ４４ＨＩ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度の減少をもたらす（２４～２６週齢での試験終了時）。棒グラフは、脾臓及び流入領域ＬＮのフローサイトメトリー分析から誘導した。各棒は、ｎ＝４～５匹のマウスの平均値の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を表す。図２６Ａは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後の脾臓中のＣＤ４４ＨＩ ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を示す。図２６Ｂは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後のＬＮ中のＣＤ４４ＨＩ ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を示す。図２６Ｃは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後の脾臓中のＣＤ４４ＨＩ ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団を示す。図２６Ｄは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及びアイソタイプコントロール抗体の投与後のＬＮ中のＣＤ４４ＨＩ ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団を示す。 治療的抗ＦＬＴ３Ｌ遮断は、２つの血清中ＩｇＧ自己抗体特異性を選択的に減少させる。対応する血清サンプルは、ＵＴＳＷ ＩｇＧ自己抗体分析によって測定した。
本発明は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、そのような分子は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片である。１つの実施形態では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、炎症性シグナル伝達経路の活性化を阻害するために、ＦＬＴ３／ＦＬＴ３Ｌ結合を阻害又は減少させるために使用され得る。そのようなアプローチは、シグナル伝達源で炎症を攻撃して、より強固な抗炎症治療作用を許容するために有益である。抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む、関連するポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物も提供される。更に、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及び抗原結合断片を生成する方法並びにそれらを使用する方法、例えば対象における自己免疫疾患及び／又は慢性炎症性疾患を治療する方法（直接療法、アジュバント療法として又は併用療法において）も企図されている。
本開示をより容易に理解できるように、特定の用語について最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明を通して規定する。
定義
本発明について詳細に説明する前に、特定の組成物又はプロセスステップは、変動し得るため、本発明は、特定の組成物又はプロセスステップに限定されないことを理解すべきである。他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。下記の参考文献は、当業者に本開示において使用する多数の用語の一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、下記の用語は、他に特に規定しない限り、以下でそれらに与えられた意味を有する。
本開示において使用する用語「抗体」（又はその断片、変異体若しくは誘導体）は、例えば、Ｂ細胞によって生成された典型的な抗体に関連して、抗原、例えば少なくとも１本の重鎖（ＶＨ）の可変ドメイン及び１本の軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインに結合することができる抗体の少なくとも最小部分を意味する。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的明確に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８８）を参照されたい。抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、エピトープ結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含有する断片（Ｆｄ）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片及び抗原結合機能、即ち例えばＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する能力を保持している他の抗体断片及びそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨ又はＶＨと略記する）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬ又はＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＷ）と称される領域を間に挟んで、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に更に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＷから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への結合を媒介し得る。本開示の典型的な抗体としては、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（原抗体及び生殖細胞系抗体）、親和性最適化クローン、ＡＤＣＣが欠如する最適化抗体、複合体化抗体（例えば、ＡＤＣ）及び他の最適化抗体（例えば、ＹＴＥ突然変異を含む血清半減期最適化抗体）が挙げられる（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４－２４（２００６）及び米国特許第７，０８３，７８４号明細書を参照されたい）。
特定の実施形態では、ＶＨのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）並びにＶＬのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）は、（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８のアミノ酸配列からなる。
抗体は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づき、５つの主要クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の何れかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、裸抗体であり得るか、又はＡＤＣを形成するために毒素、放射性同位体等の他の分子に複合体化され得る。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、ＦＬＴ３Ｌ等のそれが結合する抗原の生物活性を阻害又は減少させる抗体である。特定の態様では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的又は完全に阻害する。例えば、ＦＬＴ３のＦＬＴ３Ｌ媒介性活性化は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％，少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は更に１００％減少させることができる。
用語「ＦＬＴ３Ｌ抗体」、「ＦＬＴ３Ｌに結合する抗体」又は「抗ＦＬＴ３Ｌ抗体」は、その分子がＦＬＴ３Ｌを標的とする際の治療薬又は診断用試薬として有用であるように十分な親和性でＦＬＴ３Ｌに結合することができる抗体又はその抗原結合断片を指す。用語「抗ＦＬＴ３Ｌ」には、例えば、スカフォールド内に組み込まれた本明細書に開示した抗体のＣＤＲを含む分子も広範囲に含まれる。
用語「生殖系列化」は、抗体内の特定位置のアミノ酸が生殖細胞系内の抗体に突然変異により戻されることを意味する。
抗体の「可変領域」は、単独で又は組み合わせての何れかで抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖各々の可変領域は、３つのＣＤＲ領域によって連結された４つのＦＷ領域からなる。各鎖内のＣＤＲは、他の鎖からのＣＤＲと共にＦＷ領域によって極めて密接に一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために少なくとも２種の技術がある：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（即ちＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；及び（２）抗原－抗体複合体に関する結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））。更に、当技術分野では、ＣＤＲを決定するためにこれらの２種のアプローチの組合せがときに使用される。
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムは、一般に可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の１～１０７個の残基及び重鎖の１～１１３個の残基）について言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
語句「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置のナンバリング」又は「Ｋａｂａｔ位置」等は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１において抗体の集積の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対して使用されたナンバリングシステムを指す。
用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」及び「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的結合に責任を有するアミノ酸を含む抗体分子の一部を意味する。可変領域は、抗体又は抗原結合断片が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。即ち、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、結合して三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。より詳細には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖各々の上の３つのＣＤＲによって定義される。本明細書で使用する抗原結合ドメインとの特異的相互作用に責任を有する抗原分子の一部分は、「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、典型的には抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域を含むが、しかしながら、必ずしも両方を含んではいない。例えば、いわゆる「Ｆｄ」抗体断片は、ＶＨドメインのみからなるが、依然としてインタクト抗体の一部の抗原結合機能を維持している。
抗体の結合断片は、組換えＤＮＡ技術又はインタクト抗体の酵素的開裂若しくは化学的開裂によって生成される。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び一本鎖抗体が挙げられる。酵素であるパパインによる抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても公知である２つの同一抗原結合断片と、抗原結合活性を有していないが、結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片とを生じさせる。酵素であるペプシンによる抗体の消化は、その抗体分子の２本のアームが結合したままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を生じさせる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原に架橋結合する能力を有する。本明細書で使用する場合の「Ｆｖ」は、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。本明細書で使用する場合の「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指す。
本明細書で使用するＦｃ領域としては、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドが挙げられる。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインへの可撓性ヒンジＮ末端とを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインであるＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃｙ２及びＣｙ３）並びにＣガンマ１（Ｃｙ１）とＣガンマ２（Ｃｙ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は、変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端への残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むと定義されており、ここで、ナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１に規定されているＥＵインデックスに従っている。
「モノクローナル抗体」は、単一抗原決定因子又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関係している均質な抗体集団を指す。これは、典型的には、異なる抗原決定因子に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。
用語の「モノクローナル抗体」には、インタクト及び全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子が含まれる。更に、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現及びトランスジェニック動物を含むが、それらに限定されない多数の方法で作成されたそのような抗体を指す（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の発現）。
用語「ヒト化抗体」は、ヒトにおいて生成される抗体変異体との類似性を増加させるために遺伝子組換えされている非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成された抗体又は当技術分野において公知の任意の技術（例えば、培養物細胞内での組換え発現又はトランスジェニック動物における発現）を使用して作成されたヒトによって生成された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。従って、用語「ヒト抗体」は、最初にヒトによって生成された抗体に対応するアミノ酸配列を有するが、非ヒト系中で発現させた（例えば、化学合成によって生成された；微生物、哺乳動物又は昆虫細胞中で組換え的に発現された；又は動物対象において発現された）抗体（又はその遺伝子組換え変異体若しくは誘導体）も含む。従って、ヒト対象又はヒト細胞（例えば、組換え抗体又はその断片を発現するハイブリドーマ又は細胞系）から得られ、引き続いて動物、例えばマウスにおいて発現された抗体は、ヒト抗体と見なされる。ヒト抗体についてのこの定義には、インタクト抗体若しくは全長抗体、それらの断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖、及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種以上の動物種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を備える１種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応する一方、定常領域は、その種における免疫反応を引き出すことを回避するために別の種（通常、ヒト）に由来する抗体内の配列と相同である。
用語「ポリヌクレオチド」は、単一核酸及び複数の核酸を含み、単離核酸分子又は構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見出されるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド内に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸又はポリヌクレオチドは、その自然環境から除去されている核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡであることが意図されている。例えば、ベクター内に含有されるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示したように単離されたと見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞内で維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中で（部分的若しくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、ポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。単離ポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生成されたそのような分子を更に含む。更に、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターであり得るか又はそれらを含み得る。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコーディング領域と操作可能に関連しているプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。操作可能な関連又は連結は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコーディング領域に調節配列の影響下又は制御下でその遺伝子産物の発現を配置できるような方法で１つ以上の調節配列が関連している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコーディング領域及びそれと関連しているプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じさせる場合及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害しない場合又はＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害しない場合、「操作可能に関連している」又は「操作可能に連結している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を実行できる場合、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に関連されるであろう。プロモーターは、事前に決定された細胞においてのみＤＮＡの実質的転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと操作可能に関連付けることができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態であるＲＮＡであり得る。
「ベクター」は、宿主細胞内に導入され、それにより形質転換宿主細胞を生成する核酸分子である。ベクターは、複製起源等の宿主細胞内で複製することを許容する核酸配列を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子及び当技術分野において公知の他の遺伝要素も含み得る。
「形質転換」細胞又は「宿主」細胞は、その中に分子生物学技術によって核酸分子が導入されている細胞である。本明細書で使用する用語「形質転換」は、それによって核酸分子がそのような細胞内に導入され得る、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換並びにエレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子銃加速法による裸のＤＮＡの導入を含む全ての技術を含んでいる。形質転換細胞又は宿主細胞は、細菌細胞又は真核細胞であり得る。
