JP7286131B2 - 糖尿病性潰瘍の治癒促進剤 - Google Patents
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健常者においては、一般的にこれらの創傷治癒過程がスムーズに進行するが、糖尿病患者においては神経障害、末梢血管障害、局所の高血糖状態、患者の活動性低下などの創傷治癒阻害因子により治癒機転が阻害され、創傷治癒が遷延し、糖尿病性潰瘍に代表される難治性の慢性皮膚創傷を生じる。
糖尿病性潰瘍などの難治性の慢性皮膚創傷では、炎症期、細胞増殖期、成熟期・再構築期の状態が混在していることが多く、創傷治癒が遷延する原因の一つとして炎症期が正常に完結していないことが知られている。炎症期が完結しない主な要因は感染や血流低下であることから、血管新生を促し、血流を回復させることは慢性皮膚創傷の治癒において極めて有効である。
近年、ギヌラ・プロクンベンス抽出物の生物学的活性について研究が進んでおり、抗酸化、抗菌、抗炎症、精子の受精能力向上、抗がん、高血圧の抑制、高血糖の抑制、臓器の保護などの作用を有することが報告されている(非特許文献1、2)。また、作用機序は不明ながら、健常ラットの創傷モデルにおいて治癒促進効果が見られることが報告されている(非特許文献3)。
〔1〕ギヌラ・プロクンベンス又はその抽出物を有効成分とする糖尿病性潰瘍の治癒促進剤。
〔2〕抽出物が、水、アルコール類又はアルコール類-水混合液の抽出物である〔1〕記載の糖尿病性潰瘍の治癒促進剤。
〔3〕皮膚外用剤である〔1〕又は〔2〕記載の糖尿病性潰瘍の治癒促進剤。
ギヌラ・プロクンベンスは、そのまま、乾燥又はそれらを処理して用いることができる。処理としては、例えば、切断、破砕、磨砕、粉砕などが挙げられる。
抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれでもよく、例えば、水;メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類;プロピレングリコール、ブチレングリコールなどの多価アルコール類;アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類;酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類;テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどの鎖状及び環状エーテル類;ポリエチレングリコールなどのポリエーテル類;スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの炭化水素類;トルエンなどの芳香族炭化水素類;ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類;超臨界二酸化炭素;ピリジン類;油脂、ワックスなどその他オイル類;並びにこれらの混合物が挙げられる。なかでも、好ましくは水、アルコール類、アルコール類-水混合液であり、より好ましくはエタノール-水混合液である。
アルコール類-水混合液において、アルコール類と水は任意の割合で混合して使用することができるが、アルコール類の濃度(25℃における容量%、以下「%」)は、好ましくは50~99.9%であり、より好ましくは80~99.5%、更に好ましくは90~99%である。
えば、ギヌラ・プロクンベンス(乾燥物)に対して、好ましくは5~60質量倍であり、より好ましくは5~30質量倍である。
抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されないが、例えば、抽出期間(時間)は、好ましくは0.5日~30日であり、より好ましくは1日~15日である。抽出温度は、0℃以上、使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、より好ましくは室温である。
抽出は、1回又は複数回行うことができる。
得られた抽出液はそのまま、或いは適宜溶剤で希釈した希釈液としてもよく、濃縮エキスや乾燥粉末、ペースト状に調製してもよい。また、凍結乾燥し、用時に溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソームなどのベシクルやマイクロカプセルなどに内包させて用いることもできる。
従って、ギヌラ・プロクンベンス又はその抽出物は、糖尿病性潰瘍の治癒促進剤となり得、また、糖尿病性潰瘍の治癒を促進するために使用することができる。当該治癒促進作用により糖尿病性潰瘍を治療できる。
本発明において、糖尿病性潰瘍は、糖尿病に起因する皮膚潰瘍である。潰瘍形成部位は、例えば、下肢が挙げられる。
剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、チック剤、リニメント剤、ローション剤、スプレー剤、外用散剤などが挙げられる。
このような種々の剤形の製剤は、有効成分であるギヌラ・プロクンベンス又はその抽出物、必要に応じて、薬学的に許容される担体、その他の薬効成分と適宜組み合わせて、それぞれ一般的な製造方法により調製することができる。当該薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、pH調節剤・緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、矯味・矯臭剤、安定化剤などが挙げられる。
本発明では斯かる量を1日に1回~複数回に分けて、1日間以上反復・継続して投与するのが好ましい。
本発明の糖尿病性潰瘍の治癒促進剤の投与対象は、糖尿病性潰瘍の治癒が望まれる又は必要とするヒト及び非ヒト動物である。非ヒト動物としては、例えば、類人猿、その他霊長類、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。対象の好ましい例として、ヒトが挙げられる。
ギヌラ・プロクンベンス(Gynura procumbens)の乾燥葉100gを細断した後、95%エタノール1Lを加え、ときどき撹拌しながら、室温で3日間抽出した。その後、濾過により抽出残渣を分離し、70℃のインキュベーター内で過熱による溶媒除去を行い、抽出液を濃縮した。本濃縮物にワセリンを混合して0.5%ギヌラ・プロクンベンス抽出物とし、動物創傷治癒試験に使用した。
