JP7437328B2 - 多能性幹細胞の除去剤 - Google Patents

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Description

本発明は、多能性幹細胞の除去剤に関する。
多能性幹細胞の一種である人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）は自己複製能と分化能を兼ね備える細胞であり、生体内にそのまま移植した場合、未分化状態のiPS細胞が混入されていると奇形腫（Teratoma）と呼ばれる腫瘍を形成する（非特許文献１）。奇形腫はいわゆる癌（悪性腫瘍）とは異なるものの、iPS細胞を出発材料とした細胞製品を開発する際、もし最終製品にiPS細胞が残存し、その細胞から奇形腫が形成されると、製品の安全性と有効性が損なわれる可能性がある。そこで、iPS細胞由来細胞製品を開発する際には、奇形腫形成能のある未分化状態のiPS細胞が製品中に存在しないことが極めて重要となる。
現在ではiPS細胞を高感度に検出することが可能となっているものの、検出には技術的な限界があり、特に大量の細胞から構成される細胞製品の場合、微量のiPS細胞の存在を完全には否定できない場合がある。そこで製造面からのアプローチとして、製品の中間体又は最終製品についてiPS細胞を除去する処理を行うことで、微量のiPS細胞が存在する可能性を低減し、安全性を高めることを目的として、様々な手法が開発されている。例えば、細胞死を誘導する物質を用いてiPS細胞を除去する方法が挙げられる。
iPS細胞に対して細胞死を誘導できる物質としては、例えば、iPS細胞を認識する糖蛋白と毒素との融合蛋白（非特許文献２）、iPS細胞を認識して細胞死を誘導する抗体（非特許文献３）、脂肪酸不飽和化を阻害する化合物（特許文献１、非特許文献４）、選択的にiPS細胞を認識して細胞死を誘導する抗体薬物複合体（非特許文献５）が知られている。しかしながら、そのような物質として本発明のヘミアスタリン誘導体及びその抗体薬物複合体は知られていない。iPS細胞認識糖蛋白と毒素との融合蛋白、iPS細胞の除去抗体は、平面培養している単層のiPS細胞に対しては効率よく作用するものの、分子量の大きい巨大分子であるという性質上、血管系を持たない細胞塊に添加した場合、細胞塊内部に浸透する効率は極めて悪いと考えられている。
抗体薬物複合体は、標的認識分子として抗体を用い、これと薬物を直接的に、又は適切なリンカーを介して、結合させた複合体である。そして、抗体薬物複合体は、標的細胞に発現している抗原に結合する抗体を介して薬物を標的細胞へ送達することにより、細胞選択的に標的細胞を除去する特徴を持つ。
例えば、抗ＣＤ３０抗体にモノメチルオーリスタチンを結合したアドセトリスは、残留するiPS細胞を選択的に細胞死を誘導することが報告されている（特許文献２、非特許文献５）。
抗体薬物複合体で、膜透過性を示す薬物は、バイスタンダー効果と呼ばれる、標的細胞周辺から薬物拡散が生じ、抗原非発現細胞にも細胞傷害を示す。例えば、アドセトリスは、バイスタンダー効果があることが報告されている（非特許文献６）。
ヘミアスタリンは、海綿から単離される、トリペプチド構造を有する天然化合物であり、細胞中での微小管脱重合及び有糸分裂停止に関与している（非特許文献７）。
これまでに、いくつかのグループが、ヘミアスタリン誘導体の構造修飾を行い、構造活性相関を報告している（特許文献３～７、非特許文献８～１１）。そして、抗有糸分裂作用に基づく強力な細胞毒性（細胞傷害性）を示すヘミアスタリン誘導体が見いだされてきた。
また、抗原発現細胞において細胞傷害活性を示す、ヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体が報告されている（特許文献６、８～１２）。
さらに、他のいくつかのグループが、抗体のシステイン残基と薬物を直接的に結合させた抗体薬物複合体は、抗体の代謝によって、細胞内で、抗体薬物複合体のＣｙｓ－薬物部分を放出することを報告している（非特許文献１２）。
特表２０１５－５２５２０７号公報 国際公開第２０１６／０７２５１９号 国際公開第２００４／０２６２９３号 国際公開第９６／３３２１１号 米国特許第７５７９３２３号 国際公開第２０１４／１４４８７１号 国際公開第２００３／０８２２６８号 国際公開第２０１６／１２３５８２号 国際公開第２０１５／０９５９５２号 国際公開第２０１５／０９５９５３号 国際公開第２０１３／１７３３９３号 国際公開第２０１４／０５７４３６号
Pros One, 9, 1-11 (2014) Stem Cell Reports, 4, 1-10 (2015) Journal of Biological Chemistry, 290, 20071-20085 (2015) Cell Stem Cell, 12, 167-179 (2013) Sci. Rep., 8, 3726 (2018) Clin. Cancer. Res., 16, 888-897 (2010) Tetrahedron Lett., 35, 4453-4456 (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, 4353-4358 (2004) J. Med. Chem., 47, 4774-4786 (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, 5317-5322 (2004) J. Nat. Prod., 66, 183-199 (2003) Bioconjugate Chem. 17, 114-124 (2006)
本発明の課題は、抗体薬物複合体から生成する化合物が、多能性幹細胞に対して特異的に細胞傷害を与える一方で、分化細胞への細胞傷害は抑えられたヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、式（１－１）、式（１－２）又は式（１－３）で表される化合物が、分化細胞への細胞毒性と比較して、iPS細胞に対して強い細胞傷害活性を示すことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［項１］
式（１－１）：
Figure 0007437328000001
 ［式中、
ｂは１～５の整数を表し、
Ｚは、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）：
Figure 0007437328000002
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000003
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000004
 で表される基を表す）
で表される基を表し、
ｆは１又は２を表し、
Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕは１又は２を表す）
で表される基である］
で表される化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項２］
式（１－２）：
Figure 0007437328000005
 ［式中、
ｈは１～５の整数を表し、
Ｚ’は、式（Ｚ－３）又は式（Ｚ－４）：
Figure 0007437328000006
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000007
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000008
 で表される基を表す）
で表される基である］
で表される化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項３］
式（１－３）：
Figure 0007437328000009
 ［式中、
Ｒ２は、グルタミン酸残基（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）又はリシン残基（Ｌｙｓ）を表し、
Ｒ２のＮ末端窒素原子はカルボニル（ａ）と共にアミド結合を形成しており、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000010
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000011
 で表される基を表す）
で表される基である］
で表される化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項４］
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基である、項１～３のいずれか一項に記載の化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項５］
以下の化合物から選択される、項１又は４に記載の化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
Figure 0007437328000012
［項６］
以下の化合物から選択される、項２又は４に記載の化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
Figure 0007437328000013
［項７］
以下の化合物から選択される、項３又は４に記載の化合物を放出する抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
Figure 0007437328000014
［項８］
式（２－１）：
Figure 0007437328000015
 ［式中、
ｍＡｂは、多能性幹細胞表面に発現する抗原を認識する抗体を表し、
ｑは１～２０の整数を表し、
ｂは１～５の整数を表し、
Ｚは、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）：
Figure 0007437328000016
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000017
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000018
 で表される基を表す）
で表される基を表し、
ｆは１又は２を表し、
Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕは１又は２を表す）
で表される基である］
で表される、抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項９］
式（２－２）：
Figure 0007437328000019
 ［式中、
ｍＡｂは、多能性幹細胞表面に発現する抗原を認識する抗体を表し、
ｑは１～２０の整数を表し、
ｈは１～５の整数を表し、
Ｚ”は、式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）：
Figure 0007437328000020
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000021
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000022
 で表される基を表す）
で表される基を表し、
Ｙは、単結合又は式（Ｙ－１）：
Figure 0007437328000023
 で表される基を表し、
式（Ｙ－１）で表される基の＊１末端は、アミン（ｂ）と共に結合を形成することを表し、
Ｇは、単結合、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－を表し、
Ｇの＊２末端はＹ又は－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆは１又は２を表し、
Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕは１又は２を表す）
で表される基である］
で表される、抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１０］
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｙが単結合であり
Ｇが単結合である、
項９に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１１］
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｙが式（Ｙ－１）で表される基であり，
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
項９に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１２］
Ｚ”が、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
項９に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１３］
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基である、項８～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１４］
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体、抗ＴＲＡ１－６０抗体、抗ＴＲＡ１－８１抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、又は抗ｒＢＣ２ＬＣＮ抗体である、項８～１３のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１５］
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体である、項８～１３のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１６］
ｑが１～８の整数である、項８～１５のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１７］
式（３－１）：
Figure 0007437328000024
 ［式中、
ｂは１～５の整数を表し、
Ｚは、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）：
Figure 0007437328000025
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000026
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000027
 で表される基を表す）
で表される基を表し、
ｆは１又は２を表し、
Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕは１又は２を表す）
で表される基である］
で表される化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１８］
式（３－２）：
Figure 0007437328000028
 ［式中、
ｈは１～５の整数を表し、
Ｚ”は、式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）：
Figure 0007437328000029
 （式中、
Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000030
 （式中、
Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000031
 で表される基を表す）
で表される基を表し、
Ｙは、単結合又は式（Ｙ－１）：
Figure 0007437328000032
 で表される基を表し、
式（Ｙ－１）で表される基の＊１末端は、アミン（ｂ）と共に結合を形成することを表し、
Ｇは、単結合、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－を表し、
Ｇの＊２末端はＹ又は－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆは１又は２を表し、
Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕは１又は２を表す）
で表される基である］
で表される化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項１９］
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｙが単結合であり
Ｇが単結合である、
項１８に記載の化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項２０］
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｙが式（Ｙ－１）で表される基であり
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
項１８に記載の化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項２１］
Ｚ”が、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
項１８に記載の化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項２２］
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基である、項１７～２１のいずれか一項に記載の化合物から製造される抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
［項２３］
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の殺傷剤。
［項２４］
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の減少剤。
［項２５］
多能性幹細胞が、ES細胞又はiPS細胞である、項１～２２のいずれか一項に記載の多能性幹細胞の除去剤。
［項２６］
多能性幹細胞が、iPS細胞である、項１～２２のいずれか一項に記載の除去剤。
［項２７］
多能性幹細胞を含む培養液に、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を添加する工程を含む、多能性幹細胞の除去方法。
［項２８］
多能性幹細胞を培養することによって製造される細胞塊を含む培養液に、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を添加する工程を含む、多能性幹細胞の除去方法。
［項２９］
多能性幹細胞が、iPS細胞である、項２７又は２８に記載の除去方法。
［項３０］
実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団を製造するための、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩の使用。
［項３１］
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩とiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団とを接触させる工程を含む、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団の製造方法。
［項３２］
以下の工程：
（１）iPS細胞を含む細胞集団を分化細胞へ分化誘導する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られる分化細胞を含む細胞集団を、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩と接触させる工程；
を含む、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団の製造方法。
［項３３］
項３１又は３２に記載の製造方法により製造される、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団。
［項３４］
分化細胞が移植用細胞である、項３３に記載の細胞集団。
［項３５］
項３３又は３４に記載の細胞集団に含まれる分化細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
本発明の多能性幹細胞の除去剤は多能性幹細胞由来の細胞医薬品から多能性幹細胞を効率的に除去することができる。とりわけ、多能性幹細胞を培養することによって製造される分化細胞を含む細胞集団から、多能性幹細胞を選択的に除去することができる。
モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ヘミアスタリン及び実施例１のブタチューブリンの重合阻害活性を示す図である。 実施例ＡＤＣ１及び実施例ＡＤＣ２３のiPS細胞に対する細胞傷害活性を示す図である。 実施例ＡＤＣ１及び実施例ＡＤＣ２３の分化細胞に対する細胞傷害活性を示す図である。
本明細書において、「Ｃ１－６アルキル基」とは、炭素原子数が１～６の直鎖状又は分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。「Ｃ１－６アルキル基」として、好ましくは「Ｃ１－４アルキル基」が挙げられ、より好ましくは「Ｃ１－３アルキル基」が挙げられ、さらに好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基が挙げられ、特に好ましくはメチル基又はエチル基が挙げられる。
「Ｃ１－３アルキル基」の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基が挙げられる。「Ｃ１－４アルキル基」の具体例としては、例えば、「Ｃ１－３アルキル基」の具体例として挙げたものに加え、ブチル基、１、１－ジメチルエチル基、１－メチルプロピル基、２－メチルプロピル基等が挙げられる。「Ｃ１－６アルキル基」の具体例としては、例えば、「Ｃ１－４アルキル基」の具体例として挙げたものに加え、ペンチル基、３－メチルブチル基、２－メチルブチル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、ヘキシル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基等が挙げられる。
本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。好ましくはフッ素原子又は塩素原子が挙げられ、より好ましくはフッ素原子が挙げられる。
＜ヘミアスタリン誘導体＞
式（１－１）、式（１－２）又は式（１－３）で表される化合物及びその塩（以下、「本発明のヘミアスタリン誘導体」と称することもある。）は、以下のとおりである。
（１）式（１－１）で表される化合物及びその塩
本発明のヘミアスタリン誘導体のうち、下記の式（１－１）で表される化合物及びその塩について説明する。
Figure 0007437328000033
式中、ｂは、１～５の整数を表す。すなわち、ｂは、１、２、３、４、又は５である。ｂの１態様としては、１～４の整数が挙げられ、別の１態様としては、１～３の整数が挙げられ、別の１態様としては、２又は３が挙げられる。
式中、Ｚは、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）：
Figure 0007437328000034
 で表される基を表す。式（Ｚ－１）において置換基Ｒ１が結合する炭素原子及び式（Ｚ－２）においてカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）が結合する炭素原子の立体配置はＳ体であってもＲ体であってもよい。
式（Ｚ－１）において、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表す。ここで、ｕは、１又は２である。ｕの１態様としては、１が挙げられ、別の１態様としては、２が挙げられる。
式（Ｚ－２）において、ｆは、１又は２を表す。ｆの１態様としては、１が挙げられ、別の１態様としては、２が挙げられる。
式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）において、Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000035
 で表される基を表す。Ｗの１態様としては、式（Ｗ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｗ－２）で表される基が挙げられる。
式（Ｗ－１）において、Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000036
 で表される基を表す。Ｑの１態様としては、式（Ｑ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｑ－２）で表される基が挙げられる。
本明細書において、水素原子は１Ｈであっても、２Ｈ（Ｄ）であってもよい。すなわち、例えば、式（１－１）で表される化合物の１つ又は２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、式（１－１）で表される化合物に包含される。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－１－Ａ）が挙げられる。
（１－１－Ａ）
式（１－１）において、
ｂが２、３又は４であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基であり、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨであり、
ｕが、１又は２の整数であり、
ｆが、１又は２の整数である、
化合物又はその塩。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－１－Ｂ）が挙げられる。
（１－１－Ｂ）
式（１－１）において、
ｂが２、３又は４であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基であり、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨであり、
ｕが、１又は２の整数であり、
ｆが、１又は２の整数である、
化合物又はその塩。
（２）式（１－２）で表される化合物及びその塩
本発明のヘミアスタリン誘導体のうち、下記の式（１－２）で表される化合物及びその塩について説明する。
Figure 0007437328000037
式中、ｈは、１～５の整数を表す。すなわち、ｈは、１、２、３、４、又は５である。ｈの１態様としては、１～４の整数が挙げられ、別の１態様としては、１～３の整数が挙げられ、別の１態様としては、３が挙げられる。
式中、Ｚ’は、式（Ｚ－３）又は式（Ｚ－４）：
Figure 0007437328000038
 で表される基を表す。Ｚ’の１態様としては、式（Ｚ－３）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｚ－４）が挙げられる。式（Ｚ－３）及び式（Ｚ－４）においてカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）が結合する炭素原子の立体配置はＳ体であってもＲ体であってもよい。
式（Ｚ－３）又は式（Ｚ－４）において、Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000039
 で表される基を表す。Ｗの１態様としては、式（Ｗ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｗ－２）で表される基が挙げられる。
式（Ｗ－１）において、Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000040
 で表される基を表す。Ｑの１態様としては、式（Ｑ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｑ－２）で表される基が挙げられる。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－２－Ａ）が挙げられる。
（１－２－Ａ）
式（１－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ’が、式（Ｚ－３）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－２－Ｂ）が挙げられる。
（１－２－Ｂ）
式（１－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ’が、式（Ｚ－４）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
（３）式（１－３）で表される化合物及びその塩