本明細書で使用する用語「ＦＬＴ３Ｌ」は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体（ＦＬＴ３）受容体に結合する造血サイトカインであるポリペプチドである、ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンドを指す。ＦＬＴ３Ｌは、最初に膜結合タンパク質として発現され、その後、酵素を使用して可溶性形態に開裂される。膜結合（ｍＦＬＴ３Ｌ）及び分泌（ｓＦＬＴ３Ｌ）の両方は、ＦＬＴ３Ｌの定義内に含まれる。
本開示では、「含む」、「含んでいる」、「含有している」及び「有する」等は、米国特許法においてそれらに帰せられている意味を有することができ、「包含する」、「包含している」等を意味することができる。「～から本質的になっている」又は「～から本質的になる」も、同様に、米国特許法においてそれらに帰せられている意味を有し、非限定的であり、言及されているものを超える存在は、言及されているものの基本的又は新規な特徴が、列挙されているものを超える存在によって変化されない限り許容されるが、先行技術の実施形態を除外する。
本明細書で使用する用語「決定する」、「評価する」、「アッセイする」、「測定する」及び「検出する」は、定量的及び定性的の両方の決定を意味しており、従って、用語「決定する」は、「アッセイする」、「測定する」等と同義的に使用される。定量的決定が意図される場合、被分析物等の「量を決定する」という語句が使用され得る。定性的及び／又は定量的決定が意図される場合、被分析物の「レベルを決定する」又は被分析物を「検出する」という語句が使用される。
２種以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「同一である」又は「パーセント同一性」は、配列同一性の一部として任意の保存的アミノ酸置換を考察せずに最高一致について比較及び（必要に応じてギャップを導入して）アラインメントした場合、同一であるか、又は規定のパーセンテージのヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウエア若しくはアルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定され得る。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用できる様々なアルゴリズム及びソフトウエアは、当技術分野において公知である（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３－５８７７において改良され、ＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２）に組み込まれたＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４－２２６８を参照されたい）。特定の実施形態では、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２、ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）に記載されたように使用することができる。
用語「単離された」は、その自然環境に存在しない分子を指す。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離抗体は、その天然又は自然環境では生成されないか又は位置していない抗体である。組換え生成された生物学的物質は、例えば、ハイブリドーマなどの非天然細胞中で生成される物質であるため、本明細書で開示したように単離されていると見なされる。例えば、抗体等の単離タンパク質である物質も、任意の好適な技術によって分離、分別又は部分的若しくは実質的に精製されている場合、「単離された」と見なされる。例えば、抗体は、それが、細胞物質又はそれが由来する細胞若しくは組織起源の他のタンパク質を実質的に含んでいなければ、「単離された」と見なされる。
用語「特異的に結合する」は、分子（例えば、受容体又はエピトープ）を認識して結合し、且つ結合することが作用物質（例えば、抗体）と分子（例えば、リガンド）との間の何らかの相補性を引き起こす作用物質（例えば、リガンド若しくは抗体）を指す。この定義により、抗体は、無作為の関連していない分子に結合する場合より容易にそのリガンドに結合する場合に「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、それにより特定のリガンドに特定の抗体が結合する相対的親和性を認定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所定のリガンド（例えば、ＦＬＴ３Ｌ）に対して抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると推定され得る。
本明細書で使用する用語「親和性」は、個別エピトープと抗体のＣＤＲとの結合の強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の第２７～２８頁を参照されたい。本明細書で使用する用語「アビディティ」は、抗体及び抗原の集団間の複合体の総合的安定性、即ち抗体混合物と抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第３９～３４頁を参照されたい。アビディティは、集団内の個々の抗体と特定のエピトープとの親和性並びにまた抗体及び抗原の原子価の両方に関連する。
本明細書で同義的に使用される用語「阻害する」又は「遮断する」は、活性の完全な遮断を含む、生物活性における何らかの統計的有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物活性における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の減少を指すことができる。
用語「エフェクター機能」は、結果としてそれらのＦｃ成分とＦｃ受容体又は補体の成分との相互作用を生じる抗体の活性を指す。これらの活性としては、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が挙げられる。従って、変化したエフェクター機能を備える抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）の活性を変化させるＦｃ領域における変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加又はオリゴ糖の変化）を含有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を指す。改良されたエフェクター機能を備える抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰ）の活性を増加させるＦｃ領域における変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加又はオリゴ糖の変化）を含有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を指す。
用語「対象」は、特別な治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類等を含むが、それらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、用語「対象」、及び「患者」、及び「個体」は、本明細書では同義的に使用される。対象の追加の例としては、非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコが挙げられる。
用語「医薬組成物」は、有効成分（例えば、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体）の生物活性が有効であることを許容できる形態であり、及びその組成物が投与されるであろう対象にとって許容できない程傷害性である追加の成分を含有していない製剤を指す。そのような組成物は、無菌であり得る。
本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の「有効量」は、詳細に明記した目的を実施するために十分な量である。「有効量」は、経験により且つ本明細書に記載した目的に関連があるルーチン法で決定することができる。
用語「治療有効量」及び「薬学的有効量」は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又は対象における疾患若しくは障害を「治療する」ために有効な他の薬物の量を指す。
「治療する」、若しくは「治療」、若しくは「治療するため」又は「緩和する」若しくは「緩和するため」等の用語は、（１）診断された病理学的状態又は障害の進行を治癒させ、その進行を緩徐化し、症状を減少させ、且つ／又は停止させる治療的手段、並びに（２）標的となる病理学的状態又は障害の発生を防止及び／又は緩徐化する予防的又は防止的手段の両方を指す。従って、治療を必要とする対象としては、既に障害を有する対象；障害を有する傾向がある対象；及び障害が防止されなければならない対象が挙げられる。特定の態様では、対象は、患者が、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患と関連する症状の完全な、部分的な又は一過性の減少を示した場合、本開示の方法に従って自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して好結果で「治療される」。
本明細書に提供される範囲は、範囲内の全数値についての省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群からの任意の数、数の組合せ又は部分範囲を含むと理解される。
本明細書で使用する用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、障害及び／又はそれに関連する症状を減少又は緩和することを指す。除外されないが、疾患又は状態を治療することは、その疾患、それに関連する状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。例えば、本明細書で企図されるように、障害の治療は、その障害の症状の悪化を予防することを含む。
本明細書で使用する用語「又は」は、詳細に明記されていない限り又は文脈からその反対のことが明白でない限り、包括的であると理解すべきである。本明細書で使用する用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、詳細に規定しない限り又は文脈からその反対のことが明白でない限り、単数又は複数であると理解すべきである。
更に、本明細書で使用する場合の「及び／又は」は、２つ以上の規定した特徴又は他方を伴うか若しくは伴わない成分の各々の特定の開示であると見なすべきである。従って、本明細書の「Ａ及び／又はＢ」等の語句において使用される用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の語句において使用される用語「及び／又は」は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；及びＡ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を含むことが意図されている。
詳細に規定しない限り又は文脈から明白でない限り、本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野における通常の容認範囲内、例えば平均値の２つの標準偏差内であると理解される。「約」は、表示値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％超又はそれ未満以内であると理解することができる。他のことが指示されない限り、本明細書に提供した全ての数値は、用語「約」によって黙示的に修飾されていると見なされる。
ＦＬＴ３Ｌは、酵素的に可溶性形態に開裂される前に最初に膜結合タンパク質として発現される。膜結合（ｍＦＬＴ３Ｌ）及び分泌（ｓＦＬＴ３Ｌ）の両方は、機能的に活性である。ＦＬＴ３Ｌ結合領域は、ヒト、齧歯類及びカニクイザルのリガンド／受容体の組合せ間で異種間反応性が存在するため、観察される種を超えて高度に保存されている。しかしながら、結合部位の周囲の重要な突然変異は、ＦＬＴ３Ｌに対して生成された中和抗体の異種間反応性の欠如を説明すると考えられる。ＦＬＴ３Ｌに対する中和抗体は、古典的及び形質細胞様ＤＣ集団に免疫系が長期間の炎症応答を誘導して持続する能力を減少させて影響を及ぼし得る。副次的作用は、循環中ＮＫ細胞の減少並びにＴ細胞及びＢ細胞活性化の低下を含み、両方の細胞型の生存減少をもたらし得る。これらをまとめると、これらの経路のダウンレギュレーションは、自己免疫性炎症を低下させ得る。
１つの実施形態では、中和抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３ＬがＦＬＴ３に結合することを阻害することによって免疫恒常性を促進することが企図されている。抗ＦＬＴ３Ｌ抗体戦略は、予想外の受容体二量化又はシグナル伝達のリスクを回避するために、受容体を超えてリガンドを標的とする。その受容体と異なり、膜結合ＦＬＴ３Ｌと関連しているシグナル伝達ドメインは存在しない。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体
本開示は、好ましい実施形態では、単離ＦＬＴ３Ｌ結合分子、例えばＦＬＴ３Ｌ、例えばヒトＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。ＦＬＴ３Ｌについての全長アミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である（例えば、ヒトＦＬＴ３ＬについてＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３６８８８又はマウスＦＬＴ３ＬについてＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ００３４２を参照されたい）。本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３のＦＬＴ３Ｌ媒介性活性化を阻害し、それにより前炎症性シグナル伝達を低下させ、対象における炎症を減少させる。
好ましい実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、構造的に類似のＴＫＲ同族ヒト幹細胞因子（ｈｕＳＣＦ）又はヒトコロニー刺激因子（ｈｕＣＳＦ１）と交差反応しない。当業者であれば、ＳＣＦ及びＣＳＦがチロシンキナーゼ受容体にも結合するリガンドであることを認識するであろう。追加のチロシンキナーゼファミリーメンバーに結合する非特異的ＦＬＴ３阻害剤は、チロシンキナーゼシグナル伝達の包括的阻害から傷害性を誘発する。従って、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３Ｌのみに結合し、構造的類似のホモログに結合しないことが極めて重要である。多数の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及び阻害剤は、特異性を欠如しており、広範囲のチロシンキナーゼ受容体に結合する。従って、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の好ましい実施形態は、ＦＬＴ３Ｌに対する高親和性及びＦＬＴ３Ｌの特異的結合を証明しなければならない。
１つの実施形態では、本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び／又はキメラ抗体である。
一部の態様では、ＦＬＴ３Ｌ結合分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ若しくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ－ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧ ＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ディアボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ－Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２又はｓｃＦｖ－Ｆｃを含む。一部の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＩｇＧタイプ、例えばＩｇＧ１タイプ（ＩｇＧ１重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む）の抗体である。他の実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有する。
一部の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉｇκ定常ドメイン（領域）及びＩｇλ定常ドメインからなる群から選択される軽鎖定常領域を含み得る。１つの特定の実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン及びヒトλ定常ドメインを含む。別の特定の実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、Ｆｃ領域内の標的突然変異が２４３位のロイシンをフェニルアラニン（Ｌ２４３Ｆ）に、２３５位のロイシンをグルタミン酸（Ｌ２３５Ｅ）に、且つ３３１位のプロリンをセリン（Ｐ３３１Ｓ）に変化させるようなＩｇＧ１－ＴＭフォーマットを有する。アミノ酸のナンバリングは、ＥＵインデックスに従っている。標的突然変異は、ＦｃＲ結合及びＡＤＣＣエフェクター機能を減少させる（例えば、参照により組み込まれるＯｒｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００８ Ｊｕｎ １；６４（Ｐｔ ６）：７００－４；及び国際公開第２００９１００３０９（Ａ２）号パンフレットを参照されたい）。
一部の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ヒト抗体（例えば、ＣＡＴ５Ｄ９、ＳＣ４０１７、ＡＭ４０、ＣＡＴ８、ＣＡＴ２６、ＤＴＡＸ３及びＤＹＡＸ５抗体）である。
ＣＡＴ５Ｄ９抗体
１つの実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号５のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、配列番号２０の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号１９の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号７０のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号６９のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ５Ｄ９抗体は、配列番号７２の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号７１の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＳＣ４０１７抗体
１つの実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号３のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号１７の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号６６のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、ＳＣ４０１７抗体は、配列番号６８の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号６７の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＡＭ４０（ＭＥＤＩ１１１６）抗体
１つの実施形態では、ＡＭ４０抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＡＭ４０抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、ＡＭ４０抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号１のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、ＡＭ４０抗体は、配列番号１６の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号１５の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、ＡＭ４０抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号６２のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、ＡＭ４０抗体は、配列番号６４の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号６３の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＣＡＴ８抗体