細胞活性化試験では、濾過後の抽出液を40℃で濃縮し、凍結乾燥した後、50mg/mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解、濾過した抽出液を使用した。
〔供試動物〕
8週齢のC57BL/6マウス(雄、日本SLC)を健常マウス群と糖尿病マウス群に無作為に群分けした。糖尿病マウス群には、生理食塩水で溶解したストレプトゾトシン(シグマ アルドリッチ ジャパン)0.2mLを100mg/kg腹腔内投与し、投与1週間後、尾静脈より全血を採取し血糖値測定器(アキュチェック、ロシュ・ダイアグノスティックス)を用いて血糖値を測定し、血糖値250mg/dL以上のマウスを糖尿病発症とみなした。
マウスを2.5%イソフルランで麻酔した後、背部を剃毛し、無菌条件下で円形生検パンチを用いて直径10mmの全層皮膚欠損創を作製した。創傷領域は、バーニヤキャリパーを用いて測定した。
ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)、10%ソルコセリルジェル(SJ)又はワセリン(Veh)を創傷形成直後及び術後48時間毎に完全治癒するまでそれぞれ局所適用した。創傷面は、ハイドロコロイド(Tegaderm)で覆った。
ImageJソフトウェア(NIH)を用いて創傷面積を計算し、以下の式を用いて創傷閉鎖率を算出した。
創傷閉鎖率(%)=〔(創傷形成日の創傷面積 - 測定日の創傷面積)/創傷形成日の創傷面積〕×100
創傷形成後2、6及び12日目のマウスの創傷皮膚組織をQIAzol Lysis Reagent(Qiagen)中でホモジナイズした。皮膚組織からRNeasy Plus Universal Miniキット(Qiagen)を用いて全RNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RTキット(東洋紡)を用いて、1μgの全RNAより一本鎖cDNAを合成した。次いで、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)及びStepOne PlusリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムPCRを実施し、mRNAを検出した。 プライマー/プローブセットはAssays-on-Demand(Applied iosystems)から入手した。
創傷形成後8日目のマウスの創傷皮膚組織を採取し、ホルマリンにて固定後パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。
免疫組織化学染色は、内皮細胞のマーカーである抗CD31抗体(Abcam)を用いて行った。 DAKO Envisionキットを使用して抗体を検出し、DAB基質で視覚化し、血管の数を1切片あたり5つの異なる高倍率視野で計数した。 オリンパスVS120バーチャルスライドスキャニングシステムを用いて画像を取得した。
統計解析は、ANOVA後のPost hoc test、又はスチューデントのt検定で行った。P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。結果は、平均±標準偏差として示した。
図1に創傷閉鎖率の推移及び創傷形成日、8日目及び16日目の創傷の代表的な写真を示す。
健常マウス群では、2日目に、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)又は陽性対照であるソルコセリルジェル(SJ)を塗布した創傷はワセリン(Veh)を塗布した場合の創傷より創傷面積の有意な縮小が認められ、16日目に完全治癒した(図1A)。
一方、糖尿病マウス群では、2日目に、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)を塗布した創傷はワセリン(Veh)を塗布した場合の創傷より創傷面積の有意な縮小が認められ、22日目に完全治癒した。また、2日目以降、陽性対照であるソルコセリルジェル(SJ)の塗布は、健常マウス群に比して糖尿病マウス群においてワセリン(Veh)塗布と同様に創傷面積縮小の遅延が見られたが、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)の塗布は、ソルコセリルジェル(SJ)の塗布に比べて、創傷面積の縮小が促進されていた(図1B)。
健常マウス群では、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)を塗布した皮膚組織において各血管新生増殖因子の高発現を示したが、陽性対照であるソルコセリルジェル(SJ)に対する有意差は見られなかった(図2A)。
一方、糖尿病マウス群では、2日目に、VEGF-Aの発現がソルコセリルジェル(SJ)塗布に対して、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)塗布で有意に増加し、また、6日目にはEGF及びbFGFの発現が増加する傾向が見られた(図2B)。
健常マウス群では、ワセリン(Veh)塗布に比べて、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)又はソルコセリルジェル(SJ)の塗布によりCD31陽性細胞数の増加が認められた。ソルコセリルジェル(SJ)塗布においてギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)塗布よりもCD31陽性細胞は多く観察された(図3A)。
一方、糖尿病マウス群では、ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)塗布においてソルコセリルジェル(SJ)塗布よりもCD31陽性細胞が多く観察され、多数の新生血管が認められた(図3B)。さらに図4に示すとおり、肉眼的観察においてもワセリン(Veh)又はソルコセリルジェル(SJ)塗布に比べてギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)の塗布によって血管数及びサイズ両方の増加が認められ、糖尿病性潰瘍部におけるギヌラ・プロクンベンス抽出物の血管新生促進が明らかになった。