本発明のヘミアスタリン誘導体のうち、下記の式（１－３）で表される化合物及びその塩について説明する。
Figure 0007437328000041
式中、Ｒ２は、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基又はリシン残基を表し、好ましくはグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基が挙げられる。本明細書において、特に区別する必要がある場合を除き、α－アミノ酸及び対応するアミノ酸残基の両方を表すのに、下記の３文字略語表記を用いることがある。また、α－アミノ酸の光学活性は、特に指定していない場合は、ＤＬ体、Ｄ体又はＬ体のいずれをも含み得るものとする。例えば、「グルタミン酸」又は「Ｇｌｕ」は、ＤＬ－グルタミン酸若しくはその残基、Ｄ－グルタミン酸若しくはその残基、又はＬ－グルタミン酸若しくはその残基を表している。
Ａｓｐ…アスパラギン酸、Ｇｌｕ…グルタミン酸、Ｌｙｓ…リシン
Ｒ２のＮ末端窒素原子はカルボニル基（ａ）と共にアミド結合を形成している。「Ｒ２のＮ末端窒素原子はカルボニル（ａ）と共にアミド結合を形成している」とは、例えば、Ｒ２がＡｓｐである場合、Ａｓｐの窒素原子（ｂ）とカルボニル基（ａ）が、下式で表すようにアミド結合を形成して連結していることを意味する。
Figure 0007437328000042
式中、Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000043
 で表される基を表す。Ｗの１態様としては、式（Ｗ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｗ－２）で表される基が挙げられる。
式（Ｗ－１）において、Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000044
 で表される基を表す。Ｑの１態様としては、式（Ｑ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｑ－２）で表される基が挙げられる。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－３－Ａ）が挙げられる。
（１－３－Ａ）
式（１－３）において、
Ｒ２が、グルタミン酸残基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－３－Ｂ）が挙げられる。
（１－３－Ｂ）
式（１－３）において、
Ｒ２が、アスパラギン酸残基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のヘミアスタリン誘導体の１つの態様としては、以下の（１－３－Ｃ）が挙げられる。
（１－３－Ｃ）
式（１－３）において、
Ｒ２が、リシン残基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
＜抗体薬物複合体＞
式（２－１）又は式（２－２）で表される抗体薬物複合体又はその塩（以下、「本発明の抗体薬物複合体」と称することもある。）は、以下に示すように、抗体分子由来の抗体部分と薬物分子由来の薬物部分が共有結合している複合体である。本明細書において、「抗体薬物複合体」を「ＡＤＣ」という場合もある。
Figure 0007437328000045
本発明の抗体薬物複合体は、Ｚ又はＺ”で表されるヘミアスタリン由来の骨格を有する化合物が、スクシンイミド構造を有するリンカーを介して抗体と結合している。本発明の抗体薬物複合体の薬物部分は、本発明のヘミアスタリン誘導体の構造の一部又は全体を有しており、抗体薬物複合体の抗体以外の構造を指す。抗体薬物複合体は、代謝されることによって薬物部分由来の化合物を放出するが、放出される化合物は薬物部分の一部又は全体であってもよい。すなわち、放出される化合物は、本発明のヘミアスタリン誘導体であっても、その部分構造であるヘミアスタリン由来の骨格を有する化合物であってもよい。本明細書において、抗体薬物複合体から放出される上記化合物を、「薬物部分由来の化合物」という場合もある。
式中、ｑは、抗体薬物複合体分子における、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、又はＤＡＲともいう。）を示す。薬物抗体比ｑは、抗体薬物複合体１分子において、抗体分子１つ当たりの、すなわち、抗体薬物複合体１分子当たりの、薬物分子の数を意味する。なお、化学合成により得られる抗体薬物複合体は、異なる薬物抗体比ｑを有し得る複数の抗体薬物複合体分子の混合物である場合が多い。本明細書において、このような抗体薬物複合体の混合物における全体の薬物抗体比（すなわち、それぞれの抗体薬物複合体の薬物抗体比ｑの平均値）を、「平均薬物抗体比」又は「平均ＤＡＲ」と呼ぶ。
ｑは、１～２０の整数を表す。すなわち、ｑは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である。ｑの１態様としては、１～１０の整数が挙げられ、別の１態様としては、１１～２０の整数が挙げられ、別の１態様としては、１～８の整数が挙げられ、別の１態様としては、４～８の整数が挙げられ、別の１態様としては、８が挙げられる。
平均ＤＡＲの１態様としては、１～２０が挙げられ、別の１態様としては、１～１０が挙げられ、別の１態様としては、１０～２０が挙げられる。別の１態様としては、１～８、１～２、２～３、３～４、４～５、６～７、７～８、８～９、９～１０、５～１５が挙げられる。平均ＤＡＲは、紫外可視近赤外分光法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等の、平均ＤＡＲの決定に通常用いられる方法によって決定することができる。疎水性相互作用カラムクロマトフィー（ＨＩＣ）ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、電気泳動等の方法により、異なるＤＡＲを有する複数の抗体薬物複合体の混合物から、特定のＤＡＲの抗体薬物複合体の分離、精製及び特性決定を行うことができる
ｍＡｂは「抗体」を示す。ここで、「抗体」は、少なくとも重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインを含む抗体であればよく、完全抗体であっても、完全抗体の断片であって抗原認識部位を有する抗原結合断片であってもよい。完全抗体は、２つの全長の軽鎖と２つの全長の重鎖とを有し、それぞれの軽鎖と重鎖とはジスルフィド結合によって連結されている。完全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは、サブタイプとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。また、抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体部分と薬物部分とは、抗体中のジスルフィド結合が還元されて得られるスルフヒドリル基を介して結合している。
本明細書において、抗体及びｍＡｂは、多能性幹細胞、具体的にはES細胞又はiPS細胞の表面に発現する抗原を認識する抗体であることが望ましい。多能性幹細胞の表面に存在する抗原は、分化細胞で発現されない又は発現量の少ない、多能性幹細胞に特異的な抗原であることが好ましい。例えば、多能性幹細胞に発現する量が、分化細胞で発現する量の１０倍以上、好ましくは１００倍以上、更に好ましくは１０００倍以上である抗原を選択することができる。ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の表面に発現する抗原としては、例えば、ＣＤ３０、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ｒＢＣ２ＬＣＮ等が挙げられるが、これらに限定されない。ｍＡｂの１態様としては、抗ＣＤ３０抗体、抗ＴＲＡ１－６０抗体、抗ＴＲＡ１－８１抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、又は抗ｒＢＣ２ＬＣＮ抗体が挙げられ、別の１態様としては、抗ＣＤ３０抗体が挙げられる。
抗ＣＤ３０抗体としては、例えば、ブレンツキシマブ、イラツムマブ等が挙げられる。また、抗ＴＲＡ１－６０抗体、抗ＴＲＡ１－８１抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、及び抗ｒＢＣ２ＬＣＮ抗体は市販品を利用することができる。
本発明の抗体薬物複合体の抗体部分は、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の細胞表面に発現している抗原に対する抗体であればよい。ｍＡｂの１態様としては、ブレンツキシマブ、又はイラツムマブが挙げられ、好ましくはブレンツキシマブが挙げられる。ここに具体的に挙げられた抗体は、市販品を利用することができるか、又は公知の方法によって製造することができる。
本発明の抗体薬物複合体の抗体部分は、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の細胞表面に発現している抗原に対する抗体であればよい。ｍＡｂとして、例えば、抗ＣＤ３０抗体、抗ＴＲＡ１－６０抗体、抗ＴＲＡ１－８１抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、又は抗ｒＢＣ２ＬＣＮ抗体が挙げられる。ｍＡｂの別の１態様として、抗ＣＤ３０抗体が挙げられる。
式（２－１）における、Ｚ及びｂは、式（１－１）におけるこれらの符号と同義である。
式（２－２）における、Ｚ”は、式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）：
Figure 0007437328000046
 で表される基を表す。
式中、Ｇは、単結合、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－であり、Ｇの＊２末端はＹ又は－ＮＨ－と結合していることを表す。Ｇの１態様としては、単結合、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－が挙げられ、別の１態様としては、単結合が挙げられ、別の１態様としては、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－が挙げられ、好ましくは、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－が挙げられる。
式中、Ｙは、単結合又は式（Ｙ－１）：
Figure 0007437328000047
 で表される基を表す。Ｙの１態様としては、単結合が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｙ－１）で表される基が挙げられる。
式（Ｙ－１）中の＊１末端は、アミン（ｂ）と共に結合を形成している。
式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）中、Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
Figure 0007437328000048
 で表される基を表す。Ｗの１態様としては、式（Ｗ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｗ－２）で表される基が挙げられる。
式（Ｗ－１）及び式（Ｚ－７）において、Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
Figure 0007437328000049
 で表される基を表す。Ｑの１態様としては、式（Ｑ－１）で表される基が挙げられ、別の１態様としては、式（Ｑ－２）で表される基が挙げられる。
式（Ｚ－７）及び式（Ｚ－９）において、ｆは、１又は２を表す。ｆの１態様としては、１が挙げられ、別の１態様としては、２が挙げられる。
式（Ｚ－８）において、Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表す。ここで、ｕは、１又は２である。
式中、Ｇが、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－であり、Ｙが式（Ｙ－１）で表される、本発明の抗体薬物複合体は、生体内において、まず式（Ｚ－５）及び式（Ｚ－６）におけるＹ－Ｇ間の結合、又は式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）及び式（Ｚ－９）における－ＮＨ－Ｇ間の結合において切断され、次いで、薬物とＹの間の結合において切断されることにより、式（１－１）、式（１－２）又は式（１－３）で表されるヘミアスタリン誘導体を放出すると推定される。
Ｇ－Ｙ結合又はＧ－ＮＨ結合は、細胞内環境中（例えば、リソソーム、エンドソーム又はカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する、細胞内ペプチダーゼ、プロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼ）等によって切断される。
細胞内環境中に存在するプロテアーゼとしては、例えば、カテプシンＢが知られている。カテプシンＢによるＧ－Ｙ結合又はＧ－ＮＨ結合の切断については、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ Ｇ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，１９９８,Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：３３４１－３３４６等に記載されている。カテプシンＢにより切断されるＹ－Ｇの具体例としては、例えば、Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ、Ｙ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ、Ｙ－Ｌｙｓ－Ａｌａ、Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｙ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ、Ｙ－Ｌｙｓ、Ｙ－Ｃｉｔ－Ｖａｌ、Ｙ－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ、Ｙ－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ、Ｙ－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ、Ｙ－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ、Ｙ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ等が挙げられる。
細胞内環境中に存在する他のプロテアーゼとしては、例えば、アスパラギンエンドペプチダーゼが知られている。アスパラギンエンドペプチダーゼによるＧ－Ｙ結合又はＧ－ＮＨ結合の切断については、Ｄａｎｄｏ Ｍ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：７４３－７４９等に記載されている。アスパラギンエンドペプチダーゼにより切断されるＧ－Ｙ結合又はＧ－ＮＨ結合の具体例としては、例えば、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、Ｙ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ等が挙げられる。
細胞内環境中において、Ｇが、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－であり、Ｇの＊２末端が式（Ｙ－１）で表される基又は－ＮＨ－と結合している、本発明の抗体薬物複合体から、薬物が放出される推定機構を、Ｚ”が式（Ｚ－７）である式（２－２）で例示する。これらの薬物放出機構は、Ｔｏｋｉ ｅｔ． ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７，１８６６－１８７２．等に記載されている抗体薬物複合体の薬物放出機構から推定されたものである。
Figure 0007437328000050
本発明の抗体薬物複合体は、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞に取り込まれた後、細胞内で抗体が代謝され、薬物部分由来の化合物、又は抗体の一部（抗体断片）と薬物部分を含む構造に相当する化合物が放出されうる。例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ Ｓ．Ｏ．ら、２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７：１１４－１２４では、抗体の代謝によって、細胞内で、抗体薬物複合体のＣｙｓ－薬物部分が放出されることが記載されている。本発明の抗体薬物複合体において、同様のメカニズムで放出されるＣｙｓが結合した薬物部分としては、式（１－１）又は式（１－２）で表される化合物が挙げられる。
本明細書において、「化合物を放出する」とは、抗体薬物複合体が、細胞内において抗体部分のプロテアーゼによる代謝を受けることによって、薬物部分由来の化合物を細胞内に放出することを意味する。放出された化合物は細胞内で薬理活性、すなわち細胞障害活性を示し、細胞死を誘導する。「化合物を放出する抗体薬物複合体」とは、細胞内において抗体部分の代謝を受けることによって薬物部分由来の化合物を放出することのできる抗体薬物複合体を意味する。
前記化合物を放出する抗体薬物複合体は、適宜当業者に周知の技術で設計し、製造することができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｌａｕｒｅｎｔ Ｄｕｃｒｙ編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ刊行、２０１３年）では、抗体と薬物をつなぐリンカーやその結合形式が記載されており、そのように設計し、製造された抗体薬物複合体が、化学的反応又は酵素的反応によって、目的とする化合物を放出することが記載されている。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－１－Ａ）が挙げられる。
（２－１－Ａ）
式（２－１）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｂが２、３、４又は５であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２を表し、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－１－Ｂ）が挙げられる。
（２－１－Ｂ）
式（２－１）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｂが２、３、４又は５であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２を表し、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ａ）が挙げられる。
（２－２－Ａ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、単結合であり、
Ｙが、単結合であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｂ）が挙げられる。
（２－２－Ｂ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、単結合であり、
Ｙが、単結合であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｃ）が挙げられる。
（２－２－Ｃ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端とＹと結合していることを表し、
Ｙが、式（Ｙ－１）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｄ）が挙げられる。
（２－２－Ｄ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端とＹと結合していることを表し、
Ｙが、式（Ｙ－１）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｅ）が挙げられる。
（２－２－Ｅ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－７）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｆ）が挙げられる。
（２－２－Ｆ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－７）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｇ）が挙げられる。
（２－２－Ｇ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－８）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２を表し、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｈ）が挙げられる。
（２－２－Ｈ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－８）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２を表し、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｉ）が挙げられる。
（２－２－Ｉ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、iPS細胞表面に発現する抗原を認識する抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆが、１又は２であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
本発明の抗体薬物複合体の１つの態様としては、以下の（２－２－Ｊ）が挙げられる。
（２－２－Ｊ）
式（２－２）において、
ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体であり、
ｑが、１～８の整数であり、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆが、１又は２であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
＜ＡＤＣ中間体＞
本発明の抗体薬物複合体を合成するための合成中間体（以下、「本発明のＡＤＣ中間体」ともいう）は、下記式（３－１）又は式（３－２）で表される、化合物又はその塩である。
（１）式（３－１）で表される化合物及びその塩
本発明のＡＤＣ中間体のうち、下記の式（３－１）で表される化合物及びその塩について説明する。
Figure 0007437328000051
式（３－１）における、Ｚ及びｂは、式（２－１）におけるこれらの符号と同義である。
（２）式（３－２）で表される化合物及びその塩
本発明のＡＤＣ中間体のうち、下記の式（３－２）で表される化合物及びその塩について説明する。
Figure 0007437328000052
式（３－２）における、Ｚ”及びｈは、式（２－２）におけるこれらの符号と同義である。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－１－Ａ）が挙げられる。
（３－１－Ａ）
式（３－１）において、
ｂが２、３、４又は５であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基であり、
ｆが、１又は２を表し、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－１－Ｂ）が挙げられる。
（３－１－Ｂ）
式（３－１）において、
ｂが２、３、４又は５であり、
Ｚが、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２を表し、
Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ａ）が挙げられる。
（３－２－Ａ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、単結合であり、
Ｙが、単結合であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｂ）が挙げられる。
（３－２－Ｂ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、単結合であり、
Ｙが、単結合であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｃ）が挙げられる。
（３－２－Ｃ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端とＹと結合していることを表し、
Ｙが、式（Ｙ－１）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｄ）が挙げられる。
（３－２－Ｄ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端とＹと結合していることを表し、
Ｙが、式（Ｙ－１）で表される基であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｅ）が挙げられる。
（３－２－Ｅ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－７）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基であり、
ｆが、１又は２である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｆ）が挙げられる。
（３－２－Ｆ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－７）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基であり、
ｆが、１又は２である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｇ）が挙げられる。
（３－２－Ｇ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－８）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し
Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２を表し、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｈ）が挙げられる。
（３－２－Ｈ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－８）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し
Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
ｕが１又は２を表し、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｉ）が挙げられる。
（３－２－Ｉ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆが、１又は２であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり
Ｑが、式（Ｑ－１）で表される基である、
化合物又はその塩。
本発明のＡＤＣ中間体の１つの態様としては、以下の（３－２－Ｊ）が挙げられる。
（３－２－Ｊ）
式（３－２）において、
ｈが２、３、４又は５であり、
Ｚ”が、式（Ｚ－９）で表される基であり、
Ｇが、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－又は＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－であり、
＊２が、Ｇ末端と－ＮＨ－と結合していることを表し、
ｆが、１又は２であり、
Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基であり、
Ｑが、式（Ｑ－２）で表される基である、
抗体薬物複合体又はその塩。