１つの実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３９、４０、４１、４２、４３及び４４のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、配列番号２２の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号２１の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号７４のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号７３のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ８抗体は、配列番号７６の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号７５の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＣＡＴ２６抗体
１つの実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４５、４０、４６、４７、４８及び４９のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、配列番号２４の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号２３の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号７８のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号７７のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、ＣＡＴ２６抗体は、配列番号８０の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号７９の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＤＹＡＸ３抗体
１つの実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５０、５１、５２、５３、５４及び５５のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、配列番号２６の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号２５の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号８２のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号８１のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ３抗体は、配列番号８４の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号８３の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
ＤＹＡＸ５抗体
１つの実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体を指す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５６、５７、５２、５８、５９及び６０のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
更なる実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する２つのＶＬドメイン及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、配列番号２８の核酸配列によってコードされた２つのＶＬドメイン及び配列番号２７の核酸配列によってコードされた２つのＶＨドメインを含む抗体を指す。
１つの実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合し、且つ配列番号８６のアミノ酸配列を有する１本の軽鎖及び配列番号８５のアミノ酸配列を有する１本の重鎖を含むＩｇＧ１抗体を指す。
別の実施形態では、Ｄｙａｘ５抗体は、配列番号８８の核酸配列によってコードされた１本の軽鎖及び配列番号８７の核酸配列によってコードされた１本の重鎖を含む抗体を指す。
特定の実施形態では、相補性決定領域（ＣＤＲ）の組：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供が提供され、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３及びＦＷ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域（ＦＷ）を含む。
特定の態様では、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、（ａ）それぞれ配列番号１及び配列番号２；又は（ｂ）それぞれ配列番号３及び配列番号４；又は（ｃ）それぞれ配列番号５及び配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
特定の態様では、ＶＨのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）並びにＶＬのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）は、（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８のアミノ酸配列からなる。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体配列の概要表は、下記の表１に提示した。
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誘導体
本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する能力を保持していることを前提に配列の変異体を含み得る。そのような変異体は、当業者であれば、当技術分野において周知である技術を使用してこれらの抗体の配列から引き出すことができる。例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加は、抗体のそれらのエピトープへの結合を妨害する抗ＦＬＴ３Ｌ抗体のＦＲ領域内及び／又はＣＤＲ内で作成することができる。ＦＲ内の変化は、通常、抗原結合ドメインの安定性及び免疫原性を改善するために設計されるが、ＣＤＲ内の変化は、典型的には抗原結合ドメインのその標的への親和性を高めるために設計される。ＦＲの変異体には、天然型免疫グロブリンアロタイプも挙げられる。そのような親和性を高める変化は、ＣＤＲを変化させること及び抗原結合ドメインのその標的への親和性を試験することを含むルーチン技術によって経験的に決定することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、本明細書に開示したＣＤＲの何れか１つ内で作成することができる。様々な変化は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，１９９５に記載された方法に従って作成できる。これらの変化には、配列内で機能的に均等なアミノ酸残基をコードし、従って「サイレント」変化を生成する様々なコドンの置換によって変化されるヌクレオチド配列が含まれるが、それらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
本開示の抗体の誘導体及びアナログは、組換え法及び合成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＢｏｄａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、当技術分野において周知である様々な技術によって作成できる。
１つの実施形態では、本開示のＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを作成するための方法は、本明細書に開示したＶＨドメインのアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸を付加するか、欠失させるか、置換するか又は挿入するステップ、任意選択的にこのように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと結合するステップ及びＶＨドメイン又はＶＨ／ＶＬの１つ以上の組合せを抗原への特異的結合について試験するステップを含む。本明細書に開示したＶＬドメインの１つ以上の配列変異体が１つ以上のＶＨドメインと結合される類似の方法を使用できる。
類似のシャッフリング又はコンビナトリアル技術は、β－ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術について記載しているが、そのアプローチが抗体生成のために使用できることを観察しているＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９－３９１）によっても開示されている。
更なる実施形態では、１つ以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発法を使用して、本明細書に開示した配列に由来する１つ以上の配列を有する新規なＶＨ又はＶＬ領域を生成することができる。１つのそのような技術、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ（変異性）ＰＣＲは、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６－３５８０）によって記載されている。
使用できる別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲに突然変異誘発を方向付けることである。そのような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９－３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：５５１－５６７）によって開示されている。
同様に、抗原結合ドメインの１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲは、ＶＨ又はＶＬドメインのレパートリー内に移植することができ、それらは、その後、ＦＬＴ３Ｌに対して特異的である抗原結合断片に対してスクリーニングされる。
本明細書で有用である免疫グロブリン可変ドメインの一部分は、本明細書に実質的に規定した少なくとも１つのＣＤＲ及び任意選択的に本明細書に規定したｓｃＦｖ断片由来の介在性フレームワーク領域を含み得る。その部分は、ＦＲ１及びＦＲ４の何れか又は両方の少なくとも約５０％を含むことができ、その５０％は、ＦＲ１のＣ末端５０％及びＦＲ４のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端又はＣ末端にある追加の残基は、通常、天然型可変ドメイン領域と関連していない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、クローニング又は他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによってコードされたＮ末端又はＣ末端残基の導入を生じさせ得る。他の操作ステップには、免疫グロブリン重鎖定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの生成における）又は下記でより詳細に考察するタンパク性標識を含む、更なるタンパク質配列に可変ドメインを結合するためのリンカーの導入が含まれる。
本明細書に記載した本開示の抗原結合ドメインは、他の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（アルブミン、別の抗体等）に結合させることができる。例えば、抗原結合ドメインは、化学的架橋結合又は組換え法によって結合させることができる。抗原結合ドメインは、様々な非タンパク性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書；又は同第４，１７９，３３７号明細書に規定した方法で結合させることもできる。抗原結合ドメインは、例えば、それらの循環中半減期を増加させるために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾することができる。典型的なポリマー及びそれらに付着させるための方法は、米国特許第４，７６６，１０６号明細書；同第４，１７９，３３７号明細書；同第４，４９５，２８５号明細書及び同第４，６０９，５４６号明細書にも示されている。
本明細書に開示した抗体は、自然パターンと異なるグリコシル化パターンを有するように変化させることもできる。例えば、１つ以上の炭水化物部位を欠失させることができ、且つ／又は１つ以上のグリコシル化部位を付加することができる。本明細書に開示した抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、当技術分野において公知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって実施することができる。抗体断片上の炭水化物部位の数を増加させる別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによる。そのような方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：２５９－３０６に記載されている。抗体からの任意の炭水化物部分の除去は、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１及びＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０に記載されているように、科学的又は酵素的に実施することができる。抗体断片は、検出可能な標識又は機能的標識を用いて標識することもできる。検出可能な標識には、従来型化学を使用して更に抗体断片に付着させることもできる放射性標識、例えば１３１Ｉ又は９９Ｔｃが含まれる。検出可能な標識には、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等も含まれる。検出可能な標識には、化学的部分、例えば特異的同族検出可能部分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出できるビオチンが更に含まれる。
ＣＤＲ配列が、本明細書に規定したＣＤＲ配列と非実質的にのみ相違する抗原結合ドメインは、本開示の範囲内に含まれる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性又は立体化学的特徴を有する関連アミノ酸によって置換される。そのような置換は、当業者の技術の範囲内に含まれるであろう。ＣＤＲと異なり、抗体の結合特性に有害な影響を及ぼさずにＦＲ内でより実質的な変化を加えることができる。ＦＲへの変化には、非ヒト由来をヒト化するか、又は抗原接触若しくは結合部位を安定化するために重要である特定のフレームワーク残基を操作すること、例えば定常領域のクラス又はサブクラスを変化させること、例えば米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書並びにＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７－２６６２及びＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９－３２４に記載されているように、Ｆｃ受容体結合等のエフェクター機能を変化させる可能性がある特異的アミノ酸残基を変化させること又は定常領域がそれに由来する種を変化させることが含まれるが、それらに限定されない。
当業者であれば、上記に記載した修飾が完全に排他的ではないこと、本明細書に記載したタンパク質サブユニットに適用できること及び多数の他の修飾が本開示の教示に照らせば当業者に可能であろうことを理解するであろう。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の親和性及び特異性
当業者は、自己免疫疾患において使用するための抗ＦＬＴ３Ｌ抗体が、高親和性の結合を必要とするが、それでもヒトにおけるそれらの使用を妨害する傷害性が欠如していなければならないことを認識するであろう。ＦＬＴ３Ｌの構造的類似のホモログとしては、幹細胞因子（ＫＩＴ－リガンドとしても公知であるＳＣＦ）及びコロニー刺激因子１（マクロファージコロニー刺激因子「Ｍ－ＣＳＦ」としても公知であるＣＳＦ１）が挙げられる。ＦＬＴ３Ｌに結合し、且つＳＣＦ及びＣＳＦ１にも結合する非特異的抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、非特異的な傷害性を生じさせ得る。従って、本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３Ｌのみに対する結合特異性を保持しているが、ＳＣＦ及びＣＳＦ１等の構造的に類似のサイトカインには特異的に結合しない。当業者であれば、結合特異性の尺度としてのＫｏｎ、Ｋｏｆｆ及びＫＤを含むが、それには限定されない結合動態を使用することを知っているであろう。
血清中ＦＬＴ３Ｌ及び循環中ｐＤＣは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体リードクローンと関連している傷害性の指標として使用できるバイオマーカーである。ＦＬＴ３Ｌが中和された場合のｐＤＣの急激な低下は、免疫反応を強化するＦＬＴ３Ｌ媒介性細胞シグナル伝達の抑制を示している。ＦＬＴ３Ｌの存在下でのｐＤＣの頻度の急激な回復は、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体における傷害性の欠如を反映する可能性がある。好ましい実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、ＦＬＴ３Ｌを中和し、遊離ＦＬＴ３Ｌが回復する場合にｃＤＣ及びｐＤＣの可逆性枯渇を許容する。当業者であれば、ベースラインへの回復が続くＦＬＴ３Ｌの中和後の樹状細胞の低下がリードクローンの低傷害性の指標であることを認識するであろう。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の生成
本開示の実施は、他に特に指示しない限り、当業者の知識の範囲内に明確に含まれる分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の技術を使用する。そのような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９６）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」；（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）等の文献において十分に説明されている。これらの技術は、本開示のポリペプチドの生成に適用することができ、従って本開示を生成及び実施する際に考慮に入れることができる。特定の実施形態のために特に有用な技術について、下記の実施例のセクションにおいて考察する。
１つの実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子は、宿主細胞内での発現のための１つ以上の制御配列に操作可能に連結している。単離核酸は、ベクター内に組換え的に組み込むことができ、これは、次に、公知の技術を使用して宿主細胞内にトランスフェクトされる。
１つの実施形態では、１つ以上の制御配列に操作可能に連結されている抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞は、本明細書で企図されている。企図された宿主細胞の実施例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞が挙げられる。
１つの実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（例えば、ＣＡＴ５Ｄ９、ＳＣ４０１７又はＡＭ４０）及びその抗原結合断片は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されるもの等のハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物は、免疫抗原に特異的に結合するであろう抗体のリンパ球による産生を引き出すために、上述したように免疫される。
別の実施形態では、リンパ球は、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球は、単離され、例えばポリエチレングリコールを使用して、その後、未融合リンパ球及び骨髄腫細胞から選択して除去できるハイブリドーマ細胞を形成するために、好適な骨髄腫細胞系と融合される。免疫沈降法、免疫ブロッティング法又はインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される選択された抗原に対して特異的に立てられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その後、標準法（Ｃｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を使用してインビトロ培養中又は動物における腹水腫瘍としてインビボでの何れかで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、その後、上記のポリクローナル抗体について記載したように培養培地又は腹水液から精製することができる。
