JP7489271B2

JP7489271B2 - 脂肪線維化抑制剤

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Publication number: JP7489271B2
Application number: JP2020149160A
Authority: JP
Inventors: 絵里奈前山; 雅文青木; 浩二郎橋爪; 准子石川
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2024-05-23
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: JP2022043718A

Description

本発明は、脂肪組織の線維化を抑制する脂肪線維化抑制剤に関する。

線維化とは、細胞外マトリクス(コラーゲンなど)が重合し、線維状構造を形成することであり、代謝異常や慢性炎症、自己免疫疾患などで線維化が誘導されると、その臓器や組織は機能低下することが知られている(非特許文献１)。また、線維化は諸臓器の終末期に共通して見られる病理像であることから、疾患の分野を問わず、機序の解明や治療法の開発に向けた研究が進められている(非特許文献２)。代表的な線維化疾患として、肝硬変、糖尿病性腎症、肺線維症などが挙げられるが、有効な治療法は確立されていない。

近年、脂肪組織においても線維化が生じることが明らかとなった（非特許文献３、４）。脂肪組織の線維化の場合、その前段階として、マクロファージが脂肪組織中に浸潤することが報告されており（非特許文献５）、このマクロファージが浸潤した脂肪組織では、分泌因子の影響により線維化が誘導されることが明らかになっている。すなわち、炎症性サイトカインの分泌により慢性炎症が誘導されると同時に、Transforming Growth Factor β（ＴＧＦβ）等の形質転換を誘導するサイトカインの分泌により、脂肪細胞や線維芽細胞は筋線維芽細胞（Myofibroblast）への形質転換を引き起こし、コラーゲンなどを大量に分泌することで線維化が強力に促進されることが知られている（非特許文献６、７）。

内臓脂肪の線維化は、インスリン抵抗性の原因になることや、脂肪肝などの異所性脂肪の蓄積を引き起こし、糖・脂質代謝低下の一因になることが報告されている（非特許文献８、９）。一方で、皮下脂肪の線維化がセルライトの発症に関与するとの報告も複数なされている(非特許文献１０、１１、１２)。「セルライトは、主に女性の体表に現れる皮膚の凹凸の変化」と定義され、病態生理学的には「末梢の循環不全、代謝不全に伴って脂肪組織内に線維化が生じ、周囲組織も線維化した状態」と考えられている（非特許文献１０）。セルライトは、女性の８０～９０％に存在しているが（非特許文献１３）、過体重（肥満）の女性に特異的な症状ではないことも報告されており（非特許文献１３、１４）、このことから単純に肥満抑制剤（痩身剤など）を使用しただけでは、セルライトの改善は困難であると考えられる。以上のことから、脂肪組織の線維化を抑制することにより、「糖・脂質代謝の改善」や「セルライトの予防・改善」などの効果が期待できる。

近年、脂肪組織の線維化に関わる因子として、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＣ－ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）が同定されてきた（非特許文献９、１５）。Ｍｉｎｃｌｅは脂肪組織に浸潤したマクロファージで高発現するＣ型レクチン受容体であり、Ｍｉｎｃｌｅの増加によりＴＧＦβなどの線維化誘導分子が発現誘導されることや、Ｍｉｎｃｌｅをノックアウトしたマウスでは脂肪組織の線維化が抑制されることが報告され（非特許文献９、１５）、Ｍｉｎｃｌｅの増加が脂肪組織の線維化に大きく関わると考えられている。

一方、アブラナ科の植物であるケール（Ｂｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ）は、その搾汁液が飲料として用いられる他、例えばエンドセリン拮抗作用（特許文献１）、インターロイキン４産生抑制作用（特許文献２）等、種々の生理活性があることが報告されている。
また、シソの１種であるアオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓｖａｒ．ｃｒｉｓｐａｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ．Ｍａｋｉｎｏ）は、大葉とも呼ばれ食用として用いられているが、その抽出物には、発汗、解熱、去痰（きょたん）、健胃、鎮痛などの薬理作用があることが報告されている。
また、シナノキ科の一年生の草本であるモロヘイヤ（ＣｏｒｃｈｏｒｕｓｏｌｉｔｏｒｉｕｓＬ．）は、栄養価の高い緑黄色野菜として知られており、例えば血圧降下作用があることが報告されている（特許文献３）。