「塩」は、本発明のヘミアスタリン誘導体の好適な塩及び医薬品原料として許容しうる塩であり、好ましくは慣用の無毒性塩である。「塩」としては、例えば、有機酸塩（例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ギ酸塩又はｐ－トルエンスルホン酸塩等）及び無機酸塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩又はリン酸塩等）のような酸付加塩、アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等）との塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩等）及びアルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩等）等の金属塩、アンモニウム塩、又は有機塩基塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩又はＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩等）等の他、適当な塩を当業者が適宜選択することができる。
一般に、抗体薬物複合体の作製及び解析は、当業者に公知の任意の技術によって行うことができる。このような方法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｌａｕｒｅｎｔ Ｄｕｃｒｙ編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ刊行、２０１３年）等に記載の方法が挙げられる。
本発明の抗体薬物複合体は、例えば、抗体中のジスルフィド結合をスルフヒドリル基に還元し、このスルフヒドリル基を、ＡＤＣ中間体と反応させることによって形成することができる。
本発明ヘミアスタリン誘導体、抗体薬物複合体又はＡＤＣ中間体の塩を取得したいとき、目的の化合物が塩の形で得られる場合には、それをそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られる場合には、それを適当な有機溶媒又は緩衝液に溶解若しくは懸濁させ、酸又は塩基を加えて通常の方法により塩を形成させればよい。
本発明のヘミアスタリン誘導体、抗体薬物複合体及びＡＤＣ中間体は、水和物及び／又は各種溶媒との溶媒和物（エタノール和物等）の形で存在することもあり、これらの水和物及び／又は溶媒和物も本発明のヘミアスタリン誘導体、抗体薬物複合体及びＡＤＣ中間体に含まれる。さらに、本発明には、本発明のヘミアスタリン誘導体、抗体薬物複合体及びＡＤＣ中間体のあらゆる様態の結晶形も含まれる。
本発明のヘミアスタリン誘導体、抗体薬物複合体及びＡＤＣ中間体の中には、光学活性中心に基づく光学異性体、分子内回転の束縛により生じた軸性又は面性キラリティーに基づくアトロプ異性体、その他のあらゆる立体異性体、互変異性体、及び幾何異性体等が存在し得るものがあるが、これらを含め、全ての可能な異性体は本発明の範囲に包含される。
特に、光学異性体やアトロプ異性体は、ラセミ体として得ることができ、また光学活性の出発原料や中間体が用いられた場合には光学活性体として得ることができる。必要であれば、下記製造法の適切な段階で、対応する原料、中間体又は最終品のラセミ体を、光学活性カラムを用いた方法、分別結晶化法等の、公知の分離方法によって、物理的に又は化学的に光学対掌体に光学分割することができる。具体的には、例えばジアステレオマー法では、光学活性分割剤を用いる反応によってラセミ体から２種のジアステレオマーを形成する。この異なるジアステレオマーは一般に物理的性質が異なるため、分別結晶化等の公知の方法によって光学分割することができる。
本発明のヘミアスタリン誘導体の製造方法について以下に述べる。式（１－１）、式（１－２）、式（１－３）、式（３－１）又は式（３－２）で表される本発明のヘミアスタリン誘導体は、例えば、下記の製造法Ａ～Ｌにより製造することができる。
製造法Ａ
Ｚが式（Ｚ－１）で表される基であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基であり、Ｑが式（Ｑ－１）で表される基である場合、式（１－１）又は式（３－１）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000053
Figure 0007437328000054
（式中、ｕ及びｂは、項１又は項１７に定義されるとおりであり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲＺは、それぞれ独立に、Ｃ１－６アルキル基又はベンジル基を表し、ＰＸはアミノ基の保護基を意味する。）
上記ＰＸで表されるアミノ基の保護基としては、Protective Groups in Organic Synthesis（Theodora W. Greene, PeterG. M. Wuts著、John Wiley & Sons, Inc.発行、１９９９年）に記載の保護基等を使用できる。上記ＰＸで表されるアミノ基の保護基としては、Protective Groups in Organic Synthesis（Theodora W. Greene, PeterG. M. Wuts著、John Wiley & Sons, Inc.発行、１９９９年）に記載の保護基等を使用できる。
化合物ａ１は、例えば、J. Med. Chem., 2007, 50, 4329-4339等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。化合物ａ１５は、例えば、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。
［Ａ－１工程］
化合物ａ２は、化合物ａ１を、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のメチル化試薬を反応させることにより製造することができる。メチル化試薬としては、例えば、ハロゲン化メチル等が挙げられ、好ましくはヨウ化メチル、臭化メチル、塩化メチル等が挙げられる。塩基としては、好ましくはカリウムヘキサメチルジシラジドが挙げられる。溶媒としては、好ましくはテトラヒドロフランが挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは１０分～２時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは－７８℃～１０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－２工程］
化合物ａ３は、化合物ａ２より、上記Ａ－１工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ａ－３工程］
化合物ａ４は、化合物ａ３を、適当な溶媒中で、適当な還元剤と反応させることにより製造することができる。還元剤としては、通常の有機合成反応に用いられる還元剤から適宜選択されるが、好ましくは水素化ジイソブチルアルミニウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはジエチルエーテルが挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは１０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは－７８℃～５０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－４工程］
化合物ａ５は、化合物ａ４を、適当な溶媒中、適当な酸化剤を用いて酸化することにより製造することができる。酸化剤としては、通常の有機合成反応に用いられる酸化剤から適宜選択することができるが、好ましくは過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはジクロロメタンが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは、－７８℃～５０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－５工程］
化合物ａ６は、化合物ａ５のアルデヒドを、適当な溶媒中、α－アミノシアノ化することにより製造することができる。溶媒としては、好ましくはトルエン及びジクロロメタンが挙げられる。反応時間は、通常５分～９６時間であり、好ましくは２４時間～７２時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～１００℃である。本工程は、Org. Lett. 2002, 4, 695-697等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－６工程］
化合物ａ７は、化合物ａ６を、適当な塩基存在下又は非存在下、適当な溶媒中で、適当な酸化剤を用いて製造することができる。酸化剤としては、通常の有機合成反応で用いられる酸化剤から適宜選択することができるが、好ましくは過酸化水素が挙げられる。塩基としては、好ましくは炭酸カリウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはメタノールが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～６０℃である。本工程は、J. Org. Chem. 2001, 66, 7355-7364等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－７工程］
化合物ａ８は、化合物ａ７を、適当な溶媒中、適当な触媒存在下で、還元剤を用いて還元することにより製造することができる。還元剤としては、通常の有機合成反応で用いられる還元剤から適宜選択することができるが、好ましくは水素、ギ酸アンモニウム等のギ酸の塩又はヒドラジンが挙げられる。触媒としては、パラジウム、ニッケル、ロジウム、コバルト、白金等の遷移金属、その塩若しくはその錯体又は上記遷移金属をポリマー等の担体に担持させたものが挙げられる。溶媒としては、好ましくはエタノール又はメタノールが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～１００℃である。本工程は、J. Org. Chem. 2001, 66, 7355-7364等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－８工程］
化合物ａ９は、化合物ａ８のアミノ基を保護基ＰＸで保護することにより製造することができる。本工程は、Protective Groups in Organic Synthesis（TheodoraW. Greene, Peter G. M. Wuts著、John Wiley & Sons, Inc.発行、1999年）に記載されている方法等に準じて行うことができる。
［Ａ－９工程］
化合物ａ１１は、化合物ａ９と種々のアシル化試薬（例えば、化合物ａ１０）を、適当な塩基存在下又は非存在下、適当な溶媒中で、反応させることにより製造することができる。アシル化試薬としては、例えば、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物等が挙げられ、好ましくはジ－ｔｅｒｔブチルジカルボネートが挙げられる。塩基としては、好ましくはジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはクロロホルムが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～５０℃である。
［Ａ－１０工程］
化合物ａ１２は、化合物ａ１１を、適当な溶媒中、適当なアルカリ金属アルコキシド類と反応させることにより製造することができる。アルカリ金属アルコキシド類としては、通常の有機合成反応で用いられるアルカリ金属アルコキシド類から適宜選択することができるが、好ましくはリチウムメトキシド又はリチウムエトキシドが挙げられる。溶媒としては、好ましくはメタノール又はエタノールが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～６時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは－７８℃～５０℃である。
［Ａ－１１工程］
化合物ａ１３は、化合物ａ１２に、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のメチル化試薬を反応させることにより製造することができる。メチル化試薬としては、例えば、ハロゲン化メチル等が挙げられ、好ましくはヨウ化メチル、臭化メチル、塩化メチル等が挙げられる。塩基としては、好ましくは水素化ナトリウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはテトラヒドロフランが挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは１０分～２時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは－７８℃～１０℃である。
［Ａ－１２工程］
化合物ａ１４は、化合物ａ１３のエステルを、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、加水分解することにより製造できる。塩基としては、好ましくは水酸化リチウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくは水又はメタノールが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃、好ましくは０℃～１００℃である。
［Ａ－１３工程］
化合物ａ１６は、化合物ａ１４と化合物ａ１５を、適当な溶媒中、適当な塩基存在下で、種々の縮合剤を用いて、縮合することにより製造することができる。縮合剤としては、通常の有機合成反応に用いられる種々の縮合剤を使用することができるが、好ましくは（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド又はブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートが挙げられる。また、必要に応じて、縮合反応の効率を向上させるために、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール等のカルボニル活性化試薬を共に用いることができる。塩基としては、好ましくはジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは０℃～１００℃である。本工程は、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－１４工程］
化合物ａ１７は、化合物ａ１６のエステルを、上記Ａ－１２工程に記載の方法に準じて加水分解することにより、製造することができる。本工程は、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ａ－１５工程］
化合物ａ１８は、化合物ａ１７とＮ－ヒドロキシスクシンイミドを、適当な溶媒中、適当な塩基存在下で、種々の縮合剤を用いて反応させることにより製造することができる。縮合剤としては、通常の有機合成反応に用いられる種々の縮合剤を使用することができるが、好ましくは（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド又はブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートが挙げられる。また、必要に応じて、反応の効率を向上させるために、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール等のカルボニル活性化試薬を共に用いることができる。塩基としては、好ましくはジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは０℃～１００℃である。
［Ａ－１６工程］
化合物ａ１９は、化合物ａ１８を、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、アミノ酸のエステル体と反応させることにより製造することができる。塩基としては、好ましくはジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～１００℃である。
［Ａ－１７工程］
化合物ａ２０は、化合物ａ１９とアミノアルキルマレイミド化合物を、上記Ａ－１３工程に記載の方法に準じて縮合することにより、製造することができる。
［Ａ－１８工程］
化合物Ａ１は、化合物ａ２０のアミノ基の保護基ＰＸの脱保護及びエステル（－ＣＯＯＲｂ）の加水分解により製造することができる。本工程は、Protective Groups in Organic Synthesis（TheodoraW. Greene, Peter G. M. Wuts著、John Wiley & Sons, Inc.発行、1999年）に記載されている方法等に準じて行うことができる。
［Ａ－１９工程］
化合物Ａ２は、化合物Ａ１とシステインを、適当な溶媒中で反応させることで製造することができる。溶媒としては、好ましくは水、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～約２００℃であり、好ましくは０℃～４０℃である。
製造法Ｂ
Ｚが式（Ｚ－１）で表される基であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基であり、Ｑが式（Ｑ－２）で表される基である場合、式（１－１）又は式（３－１）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000055
Figure 0007437328000056
（式中、ｕ又はｂは、項１又は項１７に定義されるとおりであり、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｘは、Ｃ１－６アルキル基又はベンジル基を表し、ＰＸはアミノ基の保護基を意味する。）
化合物ｂ１は、例えば、市販品として購入できる。化合物ｂ１１は、例えば、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。
［Ｂ－１工程］
化合物ｂ２は、化合物ｂ１に、種々のルイス酸存在下、ベンゼンを反応させることにより製造することができる。ルイス酸としては、例えば、ハロゲン化ホウ素、ハロゲン化アルミニウム、ハロゲン化ガリウム、ハロゲン化鉄、ハロゲン化チタン等が挙げられ、好ましくは塩化アルミニウム、塩化鉄等が挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは３０分～４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは５０℃～１５０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｂ－２工程］
化合物ｂ３は、化合物ｂ２を、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のカルボン酸ハロゲン化物と反応させた後、アルカリ金属化４－アルキル－２－オキサゾリジノンを反応させることにより製造することができる。塩基としては、好ましくはトリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはテトラヒドロフランが挙げられる。カルボン酸ハロゲン化物としては、例えば、カルボン酸塩化物等が挙げられ、好ましくはピバロイルクロライド等が挙げられる。アルカリ金属化４－アルキル－２－オキサゾリジノンとしては、４－アルキル－２－オキサゾリジノンリチウム、４－アルキル－２－オキサゾリジノンナトリウム等が挙げられ、好ましくは４－イソプロピル－２－オキサゾリジノンリチウムが挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは１０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは－７８℃～５０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｂ－３工程］
化合物ｂ４は、化合物ｂ３を、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のアジド化試薬と反応させることにより製造することができる。アジド化試薬としては、例えば、アジ化ナトリウム、トリメチルシリルアジド、ジフェニルリン酸アジド等が挙げられ、好ましくはトリメチルシリルアジドが挙げられる。塩基としては、好ましくはカリウムヘキサメチルジシラジドが挙げられる。溶媒としては、好ましくはテトラヒドロフランが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは－７８℃～７５℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｂ－４工程］
化合物ｂ５は、化合物ｂ４より、上記Ａ－７工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－５工程］
化合物ｂ６は、化合物ｂ５より、上記Ａ－８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－６工程］
化合物ｂ７は、化合物ｂ６を、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、適当な酸化剤を用いることにより製造することができる。塩基としては、好ましくは水酸化リチウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはメタノール、テトラヒドロフラン又は水が挙げられる。酸化剤としては、通常の有機合成反応で用いられる酸化剤から適宜選択することができるが、好ましくは過酸化水素が挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常０℃～２００℃であり、好ましくは０℃～６０℃である。本工程は、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｂ－７工程］
化合物ｂ８は、化合物ｂ７に、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のアルキル化試薬を反応させることにより製造することができる。アルキル化試薬としては、例えば、ハロゲン化アルキル等が挙げられ、好ましくはヨウ化アルキル、臭化アルキル、塩化アルキル等が挙げられる。塩基としては、好ましくは炭酸ナトリウム、炭酸カリウムが挙げられる。溶媒としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～４８時間であり、好ましくは１０分～２時間である。反応温度は、通常－７８℃～１００℃であり、好ましくは－１０℃～２５℃である。本工程は、Protective Groups in Organic Synthesis（TheodoraW. Greene, Peter G. M. Wuts著、John Wiley & Sons, Inc.発行、1999年）に記載されている方法等に準じて行うことができる。
［Ｂ－８工程］
化合物ｂ９は、化合物ｂ８より、上記Ａ－１１工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－９工程］
化合物ｂ１０は、化合物ｂ９より、上記Ａ－１２工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１０工程］
化合物ｂ１２は、化合物ｂ１０と化合物ｂ１１より、上記Ａ－１３工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１１工程］
化合物ｂ１３は、化合物ｂ１２のエステルを、上記Ａ－１２工程に記載の方法に準じて加水分解することにより、製造することができる。
［Ｂ－１２工程］
化合物ｂ１４は、化合物ｂ１３より、上記Ａ－１５工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１３工程］
化合物ｂ１５は、化合物ｂ１４より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１４工程］
化合物ｂ１６は、化合物ｂ１５より、上記Ａ－１７工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１５工程］
化合物Ｂ１は、化合物ｂ１６より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｂ－１６工程］
化合物Ｂ２は、化合物Ｂ１より、上記Ａ－１９工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｃ
Ｚが式（Ｚ－２）で表される基であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基である場合、式（１－１）又は式（３－１）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000057
 （式中、Ｑ、ｆ及びｂは、項１又は項１７に定義されるとおりであり、Ｒｂ及びＰＸは上記と同義である。）
化合物ｃ１は、製造法Ａの化合物ａ１８、製造法Ｂの化合物ｂ１４を表す。
［Ｃ－１工程］
化合物ｃ２は、化合物ｃ１より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｃ－２工程］
化合物ｃ３は、化合物ｃ２より、上記Ａ－１７工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｃ－３工程］
化合物Ｃ１は、化合物ｃ３より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｃ－４工程］
化合物Ｃ２は、化合物ｃ４より、上記Ａ－１９工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｄ
Ｒ２がリシン（Ｌｙｓ）残基であり、Ｚ”が式（Ｚ－３）又は式（Ｚ－５）で表される基であり、Ｙが単結合であり、Ｇが単結合であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基である場合、式（１－２）、式（１－３）又は式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000058
 （式中、Ｑ及びｈは、項２、項３又は項１８に定義されるとおりであり、Ｒｘ及びＰＸはび上記と同義であり、ＰＹはアミノ基の保護基を意味する。）
化合物ｄ１は、製造法Ａの化合物ａ１８、製造法Ｂの化合物ｂ１４を表す。化合物ｄ３は、例えば、市販品として購入できる。
［Ｄ－１工程］
化合物ｄ２は、化合物ｄ１より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｄ－２工程］
化合物Ｄ１は、化合物ｄ２より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｄ－３工程］
化合物Ｄ２は、化合物Ｄ１と化合物ｄ３より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｄ－４工程］
化合物Ｄ３は、化合物Ｄ２より、上記Ａ－１９工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｅ
Ｒ２がリシン（Ｌｙｓ）残基であり、Ｚ”が式（Ｚ－４）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、Ｙが単結合であり、Ｇが単結合であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基である場合、式（１－２）、式（１－３）又は式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000059
 （式中、Ｑ及びｈは、項２、項３又は項１８に定義されるとおりであり、Ｒｘ、ＰＸ及びＰＹは上記と同義である。）
化合物ｅ１は、製造法Ａの化合物ａ１８、製造法Ｂの化合物ｂ１４を表す。化合物ｅ３は、例えば、市販品として購入できる。
［Ｅ－１工程］
化合物ｅ２は、化合物ｅ１より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｅ－２工程］
化合物Ｅ１は、化合物ｅ２より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｅ－３工程］
化合物Ｅ２は、化合物Ｅ１と化合物ｅ３より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｅ－４工程］
化合物Ｅ３は、化合物Ｅ２より、上記Ａ－１９工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｆ
Ｒ２がアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基又はグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基である場合、式（１－３）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000060
 （式中、Ｑは、項３に定義されるとおりであり、ｓは１又は２を表し、ＰＸは上記と同義である。）
化合物ｆ１は、製造法Ａの化合物ａ１８、製造法Ｂの化合物ｂ１４を表す。
［Ｆ－１工程］
化合物ｆ２は、化合物ｆ１より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｆ－２工程］