代わりに、抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（例えば、ＣＡＴ５Ｄ９、ＳＣ４０１７又はＡＭ４０）及びその抗原結合断片は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載された組換えＤＮＡ法を使用して作成することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲ等によって成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は、従来型手技を使用して決定される。重鎖及び軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドは、次に、好適な発現ベクター内にクローン化され、これらは、さもなければ宿主細胞によって生成される免疫グロブリンタンパク質、モノクローナル抗体を生成しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞等の宿主細胞内にトランスフェクトされる。更に、所望の種の組換え抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７）に記載されたように所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、交互抗体を生成するために組換えＤＮＡテクノロジーを使用して多数の異なる方法で更に修飾することができる。一部の態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、（１）例えば、キメラ抗体を生成するためにヒト抗体のそれらの領域、又は（２）融合抗体を生成するために非免疫グロブリンポリペプチドと置換され得る。一部の態様では、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成するために切断又は除去される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を使用すると、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
特定の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して直接的に調製され得る。インビトロで免疫されたか、又は標的抗原に対して立てられた抗体を生成する免疫した個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球を生成することができる（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（ｌ）：８６－９５；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照されたい）。
更に、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ファージライブラリーから選択することができ、ここで、そのファージライブラリーは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９－３１４，Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７－６１６２，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）に記載されているようにヒト抗体を発現する。抗体ファージライブラリーを生成及び使用するための技術は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書及び同第７，２６４，９６３号明細書；並びにＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８（これらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略（参照によりその全体として組み込まれるＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３）は、当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片を生成するために使用することができる。
一部の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体は、ヒト化抗体であり得る。非ヒト又はヒト抗体を遺伝子操作、ヒト化又は表面再構成するための方法も使用することができ、当技術分野において周知である。ヒト化、表面再構成又は類似に遺伝子操作された抗体は、非ヒト、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物であるが、それらに限定されない起源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には、公知のヒト配列の「輸入」可変ドメイン、定常ドメイン又は他のドメインから取り出される「輸入」残基と言われることが多い残基と置換される。そのような輸入配列は、免疫原性を減少させるか、又は結合、親和性、オンレート（ｏｎ－ｒａｔｅ）、オフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、アビディティ、半減期若しくは当技術分野において公知である任意の他の好適な特徴を減少、増強又は修飾するために使用することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、ＦＬＴ３Ｌの結合に影響を及ぼすことに直接的且つ最も実質的に関与している。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全部は、可変領域及び定常領域の非ヒト配列がヒトアミノ酸又は他のアミノ酸と置換され得る間に維持される。
抗体は、任意選択的に、ヒト化、表面再構成、遺伝子組み換えされ得るか、又はＦＬＴ３Ｌ抗原に対する高親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持しながら遺伝子組換えされたヒト抗体でもあり得る。この目標を達成するために、ヒト化（若しくはヒト）又は遺伝子組換え抗ＦＬＴ３Ｌ抗体及び表面再構成抗体は、任意選択的に、親配列並びに遺伝子組換え配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列並びに様々な概念的ヒト化及び遺伝子組換え産物を分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは、市販で入手可能であり、当業者であれば習熟している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体配座構造を例示及び提示するコンピュータープログラムは、利用可能である。これらの提示に関する検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割に関する分析、即ちＦＬＴ３Ｌ等の候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を許容する。この方法でフレームワーク（ＦＷ）残基を選択し、標的抗原に対する親和性の増加等の所望の抗体特徴が達成されるように、コンセンサス配列及び輸入配列から組み合わせることができる。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片のヒト化、表面再構成又は遺伝子操作は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第５，９，５５，３５８号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第６，３３１，４３１号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第７，６３５，６６６号明細書；同第７，７２３，２７０号明細書；同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；国際出願公開ＰＣＴ／米国特許第Ｓ９８／１６２８０号明細書；ＰＣＴ／米国特許第９１／０５９３９号明細書；ＰＣＴ／米国特許第９４／０１２３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許第９２／０１７５５号明細書；国際特許出願公開国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；同第９０／１４４２４号パンフレット；同第９０／１４４３０号パンフレット；及び欧州特許公開欧州特許第２２９２４６号明細書（これらのそれぞれは、それらの中に言及された文献を含めて、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている方法等であるが、それらに限定されない任意の公知の方法によって実施することができる。
抗ＦＬＴ３Ｌヒト化抗体及びその抗原結合断片は、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生成する免疫後に可能であるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作成することもできる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
特定の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体断片が提供される。抗体断片を生成するために様々な技術が公知である。従来、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク分解性消化によって引き出される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。特定の態様では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体断片は、組換え的に生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は、全てが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞内で発現及び分泌され得るため、従って大量のこれらの断片の生成を可能にする。そのような抗ＦＬＴ３Ｌ抗体断片は、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗ＦＬＴ３Ｌ抗体断片は、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されたように線状抗体でもあり得る。抗体断片を生成するための他の技術、例えば化学合成は、当業者に明白であろう。
本開示によると、ＦＬＴ３Ｌに特異的である一本鎖抗体を生成するための技術を適用することができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）。更に、ＦＬＴ３Ｌ又はその誘導体、断片、アナログ若しくはホモログに対する所望の特異性を備えるモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ効果的な同定を許容するためのＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）を参照されたい）を構築するための方法を適合させることができる。抗体断片は、（ａ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることによって生成されるＦａｂ断片、（ｃ）パパイン及び還元剤を用いた抗体分子の処理によって生成されるＦａｂ断片、及び（ｄ）Ｆｖ断片を含むが、それらに限定されない当技術分野の技術によって生成することができる。
本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、その血清中半減期を増加させるために修飾することができる。これは、例えば、抗体若しくは抗体断片における適切な領域の突然変異による抗体若しくは抗体断片内へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、又はその後、何れかの端部若しくは中央部での抗体若しくは抗体断片に（例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって）、若しくはＹＴＥ突然変異によって融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより達成され得る。抗体又はその抗原結合断片の血清中半減期を増加させるための他の方法、例えばＰＥＧ等の異種分子へのコンジュゲート化は、当技術分野において公知である。
医薬組成物
本発明は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物にも向けられる。特定の実施形態では、本開示は、対象を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
有効量の本開示の医薬組成物が投与されなければならず、ここで、「有効量」は、対象における所望の予防的、治療的又は緩和的反応を生成するために十分な量であると定義されいている。有効量は、投与される対象の種及び体重に依存して変動するであろうが、標準技術を使用して確定することができる。
特定の態様では、本開示は、限定なく、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬又は関節リウマチを含む自己免疫疾患の治療又は（その可能性を低下させる）予防において、それを必要とする対象において使用するための治療用及び予防用組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。これに関連して、「薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤」には、ヒト又は家畜において使用するために許容されると米合衆国食品医薬品局によって承認されているか又は承認されていない可能性がある任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存料、色素／着色料、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤又は乳化剤が含まれるが、それらに限定されない。例えば、適切な担体は、当業者に公知であり、安定剤、希釈剤及び緩衝剤が含まれる。好適な安定剤としては、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン及びグルコース並びにアルブミン又はカゼイン等のタンパク質が挙げられる。好適な希釈剤としては、食塩液、ハンクス平衡食塩液及びリンゲル液が挙げられる。好適な緩衝剤としては、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩又はアルカリ土類金属炭酸塩が挙げられる。
特定の態様では、本開示の医薬組成物は、１種以上の補助物質、例えば１種以上の脂質、リン脂質、炭水化物及びリポポリ多糖を更に含有することができる。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、任意選択的に１種以上の追加の活性物質を含む。
特定の場合、本開示の医薬組成物は、当業者に公知の技術によって調製することができる。医薬組成物の製剤及び／又は製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。一般に、本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、液剤、懸濁液又は乳剤を形成するために担体と混合される。本明細書で考察した１種以上の添加物は、担体中に添加され得るか又は引き続いて添加され得る。本開示の医薬組成物は、水溶液、乳剤若しくは懸濁液であり得るか又は乾燥製剤であり得る。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、例えば、保管又は製剤の目的でフリーズドライ若しくはスプレードライによって乾燥させるか又は凍結乾燥させることができる。それらは、引き続いて、適切な液体担体の添加によって液体組成物に再構成することができるか、又は当業者であれば公知の方法を使用して乾燥製剤で投与され得る。
本開示の医薬組成物は、当技術分野において公知の様々な経路によって対象に投与され得る。そのような医薬組成物を投与する典型的な経路としては、経口、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、経口腔、経直腸、経膣及び鼻腔内が挙げられる。従って、特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、経口腔、経直腸、経膣及び鼻腔内経路からなる群から選択される経路によって投与されるように調製される。本明細書で使用する用語非経口には、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内注射又は注入技術が含まれる。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、その中に含有された本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片が対象への投与後に生体内利用可能となることを許容するように調製される。
医薬組成物の投与の選択は、選択される製剤に依存するであろう。本開示の医薬組成物は、処方物と適合する方法及び治療的に有効であるような量で投与される。特定の態様では、本開示の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア及びエアロゾルを含むが、それらに限定されない固体、半固体、液体又は気体形態の製剤に調製される。
特定の例では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、固体又は液体の形態であり得る。一部の態様では、担体は、例えば、組成物が錠剤又は散剤形態であるように粒子状物質である。他の態様では、担体は、液体であり、組成物は、例えば、吸入投与のために有用である経口シロップ、注射液又はエアロゾルである。経口投与が意図される場合、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、固体形又は液体形の何れかであり、ここで、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形は、固体又は液体の何れかとして本明細書で考察された形態に含まれる。
特定の態様では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、ピル剤、カプセル剤、チューインガム、ウエファー等の形態に調製され得る。一部の例では、そのような固体組成物は、典型的には１種以上の不活性希釈剤又は食用担体を含有するであろう。特定の実施形態では、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガントガム又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース又はデキストリン；崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチ等；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｘ；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料；及び着色剤の１種以上が追加的に存在し得る。
これらの組成物は、ミクロスフェア、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放性製剤又は散剤の形態を取ることができ、約０．００１～９５％の本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含有する。一部の剤形は、５０μｇ～２５０μｇの抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含有し得る。
一部の態様では、本開示の医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、本明細書に開示した物質に加えて、ポリエチレングリコール又は油等の液体担体を含有し得る。経口製剤は、通常使用される賦形剤、例えば医薬等級のサッカリン、セルロース及び炭酸マグネシウムも含み得る。
他の態様では、本開示の医薬組成物は、液体、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の形態である。特定の実施形態では、液体は、経口投与のため又は注射による送達のためであり得る。特定の実施形態では、経口投与のために意図された場合、本開示の医薬組成物は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片に加えて、１種以上の甘味剤、保存剤、色素／着色剤及び風味増強剤を含有する。特定の態様では、注射によって投与されることが意図される医薬組成物では、１種以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤を含めることができる。
特定の場合、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む液体医薬組成物は、それらが液剤、懸濁剤又は他の同様の形態であってもなくても、以下の成分：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩液、例えば生理学的食塩液、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えば溶媒又は懸濁媒体として機能できる合成モノグリセリド若しくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び等張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースの１種以上を含み得る。一部の場合、製剤は、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入することができる。一部の実施形態では、注射用医薬組成物は、好ましくは、無菌である。