しかしながら、ケール、アオジソ及びモロヘイヤに脂肪線維化抑制作用やセルライト改善作用があることは知られていない。

特開２００３－２７７２７９号公報特開２００３－２６７８８０号公報特開２０１０－２７００６９号公報

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本発明は、脂肪組織の線維化抑制に有用な素材を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題に鑑み検討したところ、ケール、アオジソ及びモロヘイヤの各植物抽出物にＭｉｎｃｌｅの発現を抑制する作用があり、脂肪の線維化抑制に有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、以下を提供する。
１）ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤。
２）ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制剤。
３）ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制用食品。
４）ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制用食品。

本発明によれば、脂肪細胞におけるＭｉｎｃｌｅの発現を抑制することにより、脂肪組織の線維化抑制に有用な医薬品、食品を提供できる。

ケール、アオジソ及びモロヘイヤによるＭｉｎｃｌｅ遺伝子の発現抑制効果。ケール、アオジソ及びモロヘイヤによるＭｉｎｃｌｅタンパク質の発現抑制効果。ケール、アオジソ及びモロヘイヤによるαＳＭＡ発現抑制作用。

本明細書において、「ケール」とは、アブラナ科のケール（ＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａＤＣ．）を指す。
「アオジソ」とは、シソ科のアオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓｖａｒ．ｃｒｉｓｐａｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ．Ｍａｋｉｎｏ）を指し、「大葉」と呼ばれることもある。
「モロヘイヤ」とは、シナノキ科のモロヘイヤ（ＣｏｒｃｈｏｒｕｓｏｌｉｔｏｒｉｕｓＬ．）を指し、別名「タイワンツナソ」とも称される。

本発明において、ケール、アオジソ及びモロヘイヤ（以下、「本発明の植物」とも称する）は、その任意の部位、例えば、全草、葉（葉身、葉柄等）、果実（成熟、未熟等）、樹皮、枝、種子、花（花弁、子房等）、茎、地上部、根茎、根、塊根、皮又はそれらの組み合わせが使用され得る。このうちケールについては葉、茎、花又は根を、アオジソについては全草、葉、根又は果実を、モロヘイヤについては葉、花又は皮を用いるのが好ましく、いずれの植物においても葉を用いるのがさらに好ましい。
斯かる植物は、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
また、本発明において、上記の植物又はその抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。

斯かる本発明の植物の抽出物としては、各植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出される各種溶媒抽出物、超臨界二酸化炭素等の超臨界抽出によって得られる抽出物、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末等が挙げられる。

抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類及びその水溶液が挙げられ、アルコール類としてはメタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等が挙げられ、好ましくはエタノールである。

上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度（２５℃における容量％）は、好ましくは３０容量％以上、より好ましくは５０容量％以上、さらに好ましくは７５容量％以上であり、且つ好ましくは９９．８容量％以下、より好ましくは９９．７容量％以下、さらに好ましくは９９．６容量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは３０～９９．８容量％、より好ましくは５０～９９．７容量％、さらに好ましくは７５～９９．６容量％である。好ましくは、３０～９９．８容量％エタノール水溶液、より好ましくは５０～９９．７容量％エタノール水溶液、さらに好ましくは７５～９９．６容量％エタノール水溶液が挙げられる。

抽出における溶媒の使用量としては、本発明の植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１～１００ｍＬが好ましく、３～５０ｍLがより好ましい。抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されないが、例えば、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上がより好ましく、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは３週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。
抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、ソックスレー抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の通常の手段を用いることができる。

本発明の植物の抽出物は、例えば食品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂、澱出し等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
また、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。