化合物Ｆ１は、化合物ｆ２より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｇ
Ｚ”が式（Ｚ－７）で表される基であり、Ｗが式（Ｗ－１）で表される基であり、Ｇがアミノ酸又はペプチドで表される基である場合、式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000061
Figure 0007437328000062
（式中、Ｑ、ｆ、Ｇ及びｈは、項１８に記載される通りであり、Ｒａ、Ｒｘ及びＰＸは、上記と同義である。）
化合物ｇ１は、例えば、市販品として購入できる。化合物ｇ４は、例えば、J. Nat. Prod. 2003, 66, 183-199、J. Med. Chem., 2004, 47, 4774-4786等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。化合物ｇ７は、例えば、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。
［Ｇ－１工程］
化合物ｇ２は、化合物ｇ１とＧ基の原料となるアミノ酸又はペプチドとを、適当な溶媒中、適当な塩基存在下で、種々の縮合剤を用いて、縮合することにより製造することができる。縮合剤としては、通常の有機合成反応に用いられる種々の縮合剤を使用することができるが、好ましくは１－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）が挙げられる。また、必要に応じて、縮合反応の効率を向上させるために、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール等のカルボニル活性化試薬を共に用いることができる。塩基としては、好ましくはジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはジクロロメタンが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは０℃～５０℃である。本工程は、Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｇ－２工程］
化合物ｇ３は、化合物ｇ２に、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、種々のｐ－ニトロフェニル炭酸エステル化試薬を反応させることにより製造することができる。ｐ－ニトロフェニル炭酸エステル化試薬としては、例えば、クロロギ酸４－ニトロフェニル、ビス（４－ニトロフェニル）カルボナート等が挙げられ、好ましくはビス（４－ニトロフェニル）カルボナートが挙げられる。塩基としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは１時間～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは１０℃～５０℃である。本工程は、Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869やBioconjugate Chem. 2015, 26, 650-659等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｇ－３工程］
化合物ｇ５は、化合物ｇ３と化合物ｇ４とを、適当な塩基存在下、適当な溶媒中で、反応させることにより製造することができる。また、必要に応じて、縮合反応の効率を向上させるために、１－ヒドロキシ－７－ベンゾトリアゾール等のカルボニル活性化試薬を共に用いることができる。塩基としては、好ましくはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、２，６－ルチジンが挙げられる。溶媒としては、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは１時間～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは１０℃～５０℃である。本工程は、Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869やBioconjugate Chem. 2015, 26, 650-659等に記載されている方法に準じて行うことができる。
［Ｇ－４工程］
化合物ｇ６は、化合物ｇ５のエステルを、上記Ａ－１２工程に記載の方法に準じて加水分解することにより、製造することができる。
［Ｇ－５工程］
化合物ｇ８は、化合物ｇ６と化合物ｇ７より、上記Ａ－１３工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｇ－６工程］
化合物ｇ９は、化合物ｇ８のエステルを、上記Ａ－１２工程に記載の方法に準じて加水分解することにより製造することができる。
［Ｇ－７工程］
化合物ｇ１０は、化合物ｇ９より、上記Ａ－１５工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｇ－８工程］
化合物ｇ１１は、化合物ｇ１０より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｇ－９工程］
化合物ｇ１２は、化合物ｇ１１より、上記Ａ－１７工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｇ－１０工程］
化合物Ｇ１は、化合物ｇ１２より、上記Ａ－１３工程又はＡ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｈ
Ｚ”が式（Ｚ－８）で表される基であり、Ｇがアミノ酸又はペプチドで表される基である場合、式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000063
 （式中、Ｗ、Ｒ３、ｕ、Ｇ及びｈは、項１８に記載される通りであり、ＲＸ、ＰＸ及びＰＹは、上記と同義である。）
化合物ｈ１は、製造法Ｇの化合物ｇ２を表す。
［Ｈ－１工程］
化合物ｈ２は、化合物ｈ１とグルタミン酸誘導体又はアスパラギン酸誘導体を、適当なスルホニル化試薬及びイミダゾール類存在下、適当な溶媒中で、縮合反応させることにより製造することができる。スルホニル化試薬としては、例えば、メチルスルホニルクロリドやｐ－トルエンスルホニルクロリド等が挙げられ、好ましくはｐ－トルエンスルホニルクロリドが挙げられる。イミダゾール類としては、イミダゾールや１－メチルイミダゾール等が挙げられ、好ましくは１－メチルイミダゾールが挙げられる。溶媒としては、好ましくはアセトニトリルが挙げられる。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは０℃～５０℃である。
［Ｈ－２工程］
化合物ｈ３は、化合物ｈ２より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｈ－３工程］
化合物ｈ４は、化合物ｈ３より、上記Ａ－１３工程又はＡ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｈ－４工程］
化合物ｈ５は、化合物ｈ４より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｈ－５工程］
化合物Ｈ１は、化合物ｈ５より、上記Ａ－１３工程又はＡ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｉ
Ｚ”が式（Ｚ－９）で表される基であり、Ｇがアミノ酸又はペプチドで表される基である場合、式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000064
 （式中、Ｗ、ｆ、Ｇ及びｈは、項１８に記載される通りであり、ＲＸ、ＰＸ及びＰＹは、上記と同義である。）
化合物ｉ１は、製造法Ｇの化合物ｇ２を表す。
［Ｉ－１工程］
化合物ｉ２は、化合物ｉ１より、上記Ｈ－１工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｉ－２工程］
化合物ｉ３は、化合物ｉ２より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｉ－３工程］
化合物ｉ４は、化合物ｉ３より、上記Ａ－１３工程又はＡ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｉ－４工程］
化合物ｉ５は、化合物ｉ４より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｉ－５工程］
化合物Ｉ１は、化合物ｉ５より、上記Ａ－１３工程又はＡ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｊ
Ｚ”が式（Ｚ－５）で表される基であり、Ｙが式（Ｙ－１）で表される基であり、Ｇがアミノ酸又はペプチドで表される基である場合、式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000065
 （式中、Ｗ、Ｇ及びｈは、項１８に記載される通りであり、ＰＸは、上記と同義である。）
化合物ｊ１は、製造法Ｄの化合物Ｄ１又は製造法Ｌの化合物Ｌ５を表す。化合物ｊ２は、製造法Ｇの化合物ｇ３を表す。化合物ｊ５は、例えば、市販品として購入できる。
［Ｊ－１工程］
化合物ｊ３は、化合物ｊ１と化合物ｊ２より、上記Ｇ－３工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｊ－２工程］
化合物ｊ４は、化合物ｊ３より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｊ－３工程］
化合物Ｊ１は、化合物ｊ４と化合物ｊ５より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｋ
Ｚ”が式（Ｚ－６）で表される基であり、Ｙが式（Ｙ－１）で表される基であり、Ｇがアミノ酸又はペプチドで表される基である場合、式（３－２）で表される化合物は、例えば、下記の製法によって製造することができる。
Figure 0007437328000066
 （式中、Ｗ、Ｇ及びｈは、項１８に記載される通りであり、ＰＸは、上記と同義である。）
化合物ｋ１は、製造法Ｄの化合物Ｄ１又は製造法Ｌの化合物Ｌ５を表す。化合物ｋ２は、製造法Ｇの化合物ｇ３を表す。化合物ｋ５は、例えば、市販品として購入できる。
［Ｋ－１工程］
化合物ｋ３は、化合物ｋ１と化合物ｋ２より、上記Ｇ－３工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｋ－２工程］
化合物ｋ４は、化合物ｋ３より、上記Ａ－１８工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｋ－３工程］
化合物Ｋ１は、化合物ｋ４と化合物ｋ５より、上記Ａ－１６工程に記載の方法に準じて製造することができる。
製造法Ｌ
化合物ｌ６は、Ｗが式（Ｗ－２）で表される基であり、Ｚが式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）で表される基であり、Ｚ'が式（Ｚ－３）又は式（Ｚ－４）で表される基であり、Ｚ”が式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）で表される基である場合、式（１－１）、式（１－２）、式（１－３）、式（３－１）又は（３－２）で表される化合物Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５の製造中間体である。化合物ｌ６は、例えば、下記の製法によって製造することができる。また、化合物Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５は、化合物ｌ６より、製造法ＡのＡ－１６工程からＡ－１９工程に記載の製造法に準じて、製造することができる。
Figure 0007437328000067
 （式中、Ｒ２、ｂ及びｈは項１、項２、項３、項１７又は項１８に定義されるとおりであり、ＲａはＣ１－６アルキル基を表す。）
化合物ｌ１は、例えば、市販品として購入できる。化合物ｌ３は、例えば、Tetrahedron Lett., 1997, 38, 317-320等に記載されている方法により製造できるか、又は市販品として購入できる。
［Ｌ－１工程］
化合物ｌ２は、例えば、国際公開第２００３／０８２２６８号等に記載されている方法に準じて製造することができる。
［Ｌ－２工程］
化合物ｌ４は、化合物ｌ２と化合物ｌ３より、上記Ａ－１３工程に記載されている方法に準じて製造することができる。
［Ｌ－３工程］
化合物ｌ５は、化合物ｌ４より、上記Ａ－１４工程に記載されている方法に準じて製造することができる。
［Ｌ－４工程］
化合物ｌ６は、化合物ｌ５より、上記Ａ－１５工程に準じて製造することができる。
式（２－１）又は式（２－２）で表される本発明の抗体薬物複合体は、例えば、下記の製造法Ｍ又は製造法Ｎにより製造することができる。
製造法Ｍ
Figure 0007437328000068
 （式中、ｍＡｂ、ｑ、ｂ及びＺは、項８と同義であり、ｍＡｂ’は、ジスルフィド結合が還元されたｍＡｂを表し、ｑｑは１～２０の整数を表す。）
［Ｍ－１工程］
化合物ｍ２は、化合物ｍ１を、適当なジスルフィド還元剤と、適当な緩衝液中で、反応させることにより製造することができる。ジスルフィド還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン等が挙げられ、好ましくはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンが挙げられる。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸系緩衝液、ホウ酸系緩衝液、リン酸系緩衝液、炭酸系緩衝液が挙げられ、好ましくは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌやＰＢＳが挙げられる。反応時のｐＨは、通常２～１２であり、好ましくは４～９である。反応時間は、通常５分～２４時間であり、好ましくは５分～５時間である。反応温度は、通常－１０℃～５０℃であり、好ましくは０℃～４０℃である。
［Ｍ－２工程］
化合物Ｍ１は、化合物ｍ２と化合物ｍ３を、適当な緩衝液中で、反応させることにより製造することができる。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸系緩衝液、ホウ酸系緩衝液、リン酸系緩衝液、炭酸系緩衝液が挙げられ、好ましくは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌやＰＢＳが挙げられる。反応時のｐＨは、通常２～１２であり、好ましくは４～９である。反応時間は、通常５分～７２時間であり、好ましくは３０分～２４時間である。反応温度は、通常－７８℃～２００℃であり、好ましくは０℃～２５℃である。
製造法Ｎ
Figure 0007437328000069
 （式中、ｍＡｂ、ｑ、ｈ及びＺ”は、項９と同義であり、ｍＡｂ’は、ジスルフィド結合が還元されたｍＡｂを表し、ｑｑは１～２０の整数を表す。）
［Ｎ－１工程］
化合物ｎ２は、化合物ｎ１より、上記Ｍ－１工程に記載の方法に準じて製造することができる。
［Ｎ－２工程］
化合物Ｎ１は、化合物ｎ２と化合物ｎ３より、上記Ｍ－２工程に記載の方法に準じて製造することができる。
上記に本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体の製造法を示している。しかし、これら以外の方法であっても、例えば、当業者に公知の方法を適宜組み合わせることによっても、本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体を製造することができる。
上記の各製造法の各工程において使用される適当な塩基は、反応や原料化合物の種類等によって適宜選択されるべきであるが、例えば、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等の重炭酸アルカリ類；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸アルカリ類；水素化ナトリウム、水素化カリウム等の金属水素化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；ナトリウムメトキシド、ナトリウムｔ－ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類；ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機金属塩基類；トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）等の有機塩基類等が挙げられる。
上記の各製造法の各工程において使用される適当な溶媒は、反応や原料化合物の種類等によって適時選択されるべきであるが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類；アセトン、メチルケトン等のケトン類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等のエーテル類；トルエン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；酢酸エチル、酢酸プロピル等のエステル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－２－ピロリドン等のアミド類；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド類；アセトニトリル等のニトリル類；蒸留水等が挙げられ、これらの溶媒は単独又は２種類以上を混合して用いることができる。また、反応の種類によっては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の有機塩基類を溶媒として用いてもよい。
本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体は、当業者に公知の方法で分離、精製することができる。例えば、抽出、分配、再沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー若しくは分取液体クロマトグラフィー）又は再結晶等が挙げられる。
再結晶溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール等のアルコール系溶媒；ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル等のエステル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；アセトン等のケトン系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒；ヘキサン等の炭化水素系溶媒；ジメチルホルムアミドアセトニトリル等の非プロトン系溶媒；水；又はこれらの混合溶媒等を用いることができる。
その他の精製方法としては、実験化学講座（日本化学会編、丸善）１巻等に記載されている方法等を用いることができる。また、本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体の分子構造の決定は、それぞれの原料化合物に由来する構造を参照して、核磁気共鳴法、赤外吸収法、円二色性スペクトル分析法等の分光学的手法、又は質量分析法により容易に行える。
また、上記製造方法における中間体又は最終生成物は、その官能基を適宜変換すること、また特に、アミノ基、水酸基、カルボニル基、ハロゲン原子等を足がかりに種々の側鎖を伸張すること、及びその際に必要に応じて上記官能基の保護、脱保護を行うことによって、本発明に含まれる別の化合物へ導く事もできる。官能基の変換及び側鎖の伸張は、通常行われる一般的方法（例えば、Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, John Wiley& Sons Inc.(1999)等を参照）によって行うことができる。
本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体には、不斉が生じる場合又は不斉炭素を有する置換基を有する場合があり、そのような化合物にあっては光学異性体が存在する。光学異性体は通常の方法に従って製造することができる。製造方法としては、例えば、不斉点を有する原料を用いる方法又は途中の段階で不斉を導入する方法が挙げられる。例えば、光学異性体の場合、光学活性な原料を用いるか、製造工程の適当な段階で光学分割等を行うことで、光学異性体を得ることができる。光学分割法としては、例えば、本発明のヘミアスタリン誘導体及び抗体薬物複合体が、塩基性官能基を有する場合には、不活性溶媒中（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール等のアルコール系溶媒；ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル等のエステル系溶媒；トルエン等の炭化水素系溶媒；アセトニトリル等の非プロトン系溶媒；又は上記溶媒から選択される２種以上の混合溶媒）で、光学活性な酸（例えば、マンデル酸、Ｎ－ベンジルオキシアラニン、乳酸等のモノカルボン酸；酒石酸、ｏ－ジイソプロピリデン酒石酸、リンゴ酸等のジカルボン酸；カンファースルホン酸、ブロモカンファースルホン酸等のスルホン酸等）を用いて、塩を形成させるジアステレオマー法が挙げられる。本発明のヘミアスタリン誘導体又はその合成中間体が、カルボキシル等の酸性官能基を有する場合には、光学活性なアミン（例えば、１－フェニルエチルアミン、キニン、キニジン、シンコニジン、シンコニン、ストリキニーネ等の有機アミン）を用いて、塩を形成させることにより、光学分割を行うこともできる。
塩を形成させる温度としては、－５０℃から溶媒の沸点までの範囲が挙げられ、好ましくは０℃から沸点までの範囲が挙げられ、より好ましくは室温から溶媒の沸点までの範囲が挙げられる。光学純度を向上させるためには、一旦、溶媒の沸点付近まで温度を上げることが望ましい。析出した塩を濾取する際、必要に応じて冷却し、収率を向上させることができる。光学活性な酸又はアミンの使用量は、基質に対し約０．５～約２．０当量の範囲が挙げられ、好ましくは１当量前後の範囲が挙げられる。必要に応じて、結晶を不活性溶媒中（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール等のアルコール系溶媒；ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル等のエステル系溶媒；トルエン等の炭化水素系溶媒；アセトニトリル等の非プロトン系溶媒；又は上記溶媒から選択される２種以上の混合溶媒）で再結晶し、高純度の光学活性な塩を得ることもできる。また、必要に応じて、光学分割した塩を通常の方法で酸又は塩基で処理し、フリー体として得ることもできる。
上記の各々の製造法における原料又は中間体のうち、特にあらためてその製造法を記載しなかったものについては、市販化合物であるか、又は市販化合物から当業者に公知の方法若しくはそれに準じた方法によって合成することができる。
本発明における多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されない。多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞（Embryonic germ cell）、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）、及び生殖細胞（例えば精巣）から作製される精子幹細胞（GS細胞：Germline stem cell）も多能性幹細胞に包含される。ES細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦ（白血病抑制因子）を含む培地中で培養することによって製造することができる。ES細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ES細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。ヒトES細胞であるＲｘ：：ＧＦＰ株（ＫｈＥＳ－１株由来）は、国立研究開発法人理化学研究所から入手可能である。マウスES細胞であるＥＢ５細胞株及びＤ３細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びＡＴＣＣから、入手可能である。
ES細胞の一つである核移植胚性幹細胞（ntES細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することによって製造することができる（Cell, 70:841-847, 1992）。
本発明における人工多能性幹細胞（iPS細胞）とは、体細胞を公知の方法等により初期化することにより、多能性を誘導した細胞である（Cell 126, p663-676, 2006、Cell 131, p861-872, 2007、Science 318, p1917-1920, 2007、Nat Biotechnol 26, p101-106, 2008）。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等の分化した体細胞をOct3/4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、N-Myc、L-Myc、TERT、SV40 Large T antigen、Glis1、Nanog、Sall4、lin28及びEsrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかにより初期化された細胞が挙げられる。初期化因子は少なくとも１つ、２つ又は３つ含む組合せがよく、好ましくは４つ以上含む組合せである。好ましい初期化因子の組合せとしては、（１）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（２）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28、及びL-Mycを挙げることができる。
これらの初期化因子は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過ペプチドとの融合、マイクロインジェクション等の方法で細胞に導入することも可能であるし、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の形態で、例えばリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ウイルス、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター等の方法で細胞に導入することも可能である。ウイルスベクターとしてはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が例示される。プラスミドベクターとしては、一般的に利用可能な哺乳動物細胞用プラスミドを用いることができ、初期化因子の発現効率を高めるためにプロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター等の制御配列が一般的に組み込まれ、プラスミド自己複製効率を上げるためにEBNA-1等の因子が組み込まれることもある。また、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞からiPS細胞を誘導することもできる（Science 341, p651-654, 2013、WO2010/068955）。
また、株化されたiPS細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）で樹立されたiPS細胞株が、京都大学及びiPSポータル株式会社より入手可能である。
iPS細胞を製造する際の出発材料となる体細胞としては、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、ホルモン分泌細胞、肺胞細胞、神経細胞、色素細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球(PBMC)やT細胞、臍帯血細胞など）、間葉系幹細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、及びこれらの前駆細胞等が挙げられる。組織の分化の程度や採取する動物の齢に制限はなく、全て本発明における体細胞の材料として使用することができる。
本発明に用いられるiPS細胞は、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウス）のiPS細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）のiPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。また、本発明に用いられるiPS細胞は、ゲノム編集などの手法により遺伝子改変されたiPS細胞も含む。