他の実施形態では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、局所投与を目的とすることができ、その場合、担体は、好適には溶液、乳剤、軟膏又はゲル基剤を含み得る。特定の態様では、その基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、希釈剤、例えば水及びアルコール並びに乳化剤及び安定剤の１種以上を含み得る。他の態様では、増粘剤が局所投与のための医薬組成物中に存在し得る。特定の実施形態では、経皮投与が意図される場合、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、経皮パッチ又はイオントフォレーシス器具と共に含めることができる。
更に他の実施形態では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、例えば、坐剤の形態において、直腸投与のために意図されている。坐剤のために、結合剤及び担体は、例えば、ポリアルカレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）又はトリグリセリドを含み得る。特定の例では、直腸投与のための組成物は、好適な非刺激性賦形剤として脂肪性基剤を含有する。そのような基剤としては、限定なく、ラノリン、カカオ脂又はポリエチレングリコールが挙げられる。
他の態様では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、エアロゾルとして投与され得る用量単位を含む。用語エアロゾルは、コロイド的性質のシステムから、加圧式パッケージからなるシステムの範囲に及ぶ様々なシステムを意味するために使用される。特定の実施形態では、送達は、液化ガス若しくは圧縮ガスにより、又は有効成分を定量吐出する好適なポンプシステムにより実施される。一部の実施形態では、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片のエアロゾルは、有効成分を送達するために単相系、二相系又は三相系で送達され得る。他の実施形態では、エアロゾルの送達は、一緒にキットを形成し得る必要な容器、アクチベーター、バルブ、小分け容器等を含む。当業者であれば、特定のエアロゾル製剤及び送達様式を容易に決定することができる。
本開示の医薬組成物は、好適な非毒性医薬担体で投与され得、マイクロカプセル、マイクロビーズに含まれ得、且つ／又は徐放性インプラントに含まれ得る。
他の態様では、本開示の医薬組成物は、有効成分の周囲でコーティングシェルを形成する物質を含む。一部の例では、コーティングシェルを形成する物質は、典型的には不活性であり、例えば糖、セラック及び他の腸溶コーティング剤から選択され得る。
更に他の実施形態では、固体又は液体形態における本開示の医薬組成物としては、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片に結合し、それにより抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片の送達を支援する作用物質が挙げられる。特定の例では、この能力において作用する好適な作用物質には、タンパク質又はリポソームが含まれる。
特定の態様では、対象に投与されるであろう医薬組成物は、１種以上の用量単位の形態を取り、ここで、例えば、錠剤は、単一用量単位であり得、本明細書に開示したエアロゾル形態である抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片の容器は、複数の用量単位を保持することができる。そのような剤形を調製するための実際的な方法は、公知であるか、又は当業者に明白であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照されたい。投与されるべき組成物は、いかなる場合でも、本明細書の教示に従って対象の疾患又は状態の治療に役立つように、治療有効量の、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体若しくはその抗原結合断片又はそれらの薬学的に許容される塩を含有するであろう。
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、１種以上の追加の治療的活性物質を含む。他の実施形態では、治療有効量の本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、１種以上の追加の治療的活性物質と併用して投与される。本明細書で使用する「併用」は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片及び１種以上の追加の治療的活性物質を含む併用を指すが、それらの各々は、逐次的（連続的）に、一緒に又は同時に投与され得る。
本開示の医薬組成物は、望ましくは、治療レベルを維持するために数回の間隔を空けて投与され得る。本開示の医薬組成物は、他の殺菌法又は静菌法と結び付けて使用され得る。
本明細書に提供した医薬組成物についての説明は、主としてヒトに投与するために好適である医薬組成物に向けられるが、当業者であれば、そのような組成物が概して全ての種類の対象に投与するために好適であることを理解するであろう。特定の態様では、対象は、哺乳動物である。特定の態様では、哺乳動物としては、ヒト、サル及び類人猿等の霊長類並びに研究室用動物及び身近なペット類を含む家畜動物及び農耕動物（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）等の非霊長類並びに野生動物、鳥類等の非家畜動物が挙げられる。
自己免疫／抗炎症性療法
本開示は、自己免疫疾患及び／又は他の炎症性疾患（即ち過剰反応性及び／又は異常機能免疫系を包含する疾患）を治療するために有用である、例えば上記のもの等の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体を含む組成物及び方法も特徴とする。様々な実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、対象の免疫系又は特定の抗原若しくは一連の抗原への特異的免疫反応を阻害するか又は減弱させ、それにより自己免疫疾患又は他の炎症性疾患を減少又は予防するために設計された他の免疫調節薬と併用して投与することができる。
更に、本明細書では、１種以上の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与を含む、自己免疫疾患及び／又は他の炎症性疾患を治療するための方法が提供される。本明細書で示したように、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、免疫反応の減少、１つ以上の免疫学的シグナル伝達カスケードの発現又は免疫細胞集団の減少の少なくとも１つを生じさせ得る。特定の態様では、自己免疫疾患又は他の炎症性疾患を提示している患者又は対象に抗ＦＬＴ３Ｌ抗体が投与される。
抗ＦＬＴ３Ｌ抗体を含む自己免疫疾患及び／又は他の炎症性疾患療法の治療は、例えば、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の進行速度の減少、免疫細胞増殖の遅延若しくは安定化、病変の収縮（例えば、ＭＳ患者における等）及び／又は疾患の退行を引き起こす。一部の態様では、自己免疫疾患又は炎症性疾患の減少又は遅延（例えば、炎症、炎症性サイトカインのレベル、免疫細胞集団及び／又は組織病変等の関連性損傷の減少）を測定する測定基準は、統計的に有意であり得る。自己免疫疾患又は炎症性疾患の測定基準における減少は、個体の疾患進行の予想レベルに対する、大きい患者集団に基づく疾患進行の予想レベルに対する又はコントロール集団の疾患進行の予想レベルに対する、ベースライン時（治療前）の患者の測定基準のレベルとの比較によって測定することができる。
１つの実施形態では、本明細書で企図した治療方法は、本開示の抗ＦＬＴ３Ｌ結合分子、抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体の、対象又は患者への適用又は投与或いは抗ＦＬＴ３Ｌ結合分子の、対象又は患者由来の単離組織又は細胞系への適用又は投与を含み、ここで、対象又は患者は、疾患、疾患の症状又は疾患に向かう素因を有する。
企図される疾患の例としては、１型及び２型糖尿病を含む急性又は慢性炎症性疾患、例えば糖尿病、糖尿病性腎症及び高血圧によって誘発されたＣＫＤを含むＣＫＤ、動脈硬化症、アルツハイマー病、癌並びに心疾患、高血圧、貧血症、心膜炎、腎性骨ジストロフィー等を含むそのような疾患の関連合併症が挙げられる。追加の企図される疾患の例としては、限定なく、全身性エリテマトーデス、筋炎、原発性シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬及び関節リウマチを含む自己免疫疾患が挙げられる。
別の実施形態では、抗ＦＬＴ３Ｌ結合分子、例えば、本開示の抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体を含む医薬組成物の、対象又は患者への適用又は投与或いは抗ＦＬＴ３Ｌ結合分子を含む医薬組成物の、対象又は患者に由来する単離組織又は細胞系への適用又は投与を含む治療も企図されており、ここで、対象又は患者は、疾患、疾患の症状又は疾患に向かう素因を有する。
本開示の方法によると、本明細書の何れかの箇所で定義した少なくとも１つの抗ＦＬＴ３Ｌ抗体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関する肯定的な治療反応を促進するために使用される。用語「肯定的な治療反応」は、自己免疫疾患又は炎症性疾患と関連している症状の減少を指す。従って、例えば、疾患の改良は、完全な反応であると特徴付けることができる。「完全な反応」は、任意の以前の試験結果の正常化を伴う臨床的に検出可能な疾患の非存在であることが意図されている。代わりに、疾患の改良は、部分的反応であると分類することができる。「肯定的な治療反応」は、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ結合分子の投与の結果として生じた、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の進行及び／又は期間の減少若しくは阻害、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患の重症度の減少若しくは緩和及び／又はそれらの１つ以上の症状の緩和を含む。
特定の実施形態では、原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
特定の実施形態では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、対象は、健常対象と比較して、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度によって測定されるＦＬＴ３Ｌの増加した血清中レベルを有する。
一部の実施形態では、対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断するための方法であって、（ａ）ＦＬＴ３Ｌの血清中レベルを測定するステップ、又は（ｂ）ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度を測定するステップを含み、健常ドナーと比較して対象におけるＦＬＴ３Ｌの増加した血清中レベル又はＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の素増加した頻度は、対象がＳＬＥを有することを示す、方法が提供される。特定の態様では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）である。
一部の実施形態では、膜結合ＦＬＴ３Ｌの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、ＦＬＴ３Ｌは、膜結合ＦＬＴ３Ｌの活性が「投与前」レベルに戻ることができるように可逆的に中和される。
他の実施形態では、可溶性ＦＬＴ３Ｌの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、ＦＬＴ３Ｌは、可溶性ＦＬＴ３Ｌのレベルが投与前レベルに戻ることができるように可逆的に中和される。
特定の実施形態では、可溶性ＦＬＴ３Ｌを中和する方法は、対象に抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を週１回、約０．０３ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの範囲で皮下投与するステップを更に含む。他の実施形態では、本方法は、対象に抗ＦＬＴ３Ｌ抗体又はその抗原結合断片を４週間毎に１回、約１５０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与するステップを更に含む。
他の実施形態では、循環している古典的樹状細胞（ｃＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。特定の態様では、ｃＤＣ及びｐＤＣの集団は、ｃＤＣ及びｐＤＣの集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される。
特定の実施形態では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＦＬＴ３Ｌの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法が提供される。
他の実施形態では、リンパ芽球におけるＥＲＫシグナル伝達を減少させる方法であって、リンパ芽球を、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法が提供される。
特定の実施形態では、一次ＣＤ１３３＋ヒト幹細胞におけるＭＥＫ １／２リン酸化を減少させる方法であって、幹細胞を、本明細書に開示した抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法が提供される。
本開示は、次の態様を包含する。
［項１］
ＦＬＴ３Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の組：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、
（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は
（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は
（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８
のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。
［項２］
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３及びＦＷ４で配列された３個のＣＤＲ及び４個のフレームワーク領域（ＦＷ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬ領域は、
（ａ）それぞれ配列番号１及び配列番号２；又は
（ｂ）それぞれ配列番号３及び配列番号４；又は
（ｃ）それぞれ配列番号５及び配列番号６
と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する、項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項３］
前記ＶＨの前記ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）並びに前記ＶＬの前記ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）は、
（ａ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４；又は
（ｂ）それぞれ配列番号２９、３０、３１、３５、３３及び３４；又は
（ｃ）それぞれ配列番号２９、３６、３７、３２、３３及び３８
のアミノ酸配列からなる、項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項４］
前記ＶＨ及びＶＬは、
（ａ）それぞれ配列番号１及び配列番号２；又は
（ｂ）それぞれ配列番号３及び配列番号４；又は
（ｃ）それぞれ配列番号５及び配列番号６
のアミノ酸配列を含む、項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項５］
（ａ）配列番号６１を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号６２を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域；又は
（ｂ）配列番号６５を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号６６を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域；又は
（ｃ）配列番号６９を含むアミノ酸配列を有する重鎖領域及び配列番号７０を含むアミノ酸配列を有する軽鎖領域
を含む、項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
［項６］
ヒト幹細胞、造血細胞前駆体、樹状細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞、単核白血球又はミクログリア上の膜結合ＦＬＴ３のＦＬＴ３Ｌ媒介性活性化を阻害する、項１～５の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項７］
ヒト幹細胞因子（ｈｕＳＣＦ）及びヒトコロニー刺激因子（ｈｕＣＳＦ１）の少なくとも１つに特異的に結合しない、項６に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項８］
ｈｕＳＣＦ又はｈｕＣＳＦ１の何れかに特異的に結合しない、項６に記載の抗体又はその断片。
［項９］
モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１０］
（ａ）ＩｇＡ定常ドメイン；
（ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン；
（ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン；
（ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン；
（ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン；
（ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン；
（ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン；及び
（ｈ）ＩｇＭ定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項１～９の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１１］
ＩｇＧ１定常ドメインを含む、項１０に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１２］
（ａ）Ｉｇκ定常ドメイン；及び
（ｂ）Ｉｇλ定常ドメイン
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを更に含む、項１～１１の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１３］
抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトλ軽鎖定常ドメインを含む、項１～１２の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１４］
前記ＩｇＧ１定常ドメインは、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
［項１５］
項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
［項１６］
制御配列に操作可能に連結されている、項１５に記載の核酸分子。
［項１７］
項１５又は１６に記載の核酸分子を含むベクター。
［項１８］
項１５若しくは１６に記載の核酸分子又は項１７に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
［項１９］
哺乳動物宿主細胞である、項１８に記載の宿主細胞。
［項２０］
項１～１４の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成するハイブリドーマ。
［項２１］
項１～１４の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成する単離宿主細胞。
［項２２］
項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、（ａ）前記抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法。
［項２３］
項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
［項２４］
医薬品として使用するための、項２３に記載の医薬組成物。
［項２５］