また、本発明の植物の抽出物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。

後述する実施例に示すように、ケール、アオジソ及びモロヘイヤの各植物抽出物は、Ｍｉｎｃｌｅの発現を遺伝子及びタンパク質レベルで抑制する。Ｍｉｎｃｌｅの増加によりＴＧＦβなどの線維化誘導分子が発現誘導されることや、Ｍｉｎｃｌｅをノックアウトしたマウスでは脂肪組織の線維化が抑制されることが報告されていることから（前記非特許文献９，１５）、Ｍｉｎｃｌｅの増加が脂肪組織の線維化に大きく関わると考えられている。したがって、Ｍｉｎｃｌｅの発現を抑制することにより脂肪線維化が抑制できると考えられる。

したがって、本発明の植物又はその抽出物は、Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制剤、脂肪線維化抑制剤（以下、「Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制剤等」と称す）となり得、また当該Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制剤等を製造するために使用できる。
また、本発明の植物又はその抽出物は、Ｍｉｎｃｌｅ発現の抑制、脂肪線維化の抑制のために使用することができ、セルライトの予防又は改善、糖・脂質代謝の改善に応用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

本発明のＭｉｎｃｌｅの発現抑制には、遺伝子レベルでの発現抑制及びタンパク質レベルでの発現抑制が包含される。遺伝子レベルでの発現抑制にはｍＲＮＡの発現抑制、ｍＲＮＡへの転写抑制が挙げられ、タンパク質レベルでの発現抑制には翻訳における抑制が含まれるが、好ましくはＭｉｎｃｌｅのｍＲＮＡの発現抑制である。
尚、Ｍｉｎｃｌｅ（Ｃ－ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎｄｏｍａｉｎｆａｍｉｌｙ４ｍｅｍｂｅｒＥ：ＣＬＥＣ４Ｅ）とは、ＮＣＢＩのデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ）[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein]にＮＰ＿０５５１７３として登録されているタンパク質を指す。

本発明において、「線維化」とは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが線維状の構造を形成し、臓器や組織が硬化すると共にその機能が低下することを意味する。「脂肪の線維化」とは、脂肪組織が線維化することを指し、例として皮下脂肪組織や内臓脂肪の線維化が挙げられる。

本発明において「セルライト」とは、皮下脂肪のうち、体表に現れる皮膚の凸凹の変化で主に腹部・臀部・大腿部に不均一かつブロック状に存在する組織を指す。病態生理学的には、末梢の循環不全、代謝不全に伴って脂肪組織内に線維化が生じ、線維化により脂肪組織の代謝不全が亢進して脂肪組織が変性をきたすとともに周囲組織も線維化した状態と考えられている。

本発明において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。

本発明のＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤等は、Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制、脂肪線維化抑制の各作用効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品となり、また当該医薬品、医薬部外品、食品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
なお、当該食品には、脂肪線維化抑制をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。

本発明のＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤等を医薬品（医薬部外品を含む）として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明の植物又はその抽出物と他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。

本発明のＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤等を食品として用いる場合、当該食品の形態は、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品は、本発明の植物又はその抽出物と他の食品材料や溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて調製することができる。

上記医薬品又は食品における本発明の植物又はその抽出物の含有量（乾燥物換算）は、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．００１～１０質量％、より好ましくは０．０１～５質量％である。なお、本明細書において「乾燥物」とは、抽出物を－３０～－４０℃で３～４時間凍結させたものを、乾燥温度４０～１００℃、真空到達度２０～７０Ｐａの条件下で、１２～２０時間かけて乾燥させて得られる残分をいう。

本発明の植物又はその抽出物の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合、成人（体重６０ｋｇ）１人、１日あたり、乾燥物換算で、好ましくは０.６ｍｇ以上、より好ましくは６ｍｇ以上であり、より好ましくは３０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは６０００ｍｇ以下、より好ましくは３０００ｍｇ以下、より好ましくは１２００ｍｇ以下である。また、１日あたり好ましくは０．６～６０００ｍｇ、より好ましくは６～３０００ｍｇ、より好ましくは３０～１２００ｍｇである。