ES細胞は、iPS細胞と同じく多能性を有する幹細胞の一種であり、iPS細胞と同じ抗原を細胞表面に発現していることが知られている（Cell, 131:861-872, 2007）。よって本発明の抗体薬物複合体は、iPS細胞だけでなく、ES細胞に対し細胞死を誘導することができる。すなわち、本発明の抗体薬物複合体は、ES細胞由来の分化細胞を含む細胞集団から、ES細胞を選択的に除去することが可能である。また、多能性幹細胞においても、iPS細胞と共通の抗原を細胞表面に発現していることから、本発明の抗体薬物複合体は、多能性幹細胞に対し細胞死を誘導することができ、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞集団から、多能性幹細胞を選択的に除去することができる。
本明細書において、「多能性幹細胞の除去剤」とは、多能性幹細胞の細胞死を誘導し多能性幹細胞を除去する薬剤を意味する。多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞集団に対し、多能性幹細胞の除去剤を作用させることで多能性幹細胞の細胞死を誘導し、細胞集団から完全に又は部分的に多能性幹細胞を取り除くことができる。
本明細書において、「多能性幹細胞の殺傷剤」とは、多能性幹細胞の細胞死を誘導し多能性幹細胞を殺傷する薬剤を意味する。また、本明細書において、「多能性幹細胞の減少剤」とは、多能性幹細胞の細胞死を誘導し多能性幹細胞の数又は細胞集団におけるその割合を減少する薬剤を意味する。
抗体薬物複合体は、抗体－抗原反応を利用した細胞内への取り込みにより、特定の抗原発現細胞内に特異的に送達された後、上述の機構で細胞内において酵素による代謝を受け、薬物部分由来の化合物を抗体薬物複合体から放出することで特定の抗原発現細胞のみで薬効を発揮させることができる。すなわち、本発明の抗体薬物複合体は、多能性幹細胞の細胞表面に発現する抗原に対する抗体部分が多能性幹細胞を認識し、多能性幹細胞特異的に取り込まれ得るため、多能性幹細胞に対しては細胞内で薬物部分由来の化合物を放出し細胞傷害性を発揮する一方、前記抗原を細胞表面に発現しない分化細胞に対しては低い細胞傷害性を示すと期待できる。
一方、抗体薬物複合体は、目的とする細胞に送達される前に、培地中に含まれるプロテアーゼ等によって分解され、培地中で薬物部分由来の化合物を放出し、非選択的に細胞に傷害を与えてしまうことが懸念される。従来の抗体薬物複合体の場合は、薬物部分の細胞膜透過性が高いため、培地中に放出された薬物部分由来の化合物は、分化細胞にも受動拡散して取り込まれてしまう。そのため、意図していない暴露となり、分化細胞への傷害が起こりやすいことから、好ましくない。
これに対し、本発明の抗体薬物複合体の薬物部分、すなわちヘミアスタリン誘導体は細胞膜透過性が低いため、仮にiPS細胞等の多能性幹細胞に到達する前に培地中で薬物部分由来の化合物が放出されても、薬物は分化細胞に受動拡散して取り込まれにくく、分化細胞への傷害が少ないことが期待できる。
さらに、抗体と結合させる薬物部分として低膜透過性の化合物を用いた場合、目的とする多能性幹細胞内で放出された薬物部分由来の化合物が細胞膜を介して細胞の外に流出することが抑えられるため、薬物部分由来の化合物は目的細胞内に長期間滞在でき、良好な細胞除去効果が発揮されることが期待される。
すなわち、本発明の抗体薬物複合体は細胞膜透過性の低いヘミアスタリン誘導体を薬物部分として有するため、多能性幹細胞特異的に細胞傷害性を示し、かつ、分化細胞への影響が少ないことが期待される。
本発明の抗体薬物複合体は、ES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞に取り込まれ、細胞内で放出された薬物が細胞傷害性を示し、多能性幹細胞の増殖抑制及び細胞死を誘導することから、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞集団から残存する多能性幹細胞を効率的に除去することができる。さらに、本発明の抗体薬物複合体は、iPS細胞選択的に細胞死を誘導することから、分化細胞への傷害性を抑えながらiPS細胞の除去を効率的に行うことができる。
本発明における細胞塊としては、単層の細胞を２層以上積み重ねる、あるいは単層細胞の上に新たに細胞層を形成させて作製する細胞積層体、細胞を凝集させて作製する細胞凝集体、３Ｄバイオプリンターなどのデバイスを用いて細胞を立体的に積層させた細胞集合体、三次元的な培養で自己組織化により形成させたオルガノイド等が挙げられる。これらの細胞塊においては、細胞同士が互いに接着することで培養足場を提供し、構造を保持しているが、細胞塊中にハイドロゲルなどの足場器材が含有された状態であってもよい。ハイドロゲルとは水を大量に含むことができる物質であり、酸素や水・栄養素などの生存に必要な物質と老廃物を容易に拡散移動させることができる。通常は生体適合性の物質が用いられ、例えばゼラチンハイドロゲルなどが挙げられる。
本発明の適用対象となるiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団は、再生医療等製品を含む細胞医薬品の有効成分又はその製造中間体となる、iPS細胞を分化誘導してできる細胞集団であり、例えば、コロニーを含む平面培養細胞、単細胞での浮遊培養細胞及び上記で定義した細胞塊などが挙げられる。
iPS細胞から分化誘導する細胞としては、髪、眼（網膜、角膜）、神経組織（脳、脊髄、末梢神経）、心臓、骨（軟骨）、肺、腎臓、膵臓、腸管、血管、血液、筋肉、半月板、アキレス腱、肝臓、脂肪（乳房）、皮膚、食道などの組織を構成する細胞、又は当該細胞の幹細胞／前駆細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
iPS細胞を含む細胞集団を分化細胞へ分化誘導する工程において、iPS細胞から各組織への分化誘導方法については、分化誘導が可能な方法であれば何でもよく、特に限定されない。iPS細胞から各組織への分化誘導方法としては、例えば、iPS細胞を無血清培地中でＢＭＰ阻害剤及びアクチビン／ＴＧＦβファミリー阻害剤の存在下で培養することにより神経前駆細胞を分化誘導する方法などが挙げられる。
本明細書において、「実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団」とは、生体内において奇形種形成を起こす量のiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団を意味する。iPS細胞が残存しているかどうかは、当業者に周知の方法で検出することができ、全細胞数に占めるiPS細胞の割合を定量することもできる。iPS細胞の定量方法としては、特に限定されないが、細胞の表面又は内部に発現しているマーカー分子の発現量を測定する方法が挙げられる。細胞表面に発現しているマーカー分子としては、例えば、TRA1-60及びSSEA4等が挙げられ、細胞内部（核内）に発現しているマーカー分子としては、例えば、NANOG、OCT4及びLIN28A等が挙げられる。これらのマーカー分子の測定方法としては、例えば、細胞表面の発現マーカーであればフローサイトメトリー等、細胞核内の発現マーカーであれば免疫染色及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）等が挙げられる。実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団の１態様としては、全体の細胞数に対してのiPS細胞数の割合が１％未満であるiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団が挙げられ、別の１態様としては、全体の細胞数に対してのiPS細胞数の割合が０．１％未満であるiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団が挙げられ、また別の１態様としては、全体の細胞数に対してのiPS細胞数の割合が０．０１％未満であるiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団が挙げられる。
iPS細胞を分化誘導してできる細胞集団において、多能性を維持する未分化の細胞又は分化抵抗性を示す細胞、具体的には残存するiPS細胞又はiPS様細胞を除去するために、当該細胞集団に対し本発明の抗体薬物複合体を作用させることができる。iPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団を本発明の抗体薬物複合体と接触させる工程において、当該細胞集団を抗体薬物複合体と接触させる方法としては、細胞もしくは細胞集団に本発明の抗体薬物複合体を直接接触させればよい。具体的には、抗体薬物複合体を含有する液体（溶液もしくは懸濁液）、又は抗体薬物複合体そのものを細胞もしくは細胞集団の培養液に加えればよく、一般的には抗体薬物複合体の濃縮液を培養液に添加する方法が用いられる。抗体薬物複合体の濃縮液として用いられる溶媒としては、抗体薬物複合体を溶解できるものなら何でもよいが、抗体薬物複合体の物性にかかわらず溶解性が比較的高く、かつ細胞への毒性が低いリン酸緩衝生理食塩水がよく用いられる。濃縮液における抗体薬物複合体の濃度は、例えば、０．０１μｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましい様態において、０．１μｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬの範囲である。また、細胞もしくは細胞集団を含む培養液において、培養液を本発明の抗体薬物複合体を必要量含む培養液に交換することにより、細胞もしくは細胞集団に本発明の抗体薬物複合体を接触させることもできる。
本発明の抗体薬物複合体と細胞集団を接触させる時間は、分化細胞が生存可能であれば特に限定はないが、通常１時間から９６時間の範囲であり、好ましくは２４時間から９６時間の範囲である。
本発明の抗体薬物複合体と細胞集団を接触させる温度は、細胞が生存可能な温度であれば特に限定はないが、通常４℃から４０℃までの範囲であり、好ましくは２０℃から３７℃の範囲である。
本発明の抗体薬物複合体と細胞集団を接触させる時に使用する培地は、細胞培養に用いられる一般的な培地、又は緩衝液から調製される基礎培地を用いることができ、好ましくは、細胞の分化誘導に用いる培地が用いられる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer‘s培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
本明細書において、「移植用細胞」とは、再生医療等においてヒト又はヒト以外の動物の生体内に投与するために用いる細胞を意味する。移植用細胞は、組織又は器官の機能を修復するものであってもよいし、疾病又は損傷を予防又は治療するものであってもよい。移植用細胞の投与方法としては、特に限定されないが、例えば手術的に患部に移植する方法が挙げられる。
本発明の、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来細胞集団に含まれる細胞を有効成分として含有する医薬組成物は、例えば、再生医療等（好ましくは移植）においてヒト又はヒト以外の動物に投与して使用することができる。当該医薬組成物は、適宜、担体及び／又は添加剤を含有する。
以下に本発明を、参考例、実施例及び試験例により、さらに具体的に説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。なお、以下の参考例及び実施例において示された化合物名は、必ずしもＩＵＰＡＣ命名法に従うものではない。
参考例及び実施例の化合物は、反応後の処理等の方法により、ＴＦＡ塩等の酸付加塩として得られることもある。
明細書の記載を簡略化するために参考例、実施例及び実施例中の表において以下に示すような略号を用いることもある。置換基として用いられる略号として、Ｍｅはメチル基、Ｅｔはエチル基、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔｒｔはトリチル基、Ｐｈはフェニル基を意味する。ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＨＦはテトラヒドロフラン、ＴＣＥＰはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌはトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳは２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、ＰＩＰＥＳはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）を意味する。ＮＭＲに用いられる記号としては、ｓは一重線、ｄは二重線、ｄｄは二重線の二重線、ｔは三重線、ｑは四重線、ｍは多重線、ｂｒは幅広い、ｂｒｓは幅広い一重線、ｂｒｄは幅広い二重線、ｂｒｍは幅広い多重線、Ｊは結合定数を意味する。
高速液体クロマト質量分析計；ＬＣＭＳの測定条件は、以下の通りであり、観察された質量分析の値［ＭＳ（ｍ／ｚ）］を［Ｍ＋ｎＨ］ｎ＋／ｎ、［Ｍ＋Ｎａ］＋、［Ｍ－ｎＨ］ｎ－／ｎで、保持時間をＲｔ（ｍｉｎ）で示す。なお、各実測値においては、測定に用いた測定条件をＡ～Ｄ又はＦ～Ｈで付記する。
測定条件Ａ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ１８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１：９９
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １％ ｔｏ ９５％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９５：５
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝１：９９
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
測定条件Ｂ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ１８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １０％ ｔｏ ９０％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９０：１０
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
測定条件Ｃ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１ ％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１：９９
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １％ ｔｏ ９５％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９５：５
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝１：９９
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
測定条件Ｄ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １０％ ｔｏ ９０％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９０：１０
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
測定条件Ｅ
検出機器： Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １５０ＥＸ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ １０ＡＴＶＰ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＣＲ （Ｓ－５μｍ，４．６ｍｍ×５０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．０３５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：０．０－０．５分 Ａ液１０％，０．５－４．８分 Ａ液 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １０％ ｔｏ ９９％，４．８－５．０分
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：３．５ｍＬ／分 Ａ液 ９９％
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：２５℃
測定条件Ｆ
検出機器：ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＳＱｄｅｔｅｃｔｅｒ（ウォーターズ社）
ＨＰＬＣ：ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μｍ，２．１ｍｍ×３０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．０６％ギ酸／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．０６％ギ酸／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：０．０－１．３ｍｉｎ Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ ２％ ｔｏ ９６％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．８ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：２５℃
測定条件Ｇ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ １０％ ｔｏ ９５％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９５：５
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝１０：９０
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
測定条件Ｈ
検出機器：島津 ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（１．７μｍ Ｃ８，５０ｍｍ×２．１０ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、Ｂ液：０．１％ ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝４０：６０
０．０－１．４分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａ ４０％ ｔｏ ９５％
１．４－１．６分；Ａ／Ｂ＝９５：５
１．６－２．０分；Ａ／Ｂ＝５：９５
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．２ｍＬ／分
ＵＶ：２２０／２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
高速液体クロマトグラフ；平均薬物抗体比（平均ＤＡＲ）を求める測定条件は、以下の通りであり、保持時間をＲｔ（ｍｉｎ）で示す。なお、各実測値においては、測定に用いた測定条件をＥ又はＩで付記する。
測定条件Ｉ
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－１０Ａ ｓｅｒｉｅｓ
Ｃｏｌｕｍｎ：ｎｏｎｐｏｒｏｕｓ ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲ ｃｏｌｕｍｎ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２．５μｍ，３５ｍｍ×４．６ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム，２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９５）、Ｂ液：２５％イソプロパノール／２５ ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９５）
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１００：０
０．０－１２．０分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｂ ０％ ｔｏ １００％
１２．１－１８．０分；Ａ／Ｂ＝１００：０
Ｆｌｏｗｒａｔｅ：０．８ｍＬ／分
ＵＶ：２３０ｎｍ
カラム温度：２５℃
測定条件Ｊ
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－１０Ａ ｓｅｒｉｅｓ
Ｃｏｌｕｍｎ：ｎｏｎｐｏｒｏｕｓ ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲ ｃｏｌｕｍｎ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２．５μｍ，３５ｍｍ×４．６ｍｍ）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａ液：１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム，２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９５）、Ｂ液：２５％イソプロパノール／２５ ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９５）
Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
０．０分；Ａ／Ｂ＝１００：０
０．０－２４．０分 Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｂ ０％ ｔｏ １００％
２４．１－６０．０分；Ａ／Ｂ＝１００：０
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．８ ｍＬ／分
ＵＶ：２３０ｎｍ
カラム温度：２５℃
参考例１
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－｛（３Ｓ，４Ｅ）－６－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル｝－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000070
ａ）メチル ２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパノエート（化合物Ａ１）の製造
窒素雰囲気下、－７８℃のインドール－３－酢酸メチルエステル（３．８ｇ）のテトラヒドロフラン（８７ｍＬ）溶液にカリウムヘキサメチルジシラジド（１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液、６５．５ｍＬ）を滴下した後、０℃で２時間撹拌した。反応液を－７８℃に冷却後、ヨウ化メチル（２３ｇ）を滴下した後、０℃で３時間撹拌した。反応終了後、水を加え、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ１（３．９５ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.60 (3H, d, J =7.1 Hz),3.67 (3H, s), 3.76 (3H, s), 4.02 (1H, q, J = 7.1 Hz), 7.00 (1H, s),7.12 (1H, t,J = 7.8 Hz), 7.23 (1H, t,J = 7.8 Hz), 7.29 (1H, d,J = 7.8 Hz),7.66(1H, d, J= 7.8Hz).
ｂ）メチル ２－メチル－２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパノエート（化合物Ａ２）の製造
窒素雰囲気下、－７８℃の化合物Ａ１（３．９４ｇ）のテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）溶液にカリウムヘキサメチルジシラジド（１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液、２７．７ｍＬ）を滴下した後、０℃で２時間撹拌した。反応液を－７８℃に冷却後、ヨウ化メチル（１５．４ｇ）を滴下した後、０℃で３時間撹拌した。反応終了後、水を加え、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ２（３．５９ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.66 (6H,s), 3.61 (3H,s), 3.73 (3H,s), 6.91 (1H,s), 7.06 (1H, t,J = 8.0 Hz), 7.19 (1H, t,J = 8.0 Hz), 7.27 (1H,d,J = 8.0 Hz), 7.61 (1H, d,J =7.9 Hz).
ｃ）２－メチル－２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－１－オール（化合物Ａ３）の製造
窒素雰囲気下、－７８℃の化合物Ａ２（３．５９ｇ）のジエチルエーテル（１６９ｍＬ）及びジクロロメタン（４７ｍＬ）溶液に水素化ジイソブチルアルミニウム（１ｍｏｌ／Ｌ ｎ－ヘキサン溶液、３８．８ｍＬ）を滴下した後、０℃で１時間撹拌した。反応終了後、水を加えた後、２５℃の反応混合物を、飽和酒石酸カリウムナトリウム水溶液を加えた後、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ３（３．１４ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.42 (6H,s), 3.74 (3H,s), 3.77 (2H,s), 6.87 (1H,s), 7.07 (1H,t, J = 7.9 Hz), 7.20 (1H,t, J = 7.9 Hz), 7.29(1H,d, J = 8.0 Hz), 7.75 (1H,d,J = 8.0 Hz).
ｄ）２－メチル－２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパナール（化合物Ａ４）の製造
窒素雰囲気下、化合物Ａ３（３．１４ｇ）、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（２７１ｍｇ）、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（３．２６ｇ）及びモレキュラーシーブ４Ａ（７．７ｇ）のジクロロメタン（１１０ｍＬ）混合溶液を、２５℃で１時間撹拌した。反応終了後、セライトにて濾過後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ４（２．４ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.53 (6H,s), 3.77 (3H,s), 6.94 (1H,s), 7.07 (1H,t, J = 8.0 Hz), 7.22 (1H,t, J = 8.0 Hz), 7.30 (1H,d, J = 8.0 Hz), 7.53(1H,d, J = 8.0 Hz), 9.47 (1H,s).
ｅ）（２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］アミノ｝－３－メチル－３－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）ブタンニトリル（化合物Ａ５）の製造
窒素雰囲気下、化合物Ａ４（２．４ｇ）及び（Ｒ）－（－）－２－フェニルグリシノール（１．６３ｇ）のトルエン（４７ｍＬ）溶液を１．５時間加熱還流し、ディーン・スターク装置で水を留去した後、溶媒を留去した。窒素雰囲気下、残渣に０℃のジクロロメタン（６９ｍＬ）を加えた後、トリメチルシリルシアニド（２．３６ｇ）を加え、２５℃で９６時間撹拌した。反応溶液にフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液、１ｍＬ）を加え、さらに３０分間撹拌した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ５（２．７４ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.64 (3H,s), 1.65 (3H,s), 3.49-3.55 (1H,m), 3.73 (1H,dd, J = 10.9, 4.2 Hz), 3.79 (1H,s), 3.80 (3H,s), 4.05 (1H,dd, J = 7.9, 3.6 Hz), 6.96-7.00 (2H,m), 7.11(2H,d, J = 8.0 Hz), 7.21-7.40 (6H,m).