腎炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項２６］
原発性シェーグレン症候群を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項２７］
筋炎を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項２８］
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項２９］
前記対象は、健常対象と比較して、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度によって測定されるＦＬＴ３Ｌの増加した血清中レベルを有する、項２８に記載の方法。
［項３０］
対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断するための方法であって、
ａ．ＦＬＴ３Ｌの血清中レベルを測定するステップ；又は
ｂ．ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度を測定するステップ
を含み、前記対象における健常ドナーと比較したＦＬＴ３Ｌの増加した血清中レベル又はＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加した頻度は、前記対象がＳＬＥを有することを示す、方法。
［項３１］
前記ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、エフェクターメモリー細胞（Ｔ ＥＭ ）である、項３０に記載の方法。
［項３２］
膜結合ＦＬＴ３Ｌの中和を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
［項３３］
前記ＦＬＴ３Ｌは、可逆的に中和される、項２３に記載の方法。
［項３４］
循環している古典的樹状細胞（ｃＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の集団の減少を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を前記対象に投与するステップを含む方法。
［項３５］
ｃＤＣ及びｐＤＣの前記集団は、ｃＤＣ及びｐＤＣの前記集団が投与前レベルに戻ることができるように可逆的に減少される、項３４に記載の方法。
［項３６］
ＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＦＬＴ３Ｌの発現を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項３７］
ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージを減少させる方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
［項３８］
リンパ芽球におけるＥＲＫシグナル伝達を減少させる方法であって、前記リンパ芽球を、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
［項３９］
一次ＣＤ１３３＋ヒト幹細胞におけるＭＥＫ １／２リン酸化を減少させる方法であって、前記幹細胞を、項１～１４の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
下記の実施例は、本開示のアッセイ、スクリーニング及び治療方法を作成及び使用する方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供できるように提示するものであり、本発明者らがそれらの開示と見なすものの範囲を限定することを意図されていない。
本開示について下記の実施例を参照しながら説明する。実施例は、例示に過ぎず、本開示は、決してこれらの実施例に限定されると見なすべきではなく、むしろ本明細書に提供した教示の結果として明白になるあらゆる変形形態を含むと見なすべきである。
実施例１．抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の生成
概説：
ＦＬＴ３Ｌは、６５ｋＤａの非ジスルフィド結合ホモ二量体である糖タンパク質である。ヒト、非ヒト霊長類及びマウスについてのリガンド及び受容体の配列相同性を下記の表２に示した。
Figure 0007525397000014
完全マウスＦＬＴ３Ｌタンパク質の相同性は、７３％に過ぎないが、それのＦＬＴ３との結合部位は、種間で高度に保存されている。実際に、ヒトＦＬＴ３Ｌは、マウスＦＬＴ３に結合して活性化するが、その逆も同様である。ＦＬＴ３Ｌは、幹細胞因子（ＳＣＦ又はＫＩＴ－リガンド）及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ１）との構造的相同性を有するが、他のヒトサイトカインとの有意な配列相同性を有していない。これらの２種のリガンドに対する受容体であるｃ－ＫＩＴ及びＣＳＦ１Ｒは、それぞれ通例ＦＬＴ３の阻害剤と相互作用するクラスＩＩＩのＴＫＲでもあり、臨床使用において望ましくないオフターゲット傷害性を生じさせる。これらを考察して、ＦＬＴ３／ＦＬＴ３Ｌ経路の高度に特異的な阻害を提供する、ＳＣＦ又はＣＳＦ１と交差反応しないであろう、ＦＬＴ３Ｌに対する抗体が探求された。
リード抗体は、可溶性ヒト及びマウスＦＬＴ３－Ｌに関する二者択一の選択を使用して、選択及び試験した。一次生化学的ハイスループットスクリーニングは、ヒトＦＬＴ３／ＦＬＴ３Ｌ競合完全均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して実施した。全ての一本鎖可変断片－断片結晶領域（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）のヒットをＩｇＧ１ ＴＭフォーマットに変換させ、その後、標的細胞表面上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションを使用する機能的スクリーニングアッセイを使用してリード抗体の阻害活性を確証した。マウス及びカニクイザルのＦＬＴ３Ｌに対する交差反応性及び選択性並びに例えば幹細胞因子（ｓｃｆ）等の他のファミリーメンバーの排除は、ＥＬＩＳＡ及び機能的アッセイを使用して確証した。
リード化合物は、ＲＳ４；１１細胞系及び一次ヒトＣＤ１３３＋幹細胞におけるＦＬＴ３シグナル伝達アッセイを使用して更に評価した。内在性ＦＬＴ３Ｌへの結合は、一次ヒトＴ細胞を使用して確証した。特異的な結合部位及び結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ及びＢＩＡｃｏｒｅのそれぞれによって決定した。下記に記載するように、結果として生じたリード抗体クローンを更なる最適化のために選択した。
リード抗体候補の識別活動（Ｃ５、Ｂ１０～１１）
抗ＦＬＴ３Ｌ結合研究のためのリード抗体は、図１に示したように、ファージライブラリーを最初にスクリーニングすることによって生成した。ファージディスプレイライブラリーである骨髄Ｖａｕｇｈａｎ（ＢＭＶ）、結合脾臓（ＣＳ）、ＤＰ４７ライブラリー（ＤＰ４７）及びＤｙａｘヒト抗体ライブラリーは、ヒトＦＬＴ３Ｌ（ｈｕＦＬＴ３Ｌ）及び／又はマウスＦＬＴ３Ｌ（ｍｕＦＬＴ３Ｌ）に対してパニング（交互パニング又は競合パニング）した。手短には、社内生成ＦＬＴ３Ｌは、パニング抗原としてＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン標識化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するビオチンで標識化した。パニングは、（Ｘｉａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．，２０１７ ｍＡｂｓ ５４２ ９，９９６－１００６（２０１７））に記載されたように、社内ｓｃＦｖライブラリーを用いて２～３ラウンドにわたり実施した。ヒト／ｃｙｎｏ交差反応性を増強するために、一部の選択プロセスでは、交互法でパニング抗原としてヒト及びｃｙｎｏ組換えＦＬＴ３Ｌを使用した。ＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３相互作用を阻害する抗体を選択するために、一部の実験について競合パニングを使用した。競合パニングのためにパニング抗原としてヒトＦＬＴ３Ｌを使用したが、従来型トリプシンの代わりにファージ溶出剤として過剰（＞１００倍）のＦＬＴ３－Ｆｃを使用した（Ｘｉａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ５４２ ９，９９６－１００６（２０１７））。
ＢＭＶライブラリーは、１００倍、ＣＳライブラリーは３、５０倍及びＤＰ４７ライブラリーは、２５０倍に濃縮した。Ｄｙａｘライブラリーは、濃縮しなかった。ＢＭＶ及びＤｙａｘファージライブラリーのみは、３回パニングすると、第２ラウンドのパニングと比較して、ＢＭＶファージライブラリーの１００倍濃縮及びＤｙａｘライブラリーの５０倍濃縮が生じた（図１Ａ）。
モノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施して、各選択ラウンド後の抗原特異的ファージのパーセンテージを推定した。ハイスループットスクリーニングのために、少なくとも２０％の陽性率を達成した選択のみを処理した。この基準セットを用いて、第３アウトプットのＢＭＶパニングを第２アウトプットのＣＳ及びＤＰ４７パニングと一緒にｐＳｐｌｉｃｅ Ｖ４及びｐｄＬＧ又はｐｍＬＧベクター内にクローン化し、競合ＨＴＲＦによる機能的スクリーニングのためにｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（Ｘｉａｏ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１５ Ｏｃｔ １５；１０（１０）：ｅ０１４０６９１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４０６９１）又はＩｇＧフォーマット（Ｘｉａｏ Ｘ，ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ５４２ ９，９９６－１００６（２０１７））の何れかに変換させた。
機能的スクリーニングのために、２９３ ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、最初に、パニングアウトプットから変換させたｓｃＦｖ－Ｆｃ構築物又はＩｇＧ構築物の何れかを用いてトランスフェクトさせた。生じた上清は、ＨＴＲＦをベースとするＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３相互作用阻害アッセイにおいて直接的に使用した。ＨＴＲＦアッセイのために、１０ｎＭのビオチン標識ＦＬＴ３Ｌ、２０ｎＭのストレプトアビジン－ユーロピウムクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ）、１０ｎＭのＦＬＴ３－ｍＦｃ及び２０ｎＭの抗ｍＦｃ－Ａ６４７（Ｃｉｓｂｉｏ）を３８４ウェルのＧｒｅｉｎｅｒプレート内の総量２０μＬ／ウェル中の１０μＬのトランスフェクション上清と混合した。６６５ｎｍ及び６２０ｎｍの示度を混合の５分後及びその後、示度が安定するまで１時間間隔で入手した。その後、６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比率を計算した。比率の減少は、ＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３相互作用の阻害を示した。
直接又は交互抗原パニングからのパニングのアウトプットをｓｃＦｖ－Ｆｃに変換させ、ＨＴＲＦ ＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３－Ｆｃ相互作用阻害アッセイにおけるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のために４，０００コロニー超を選択した。１０種のリード抗体を同定し、ＩｇＧ ＴＭ変換させ、発現させた。これらの抗体を第２回ＨＴＲＦ相互作用阻害アッセイにおいて再試験し、１０個のリードを同定した。これと並行して、競合パニングからの７００を超えるヒットをＰｍＩｇＧ変換させ、哺乳動物細胞中で発現させた。変換したクローンを同一のＨＴＲＦ ＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３－Ｆｃ相互作用阻害アッセイにかけると、２個のリードが同定された（図１Ｂ）。
交互抗原パニングからの１０個のリード及び競合パニングからの２個のリードを発現させ、その後の試験のためにミリグラム量で精製した。追加の試験は、ＨＴＲＦ ＦＬＴ３Ｌ／ＦＬＴ３－Ｆｃ相互作用阻害、受容体ダウンモジュレーション及びシグナル伝達阻害アッセイを含んでいた。これらのリードは、エピトープビニング及び親和性決定法も受けた。スクリーニング活動は、５つのリード抗体Ｄｙａｘ３、Ｄｙａｘ５、ＣＡＴ８、ＣＡＴ２６及びＣＡＴ５Ｄ９を同定したため、これらを更に試験した。リード抗体についての競合ＨＴＲＦ分析からの結果は、図１Ｃに示した。
実施例２．ＦＬＴ３のダウンレギュレーションのスクリーニングアッセイ
ＦＬＴ３Ｌのライゲーション後、ＦＬＴ３受容体は、二量化し、自己リン酸化し、下流シグナル伝達経路を活性化する。このプロセスにおいて、表面ＦＬＴ３は、内在化して分解される。この内在化の特徴を有効に利用して、リード抗ＦＬＴ３Ｌ候補クローンをスクリーニングするためのアッセイを開発した。細胞表面ＦＬＴ３発現は、フローサイトメトリーによって測定することができ、受容体－リガンド結合の阻害は、細胞表面ＦＬＴ３発現レベルへの変化を定量することによって決定できる。
細胞系ＲＳ４；１１、ＥＯＬ－１、ＭＯＬＭ１３及びＭＶ４－１１は、ＦＬＴ３を構成的に発現する。細胞を通常の条件下で培養し、培養の２～２４時間後のＦＬＴ３の相対発現についてスクリーニングした。フローサイトメトリーを使用して、ＦＬＴ３の発現を測定した。手短には、市販で入手できる抗ＣＤ１３５（抗ＦＬＴ３）クローンであるＢＶ１０Ａ４Ｈ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をフローサイトメトリー実験において使用し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＬＴ３Ｌ発現の尺度として報告した。全アッセイにおいて、市販で入手できるマウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ）又は社内ｈｕＦＬＴ３－Ｆｃ構築物をＦＬＴ３Ｌ活性の効果的中和についての陽性コントロールとして使用した。
急性白血病（ｐｒｏ－Ｂ）細胞系であるＲＳ４；１１は、ＦＬＴ３を発現すると報告された他の市販で入手できる細胞系と比較して、培養中でＦＬＴ３の一貫した高い発現を示した（図２Ａ）。ＦＬＴ３Ｌの細胞表面ＦＬＴ３への直接結合は、ビオチン化組換えｈｕＦＬＴ３Ｌ（ｒｈｕＦＬＴ３Ｌ）の連続希釈物を使用して確証し、ここで、この連続希釈物は、４℃でのＲＳ４；１１細胞との３０分間のインキュベーション後にＢＶ４２１－ストレプトアビジンを使用して細胞表面への物理的結合を検出することができ、その後、フローサイトメトリー分析を実施して平均蛍光強度を決定した（図２Ｂ）。
最後に、ｒｈｕＦＬＴ３ＬがＲＳ４；１１細胞上の細胞表面ＦＬＴ３の検出可能なダウンレギュレーションを誘導する能力は、ＲＳ４；１１細胞を３７℃で２時間にわたりＦＬＴ３Ｌの連続希釈物と共にインキュベーションすることによって確証した。状態の安定性は、２種の異なる濃度のＲＳ４；１１細胞（細胞５０，０００（５０Ｋ）個及び１００，０００（１００Ｋ）個）を使用して評価した。細胞表面ＦＬＴ３のダウンレギュレーションは、蛍光標識抗ＣＤ１３５抗体（クローンＢＶ１０Ａ４Ｈ２）を使用して決定した。両方の細胞密度は、ｈｕＦＬＴ３Ｌとのインキュベーション２時間後に細胞表面ＦＬＴ３の用量依存性ダウンレギュレーションを示した。ＦＬＴ３発現のインジケーターであるアロフィコシアニン（ＡＰＣ）ＭＦＩは、本アッセイで使用したｈｕＦＬＴ３Ｌの範囲にわたって２５分の１に減少した（図２Ｃ）。これらの結果は、スクリーニングアッセイが生体利用可能性ＦＬＴ３Ｌの用量依存性反応を測定する際に有効であり、候補クローンがＦＬＴ３Ｌを機能的に中和する能力を試験するために好適であろうことを証明した。この反応は、１ウェル当たり細胞５０，０００個又は１００，０００個の何れを使用しても有意に相違しなかった。
スクリーニングアッセイの最適化
抗ＦＬＴ３Ｌ候補クローンを評価するために理想的な細胞培養条件を決定するために、スクリーニングアッセイ条件を更に精密化した。最終条件は、３７℃、５％ＣＯ２に設定した加湿インキュベーター内で２時間にわたり、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む完全ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地中で抗ＦＬＴ３Ｌ ｍＡｂ候補クローンを含めて又は含めずに９６ｐＭのｒｈｕＦＬＴ３Ｌと共にインキュベートした、１ウェル当たり５０，０００個のＲＳ４；１１細胞であった。ＦＬＴ３発現のその後のダウンレギュレーションは、生ＭＦＩ又はダウンレギュレーション率（％）の何れかとして測定するフローサイトメトリーによって決定した。９６ｐＭのｒｈｕＦＬＴ３Ｌ（ＥＣ８０）を選択したのは、用量反応曲線の対数期が始まり、従ってｒｈｕＦＬＴ３Ｌの何らかの機能的阻害が細胞ＲＳ４；１１細胞表面上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションのレベルへの変化によって直ちに反映されることが保証されるポイントであるからであった（図３Ａ）。アッセイの有効性は、市販で入手できるマウス抗ｈｕＦＬＴ３Ｌ抗体コントロール（ＭＡＢ６０８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して確証した（図３Ｂ）。ＦＬＴ３とそのリガンドとの種間反応性に起因して、このアッセイは、ヒト細胞系であるにもかかわらず、ヒト、ｃｙｎｏ及び齧歯類ＦＬＴ３Ｌに対するクローンについて試験するために有効であった。マウスＦＬＴ３Ｌについて、ＥＣ８０は、３６ｐＭであった。
実施例３．可溶性ＦＬＴ３Ｌに対するリード抗体候補の中和活性
ＦＬＴ３ＬからＦＬＴ３へのライゲーション後、受容体は、二量化し、自己リン酸化し、且つ内在化するとシグナル伝達カスケードを伝播させる。ＦＬＴ３のダウンレギュレーションによって測定されるこのプロセスは、ＦＬＴ３Ｌに結合する抗体によって阻害され得る。従って、リード候補について、それらがヒト、マウス又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）可溶性ＦＬＴ３Ｌ（ｓＦＬＴ３Ｌ）に結合することによってＲＳ４；１１細胞上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションを阻害する能力について試験した。最適化スクリーニングアッセイを使用して、リード候補の中和能力を試験した。上述したように、ＲＳ４；１１細胞（１ウェル当たり細胞５０，０００個）を２時間にわたり、ヒト若しくはｃｙｎｏ ＦＬＴ３Ｌ（９６ｐＭ）又はマウスｓＦＬＴ３Ｌ（３６ｐＭ）の何れかの存在下で１％のＢＳＡを含む完全ＲＰＭＩ中でインキュベートした。各クローンの連続希釈物を添加し、陽性コントロールとして可溶性ＦＬＴ３－Ｆｃ構築物又は市販で入手できるヒト抗ＦＬＴ３Ｌ抗体を使用した。ＲＳ４；１１細胞上でのＦＬＴ３の発現は、フローサイトメトリーを使用して決定し、ＭＦＩとして報告した。
図４Ａ及び４Ｂに示したように、全てのリードクローン候補は、ヒト及びｃｙｎｏ ｓＦＬＴ３Ｌの両方をある程度阻害する能力を証明した。ＣＡＴ８、ＣＡＴ２６、Ｄｙａｘ３及びＤｙａｘ５の全部は、ヒトｓＦＬＴ３Ｌ及びｃｙｎｏ ｓＦＬＴ３Ｌの類似の阻害を示した。下記の表３に示したが、ＣＡＴ８、ＣＡＴ２６、Ｄｙａｘ３及びＤｙａｘ５についてのＩＣ５０値は、ＩＣＭＡＸに一度も到達しなかったため、妥当性が欠如している。
これとは対照的に、ＣＡＴ５Ｄ９は、ＩＣＭＡＸを達成し、ＦＬＴ３Ｌ阻害から予測されるＳ字形曲線を生成した（図４Ａ及び４Ｂ）。表３に提示したＣＡＴ５Ｄ９についてのＩＣ５０値は、ヒト及びｃｙｎｏとの交差反応性を示しているが、マウスＦＬＴ３Ｌとの交差反応性を示していない（図４Ｃ）。
Figure 0007525397000015
実施例４．リード抗体候補の細胞表面ＦＬＴ３Ｌに対する結合活性
ＦＬＴ３Ｌは、細胞膜タンパク質として発現し、開裂すると可溶性タンパク質として循環する。膜結合形態及び可溶性形態の両方は、生物学的に活性である。ＦＬＴ３媒介性シグナル伝達経路を効果的に遮断するために、リード抗体候補は、ＦＬＴ３Ｌの可溶性形態及び膜結合形態の両方に結合しなければならない。
これに一致して、ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＦＬＴ３Ｌへの細胞表面結合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を各種について各全長タンパク質によってトランスフェクトすることによって評価した。候補クローンは、１時間にわたり４℃において、ＦＬＴ３Ｌを発現する細胞系と共にインキュベートし、その後、未結合抗体を除去するために２回洗浄した。次に、結合抗体を定量するために細胞をＰＥ標識ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ二次検出ｐＡｂと共にインキュベートし、これをＰＥシグナルのフローサイトメトリー分析によって測定した。ｈｕ ＩｇＧ主鎖上のｈｕＦＬＴ３－Ｆｃ構築物は、ヒトリガンドに加えて、ｃｙｎｏ及びマウスと交差反応するため、ＦＬＴ３Ｌ発現についての陽性コントロール試薬として使用した。
全リード候補は、ヒトＦＬＴ３Ｌに結合し（図５Ａ）、ＤＹＡＸ５を除く全部がｃｙｎｏ ＦＬＴ３Ｌに結合した（図５Ｂ）。これとは対照的に、Ｄｙａｘ５のみ及び少ない程度でＤｙａｘ３は、マウスＦＬＴ３Ｌとの交差反応性を示した（図５Ｃ）。