本発明の植物又はその抽出物は、１日１回～数回に分け、又は任意の期間及び間隔で投与又は摂取することができる。投与又は摂取期間は適宜決定することができ、例えば、１日以上が好ましく、７日以上がより好ましく、３０日以上がさらに好ましい。

本発明のＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤等の適用対象としては、二の腕、臀部、太もも等の皮下脂肪にできたセルライトの除去を望むヒト、或いはセルライトの発生を予防したいヒトが好ましい。さらに、内臓脂肪の線維化によってもたらされるインスリン抵抗性を示すヒトや、それに起因する糖尿病などの疾患の罹患者又は疾患のおそれがあるヒトが対象者として挙げられる。

上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤。
＜２＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制剤。
＜３＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするセルライト予防又は改善剤。
＜４＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制用食品。
＜５＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制用食品。
＜６＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の抽出物を有効成分とするセルライト予防又は改善用食品。

＜７＞Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制剤を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜８＞脂肪線維化抑制剤を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜９＞セルライト予防又は改善剤を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜１０＞Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制用食品を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜１１＞脂肪線維化抑制用食品を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。
＜１２＞セルライト予防又は改善用食品を製造するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の使用。

＜１３＞Ｍｉｎｃｌｅ発現抑制に使用するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物。
＜１４＞脂肪線維化抑制に使用するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物。
＜１５＞セルライト予防又は改善に使用するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物。

＜１６＞Ｍｉｎｃｌｅ発現を抑制するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の非治療的使用。
＜１７＞脂肪線維化を抑制するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の非治療的使用。
＜１８＞セルライトを予防又は改善するための、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の非治療的使用。

＜１９＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＭｉｎｃｌｅ発現抑制方法。
＜２０＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する脂肪線維化抑制方法。
＜２１＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するセルライトの予防又は改善方法。
＜２２＞投与又は摂取が、経口による投与又は摂取である＜１９＞～＜２１＞の方法。
＜２３＞投与又は摂取する有効量が、成人（体重６０ｋｇ）１人、１日あたり、乾燥物換算で、好ましくは０.６ｍｇ以上、より好ましくは６ｍｇ以上であり、より好ましくは３０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは６０００ｍｇ以下、より好ましくは３０００ｍｇ以下、より好ましくは１２００ｍｇ以下である。また、１日あたり好ましくは０．６～６０００ｍｇ、より好ましくは６～３０００ｍｇ、より好ましくは３０～１２００ｍｇである＜１９＞～＜２２＞の方法。
＜２４＞ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物の投与又は摂取期間が１日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは３０日以上である＜２３＞の方法。
＜２５＞投与又は摂取の対象者が、二の腕、臀部、太もも等の皮下脂肪にできたセルライトの除去を望むヒト、或いはセルライトの発生を予防したいヒト、内臓脂肪の線維化によってもたらされるインスリン抵抗性を示すヒトや、それに起因する糖尿病などの疾患の罹患者又は疾患のおそれがあるヒトである＜１９＞～＜２４＞の方法。
＜２６＞植物抽出物が、ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の溶媒抽出物であり、抽出のための溶媒が好ましくは極性溶媒であり、より好ましくは水、アルコール類及びその水溶液、さらに好ましくはエタノール及びその水溶液である、＜１＞～＜３＞の剤、＜４＞～＜６＞の食品、＜７＞～＜１２＞の使用、＜１３＞～＜１５＞の植物又はその抽出物、＜１６＞～＜１８＞の非治療的使用、＜１９＞～＜２５＞の方法。

製造例１各植物抽出物の調製
（１）ケール抽出物の調製
アブラナ科ケール〔ＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａＤＣ．〕の葉乾燥品（中国産）１０ｇに、９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１００ｍＬを加え、室温、静置下で、１７日間浸漬した。その後、ろ過により抽出残渣と分離した後、抽出液を減圧にて濃縮・乾燥し、エタノール抽出物６０１．８ｍｇを得た。得られた抽出物を９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にエキス濃度１％（ｗ／ｖ）となるように溶解して、試験サンプルとした。