ｆ）Ｎα－［（１Ｒ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－β，β，１－トリメチル－Ｌ－トリプトファンアミド（化合物Ａ６）の製造
化合物Ａ５（２．７４ｇ）、ジメチルスルホキシド（６．１６ｇ）及び炭酸カリウム（１０．９ｇ）のメタノール（５０ｍＬ）及び水（２．１ｍＬ）懸濁液に３０％過酸化水素水（８．９４ｍＬ）を０℃で加えた後、４５℃で１．５時間撹拌した。反応終了後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ａ６（２．３２ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.49 (3H,s),1.51 (3H, s), 2.06-2.14 (1H, br), 2.37 (1H,dd, J = 6.0, 6.0 Hz), 3.44-3.50 (1H, m),3.50-3.54 (1H, m), 3.56-3.63(m, 2H), 3.75 (3H, s), 5.52 (1H, brs), 6.14 (1H, brs), 6.71-6.73 (2H, m), 6.81-6.85(2H, m), 6.97-7.00 (2H, m), 7.10-7.18 (2H, m), 7.24-7.28 (2H, m).
ｇ）β，β，１－トリメチル－Ｌ－トリプトファンアミド（化合物Ａ７）の製造
化合物Ａ６（２．３２ｇ）のメタノール（６５ｍＬ）溶液に水酸化パラジウム／炭素（２．８ｇ）を加え、水素雰囲気下、室温にて３時間攪拌した。セライトにて濾過後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ａ７（１．２７ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6):1.24 (2H, brs), 1.28 (3H, s), 1.42(3H, s), 3.68 (1H, s), 3.71 (3H, s), 6.93-7.00 (2H, m), 7.06 (1H, s), 7.11 (1H,t, J = 7.7 Hz), 7.29 (1H, brs), 7.36 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.88 (1H, d, J = 8.2Hz).
ｈ）Ｎα－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β，β，１－トリメチル－Ｌ－トリプトファンアミド（化合物Ａ８）の製造
化合物Ａ７（１．２７ｇ）、炭酸水素ナトリウム（５２２ｍｇ）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（１．３５ｇ）、テトラヒドロフラン（１３ｍＬ）、クロロホルム（１３ｍＬ）及び水（６．５ｍＬ）の混合液を２５℃にて１６時間攪拌した。反応終了後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ａ８（１．８０ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.33 (3H, s), 1.47 (9H, s),1.50 (3H, s), 3.73 (3H, d, J = 1.3 Hz), 4.51 (1H, brs), 4.86 (1H, brs), 5.02(1H, brd, J = 8.2 Hz), 5.59 (1H, brd, J = 6.4 Hz), 6.83 (1H, d, J = 1.8 Hz),7.15 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.21-7.25 (1H, m), 7.30 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.05(1H, brd, J = 7.3 Hz).
LC-MS:346 (M+H)+ (1.211 min, 測定条件A).
ｉ）Ｎ，Ｎ，Ｎα－トリス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β，β，１－トリメチル－Ｌ－トリプトファンアミド（化合物Ａ９）の製造
化合物Ａ８（１．７９ｇ）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（２．８ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．６８ｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（０．１９ｇ）及びクロロホルム（２０ｍＬ）の混合液を２５℃にて２．５時間撹拌した。反応終了後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ９（１．９９ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.08-1.58 (33H, m), 3.70(3H, s), 4.67-4.90 (0.2H, m), 5.25-5.45 (0.8H, m), 6.00-6.03 (1H, m), 6.81-6.87(1H, m), 7.04-7.09 (1H, m), 7.13-7.18 (1H. m), 7,21-7,27 (1H, m), 7.91-7.94(1H, m).
LC-MS:546 (M+H)+ (1.630 min, 測定条件A)
ｊ）メチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β，β，１－トリメチル－Ｌ－トリプトファンエート（化合物Ａ１０）の製造
窒素雰囲気下、化合物Ａ９（２．２９ｇ）のメタノール溶液（２１ｍＬ）に、リチウムメトキシド（１７６ｍｇ）を０℃で加えた後、２５℃にて２時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ１０（９２７ｍｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): 1.17-1.59 (15H, m), 3.45 and 3.58 (3H, 2brs), 3.71(3H, s), 4.56-4.73 (1.2H, m), 5.06 (0.8H, brd, J = 7.3 Hz), 6.81-6.82 (1H, m),7.05-7.10 (1H, m), 7.16-7.21 (1H, m), 7.24-7.29 (1H, m), 7.73-7.80 (1H, m).
LC-MS: 361 (M+H)+ (1.379 min, 測定条件A).
ｋ）メチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトファナート（化合物Ａ１１）の製造
窒素雰囲気下、化合物Ａ１０（９２７ｍｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１３ｍＬ）に、６０％含有水素化ナトリウム（１６８ｍｇ）を０℃で加えた後、２５℃にて１５分撹拌した。反応懸濁液を０℃にした後、ヨウ化メチル（１．１ｇ）を加え、その後、２５℃にて１時間撹拌した。反応終了後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ１１（９１５ｍｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.42 (9H, s), 1.52 and 1.64 (6H, 2s), 2.80 and 2.86(3H, 2s), 3.46 (3H, s), 3.71 (3H, s), 5.27 and 5.52 (1H, 2s), 6.85 (1H, s),7.07-7.27(3H, m), 7.78 and 7.92 (1H, 2d, J = 7.88 Hz).
LC-MS: 397 (M+Na)+ (1.406 min, 測定条件B)
ｌ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトファン（化合物Ａ１２）の製造
化合物Ａ１１（６３９ｍｇ）の水（１１ｍＬ）－メタノール（４４ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化リチウム（１３．５ｍＬ）を加え、６０℃にて２４時間撹拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌシュウ酸水溶液を加え、反応溶液をｐＨ４にした後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ａ１２（６１０ｍｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.43 (9H, s), 1.53 (3H, s), 1.63 (3H, s), 2.76 and2.89 (3H, 2s), 3.71 (3H, s), 5.36 and 5.44 (1H, 2s), 6.85 and 6.87 (1H, 2s),7.02-7.11 (1H, m), 7.18 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.24-7.27 (1H, m), 7.81 and 7.96 (1H,2d, J = 7.9 Hz).
LC-MS: 361 (M+H)+, 359 (M-H)-(1.300 min, 測定条件A).
ｍ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－エトキシ－２，５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（化合物Ａ１３）の製造
化合物Ａ１２（５００ｍｇ）、エチル（２Ｅ，４Ｓ）－２，５－ジメチル－４－［メチル（３－メチル－Ｌ－バリル）アミノ］ヘキサ－２－エノエート（５２０ｍｇ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３９９ｍｇ）、１－ヒドロキシ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール・１水和物（４２５ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）の混合液を、２５℃にて１６時間撹拌した。反応終了後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で精製することにより化合物Ａ１３（７５９ｍｇ）を得た。
LC-MS: 655 (M+H)+ (1.714 min, 測定条件A)
ｎ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－５－カルボキシ－２－メチルヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（化合物Ａ１４）の製造
化合物Ａ１３（１２７ｍｇ）の水（１．５５ｍＬ）－メタノール（４．６５ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化リチウム（１．６５ｍＬ）を加え、２５℃にて２４時間撹拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌシュウ酸水溶液を加え、反応溶液をｐＨ４にした後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ａ１４（９３ｍｇ）を得た。
LC-MS: 627 (M+H)+ (1.508 min, 測定条件A)
ｏ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－｛（３Ｓ，４Ｅ）－６－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル｝－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（参考例１）の製造
化合物Ａ１４（１８５ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（９７ｍｇ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（３９１ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（１０２ｍｇ）、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１０８ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２．８ｍＬ）の混合液を、２５℃にて４時間撹拌した。反応終了後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより参考例１（１６６ｍｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): 8.27 and 7.96 (1H, 2d, J = 7.9 Hz), 7.16-7.04 (4H,m), 6.88 (1H, d, J = 9.1 Hz), 6.17 and 6.09 (1H, 2d, J = 8.5 Hz), 5.96 and 5.66(1H, 2s), 5.07 (1H, t, J = 9.3 Hz), 4.45 and 3.87 (1H, 2d, J = 8.6 Hz), 3.74and 3.73 (3H, 2s), 2.99 (3H, s), 2.95 (3H, s), 2.83 (4H, brs), 1.97 (3H, s),1.92-1.86 (1H, m), 1.57-1.42 (14H, m), 0.89 (3H, d, J = 6.1 Hz), 0.83-0.80 (3H,m), 0.48 and 0.41 (9H, 2s).
LC-MS: 724 (M+H)+ (1.573 min, 測定条件A)
参考例２
ｔｅｒｔ－ブチル（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｅ，１７Ｒ）－９－ｔｅｒｔ－ブチル－１７－（３－｛［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロ－ル－１－イル）エチル］アミノ｝－３－オキソプロピル）－２，２，５，１１，１４－ペンタメチル－６－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－４，７，１０，１５－テトラオキソ－１２－（プロパン－２－イル）－３－オキサ－５，８，１１，１６－テトラアザオクタデカ－１３－エン－１８－カルボン酸エステル
Figure 0007437328000071
ａ）（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｅ，１７Ｒ）－１７－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－９－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２，５，１１，１４－ペンタメチル－６－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－４、７，１０，１５－テトラオキソ－１２－（プロパン－２－イル）－３－オキサ－５，８，１１，１６－テトラアザイコサ－１３－エン－２０－カルボン酸（化合物Ｂ１）の製造
参考例１（３０ｍｇ）、Ｄ－グルタミン酸 α－ｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩（１０．７ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４９．７ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）の混合液を、２５℃にて３時間撹拌した。反応終了後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ｂ１（１４．２ｍｇ）を得た。
LC-MS 834 (M+Na)+ (1.574 min, 測定条件D)
ｂ）ｔｅｒｔ－ブチル（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｅ，１７Ｒ）－９－ｔｅｒｔ－ブチル－１７－（３－｛［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロ－ル－１－イル）エチル］アミノ｝－３－オキソプロピル）－２，２，５，１１，１４－ペンタメチル－６－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－４，７，１０，１５－テトラオキソ－１２－（プロパン－２－イル）－３－オキサ－５，８，１１，１６－テトラアザオクタデカ－１３－エン－１８－カルボン酸エステル（参考例２）の製造
化合物Ｂ１（１４ｍｇ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（３．０ｍｇ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６．６ｍｇ）、１－ヒドロキシ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール・１水和物（５．２ｍｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．４ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）の混合液を、２５℃にて２時間撹拌した。反応終了後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより参考例２（１６．６ｍｇ）を得た。
LC-MS: 934 (M+H)+ (1.597 min, 測定条件D)
参考例３
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－｛［（１Ｒ）－１，３－ジカルボキシプロピル］アミノ｝－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000072
ａ）（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｅ，１７Ｒ）－９－ｔｅｒｔ－ブチル‐１７－（エトキシカルボニル）－２，２，５，１１，１４－ペンタメチル－６－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－４，７，１０，１５－テトラオキソ－１２－（プロパン－２－イル）－３－オキサ－５，８，１１，１６－テトラアザイコサ－１３－エン－２０－カルボン酸（化合物Ｃ１）の製造
参考例１（１６０ｍｇ）、α－エチル Ｄ－グルタミン酸エステル・トリフルオロ酢酸塩（１２２ｍｇ）、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１００ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２．２ｍＬ）の混合液を、２５℃にて６時間撹拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌシュウ酸水溶液でｐＨ４にし、クロロホルムで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ｃ１（１５５ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):8.26 and 7.97 (1H, 2d, J = 7.9 Hz), 7.32-7.05 (4H, m), 6.71 (1H, t, J = 6.7 Hz),6.45 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.31-6.26 (1H, m), 5.95 and 5.63 (1H, 2s), 4.94-4.82(1H, m), 4.64-4.59 (1H, m), 4.51 and 4.41 (1H, 2d, J = 9.1 Hz), 4.21 (2H, q, J= 7.3 Hz), 3.75 and 3.74 (3H, 2s), 3.00 (3H, s), 2.97 and 2.95 (3H, 2s),2.52-2.38 (2H, m), 2.29-2.20 (1H, m), 2.10-2.00 (1H, m), 1.98-1.90 (1H, m),1.90 (3H, s), 1.57-1.45 (14H, m), 1.28 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.88 (3H, d, J =6.1 Hz), 0.82 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.53 and 0.46 (9H, 2s).
LC-MS 784 (M+H)+ 782 (M-H)- (1.472 min, 測定条件Ａ)
ｂ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－｛［（１Ｒ）－１，３－ジカルボキシプロピル］アミノ｝－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（参考例３）の製造
化合物Ｃ１（１０３ｍｇ）の水（０．８ｍＬ）－メタノール（３．３ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化リチウム（１ｍＬ）を加え、２５℃にて１６時間撹拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌシュウ酸水溶液を加え、反応溶液をｐＨ４にした後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより参考例３（１００ｍｇ）を得た。
LC-MS 756 (M+H)+ 754 (M-H)- (1.388 min, 測定条件Ａ)
参考例４
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－｛（３Ｓ，４Ｅ）－６－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル｝－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000073
ａ）３－メチル－３－フェニルブタン酸（化合物Ｄ１）の製造
３－メチル－２－ブテン酸（１５ｇ）のベンゼン（１００ｍＬ）溶液に、１０℃にて塩化アルミニウム（２４．１ｇ）を加え、３０分撹拌した後、４０℃で１時間撹拌した。０℃に冷却後、氷水を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出し、ある程度濃縮し、有機層を飽和炭酸水素化ナトリウム水溶液で抽出した。水層を濃塩酸でｐＨ２にし、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、化合物Ｄ１（２６．３ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.46 (6H, s), 2.65 (2H, s),7.20 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.31 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.37 (2H, d, J = 7.2 Hz).
ｂ）（４Ｓ）－３－（３－メチル－３－フェニルブタノイル）－４－（プロパン－２－イル）－１，３－オキサゾリジン－２－オン（化合物Ｄ２）の製造
化合物Ｄ１（１７．２ｇ）のＴＨＦ溶液（９００ｍＬ）に、－７８℃でトリエチルアミン（２３．７ｍＬ）及びピバロイルクロリド（１５．３ｍＬ）を加えた。０℃に昇温して１時間撹拌した。別途、（Ｓ）－イソプロピルオキサゾリジノン（１９．５ｇ）のＴＨＦ溶液（７６０ｍＬ）に、－７８℃でｎ－ブチルリチウム（１．６４ｍｏｌ／Ｌヘキサン溶液８９．８ｍＬ）を加え、３０分撹拌し、リチウム塩を調製した。先の反応液を－７８℃にし、リチウム塩を滴下し、１時間撹拌した後、０℃に昇温し、さらに３０分撹拌した後、水を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル）で精製し、化合物Ｄ２（２７．０ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):0.723 (3H, d, J = 6.8 Hz),0.80 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.49 (s, 6H), 2.13-2.18 (m, 1H), 3.36 (s, 3H),3.99-4.09 (m, 2H), 4.20-4.23 (m, 1H), 7.16-7.20 (m, 1H), 7.28-7.32 (m, 2H),7.38-7.40 (m, 2H).
ｃ）（４Ｓ）－３－［（２Ｓ）－２－アジド－３－メチル－３－フェニルブタノイル］－４－（プロパン－２－イル）－１，３－オキサゾリジン－２－オン（化合物Ｄ３）の製造
化合物Ｄ２（２７．０ｇ）のＴＨＦ懸濁液（５６０ｍＬ）に、－７８℃に冷却し、カリウムヘキサメチルジシラジド（１．０６ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液、９９．５ｍＬ）を加え、１．５時間した。－７８℃の２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルアザイド（４０ｇ）のＴＨＦ溶液（３３０ｍＬ）を加え、１０分後、酢酸（２４．５ｍＬ）を加え、４０℃に昇温し、１時間撹拌した。飽和食塩水を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：クロロホルム）にて精製し、化合物Ｄ３（１６．４ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):0.80 (3H, d, J = 6.8 Hz),0.84 (3H, d, J = 7.2 Hz), 1.54 (3H, s), 1.56 (3H, s), 2.28-2.33 (1H, m),3.54-3.59 (1H, m), 3.87-3.90 (1H, m), 3.95-3.98 (1H, m), 5.66 (1H, s),7.23-7.420 (5H, m).
ｄ）ｔｅｒｔ－ブチル｛（２Ｓ）－３－メチル－１－オキソ－１－［（４Ｓ）－２－オキソ－４－（プロパン－２－イル）－１，３－オキサゾリジン－３－イル］－３－フェニルブタン－２－イル｝カルバメート（化合物Ｄ４）の製造
化合物Ｄ３（１６．４ｇ）の酢酸エチル溶液（１２００ｍＬ）に、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート（２４．０ｇ）及び１０％Ｐｄ－Ｃ（１１．６ｇ、５０％ウェット）を加え、水素雰囲気下、２時間撹拌した。セライトろ過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル）にて精製し、化合物Ｄ４（１６．１ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):0.77 (3H, d, J = 6.8 Hz),0.82 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.42 (3H, s), 1.43 (9H, s), 1.48 (3H, s), 2.20-2.29(1H, m), 3.45 (1H, t, J = 8.8 Hz), 3.80-3.83 (1H, m), 3.89-3.92 (1H, dd, J =2.0 Hz, J = 8.4 Hz), 5.16 (1H, brs), 6.13 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.21-7.26 (1H,m), 7.29-7.33 (2H, m). 7.42 (2H, d, J = 7.2 Hz).
ｅ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β，β－ジメチル－Ｌ－フェニルアラニン（化合物Ｄ５）の製造
化合物Ｄ４（１６．１ｇ）のＴＨＦ（４６８ｍＬ）及び水（１１７ｍＬ）溶液に、０℃にて３０％過酸化水素水（３２．５ｍＬ）及び水酸化リチウム水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ，１１９ｍＬ）を加え、２５℃に昇温し、３時間撹拌した。０℃にて硫酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｏｌ／Ｌ，４７０ｍＬ）を加え、２５℃に昇温し、１時間撹拌した。クエン酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）でｐＨ３にし、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物Ｄ５（１４．２ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.38 (9H, s), 1.44 (3H, s),1.46 (3H, s), 4.56 (1H, brd, J = 11.6 Hz), 4.94 (1H, brd, J = 14.4 Hz),7.21-7.38 (5H, m).