従って、全リード候補は、有効性に相違があるものの、異種間ＦＬＴ３Ｌに結合する能力を示した。各クローンについての受容体占有度における差が明白であったため、ＥＣ５０及び最大占有度（ＦＬＴ３－Ｆｃと比較した％として表示）を記録し、最終評価に取り込んだ。結果は、ＣＨＯ細胞において発現したヒト、ｃｙｎｏ及びマウスＦＬＴ３Ｌについて表４に示した。
Figure 0007525397000016
実施例５．リード抗体候補の内在性ヒトＦＬＴ３Ｌへの結合
ＦＬＴ３Ｌは、鎖サイトカイン、即ちＴＣＲエンゲージメントから独立して、ＩＬ－２、ＩＬ－７又はＩＬ－１５により刺激されると一次Ｔ細胞の表面上で発現する。実施例４では、リード抗体候補は、ヒトＦＬＴ３Ｌタンパク質を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合する能力を証明した。次のステップは、それらが一次ヒト細胞系由来の内在性ＦＬＴ３Ｌに結合し得ることを確証することであった。従って、リード抗体候補を、それらがヒトドナーから獲得した一次Ｔ細胞により刺激したＩＬ－２上のｈｕＦｌｔ３Ｌに結合する能力を試験した。
細胞表面上でのＦＬＴ３Ｌ発現を誘導するために、新しく単離したヒトＴ細胞を、５日間にわたり抗ＣＤ３の非存在下（抗ＣＤ３によるＴ細胞の活性化は、細胞表面からのＦＬＴ３Ｌの脱落を引き起こすであろう）で５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を用いて刺激した。この後、Ｔ細胞上の発現は、ヒトＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ構築物を使用して確証した（図６Ａ）。次に、各クローンの連続希釈物を４℃で３０分間、ＩＬ－２刺激Ｔ細胞（１００Ｋ／ウェル）と共にインキュベートした。過剰の抗体は、緩衝剤を用いた洗浄によって除去し、表面結合抗体をＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧにより検出した。ＣＡＴ５Ｄ９を除く全リードクローンは、ヒト一次Ｔ細胞上の内在性ＦＬＴ３Ｌに結合した（図６Ｂ）。内在性ＦＬＴ３ＬへのＣＡＴ５Ｄ９の結合は、結合親和性が低いため、最初に検出することができなかった。しかし、Ｔ細胞とのインキュベーション前に、ＣＡＴ５Ｄ９を、抗ＩｇＧ（ＡＰＣ標識化）を用いて二量化すると、そのアビディティは、内在性ＦＬＴ３Ｌへの用量依存性結合を確証するために十分に増強された（図６Ｃ）。
実施例６．細胞表面ＦＬＴ３Ｌのリード抗体候補による阻害
リード候補が細胞表面ＦＬＴ３Ｌに結合する能力は、リガンドの機能的阻害に関する限定された洞察を提供した。理想的には、リード候補の細胞表面ＦＬＴ３Ｌへの結合は、リガンド－受容体複合体のシグナル伝達活性を減少させるはずである。
これを試験するために、１ウェル当たり１，０００個のｈｕＦＬＴ３Ｌを発現するＣＨＯ細胞を付着させるために一晩プレーティングした。翌日、ＣＨＯ培養培地を取り除き、細胞をＲＰＭＩにより静かに洗浄し、抗体の連続希釈物を３０分間にわたり添加し、その後、ＦＬＴ３＋ＲＳ４；１１（１００Ｋ／ウェル）を添加した。３６℃での２時間のインキュベーション後、ＦＬＴ３のダウンレギュレーションを検出するために、ＲＳ４；１１細胞を染色するために氷上の新鮮９６ウェルプレート内に移した。本発明者らの標準ＲＳ４；１１ ＦＬＴ３のダウンレギュレーションアッセイのために使用した染料に加えて、何れの汚染ＣＨＯ細胞も排除するために抗ＣＤ１９を含めた。ＦＬＴ３のダウンレギュレーションは、フローサイトメトリーによって測定した。
リード抗体候補遮断アッセイは、全リード候補がある程度まで細胞表面ＦＬＴ３Ｌを阻害する能力を有することを証明したが、全候補は、低親和性を反映して、市販のコントロール抗体と比較して比較的低い活性を示した（図７）。
実施例７．リードクローンのＦＬＴ３Ｌ誘導性ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害
ＦＬＴ３の自己リン酸化は、主としてＰＩ３Ｋ及びＲＡＳカスケードを通してシグナル伝達ネットワークの活性化をもたらし、これは、順に、ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ、ＰＫＢ）、ＭＥＫ及びＥＲＫを活性化する。シグナル伝達カスケードは、最終的に細胞の生存及び増殖を促進する遺伝子の転写をもたらす。リード抗体候補が一次ヒト細胞におけるＦＬＴ３ＬによるＦＬＴ３の下流シグナル伝達を遮断したかどうかを確証するために、ＣＤ１３３＋幹細胞内のＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化は、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ＭＳＤホスホ－ＥＲＫ１／２及び蛍光体ＭＥＫ１／２全細胞溶解液を用いて測定した。
アッセイの妥当性は、用量依存法でＦＬＴ３Ｌによって誘導されたＥＲＫの活性化に関して、ＲＳ４；１１細胞系を使用して確証した（図８Ａ）。ＦＬＴ３Ｌの連続希釈物を３６℃で８分間にわたり、１ウェル当たり３００，０００個のＲＳ４；１１細胞と共にインキュベートした。次に、細胞を採取し、溶解させ、リン酸化ＥＲＫについて製造業者の取扱説明書に従ってアッセイした。以前のアッセイと同様に、ＥＲＫのＦＬＴ３Ｌ活性化についてのＥＣ８０を決定し（４７６ｐＭ）、これを使用して候補抗ＦＬＴ３Ｌ抗体クローンの阻害活性を試験した。アッセイの有用性は、効果的中和についての陽性コントロールとして市販で入手できるマウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌ抗体を使用して確証した（図８Ｂ）。
これらの確定されたパラメーターを使用して、リードクローンについて、使用前にＦＬＴ３発現について妥当性が確認されたインビトロ増殖一次ＣＤ１３３＋幹細胞を使用して試験した。リードクローンは、４７６ｐＭのＦＬＴ３Ｌと共に３０分間にわたりプレインキュベートし、次にＣＤ１３３＋幹細胞に添加した。３６℃での８分間にわたるインキュベーション後、細胞を採取し、溶解させ、ＭＳＤアッセイを製造業者の取扱説明書に従って使用してリン酸化ＥＲＫ及びＭＥＫについてアッセイした。市販で入手できるマウス抗ヒトＦＬＴ３Ｌを陽性コントロールとして使用した。
全候補クローンは、ＦＬＴ３ＬによるＭＥＫ（図９Ａ）及びＥＲＫ（図９Ｂ）の誘導を阻害すると思われた。しかし、ＣＡＴ５Ｄ９のみがＩＣＭＡＸに到達し、予想Ｓ字形用量反応曲線を示した（表５）。これらをまとめると、実施例に提示した結果は、ＣＡＴ５Ｄ９が最善のリード候補のクローンであり、親和性及びエピトープ結合部位の生物物理学的評価の条件としての最適化に進行すべきであることを示唆した。
Figure 0007525397000017
実施例８．標的特異性の確証
ＣＡＴ５Ｄ９は、生物学的アッセイにおける機能的評価により、最善のリード候補であると思われた。Ｏｃｔｅｔエピトープビニング法を使用して、受容体ＦＬＴ３に比したＣＡＴ５Ｄ９結合領域を決定した。
エピトープビニング法を使用して、ＦＬＴ３Ｌ上のＦＬＴ３受容体と同一結合領域を共有するリード抗体を決定した。ビニングは、３期で実施した。第Ｉ期では、アビジンプローブへのビオチン－ＦＬＴ３Ｌ結合を実施した。第ＩＩ期では、個々の抗体をビオチン－ＦＬＴ３Ｌに結合させた。第ＩＩＩ期では、試験抗体の各々を第ＩＩ期抗体に添加した。検出された何らかの追加の結合は、２つの抗体が標的ＦＬＴ３Ｌへの非競合結合部位を有することの指標であった。第ＩＩＩ期で抗体が添加されていない緩衝剤単独及びＦＬＴ３－Ｆｃをそれぞれ陰性コントロール及び陽性コントロールとして使用した。第ＩＩＩ期で緩衝剤単独を添加した場合、結果として生じるＦＬＴ３Ｌに対する抗体の解離動態は、標的に対するクローンの固有の親和性を反映する。
１倍及び２倍の濃度で添加されたＣＡＴ５Ｄ９のみがＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃによる結合を阻害したが、これは、ＣＡＴ５Ｄ９がＦＬＴ３Ｌ上の所望の標的部位にヒットしている（即ちＦＬＴ３－Ｆｃと同一又は重複エピトープを共有している）ことを示唆した（図１０Ａ）。重要なことに、これとは対照的に、残り４個の候補クローンは、ＣＡＴ５Ｄ９によって阻害されなかったため、それらが異なるＦＬＴ３エピトープに結合したことを示唆している（図１０Ａ）。更に、緩衝剤単独が添加された場合の急激なオフレートは、ＣＡＴ５Ｄ９の親和性が低い（最適化による性能が改良される可能性が高いことを意味している）ことを示唆している以前の実験を支持している。これと一致して、残りの４個のクローンの各々が第ＩＩ期で結合した場合（図１０Ｂに提示した代表的チャートに示したようなＣＡＴ８）、ＣＡＴ５Ｄ９及びＦＬＴ３－Ｆｃの追加の結合は、第ＩＩＩ期で検出することができ、これは、それらの結合部位が異なることを反映している。更に、他の４個のクローンのそれぞれが一緒にビニングされること及び緩衝剤単独が添加された場合にそれらの解離速度が相当低いことも観察された。
まとめると、これらのデータは、ＣＡＴ５Ｄ９のみがＦＬＴ３Ｌ結合領域でＦＬＴ３と直接的に競合し、低親和性結合でそのようにすると思われたことを確証しており、これは、ＣＡＴ５Ｄ９に最適化の可能性があることを示唆している。他方、残りのクローンの全部は、機能的データに基づくと、ＦＬＴ３と直接的に競合しない部位にヒットしていた。それらの緩徐な解離速度は、それらが既にＦＬＴ３Ｌに合理的な親和性で結合しており、最適化の可能性をほとんど有していないことを示唆した。最初のスクリーニングアッセイにおいて最初に存在した阻害は、立体障害又は受容体結合部位の部分的遮断に起因する可能性が高かった。
実施例９．ＢＩＡＣＯＲＥ結合動態（Ｃ９）
Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して抗体リードの結合動態を決定し、ＣＡＴ５Ｄ９がＦＬＴ３Ｌに対して不良な親和性を有することを示唆したＯｃｔｅｔデータを確証した。抗ＦＬＴ３Ｌ断片抗原結合並びにヒト及びカニクイザルＦＬＴ３Ｌの動態をヒトＣＡＴ８、ＣＡＴ２６、Ｄｙａｘ３及びＤｙａｘ５において決定した。更に、ＣＡＴ５Ｄ９断片抗原の結合動態をヒト及びカニクイザルの両方のＦＬＴ３Ｌについて決定した。
結果は、表６に示した。平衡解離定数（ＫＤ）は、残りのリード抗体と比較して、ＣＡＴ５Ｄ９ヒト及びカニクイザルで５０倍超高かった。ＣＡＴ５Ｄ９は、低品質の迅速なオフ動態を示した（ｈｕ＝７０．７２、ｃｙｎｏ＝７０．６６）。結果として、定常状態結合データは、動態データＫＤ上のチェックとして得た。定常状態結合は、類似の数値を示している動態結合の結果を支持した（表３）。これらのデータは、ＣＡＴ５Ｄ９の低親和性及び最適化によりその性能が改良される可能性を確証している。
Figure 0007525397000018
実施例１０．ＣＡＴ５Ｄ９の交差反応性の非存在
正しいＦＬＴ３Ｌエピトープに結合したＣＡＴ５Ｄ９を確証することに加えて、それが、ＦＬＴ３Ｌの密接な構造的ホモログである幹細胞因子（ＳＣＦ）及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ１）に結合しないであろうことを確証することも重要であった。両方の因子は、構成的に活性化されたＦＬＴ３－ＩＴ９Ｄ突然変異から発生する悪性腫瘍を管理するために腫瘍学に関連して現在使用されている低分子ＦＬＴ３阻害剤に対する主要オフターゲットヒットであるタンパク質チロシンキナーゼ受容体（それぞれｃ－Ｋｉｔ及びＣＳＦＲ１）に対するリガンドである。
これを試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを２□ｇの組換えヒトＳＣＦ又はＣＳＦ１でコーティングした。洗浄後、プレートを、トリスリン酸緩衝食塩液（ＴＰＢＳ）中の３％の乳汁を用いて遮断し、５０□□ｇ／ｍＬから開始した連続（２倍）希釈で添加した。インキュベーション後、未結合抗体は、洗浄によって除去し、結合抗体は、着色のためにＴＭＢ基質と組み合わせて抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを使用して検出した。市販で入手できるヤギ抗ＳＣＦ ｐＡｂ及びマウス抗ＣＳＦ１ ｍＡｂを陽性結合コントロールとして使用した。
何れのリード候補もｈｕＳＣＦ（図１１Ａ）又はｈｕＣＳＦ１（図１１Ｂ）と交差反応しなかった。重要なことに、これらの結果は、ＦＬＴ３Ｌのみに結合し、構造的に類似のＴＫＲリガンド分子に結合しないＣＡＴ５Ｄ９の選択性を証明している。
実施例１１．ＣＡＴ５Ｄ９の親和性の最適化
上記で考察したように、ＣＡＴ５Ｄ９は、ＦＬＴ３Ｌに低親和性で結合し、このため、親和性の最適化により性能を改良できる可能性があることを証明した。所望の３００ｐＭのＫＤは、ＰＫモデリングに基づいて設定した。最適化活動は、１０，０００倍までのＫＤの改善を達成するために設計された。
フレームワークの生殖細胞系列化後、２つの並列戦略である節約（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）突然変異誘発及びブロック突然変異誘発を使用した。節約突然変異誘発は、全６個のＣＤＲにおける各位置で全２０個のアミノ酸に１度に１回ずつ突然変異させる。クローンは、ハイスループット法を使用してスクリーニングし、個々の有益な突然変異は、一緒に結合される。ブロック突然変異誘発は、重複パターンにおいてＣＤＲにおける５～６位置の連続ストレッチを突然変異させ、結果として生じる約１Ｅ６～１Ｅ７個のクローンのライブラリーは、ファージディスプレイパニング法を使用して最初に濃縮され、後にハイスループット法を使用してスクリーニングされる。
初回の最適化ラウンド後、節約突然変異誘発からの３０個のクローン及びブロック突然変異からの２４個のクローンをＩｇＧフォーマットで試験した。分子モデリング技術を用いて、本発明者らは、１６１０ｎＭのＫＤ（Ｂｉａｃｏｒｅによって測定）、親５Ｄ９に比して７００倍の親和性の改良を達成したクローン５Ｄ９－クローン６を生じさせた最良の突然変異を同定及び結合した（図７を参照されたい）。リードクローンＳＣ４０１７及びＡＭ４０の親和性は、ＣＤＴＰ基準（＜３００ｐＭ）を超えた。更に、両方の最適化クローンは、内在性細胞表面ＦＬＴＬに結合及び中和し、ヒト血清中で内在性可溶性ＦＬＴ３Ｌに結合し、ｃｙｎｏ ＦＬＴ３Ｌに結合及び中和する。
Figure 0007525397000019
親和性におけるこの増加は、初期のクローン選択について記載した方法を使用してＲＳ４；１１細胞上のＦＬＴ３のダウンレギュレーション（図１２Ａ）によって測定された機能的活性における１０００倍超の改良に変換された。
３００ｐＭの親和性を達成するために、第２ラウンドの親和性の最適化を実施した。クローン６（Ｃ０６）を突然変異させ、生じた突然変異体は、初回最適化ラウンドにおけると同様の方法でスクリーニングした。ブロック突然変異におけるファージパニングの一部として、クローン６は、ＩｇＧフォーマットにおいて実質的により高い親和性を備えるクローンを濃縮させるための競合相手として使用した。ブロック突然変異からの最善のクローンは、ＫＤ＝１７０ｐＭを備えるクローンＡＭ４０であった。ＡＭ４０の数個のコンビナトリアルクローン及び第２ラウンドの節約突然変異誘発からの突然変異を結合し、ＫＤ＝３７ｐＭを備える１つの優れたクローン、ＳＣ４０１７を生成した。このより高い親和性は、ＲＳ４；１１細胞上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションによって証明されたように、ＦＬＴ３Ｌの改良された機能的阻害を再び反映していた（図１２Ｂ）。しかし、その後の分析は、ＳＣ４０１７の優れた性能の原因が、結合領域に隣接する組み込まれた単一の追加のトリプトファンにあると解明した。これは、酸化に曝露されたトリプトファン残基の脆弱性を前提にすると、開発リスクを表していた。この理由から、ＡＭ４０がリードＩｇＧクローンとして選択された。ＳＣ４０１７（３７ｐＭ）と比較して僅かに親和性が低い（１７０ｐＭ）にもかかわらず、それでも、ＡＭ４０は、３００ｐＭという最初の目標を超えたため、より低い開発リスクを有すると決定された。
最後に、本発明者らは、ＦＬＴ３＋ＲＳ４；１１との共培養において、７日間にわたり２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を用いて刺激した一次Ｔ細胞を使用する（一次Ｔ細胞上で細胞表面ＦＬＴ３Ｌの発現を誘導するために最も有効なプロトコルであることが見出された）アッセイを開発することにより、両方のクローンが細胞表面上の内在性ＦＬＴ３Ｌを中和できることを確証した。手短には、ＩＬ－７刺激ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＲＳ４；１１細胞と共に一晩、１５：１の比（図１３Ａに示した用量比反応）において、単独で又は候補クローンであるＳＣ４０１７及びＡＭ４０の連続希釈物の存在下でインキュベートした。ＦＬＴ３のダウンレギュレーションは、以前に記載したようにフローサイトメトリー法によって測定した。両方のクローンは、１ｎＭを超える濃度（図１３Ｂ）において、ＲＳ４；１１細胞上のＦＬＴ３のダウンレギュレーションを類似の有効性を備えて完全に防止することが証明された。
実施例１２．健常非ヒト霊長類におけるＦＬＴ３Ｌの中和
ＦＬＴ３Ｌを中和することにおけるＡＭ４０の安全性及び持続性を決定するために、週１回の反復投与を使用して１カ月間にわたり毒性試験を実施した。動物の成長を追跡するために、８週間の治療フォローアップ期間を含めた。試験の概要は、図１４に図示した。図１５Ａに示したように、遊離可溶性ＦＬＴ３Ｌレベルは、全用量においてＡＭ４０の初回投与後に急激に落下したが、０．３ｍｇ／ｋｇは、丸１週間にわたりターゲットエンゲージメントを維持するには不十分であった。高用量群（１ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ）は、１．０ｍｇ／ｋｇ群では、その時点で可溶性ＦＬＴ３Ｌのレベルがベースラインに戻った第５７日までを通して、一貫して完全なターゲットエンゲージメント（ＢＬＱ未満の遊離可溶性ＦＬＴ３Ｌとして反映された）を示した。
同様に、循環中ＤＣの頻度（フローサイトメトリーによって検出され、試験前ベースラインレベルの％として表示した全ＣＤ４５＋細胞の％）の測定は、１．０及び３０ｍｇ／ｋｇ群における第２２日までのＣＤ１ｃ＋（古典的）ＤＣ及び形質細胞様ＤＣの頻度における着実な低下を明らかにした（図１５Ｂ）。１ｍｇ／ｋｇ群及び３０ｍｇ／ｋｇ群のそれぞれについて、循環中ＣＤ１ｃ＋ＤＣの頻度は、第５０日及び第８５日まで抑制されたままであった。１ｍｇ／ｋｇ群及び３０ｍｇ／ｋｇ群のそれぞれについて、循環中ｐＤＣの頻度は、第７１日及び第８５日まで減少したままであった。１．０ｍｇ／ｋｇ群におけるＤＣ集団の回復は、第５７～第８５日のある時点で発生した遊離血清中ＦＬＴ３Ｌの回復と相関していた。これらの結果は、ＤＣ集団が、ＡＭ４０によってＦＬＴ３Ｌが中和されると低下するが、遊離ＦＬＴ３Ｌが利用可能になると急速にベースラインに回復することを示している。
実施例１３．ＦＬＴ３Ｌの発現は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の重症度と相関する
ＳＬＥは、慢性炎症を特徴とする自己免疫疾患であり、身体内のほぼ全ての臓器及び全ての年齢群に影響を及ぼす。ＳＬＥは、一般に、関節、皮膚、腎臓、肺、心臓及び脳に影響を及ぼす。前炎症性シグナル伝達においてそれが果たす役割を前提にして、ＦＬＴ３Ｌレベルと疾患重症度との相関について探索するために、ＳＬＥを有する個体におけるＦＬＴ３Ｌの発現を調査した。現在までに公表された研究は、疾患との相関を引き出す場合、そのほとんどが血清中ＦＬＴ３Ｌレベルに依存しており、血清中ＦＬＴ３Ｌレベルが臨床状況では最も実際的な測定であるが、ＤＣ及び他の活性化ＦＬＴ３Ｌ消費細胞によって利用される生産マイナスを反映しているという固有の短所を有する。炎症の状況では、ＦＬＴ３を発現する細胞の数及びそれらのＦＬＴ３Ｌの消費が極めて大きく変動するため、これは、研究間の観察所見における変動及び何れも血清中ＦＬＴ３Ｌと疾患進行の臨床スコアとの間の直接的相関を示さない理由を説明する可能性が高い。Ｔ細胞が炎症状況におけるＦＬＴ３Ｌの最重要スコアの１つであることが分かったため、本発明者らは、新しく単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用して、Ｔ細胞表面上でＦＬＴ３Ｌの発現を直接的に測定するためのアッセイを開発した。
血清及びＰＢＭＣは、ＳＬＥを有する個体（ｎ＝２４）及び健常ドナー（ＨＤ；ｎ＝１５）から単離した。血清中ＦＬＴ３Ｌは、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定し、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞は、社内で開発したフローサイトメトリー分析を使用して決定し、ＦＬＴ３Ｌは、蛍光標識抗ＦＬＴ３ＬクローンであるＭＡＢ６０８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。同一個体におけるループスの活性を決定するために、ＳＬＥ疾患活性指数（ＳＬＥＤＡＩ）を使用した。有意性は、健常コホート対疾患コホートの比較及びそれぞれＳＬＥＤＡＩとの相関についてマン・ホイットニー及びスピアマン相関を使用して決定した。
以前の文献と一致して、ＳＬＥドナーでは、ＨＤと比較して血清中ＦＬＴ３Ｌレベルが上昇したが（ｐ＜０．０５；図１６Ａ）、疾患活性（ＳＬＥＤＡＩ）との有意な相関は見出されなかった（ｐ＜０．０７；図１６Ｂ）。それに反して、ＦＬＴ３Ｌ産生を、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度によって測定すると、ＨＤと比較してＳＬＥドナーにおける高度に有意な増加（ｐ＜０．０００１；図１６Ｃ）及びＳＬＥＤＡＩスコアとの強力な相関（ｒ＝０．７０４５；ｐ＜０．０００１；図１６Ｄ）が見られた。このデータは、Ｔ細胞上のＦＬＴ３Ｌの発現を測定することが疾患状況では特に重要な可能性があることを示唆している。
ＳＬＥＤＡＩスコアとＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞との間の相関を見出したため、（１）ＳＬＥ患者由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにわたるＦＬＴ３Ｌの発現が公知の生物学と一致したかどうか、及び（２）サブセットの発現がＳＬＥＤＡＩスコアと相関するかどうかを決定するために、ＣＤ４＋細胞のサブセットを試験した。試験したＣＤ４＋サブセットは、ｎａｉｖｅ Ｔ細胞（Ｔｎａｉｖｅ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）及びセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞であった。発現及び相関を試験するために、上述したものと同一のプロトコル及び有意性レベルを使用した。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにわたるＦＬＴ３Ｌの発現は、ＦＬＴ３Ｌの発現の公知の生物学と一致していた。詳細には、ＦＬＴ３Ｌの発現は、一般にＨＤにおけるＴｎａｉｖｅ細胞上では観察されなかったが、ＳＬＥドナーでは小さいが、有意な上昇が見られた（図１７Ａ、上方）。ＳＬＥドナー由来のＴｎａｉｖｅ細胞上のＦＬＴ３Ｌの発現は、ＳＬＥＤＡＩスコアと有意に相関していた（図１７Ａ、下方；ｒ＝０．６６２９；ｐ＝０．０００４）。重要なことに、ＦＬＴ３Ｌの発現は、ＦＬＴ３Ｌの発現を誘導することが公知である□－鎖サイトカインに曝露されていたであろう最近活性化されたＴ細胞を捕捉するこの集団において予測されたように、ＨＤ及びＳＬＥ ＣＤ４＋ＴＥＭの両方で観察された。この反応は、ＨＤ及びＳＬＥドナーの両方において見られたが、後者の場合には有意に上昇し、更に、ＳＬＥドナーにおける発現は、ＳＬＥＤＡＩと相関していた（図１７Ｂ、下方；ｒ＝０．６２０１；ｐ＝０．００１２）。最後に、ＦＬＴ３Ｌの発現は、健常ＣＤ４＋ Ｔ細胞ではそれらがＴＥＭからＴＣＭに分化するために低下するが、ＳＬＥドナーのＰＢＭＣ中では維持される（図１７Ｃ、上方；ｐ＜０．０００１）。更に、ＦＬＴ３Ｌ＋ Ｔ細胞の頻度とＳＬＥＤＡＩとの間に有意な相関が存在し、これは、この群における発現が慢性炎症状態の反映であることを示唆している。
まとめると、これらの研究は、ＳＬＥ患者のＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＦＬＴ３Ｌの発現がＨＤのＦＬＴ３Ｌの発現と比較して有意に増加することを証明している。更に、ＦＬＴ３Ｌの発現の増加は、ＳＬＥＤＡＩスコアと高度に相関している。従って、ＳＬＥ患者への抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、ＳＬＥ患者における炎症を減少させるためのＦＬＴ３Ｌを発現するＴ細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
上記で使用した方法は、ＩＣ ＦＬＴ３Ｌ ＲＮＡのＰｒｉｍｅＦｌｏｗ ｉｎ ｓｉｔｕ検出を使用して妥当性を確認し、ＡＰＣコンジュゲート化ＡＭ４０を使用して確証した。
実施例１４．筋炎におけるＦＬＴ３Ｌの発現
筋炎は、衰弱、腫脹及び筋肉痛を特徴とする慢性の筋肉の炎症である。細胞レベルでは、筋炎は、インターフェロン１型タンパク質及びｐＤＣのレベル上昇を特徴とする。筋炎には、ＳＬＥ及び他の前炎症状態が関連し得る。このため、ＦＬＴ３Ｌレベルと疾患重症度との相関について探索するために、筋炎を有する個体におけるＦＬＴ３Ｌの発現を調査した。
筋炎及びＨＤを有する個体由来のＰＢＭＣは、ＦＡＣＳを使用して、ＦＬＴ３Ｌを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞について試験した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＴｎａｉｖｅサブセット、ＴＥＭサブセット及びＴＣＭサブセットに分けた。筋炎及びＨＤサンプル間の有意性は、マン・ホイットニー分析を使用して決定した。
図１８Ａ及び１８Ｂから明らかなように、筋炎を有する個体由来のＰＢＭＣ中のＦＬＴ３Ｌの発現は、それらがＦＬＴ３Ｌ（Ｔｎａｉｖｅ（ｐ＜０．０５；図１８Ａ）、ＴＥＭ（ｐ＜０．０００１；図１８Ｂ）及びＴＣＭ（ｐ＜０．０００１；図１８Ｃ））に対して陽性であるＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージの有意な増加を特徴としていたため、ＳＬＥ患者からの観察所見と匹敵している。これらの結果に照らすと、筋炎患者への抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、筋炎患者における炎症を減少させるためのＦＬＴ３Ｌを発現するＴ細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
実施例１５．腎炎におけるＦＬＴ３Ｌの発現
腎炎は、腎臓に影響を及ぼす免疫障害であり、腎臓の構造と関連している。この状態は、ＳＬＥ、特定の毒素又は特定の感染症から起こり得る。腎炎は、致死的であり得る、腎臓機能の永久的消失を生じ得る。樹状細胞は、ループス腎炎では腎臓に浸潤することが証明されており（Ｆｉｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖ４５：２５９－２６５）、腎臓において炎症を駆動することに役割を果たすと考えられているため、ＦＬＴ３Ｌの遮断は、ＤＣを抑制することができ、腎機能の進行性消失を予防できるのではないかという仮説が立てられた。
Ｍｕｒｐｈｙ Ｒｏｔｈｓ Ｌａｒｇｅ／リンパ組織増殖性（ＭＲＬ．ｌｐｒ）腎炎のマウスモデル及びマウスサロゲート抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＬＦＣ－１）を使用して、タンパク尿レベル及び腎炎スコアにＦＬＴ３Ｌの遮断が及ぼす作用を試験した。アイソタイプコントロール及び抗ＩＦＮＡＲ抗体治療群を含めた。抗ＦＬＴ３Ｌ抗体が投与されたマウスは、投与１７週間後にタンパク尿の有意な減少を示した（図１９Ａ）。更に、１８週間後の腎炎スコアは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体が投与されたマウスでは、アイソタイプコントロールと比較して減少した（図１９Ｂ）。重要なことに、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体が投与されたマウスにおけるタンパク尿及び腎炎のスコアは、投与されたマウスと比較して減少した。これらの結果は、腎炎においてＦＬＴ３Ｌ媒介性炎症が役割を果たすことを支持している。これらの結果に照らすと、腎炎患者への抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、腎炎患者における炎症を減少させるためのＦＬＴ３Ｌを発現するＴ細胞集団を減少させるための合理的な治療戦略である。
腎炎における白血球集団のＦＬＴ３Ｌ関連性変化に関する洞察を提供するために、脾臓ＤＣ集団についても試験した。脾臓は、１８週齢でＭＲＬマウスから採取し、脾臓ＤＣ集団の変化を試験した。抗ＦＬＴ３Ｌ抗体による治療は、ＭＲＬマウスにおける循環中ＤＣを有意に減少させた（図２０Ａ～Ｃ）。詳細には、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｈ＋－ｐＤＣは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与後にアイソタイプコントロールと比較して有意に減少した（図２０Ａ）。同様に、ＣＤ１１ｂ＋ｃＤＣ（ヒトＣＤ１ｃ＋ＤＣと均等）及びＣＤ８＋ｃＤＣ（ヒトＣＤ１４１＋ＤＣと均等）においても有意な減少が観察された（図２０Ｂ及び２０Ｃ）。更に、抗ＦＬＴ３Ｌ治療マウスにおける皮膚炎の発生率は、治療を受けていないマウスにおける通常の３０～４０％の発生率と比較して観察されなかった。このため、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体による治療は、腎炎モデルにおいて、循環中ＤＣ集団を減少させ、二次的病理（皮膚炎）を改善した。これらの結果に照らすと、腎炎患者への抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、ＤＣ集団を抑制することによって炎症及び組織損傷を減少させ得る。
実施例１６．シェーグレン症候群におけるＦＬＴ３Ｌの発現
原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）は、眼及び唾液腺の広範な乾燥を特徴とする自己免疫状態である。更に、この状態は、多臓器不全を誘発し得る。この症候群は、単独で又はループス若しくは関節リウマチ等の追加の自己免疫疾患の存在下において発生し得る。ｐＳＳを有する個体におけるＦＬＴ３Ｌの血清中レベルは、増加し、炎症を起こした唾液腺においてＦＬＴ３Ｌ及びその受容体の両方が局所的に発現するというエビデンスが存在する（Ｔｏｂｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ｖ６２：３４４）。
ＮＯＤ．Ｈ２ｈ４シェーグレン症候群マウスモデルを使用して、長期の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（ＬＦＣ－１）治療後の唾液腺の病理を試験した。１６週齢までにこれらのマウスは、唾液腺（ＳＧ）において、ヒトにおいて見られる病理学的変化に密接に似た方法で、主としてＤＣ、Ｂ２２０＋Ｂ細胞及びＣＤ３＋ Ｔ細胞を含む三次リンパ様構造（ＴＬＳ）を発生する。この組織損傷には、自己抗体の発達及び脾臓内での特発性胚中心の形成が先行する（Ｍａｈｍｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖ８ ３６１ｒａ１３７）。マウスは、アイソタイプＩｇＧコントロール（５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（５ｍｇ／ｋｇ）を用いる予防的（５週齢で開始する）又は治療的（１７週齢で開始する）プロトコルの何れかで治療した。両方のプロトコルについて、治療は、試験（２６週間）終了時まで週２回の投与で継続した。抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（ＬＦＣ－１）は、治療の経過を通してＦＬＴ３Ｌを効果的に中和し（図２５Ａ）、循環中薬物／リガンド複合体の蓄積を生じさせた（図２５Ｂ）。
末梢免疫細胞集団への変化を評価するためにリンパ様器官を収集し、唾液腺（ＳＧ）を採取して組織病理（ＴＬＳの頻度）について評価した。以前に予防的治療が疾患の開始を防止できることが報告されていたが、組織損傷が疾患開始後の治療的介入によって遅延又は防止され得ることについての以前の報告は限られていた。抗ＦＬＴ３Ｌモノクローナル抗体（ＬＦＣ－１）は、脾臓及び唾液腺流入領域ＬＮにおけるＣＤ４４ＨＩ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を経験した抗原を減少させ（試験終了時に２４～２６週齢）（図２６Ａ～２６Ｄ）、且つコラーゲンＩＶ及び血小板抽出物に対する特異的自己抗体を選択的に減少させた（図２７）。
予想されたように、アイソタイプコントロールＩｇＧを用いて治療された動物は、２６週齢までに唾液腺において唾液腺損傷の指標であるＴＬＳ形成を増加させた（組織１ｍｍ２当たりの頻度として測定）。抗ＦＬＴ３Ｌにより治療されたマウスは、治療的に投与された場合でも、組織ＳＧ損傷の有意な減少を示し（図２１Ａ）、予防的に投与された場合、疾患は、完全に防止された（図２１Ｂ）。脾臓中で測定したＤＣ集団は、有意に抑制されたが、完全に欠失してはいなかった（図２２Ａ～Ｄ）。それでもなお、これは、唾液腺内への炎症性浸潤を減少させることによって疾患の開始及び進行に有意な影響を及ぼすのに十分であった。これらの結果は、ｐＳＳにおける炎症がＦＬＴ３Ｌ媒介性メカニズムによって駆動されることを支持している。これらの結果に照らすと、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体の投与は、ヒト対象におけるｐＳＳを治療するための合理的な治療戦略である。
上記の説明から、本明細書に記載した本開示に対して、それを様々な使用及び条件に採用するために変更形態及び修飾形態がなされ得ることは明白であろう。そのような実施形態も添付の請求項の範囲内に含まれる。本明細書の変量の何れかの定義における要素のリストの列挙は、任意の単一要素又は列挙した要素の組合せ（若しくは部分組合せ）としてのその変量の定義を含んでいる。本明細書での１つの実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての又は任意の他の実施形態若しくはそれらの部分と組み合わせた実施形態を含んでいる。本明細書において言及した全ての特許及び刊行物は、各独立特許及び刊行物が明確に且つ個別に参照により組み込まれていると指示されたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (36)

  1. ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合断片。
  2. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ配列番号１及び配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号１及び配列番号２からなる、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. モノクローナル抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体からなる群から選択される組換え抗体である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. （ａ）ＩｇＡ定常ドメイン；
    （ｂ）ＩｇＤ定常ドメイン；
    （ｃ）ＩｇＥ定常ドメイン；
    （ｄ）ＩｇＧ１定常ドメイン；
    （ｅ）ＩｇＧ２定常ドメイン；
    （ｆ）ＩｇＧ３定常ドメイン；
    （ｇ）ＩｇＧ４定常ドメイン；及び
    （ｈ）ＩｇＭ定常ドメイン
    からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、前記ＩｇＧ１定常ドメインであり、前記ＩｇＧ１定常ドメインは、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングインデックスに従ってナンバリングされたＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. （ａ）Ｉｇκ定常ドメイン；及び
    （ｂ）Ｉｇλ定常ドメイン
    からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは、前記Ｉｇλ定常ドメインである、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を生成するＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞。
  12. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び担体を含む医薬組成物。
  13. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を作成する方法であって、（ａ）前記抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記培養された宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法。
  14. 疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、ＦＬＴ３Ｌ（ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド）に対する特異的な抗体又はその抗原結合断片を含み、前記抗体又はその抗原結合断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
  15. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１からなる重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 前記疾患は、自己免疫疾患である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  18. 前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬、腎炎及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病及び慢性腎疾患からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
  20. ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
    i．相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３：
    ii．ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン；及び
    iii．ヒトＩｇλ軽鎖定常ドメイン
    を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４のアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。
  21. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ配列番号１及び配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
  22. 配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
  23. 請求項９に記載のポリヌクレオチド又は請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  24. 自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療又は予防するための医薬を製造するための、ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）に対する特異的な抗体又はその抗原結合断片の使用であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４のアミノ酸配列を含む、使用。
  25. 前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬、腎炎及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
  26. 前記炎症性疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病及び慢性腎疾患からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
  27. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１からなる重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項２４に記載の使用。
  28. 前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項２４に記載の使用。
  29. 膜結合ＦＬＴ３Ｌ（ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド）の中和剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、中和剤。
  30. 循環している古典的樹状細胞（ｃＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の集団の低減剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、低減剤。
  31. ＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＦＬＴ３Ｌ（ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド）の発現の低減剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、低減剤。
  32. ＦＬＴ３Ｌ（ネコＭｃＤｏｎｏｕｇｈ肉腫（ＦＭＳ）様チロシンキナーゼ３受容体リガンド）を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセンテージの低減剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、低減剤。
  33. リンパ芽球におけるＥＲＫシグナル伝達の低減剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、低減剤。
  34. 一次ＣＤ１３３＋ヒト幹細胞におけるＭＥＫ １／２リン酸化の低減剤であって、請求項１～８及び２０～２２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、低減剤。
  35. ＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
  36. ＨＥＫ２９３細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
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