（２）アオジソ抽出物の調製
シソ科アオジソ〔Ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓｖａｒ．ｃｒｉｓｐａｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ．Ｍａｋｉｎｏ〕の葉（日本産）の凍結乾燥品１０ｇに、９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１５０ｍＬを加え、室温、静置下で、７日間浸漬した。その後、ろ過により抽出残渣と分離した後、抽出液を減圧にて濃縮・乾燥し、エタノール抽出物４９４．１ｍｇを得た。得られた抽出物を９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にエキス濃度１％（ｗ／ｖ）となるように溶解して、試験サンプルとした。

（３）モロヘイヤ抽出物の調製
シナノキ科のモロヘイヤ〔ＣｏｒｃｈｏｒｕｓｏｌｉｔｏｒｉｕｓＬ．〕の葉（日本産）の凍結乾燥品１０ｇに９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１５０ｍＬを加え、室温、静置下で、９日間浸漬した。その後、ろ過により抽出残渣と分離した後、抽出液を減圧にて濃縮・乾燥し、エタノール抽出物２４６．３ｍｇを得た。得られた抽出物を９９．５％エタノール水溶液にエキス濃度１％（ｗ／ｖ）となるように溶解して、試験サンプルとした。

実施例１各植物抽出物のＭｉｎｃｌｅ発現抑制作用
１．細胞培養
細胞はマウス由来マクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４（ＤＳファーマメディカル）を用い、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ培地にて培養を行った。

２．Ｍｉｎｃｌｅ遺伝子の発現解析
ＲＡＷ２６４細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に播種し、翌日、無血清培地に交換し、ＬＰＳを最終濃度０．５ｎｇ／ｍＬで添加するとともに、製造例１で調製された１％植物抽出物溶液を最終濃度０．００１％（ｖ／ｖ）で添加し、３７℃で静置培養した。なお、植物抽出物を添加せず、ＬＰＳのみを添加した細胞をコントロールとした。
ＬＰＳ添加１７時間後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてＲＮＡを抽出した。全てのサンプルについて吸光度法ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＲＮＡ量を測定し、５０ｎｇ／μＬに揃えて逆転写を行った（ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）。Ｍｉｎｃｌｅ遺伝子の発現解析は、Ｔａｑｍａｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した定量ＰＣＲにて行い、得られた値は、内部標準であるＲｐｌｐ０の値で補正した。結果は、ＬＰＳ及び植物抽出物を添加しなかった群を１とした相対値で示し、ＬＰＳのみを添加した群をコントロール群として、各植物抽出物のＭｉｎｃｌｅ遺伝子発現を評価した。
本試験で使用したＴａｑｍａｎｐｒｉｍｅｒプライマー及び遺伝子名は、表１に示す。

３．Ｍｉｎｃｌｅタンパク質の発現解析
ＲＡＷ２６４細胞を９×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に播種し、ＬＰＳ及び植物抽出物の添加から細胞回収までは、前記２．と同様の方法で行った。得られた細胞は、Ｐｒｏｔｅａｓｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）を含むＲＩＰＡＢｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）で溶解後、ソニケーション及び遠心分離（４℃，１４０００×ｇ，５分）により上清を回収した。ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりタンパク質濃度を算出後、一定濃度に調整したサンプル溶液にＳＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）を加え、９５℃で５分加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに用いた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、４－１５％ＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、１５０Ｖ定電圧で展開した。Ｉｍｍｕｎｏ－ＢｌｏｔＰＶＤＦＭｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にＣｒｉｔｅｒｉｏｎブロッター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して２００ｍＡ定電流で９０分間タンパク質を転写し、５％スキムミルク（Ｗａｋｏ）／ＴＢＳ－Ｔ（０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にてブロッキングを行った。続いて希釈した下記の１次抗体、２次抗体を順次反応させ、ＥＣＬｐｒｉｍｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてバンドを検出した。尚、抗体の希釈には、ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。