ｆ）メチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－β，β－ジメチル－Ｌ－フェニルアラニンエステル（化合物Ｄ６）の製造
化合物Ｄ５（１４．２ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（８４ｍＬ）に、炭酸ナトリウム（８．４４ｇ）及びヨウ化メチル（９．９１ｍＬ）を加え、２５℃で１５時間撹拌した。０℃に冷却後、冷水を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル）で精製し、化合物Ｄ６（１１．１ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3):1.36 (9H, s), 1.37 (3H, s),1.41 (3H, s), 3.48 (3H, brs), 4.49 (1H, brd, J = 9.8 Hz), 4.98 (1H, brd, J =9.1 Hz), 7.18-7.22 (1H, m), 7.27-7.33 (4H, m).
ｇ）メチル Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニンエステル（化合物Ｄ７）の製造
参考例１－ｋ）と同様の手法で、化合物Ｄ６（３０７ｍｇ）から化合物Ｄ７（２４５ｍｇ）を得た。
LC-MS: 344 (M+Na)+ (1.589 min, 測定条件C)
ｈ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニン（化合物Ｂ８）の製造
参考例１－ｌ）と同様の手法で、化合物Ｄ７（２３５ｍｇ）から化合物Ｄ８（１９５ｍｇ）を得た。
LC-MS: 330 (M+Na)+ (1.420 min, 測定条件C)
ｉ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－エトキシ－２，５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（化合物Ｄ９）の製造
参考例１－ｍ）と同様の手法で、化合物Ｄ８（１９５ｍｇ）から化合物Ｄ９（３０７ｍｇ）を得た。
LC-MS: 624 (M+Na)+ (1.797 min, 測定条件C)
ｊ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－５－カルボキシ－２－メチルヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（化合物Ｄ１０）の製造
参考例１－ｎ）と同様の手法で、化合物Ｄ９（３０７ｍｇ）から化合物Ｄ１０（２８６ｍｇ）を得た。
LC-MS: 596 (M+Na)+, 572 (M-H)-(1.596 min, 測定条件C)
ｋ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－｛（３Ｓ，４Ｅ）－６－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－２、５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル｝－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド（参考例４）の製造
参考例１－ｏ）と同様の手法で、化合物Ｄ１０（２８６ｍｇ）から参考例４（２２７ｍｇ）を得た。
LC-MS: 693 (M+Na)+ (1.658 min, 測定条件C)
参考例５
文献（国際公開第２００３／０８２２６８号）に記載の方法に従い、下表１に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000074
参考例６～７
参考例５を用いて、参考例１の工程ｍ）又は参考例１の工程ｏ）と同様に反応及び処理をし、下表２に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000075
参考例８～９
対応する原料化合物を用いて、参考例１のｍ）工程と同様に反応及び処理をし、下表３に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000076
参考例１０～３５
対応する原料化合物を用いて、参考例２の工程ａ）と同様に反応及び処理をし、下表４に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000077
Figure 0007437328000078
Figure 0007437328000079
Figure 0007437328000080
参考例３６～５３
対応する原料化合物を用いて、参考例２の工程ｂ）と同様に反応及び処理をし、下表５に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000081
Figure 0007437328000082
Figure 0007437328000083
参考例５４
ジエチル （（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノイル）－Ｄ－グルタミン酸
Figure 0007437328000084
ａ）（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノン酸の製造
参考例１－ｎ）と同様の手法で、エチル （Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノエート（１．６４ｇ）から（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノン酸（１．５５ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：３８５（Ｍ＋Ｈ）＋／０．９８６ｍｉｎ、測定条件Ｅ
ｂ）ジエチル（（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノイル）－Ｄ－グルタミン酸の製造
参考例１－ｍ）と同様の手法で、（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノン酸（３７６ｍｇ）からジエチル （（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノイル）－Ｄ－グルタミン酸（５００ｍｇ）を得た。
ｃ）ジエチル（（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノイル）－Ｄ－グルタミン酸（参考例５４）の製造
参考例１０３－ａ）と同様の手法で、ジエチル （（Ｓ，Ｅ）－４－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－Ｎ，３，３－トリメチルブタナミド）－２，５－ジメチルヘキサ－２－エノイル）－Ｄ－グルタミン酸（５２８ｍｇ）から参考例５４（５１５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：４７０（Ｍ＋Ｈ）＋／１．２２３ｍｉｎ、測定条件Ｃ
参考例５５
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ５－（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネート
Figure 0007437328000085
ａ）ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ５－（２－（２，５－ジオキシ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネートの製造
ＢＯＣ－Ｄ－グルタミン酸 α－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（２．０６１ｇ）、１－（２－アミノ－エチル）－ピロール－２，５－ジオン ハイドロクロリド（１．２０ｇ）、２－（１Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾールｌ－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロフォスフェイト（Ｖ）（３．８７ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．４７ｍＬ）及びＮ，Ｎージメチルホルムアミド（１０ｍＬ）の混合液を、室温にて１時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル）で生成することによりｔｅｒｔ－ブチル Ｎ２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ５－（２－（２，５－ジオキシ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネート（２．８ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：４２６（Ｍ＋Ｈ）＋（１．０３０ｍｉｎ、測定条件Ｆ）
ｂ）ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ５－（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネート（参考例５）の製造
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ５－（２－（２，５－ジオキシ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネート（５１．８ｍｇ）、ＴＦＡ（１ｍＬ）の混合液を室温にて１時間２０分攪拌した。反応液を氷冷後、減圧濃縮し、参考例５５を得た。化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
ＬＣ－ＭＳ：３２６（Ｍ＋Ｈ）＋（０．４９６ｍｉｎ、測定条件Ｆ）
参考例５６
Ｎ５－（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミン
Figure 0007437328000086
ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｎ５－（２－（２，５－ジオキシ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）－Ｄ－グルタミネート（６４．８ｍｇ）、ＴＦＡ（１ｍＬ）の混合液を室温にて１７時間攪拌した。反応終了後、減圧濃縮し、参考例５６を得た。化合物は、精製せずに次の反応に用いた。
ＬＣ－ＭＳ：２７０（Ｍ＋Ｈ）＋（０．２５４ｍｉｎ、測定条件Ｆ）
参考例１０１
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－３－メチル－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート
Figure 0007437328000087
ａ）２，５－ジオキソピロリジン－１－イル （ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリネート（化合物Ｅ１）の製造
参考例１－ｏ）と同様の手法で、（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリン（３．７２ｇ）から化合物Ｅ１（４．９ｇ）を得た。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): 1.01(3H,d,J=7.2Hz), 1.05(3H,d,J=6.8Hz), 1.44(9H,s), 2.28(1H,m), 2.82(4H,s), 4.58(1H,m), 4.97(1H,m)
ｂ）（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタナミド）－５－ウレイドペンタン酸（化合物Ｅ２）の製造
参考例２－ａ）と同様の手法で、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル （ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリネート（４．９ｇ）から化合物Ｅ２（５．３１ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：３７５（Ｍ＋Ｈ）＋／０．９７２ｍｉｎ、測定条件Ｃ
ｃ）ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（化合物Ｅ３）の製造
化合物Ｅ２（７０１ｍｇ）、４－アミノベンジルアルコール（４６１ｍｇ）、エチル ２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（９２６ｍｇ）、メタノール（１０ｍＬ）及びジクロロメタン（２０ｍＬ）の混合液を遮光下、室温にて２４時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）にて精製することにより、化合物Ｅ３（２４３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：４８０（Ｍ＋Ｈ）＋／１．５８３ｍｉｎ、測定条件Ｇ
ｄ）ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－３－メチル－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソ－５－ウレイドペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（参考例１０１）の製造
化合物Ｅ３（２．０ｇ）、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３．８１ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチレンジアミン（２．１７９ｍＬ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの混合液を室温にて２時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより、参考例１０１（２．１ｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：６４５（Ｍ＋Ｈ）＋／１．２２５ｍｉｎ、測定条件Ｇ
参考例１０２
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－３－メチル－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート
Figure 0007437328000088
ａ）（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｌ－アラニン（化合物Ｆ１）の製造
参考例２－ａ）と同様の手法で、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル （ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリネート（１．０ｇ）から化合物Ｆ１（６７６ｍｇ）を得た。
LC-MS:278(M-H)-/0.925 min、測定条件Ｇ
ｂ）ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（化合物Ｆ２）の製造
参考例１０１－ｃ）と同様の手法で、化合物Ｆ１（６７６ｍｇ）から化合物Ｆ２（４００ｍｇ）を得た。
LC-MS:394(M+H)+/0.974 min、測定条件Ｇ
ｃ）ｔｅｒｔ－ブチル （（Ｓ）－３－メチル－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（参考例４４）の製造
参考例１０１－ｄ）と同様の手法で、化合物Ｆ２（４００ｍｇ）から参考例１０２（５６７ｍｇ）を得た。
LC-MS:559(M+H)+/1.217 min、測定条件Ｇ
参考例１０３
Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ，１６Ｒ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－１６，１８－ジカルボキシ－４，１０，１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０，１５－テトラアザオクタデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド
Figure 0007437328000089
Figure 0007437328000090
Figure 0007437328000091
ａ）メチル Ｎ，β，β，１－テトラメチル－Ｌ－トリプトファンエステル（化合物Ｇ１）の製造
化合物Ａ１１（４０２ｍｇ）のクロロホルム（５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加えて、２５℃にて４５分間撹拌した。反応終了後、反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）で精製することにより化合物Ｇ１（３０６ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):1.47-1.48(6H, m), 2.21 (3H, d, J = 1.8 Hz), 3.61 (3H, d, J = 2.3 Hz), 3.71 (1H, d, J =1.8 Hz), 3.72 (3H, d, J = 1.8 Hz), 6.83 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.08 (1H, t, J =8.2 Hz), 7.19 (1H, t, J = 8.2 Hz), 7.27 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.81 (1H, d, J =8.2 Hz).
LC-MS: 275 (M+H)+ (0.856 min, 測定条件D)
ｂ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ５－カルバモイル－Ｎ－｛４－［（｛［（２Ｓ）－１－メトキシ－３－メチル－３－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１－オキソブタン－２－イル］（メチル）カルバモイル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－オルニチンアミド（化合物Ｇ２）の製造
化合物Ｇ１（３０６ｍｇ）、参考例４３（１０１ｍｇ）、２，６－ルチジン（６６３ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．５ｍＬ）の混合液を４５℃にて８時間撹拌した。反応終了後、水を加え加え、クロロホルムで抽出した。有機層を水と飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール）で精製することにより化合物Ｇ２（５１６ｍｇ）を得た。
LC-MS: 780 (M+H)+ (1.369 min, 測定条件D)
ｃ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ５－カルバモイル－Ｎ－｛４－［（｛［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－メチル－２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロピル］（メチル）カルバモイル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－オルニチンアミド（化合物Ｇ３）の製造
参考例１－ｌ）と同様の手法で、化合物Ｇ２（５１６ｍｇ）から化合物Ｇ３（１７５ｍｇ）を得た。
LC-MS: 766 (M+H)+, 764 (M-H)- (1.285 min, 測定条件D)
ｄ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－４、１０、１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２，１５－ジオキサ－４，７，１０－トリアザヘプタデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド（化合物Ｇ４）の製造
参考例１－ｍ）と同様の手法で、化合物Ｇ３（１３０ｍｇ）から化合物Ｇ４（１４６ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1060 (M+H)+ (1.380 min, 測定条件D)
ｅ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－１３－カルボキシ－４，１０－ジメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９－トリオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザテトラデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド（化合物Ｇ５）の製造
参考例１－ｎ）と同様の手法で、化合物Ｇ４（１４８ｍｇ）から化合物Ｇ５（１４５ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1032 (M+H)+ (1.231 min, 測定条件D)
ｆ）Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－１４－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－４、１０、１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザテトラデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド（化合物Ｇ６）の製造
参考例１－ｏ）と同様の手法で、化合物Ｇ５（１４５ｍｇ）から化合物Ｇ６（１３９ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1129 (M+H)+ (1.271 min, 測定条件D)
ｇ）ジエチル（２Ｒ）－２－｛［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ）－１－（４－｛［（２Ｓ）－２－（｛（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－メチルブタノイル｝アミノ）－５－（カルバモイルアミノ）ペンタノイル］アミノ｝フェニル）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－４、１０、１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザテトラデカ－１２－エン－１４－イル］アミノ｝ペンタンジオエート（化合物Ｇ７）の製造
参考例３－ａ）と同様の手法で、化合物Ｇ６（１３９ｍｇ）から化合物Ｇ７（１５４ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1217 (M+H)+ (1.533 min, 測定条件D)
ｈ）ジエチル（２Ｒ）－２－｛［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ）－１－（４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタノイル］アミノ｝－５－（カルバモイルアミノ）ペンタノイル］アミノ｝フェニル）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－４、１０、１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０－トリアザテトラデカ－１２－エン－１４－イル］アミノ｝ペンタンジオエート（化合物Ｇ８）の製造
参考例１０３－ａ）と同様の手法で、化合物Ｇ７（９２ｍｇ）から化合物Ｇ８（８７ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1117 (M+H)+ (1.279 min, 測定条件D)
ｉ）Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｅ，１６Ｒ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－１６，１８－ジカルボキシ－４，１０，１３－トリメチル－５－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－３，６，９，１４－テトラオキソ－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０，１５－テトラアザオクタデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド（参考例１０３）の製造
参考例１－ｎ）と同様の手法で合成を行い、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより化合物Ｇ８（８７ｍｇ）から参考例１０３（７９ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1061 (M+H)+ (1.124 min, 測定条件D)
参考例１０４
Ｌ－プロリル－Ｌ－アラニル－Ｎ１－（４－｛［（Ｎ－｛（２Ｅ，４Ｓ）－２，５－ジメチル－４－［メチル（Ｎ、β、β、１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－３－メチル－Ｌ－バリル）アミノ］ヘキサ－２－エノイル｝－Ｌ－α－グルタミル）オキシ］メチル｝フェニル）－Ｌ－アスパルトアミド
Figure 0007437328000092
Figure 0007437328000093
ａ）９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル［（２Ｓ）－１－｛［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］アミノ｝－１，４－ジオキソ－４－（トリチルアミノ）ブタン－２－イル］カルバメート（化合物Ｈ１）の製造
Ｎ２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ－トリチル－Ｌ－アスパラギン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、１８ｇ）とｐ－アミノベンジルアルコール（３．９ｇ）のＴＨＦ溶液１５０ｍＬ）に１－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）（８．６ｇ）を加えて、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下、留去し得られた残査に酢酸エチルを加えて、室温で撹拌した。得られた固体をろ過によって回収し、酢酸エチルで洗浄し、減圧下で乾燥した。同様の洗浄を再度行い、化合物Ｈ１（１９．２ｇ）を得た。
LC-MS: 702 (M+H)+ (3.36 min, 測定条件G)
ｂ）Ｎ１－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］－Ｎ４－トリチル－Ｌ－アスパルトアミド（化合物Ｈ２）の製造
化合物Ｈ１（３．０ｇ）に３０％ピペリジン－ＴＨＦ溶液を加えて、室温で５時間撹拌した。減圧下で濃縮し、得られた残査にジエチルエーテルを加えて、洗浄し固体をろ過によって回収した。得られた固体をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。同様の洗浄を再度行い、化合物Ｈ２（１．８２ｇ）を得た。
LC-MS: 480 (M+H)+ (3.00 min, 測定条件F)
ｃ）Ｌ－アラニル－Ｎ１－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］－Ｎ４－トリチル－Ｌ－アスパルトアミド（化合物Ｈ３）の製造
化合物Ｈ２（１．５ｇ）、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－アラニン（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、１．２３ｇ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（７１４ｍｇ）、１－ヒドロキシ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール・１水和物（５０５ｍｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１５ｍＬ）を室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加えた後に、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し有機溶媒層を回収、硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムの除去後、濃縮し、得られたアモルファスをショートカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）によって精製した。得られたアモルファスに３０％ピペリジン－ＴＨＦ溶液を加えて、室温で５時間撹拌した。減圧下で濃縮し、得られた残査をカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）によって精製し、化合物Ｈ３（５６２ｍｇ）を得た。
LC-MS: 551 (M+H)+ (2.89 min, 測定条件F)
ｄ）１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－プロリル－Ｌ－アラニル－Ｎ１－［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］－Ｎ４－トリチル－Ｌ－アスパルトアミド（化合物Ｈ４）の製造