〔細胞培養〕
ヒト臍帯静脈内皮細胞、繊維芽細胞及びケラチノサイト(クラボウ)は、
HuMedia EG-2、FibroLife及びHuMedia-KG2でそれぞれ培養した。以下の実験には、サプリメントを含まない培地中でサブコンフルエントの状態の細胞(60~80%)を用いた。
ヒト肥満細胞由来LAD2株は、Stem Pro-34栄養サプリメント(Invitrogen)及び組換え幹細胞因子(Wako)を添加したStem Pro-34無血清基礎培地で培養した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト又はヒト肥満細胞由来LAD2株を、100μg/ mLのギヌラ・プロクンベンス抽出物又は0.1%のDMSOで48時間刺激した。ANG、bFGF、血小板由来増殖因子(PDGF)及びVEGFのmRNA発現をリアルタイムPCRで測定した。各細胞について5点ずつ処理を行いその平均値を用いて評価した。
統計解析は、ANOVA後のPost hoc test、又はスチューデントのt検定で行った。P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。結果は、平均±標準偏差として示した。
図5に示すとおり、ヒト臍帯静脈内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト及びヒト肥満細胞由来LAD2株でのANG、bFGF、PDGF及びVEGFAの発現がギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)により有意に増加した。この結果は上記実施例1の結果を裏付けるものである。
〔生体外創傷治癒試験〕
インビトロの創傷治癒アッセイは、IncuCyteスクラッチアッセイ(Essen BioScience)により行った。I型コラーゲンをコーティングした96ウェルプレートに繊維芽細胞又はケラチノサイトをそれぞれ0.5×105cells/wellずつ播種し、37℃にて3時間培養した。細胞単分子層にWound Makerツールにより創傷を形成した後、PBSでウェルを洗浄し、細胞切片を取り除いてから、50μg/mLのギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)、10ng/mLのTGF-α又は0.1%のDMSO(Veh)をウェルに添加し、72時間3時間毎に細胞の画像をIncuCyte ZOOMソフトウェアを用いて記録した。各細胞について3点ずつ処理を行いその平均値を用いて評価した。
48ウェルマイクロチャンバー(Neuroprobe)を用いて細胞遊走能を評価した。12.5、25、50又は100μg/mLのギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)、又は0.1%のDMSO(Veh)を下室に加え、コラーゲンでプレコートした8μm孔径のポリビニルピロリドンフリーポリカーボネート膜(Neuro Probe)で仕切られた上室に線維芽細胞(5×103cells/well)、ケラチノサイト(5×103cells/well)、又はヒト肥満細胞由来LAD2株(7.5×103cells/well)を播種し、6時間(線維芽細胞及びケラチノサイト)又は3時間(LAD2株)インキュベーションを行った。反応後、膜に接着した細胞をDiffQuick(Kokusai hiyaku)で固定染色した。遊走した細胞数は、光学顕微鏡下で5つの高倍率視野(HPFs)で計数した(n=3)。
I型コラーゲンをコーティングした96ウェルプレートにヒト臍帯静脈内皮細胞、線維芽細胞又はケラチノサイトをそれぞれ1×104cells/wellずつ播種し、12.5、25又は50μg/mLのギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)、又は10ng/mLのTGF-αを添加し、37℃で48時間培養した。5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識及び検出キットIII(Roche Diagnostic)を用いて細胞増殖を評価した。 BrdU取り込みのレベルは、マイクロプレートリーダーを用いて測定した(n=3)。
統計解析は、ANOVA後のPost hoc test、又はスチューデントのt検定で行った。P値が0.05以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。結果は、平均±標準偏差として示した。
図6に12時間後の創傷の代表的な画像及び創傷領域の割合の推移を示す。
ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)添加後、線維芽細胞は創傷の全領域をほぼ完全に覆い(図6C)、また、ケラチノサイトも創傷の全領域を覆った(図6D)。これは、陽性対照であるTGF-αと同等の結果だった。
ギヌラ・プロクンベンス抽出物(GP)は(C)線維芽細胞、(D)ケラチノサイト及び(E)ヒト肥満細胞由来LAD2株の細胞遊走を活性化し(図7)、さらに(C)線維芽細胞は3倍、(D)ケラチノサイトは2倍、(F)ヒト臍帯静脈内皮細胞は2倍、細胞増殖を上昇させた(図8)。
Claims (2)
- ギヌラ・プロクンベンスの80~99.5容量%エタノール水溶液抽出物を有効成分とする糖尿病性潰瘍の治癒促進剤。
- 皮膚外用剤である請求項1記載の糖尿病性潰瘍の治癒促進剤。
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Acute toxicity study and wound healing potential of Gynura procumbens leaf extract in rats,Journal of Medicinal Plants Research,2011年,Vol. 5, No. 12,p. 2551-2558 |
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