１次抗体（それぞれ２０００倍希釈して使用）：
ａｎｔｉＭｉｎｃｌｅ（１Ｂ６）ＭｏｕｓｅｍＡｂ（ＭＢＬＤ２６６－３）
ａｎｔｉ β－ａｃｔｉｎ（１３Ｅ５）ＲａｂｂｉｔｍＡｂ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ＃４９７０）
２次抗体（１０００倍希釈して使用）：
ＭｏｕｓｅＩｇＧ，ＨＲＰＬｉｎｋｅｄＦ（ａｂ′）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＮＡ９３１０－１ＭＬ）
ＲａｂｂｉｔＩｇＧＨＲＰＬｉｎｋｅｄＦ（ａｂ′）２（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＮＡ９３４０－１ＭＬ）

４．結果
Ｍｉｎｃｌｅ遺伝子発現解析の結果を図１に、Ｍｉｎｃｌｅタンパク質発現解析の結果を図２に示す。
ケール抽出物、アオジソ抽出物及びモロヘイヤ抽出物は、遺伝子レベル及びタンパク質レベルでＭｉｎｃｌｅの発現を強く抑制した。

実施例２各植物抽出物の線維化抑制能（線維化マーカーαＳＭＡの発現抑制作用）
１．培養
細胞はマウス由来マクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４（ＤＳファーマメディカル）及び脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１（ＤＳファーマメディカル）を用い、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ培地にて培養を行った。

２．培養上清の回収
ＲＡＷ２６４細胞を１．８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に播種し、翌日、無血清培地に交換するとともにＬＰＳ（Ｗａｋｏ）を最終濃度０．５ｎｇ／ｍＬ、製造例１で調製された１％植物抽出物溶液を最終濃度０．００１％（ｖ／ｖ）で添加した。１７時間後に培養上清の全量（１ｍＬ）を回収し、遠心分離後、上清を使用まで－８０℃で保存した。尚、比較対照はＬＰＳのみを添加した細胞の培養上清とした。

３．αＳＭＡ遺伝子の発現解析
３Ｔ３－Ｌ１細胞を、７．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に播種した。翌日、無血清培地に交換するとともに、前記２．で回収したＲＡＷ２６４細胞の培養上清を１／１０量（ｖ／ｖ）添加した。１７時間後にＰＢＳで細胞を洗浄し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、実施例1の２．と同様の方法で行い、線維化抑制能の評価には、筋線維芽細胞特異的に発現する線維化マーカーであるαＳＭＡ（ａｃｔｉｎａｌｐｈａ２，ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ）の遺伝子発現量を指標として用いた。遺伝子発現解析は、Ｔａｑｍａｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した定量ＰＣＲにて行い、得られた値は、内部標準であるＲｐｌｐ０の値で補正した。結果は、ＬＰＳ及び植物抽出物を含有しない培地で培養したＲＡＷ２６４細胞の培養上清を添加した群を１とした相対値で示し、ＬＰＳのみを含有する培地で培養したＲＡＷ２６４細胞の培養上清を添加した群をコントロール群として、各植物抽出物の線維化抑制能を評価した。本試験で使用したＴａｑｍａｎプライマー及び遺伝子名は、表２に示す。

４．統計学的解析
得られた結果の統計学的解析は、Ｔｕｋｅｙの検定で行い、Ｐ値が０．０５未満である場合、有意差があるとした。

５．結果
αＳＭＡ遺伝子発現解析の結果を図３に示す。
ケール抽出物、アオジソ抽出物及びモロヘイヤ抽出物には優れたαＳＭＡ発現抑制活性が認められた。αＳＭＡは筋線維芽細胞マーカーとして特定されていることから、αＳＭＡの発現が抑制されたことは、線維化に伴う脂肪細胞から筋線維芽細胞への形質転換が抑制されたことを示す。

Claims

ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制剤。
ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制剤。
ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の抽出物を有効成分とするＭｉｎｃｌｅ発現抑制用食品。
ケール、アオジソ及びモロヘイヤから選ばれる植物の抽出物を有効成分とする脂肪線維化抑制用食品。