化合物Ｈ３（２７５ｍｇ）、１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－プロリン（Ｂｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、１１８ｍｇ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（７１４ｍｇ）、１－ヒドロキシ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール・１水和物（５０５ｍｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１５ｍＬ）を室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加えた後に、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し有機溶媒層を回収、硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムの除去後、濃縮し、得られたアモルファスをカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）によって精製し、化合物Ｈ４（３２１ｍｇ）を得た。
LC-MS: 748 (M+H)+ (2.42 min, 測定条件G)
ｅ）１－（４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（２Ｓ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピロリジン－２－イル］カルボニル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－４－オキソ－４－（トリチルアミノ）ブタノイル］アミノ｝ベンジル）５－ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ）－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタンジオエート（化合物Ｈ５）の製造
化合物Ｈ４（２４２ｍｇ）、（２Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝－５－オキソペンタン酸・１水和物（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ・Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ）、塩化パラトルエンスルホニル（ＴｓＣｌ）（６５ｍｇ）をアセトニトリル（５．０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。そのアセトニトリル溶液に１－メチルイミダゾール（０．０６ｍＬ）を加えて、室温に戻しながら一晩撹拌した。酢酸エチルを加えた後に、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し有機溶媒層を回収、硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムの除去後、濃縮し、得られたアモルファスをカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）によって精製し、化合物Ｈ５（３４２ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1155 (M+H)+ (4.60 min, 測定条件G)
ｆ）１－（４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（２Ｓ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピロリジン－２－イル］カルボニル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－４－オキソ－４－（トリチルアミノ）ブタノイル］アミノ｝ベンジル）５－ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ）－２－アミノペンタンジオエート（化合物Ｈ６）の製造
参考例１０４－ｂ）と同様の手法で、化合物Ｈ５（３４２ｍｇ）から化合物Ｈ６（１１０ｍｇ）を得た。
LC-MS: 933 (M+H)+ (2.23 min, 測定条件G)
ｇ）１－（４－｛［（２Ｓ）－２－｛［（２Ｓ）－２－（｛［（２Ｓ）－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピロリジン－２－イル］カルボニル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－４－オキソ－４－（トリチルアミノ）ブタノイル］アミノ｝ベンジル）５－ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ）－２－｛［（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｅ）－９－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２，５，１１，１４－ペンタメチル－６－［２－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン－２－イル］－４，７，１０，１５－テトラオキソ－１２－（プロパン－２－イル）－３－オキサ－５，８，１１－トリアザペンタデカ－１３－エン－１５－イル］アミノ｝ペンタンジオエート（化合物Ｈ７）の製造
化合物Ｈ６（３０ｍｇ）、化合物Ａ１３（２２ｍｇ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（２０ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。その混合溶液に、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．０１７ｍＬ）を滴下し、室温に戻しながら一晩攪拌した。酢酸エチルを加えて、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムの除去後、濃縮し、得られたアモルファスをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）によって精製し、化合物Ｈ７（４２ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1541 (M+H)+ (5.23 min, 測定条件G)
ｈ）Ｌ－プロリル－Ｌ－アラニル－Ｎ１－（４－｛［（Ｎ－｛（２Ｅ，４Ｓ）－２，５－ジメチル－４－［メチル（Ｎ、β、β、１－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－３－メチル－Ｌ－バリル）アミノ］ヘキサ－２－エノイル｝－Ｌ－α－グルタミル）オキシ］メチル｝フェニル）－Ｌ－アスパルトアミド（参考例１０４）の製造
参考例１０３－ａ）と同様の手法で合成を行い、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより、化合物Ｈ７（４２ｍｇ）から参考例１０４（１０．３ｍｇ）を得た。
LC-MS: 1043 (M+H)+ (2.79 min, 測定条件F)
参考例１０５～１１６
対応する原料化合物を用いて、参考例１０３及び参考例１０４と同様に反応及び処理をし、下表６に示す化合物を得た
Figure 0007437328000094
Figure 0007437328000095
Figure 0007437328000096
参考例１１７～１１９
対応する原料化合物を用いて参考例１０４と同様に反応及び処理をし、下表７に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000097
実施例１
Ｎ，β，β－テトラメチル－Ｌ－トリプトフイル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－｛［（１Ｒ）－１，３－ジカルボキシプロピル］アミノ｝－２，５－ジメチル－６－オキソヘキス－４－エン－３－イル］－Ｎ、３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000098
 参考例３（１００ｍｇ）のクロロホルム溶液（１．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて、２５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；メタノール：クロロホルム）で精製することにより実施例１（６０ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：６５６（Ｍ＋Ｈ）＋（１．０３６ｍｉｎ，測定条件Ｃ）
実施例２
Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－｛［（１Ｒ）－１，３－ジカルボキシプロピル］アミノ｝－２，５－ジメチル－６－オキソヘキス－４－エン－３－イル］－Ｎ、３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000099
 参考例１６（２０ｍｇ）のクロロホルム溶液（１．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて、２５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより実施例２（９．３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：６０３（Ｍ＋Ｈ）＋（０．８７０ｍｉｎ，測定条件Ｄ）
実施例３
Ｎ－［（２Ｅ，４Ｓ）－２，５－ジメチル－４－（メチル｛３－メチル－Ｎ－［（２Ｒ）－１－（プロパン－２－イル）ピペリジン－２－カルボニル］－Ｌ－バリル｝アミノ）ヘキサ－２－エノイル］－Ｄ－グルタミン酸
Figure 0007437328000100
 参考例６（２２．１ｍｇ）のテトラヒドロフラン（４．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）の混合溶液を０℃に冷却した後、水酸化リチウム（３．１２ｍｇ）を加え、その後２５℃にて１２時間撹拌した。反応終了後、反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより実施例３（５．８ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：５６７（Ｍ＋Ｈ）＋（０．８０ｍｉｎ，測定条件Ｇ）
実施例４～１０
対応する原料化合物を用いて実施例１、２又は３と同様に反応及び処理し、下記表８に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000101
実施例１１
Ｎ，β，β－トリメチル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（３Ｓ，４Ｅ）－６－（｛（５Ｒ）－５－カルボキシ－５－［４－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ブタナミド］ペンチル｝アミノ）－２，５－ジメチル－６－オキソヘキサ－４－エン－３－イル］－Ｎ，３－ジメチル－Ｌ－バリンアミド
Figure 0007437328000102
 実施例１０の２トリフルオロ酢酸塩（３５．１ｍｇ）、Ｎ－スクシンイミジル ４－マレイミドブチラート（１７．７ｍｇ）、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７．３ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）の混合液を、２５℃にて３時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより実施例１１（９．５ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：７６７（Ｍ＋Ｈ）＋（０．９６９ｍｉｎ，測定条件Ｇ）
実施例１２～３２
対応する原料化合物を用いて実施例１、２、３又は１１と同様に反応及び処理し、下記表９に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000103
Figure 0007437328000104
Figure 0007437328000105
実施例３３
Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（５Ｓ、８Ｓ、１１Ｓ、１２Ｅ、１６Ｒ）－８－ｔｅｒｔ－ブチル－１６，１８－ジカルボキシ－４，１０，１３－トリメチル－３，６，９，１４－テトラオキソ－５－（２－フェニルプロパン－２－イル）－１１－（プロパン－２－イル）－２－オキサ－４，７，１０，１５－テトラアザオクタデカ－１２－エン－１－イル］フェニル｝－Ｎ５－カルバモイル－Ｌ－オルニチンアミド
Figure 0007437328000106
 参考例１１６のトリフルオロ酢酸塩（０．７ｍｇ）、Ｎ－スクシンイミジル ６－マレイミドヘキサノエート（０．４ｍｇ）、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１６ｍｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）の混合液を、２５℃にて３時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより実施例３３（０．７３ｍｇ）を得た。
ＬＣ－ＭＳ：１２０１（Ｍ＋Ｈ）＋（１．１１０ｍｉｎ，測定条件Ｄ）
実施例３４～３６
対応する原料化合物を用いて実施例３３と同様に反応及び処理し、下記表１０に示す化合物を得た。
Figure 0007437328000107
実施例３７
（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｅ，１４Ｒ）－１４－（３－｛［２－（３－｛［（２Ｒ）－２－アミノ－２－カルボキシエチル］スルファニル｝－２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）エチル］アミノ｝－３－オキソプロピル）－６－ｔｅｒｔ－ブチル－８，１１－ジメチル－４，７，１２－トリオキソ－３－（２－フェニルプロパン－２－イル）－９－（プロパン－２－イル）－２，５，８，１３－テトラアザペンタデカ－１０－エン－１５－オイック アシド
Figure 0007437328000108
 実施例２８（１０ｍｇ）の水溶液（１．０ｍＬ）にシステイン（１．７３ｍｇ）を加えて、４℃で１時間撹拌した。その後、反応溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；０．１％ＴＦＡアセトニトリル：水）で精製することにより実施例３７（１０ｍｇ）を得た。
LC-MS: 846 (M+H)+, 844 (M-H)-(0.855 min, 測定条件B)
実施例３８～５９
対応する原料化合物を用いて実施例３７と同様に反応及び処理し、下表１１に示す化合物を得た
Figure 0007437328000109
Figure 0007437328000110
実施例ＡＤＣの製造に用いる抗体は、購入可能であるか、又は下表に示す文献に従って製造することができる。
Figure 0007437328000111
実施例ＡＤＣ１
ブレンツキシマブ－実施例３４複合体（平均ＤＡＲ：７．４１）
Figure 0007437328000112
 ブレンツキシマブ（９１ｍｇ）のリン酸緩衝生理水溶液（３．７７ｍＬ、ｐＨ７．４）に、１ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸緩衝液（１２．２ｍＬ、ｐＨ７．５）を加え、３７℃にて４５分間インキュベートした。抗体溶液を０℃に冷却した後、リン酸緩衝生理水溶液（ｐＨ７．４）で予備平衡させたＰＤ－１０脱塩カラムで処理することにより、還元された抗ＣＤ３０抗体（ブレンツキシマブ）のリン酸緩衝生理水溶液（ｐＨ７．４）を得た。これを０℃に冷却した後、リン酸緩衝生理水溶液（ｐＨ７．４）で１０倍希釈した、実施例３４（１２．２ｍＬ）の１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液を修飾化剤として加え、完全に混合し、４℃にて１６時間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理水溶液（ｐＨ７．４）で予備平衡させたＰＤ－１０脱塩カラムで精製した後、遠心濃縮することで、実施例ＡＤＣ１（７８．２ｍｇ）を得た。
得られたＡＤＣの平均ＤＡＲは、還元性若しくは非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又はＨＰＬＣ－ＨＩＣによって測定した。また、平均ＤＡＲは、紫外可視吸収分光法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、還元性又は非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ、ＳＥＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳ等によって、定性的又は定量的に測定することができる。これらの方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１０４５，２０１３．ｐｐ２６７－２８４．Ｌ．Ｄｕｃｒｙ，Ｅｄ．に記載される。
ヒトＩｇＧ１抗体で作製したＡＤＣの平均薬物抗体比が８の場合、還元性及び非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果からＡＤＣの生成を推定することもできる。具体的には、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をマーカーに、実施例ＡＤＣをジスルフィド非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析した結果、分子量５０ｋＤａ及び分子量２５ｋＤａ付近のバンドを強く検出した場合、これは、抗体の軽鎖－重鎖間及びヒンジのジスルフィド結合に関与するシステイン残基に修飾化剤がコンジュゲートしたことを示し、即ち、平均薬物抗体比が８のＡＤＣが得られたことを意味する。
ＨＰＬＣ－ＨＩＣ解析により求めた実施例ＡＤＣ１の平均ＤＡＲは、７．４１であった。
実施例ＡＤＣ２
ブレンツキシマブ－実施例３４複合体（平均ＤＡＲ：３．７６）
Figure 0007437328000113
 実施例ＡＤＣ１のプロトコールにおいて、ＴＣＥＰ又は修飾化剤の添加量を変更することで、ＡＤＣのＤＡＲを調整することができる。実施例ＡＤＣ１のプロトコールに従い、ＴＣＥＰを４当モル量用いることで実施例ＡＤＣ２を得た。
実施例ＡＤＣ３～２６
対応する抗体と修飾化剤を用いて、実施例ＡＤＣ１と同様に反応及び処理し、下記に示すＡＤＣを得た。また、これらのＡＤＣの平均ＤＡＲを、実施例ＡＤＣ１と同様に、ＵＶ－Ｖｉｓ、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析から算出又は推定した。
Figure 0007437328000114
Figure 0007437328000115
「ＳＤＳ－ＰＡＧＥにてＡＤＣ生成を確認した」とは、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をマーカーに、実施例ＡＤＣをジスルフィド非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析した結果、分子量５０ｋＤａ及び分子量２５ｋＤａ付近のバンドを強く検出したことを意味する。これは、抗体の軽鎖－重鎖間及びヒンジのジスルフィド結合に関与するシステイン残基に修飾化剤がコンジュゲートしたことを示し、ＡＤＣが得られたことを意味する。
上表１３における実施例のＡＤＣのＨＩＣ保持時間（分）は、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ解析により観測された、ＤＡＲが８であるＡＤＣのピークのものである。また、比較例１のＡＤＣのＲｔ（ｍｉｎ）は、ＤＡＲが８であるＡＤＣのピークのものである。
上表１３の比較例化合物１とは、国際公開第２００４／０１０９５７号に開示されている下記化合物を表す。比較例化合物１はベドチンと呼ばれる。
Figure 0007437328000116
上表１３の比較例ＡＤＣ１は、比較例化合物１とブレンツキシマブとの抗体薬物複合体である、ブレンツキシマブ ベドチンに相当する。ブレンツキシマブ ベドチンはアドセトリス（商品名）として日本で薬事承認を受けている。
比較例化合物２とは、モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）であり、試薬として購入することができる。ブレンツキシマブ ベドチンは細胞内で代謝を受けることでＭＭＡＥを放出することが知られている（非特許文献５）。
以下に、本発明の抗体薬物複合体の特定の実施例に係る薬理試験結果を示し、その薬理作用を説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
試験例１：ブタチューブリンを用いた微小管重合阻害活性評価（１）
Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社より購入したチューブリン重合阻害アッセイキット（カタログ番号：ＢＫ００６Ｐ）を用い、キットに付属するプロトコールに従って、濃度０．９１μＭの実施例の化合物の重合阻害活性を評価した。プロトコールを要約すると、９６穴マイクロプレートに、評価対象の化合物の８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、及び５％ＤＭＳＯ緩衝液を、１０μＬずつ添加し、これらに３ｍｇ／ｍＬのブタチューブリン ８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＧＴＰ、及び１０．２％ｇｌｙｃｅｒｏｌ溶液を１００μＬずつ添加した。チューブリンの重合する様子を経時的に調べるため、３４０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃にて測定した。チューブリンの重合が進むにつれて３４０ｎｍの吸光度が上昇する。結果を図１に示す。
図１に示すように、モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ヘミアスタリン及び実施例１は、微小管重合阻害評価試験において同等の微小管重合阻害活性を示した。
試験例２：ブタチューブリンを用いた微小管重合阻害活性評価（２）
Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社より購入したチューブリン重合阻害アッセイキット（カタログ番号：ＢＫ００６Ｐ）を用い、キットに付属するプロトコールに従って、濃度９．１μＭの実施例の化合物の重合阻害活性を評価した。９６穴マイクロプレートに、評価対象の化合物の８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、及び５％ＤＭＳＯ緩衝液を、１０μＬずつ添加し、これらに３ｍｇ／ｍＬのブタチューブリン ８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＧＴＰ、及び１０．２％ｇｌｙｃｅｒｏｌ溶液を１００μＬずつ添加した。チューブリンが重合する様子を経時的に調べるため、３４０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて、３７℃にて測定した。チューブリンの重合が進むにつれて、３４０ｎｍの吸光度は上昇する。
チューブリン重合阻害活性は、アッセイ開始６０分後における、重合したチューブリンの割合によって評価した。具体的には、化合物を加えていないウェルにおける重合したチューブリンの吸光度で、化合物を加えたウェルにおける重合したチューブリンの吸光度を除し、その値を１００倍することで、微小管重合率（％）を算出した。その結果を下表１４に示す。
Figure 0007437328000117
微小管重合率が低い値であるほど、化合物が微小管の重合を強く阻害していることを示す。
試験例１及び試験例２の結果が示すように、標的細胞内で抗体薬物複合体が代謝されることによって生成される式（１－１）、式（１－２）及び式（１－３）で表される本発明のへミアスタリン誘導体は、チュ－ブリン重合阻害活性を示すことが明らかとなった。
試験例３：iPS細胞に対する細胞傷害活性の評価
ヒトiPS細胞（２０１Ｂ７）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダーフリー足場にはｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ社製）を用いた。サブコンフレントになったヒトiPS細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、このヒトiPS細胞を、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μｍｏｌ／Ｌ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にて３７℃、５％ＣＯ２下でフィーダーフリー培養した。この時、プラスチック培養ディッシュとして、１２ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス製、細胞培養用、培養面積３．８ｃｍ２）を用い、単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は０．５ｘ１０４とした。播種から１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換し、さらに播種から３日後に同様に培地交換を行った。播種から４日後に、このヒトiPS細胞に、ＰＢＳに溶解した実施例ＡＤＣ１、及び実施例ＡＤＣ２３の化合物を、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３、味の素社製）に加えて７２時間培養した。７２時間後、培地を除去しＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散し、カウンテス自動セルカウンター付属のトリパンブルー０．４％溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で染色した後Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンターで生細胞数を計測し、コントロールに対する細胞生存率を算出した。結果を図２に示す。
図２に示すように、実施例ＡＤＣ１及び実施例ＡＤＣ２３の化合物はいずれも２００μｇ／ｍＬの濃度でiPS細胞に対して強い細胞傷害活性が認められた。細胞生存率はいずれも１．２％以下であった。
試験例４：分化細胞に対する細胞傷害活性の評価
試験例３と同様に、フィーダーフリー培養したサブコンフレント１日前のヒトiPS細胞（２０１Ｂ７）を、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、このヒトiPS細胞を、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ，ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μｍｏｌ／Ｌ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にて３７℃、５％ＣＯ２下でフィーダーフリー培養した。この時、プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ２）を用い、単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は２．５ｘ１０５とした。その後ＰＳＣ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）付属のＤｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ａに交換して１日培養し、さらにＤｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂに交換して１日培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ｔａｋａｒａ社製)付属のＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｏａｔｉｎｇでコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日培養した。この時プラスチック培養ディッシュとして２４ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス製、細胞培養用、培養面積２ｃｍ２）を用い、播種細胞数は２．５ｘ１０５とした。播種２日後にＰＢＳに溶解した実施例ＡＤＣ１、及び実施例ＡＤＣ２３の化合物を、終濃度２００μｇ/ｍＬとなるように、同Ｋｉｔ付属のＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍに加えて７２時間培養した。７２時間後、培地を除去しＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散し、カウンテス自動セルカウンター付属のトリパンブルー溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で染色した後自動セルカウンターで生細胞数を計測し、コントロールに対する細胞生存率を算出した。結果を図３に示す。
図３に示すように実施例ＡＤＣ１及び実施例ＡＤＣ２３の化合物は２００μｇ/ｍＬの濃度で分化誘導細胞に対して弱い傷害活性が認められた。細胞生存率は、実施例ＡＤＣ１が３４．７％であり、実施例ＡＤＣ２３が２４．６％であった。
試験例５：膜透過性試験
人工膜透過性試験（ＰＡＭＰＡ）により、次のように実施例の化合物の膜透過性を試験した。Ｄｏｎｏｒ ｐｌａｔｅに実施例の化合物を添加したＳｙｓｔｅｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＩＯＮ ｉｎｃ．）を２００μＬ、ＧＩＴ Ｌｉｐｉｄ－０（ｐＩＯＮ ｉｎｃ．）を４μＬずつ添加した。Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｐｌａｔｅにＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｎｋ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＩＯＮ ｉｎｃ．）を２００μＬ添加した。両プレートを重ね合わせ、３７℃で４時間インキュベートした後、アクセプター側及びドナー側の溶液のＵＶを、ＵＶ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（１９０－５００ｎｍ）にて測定した。ＵＶ吸収の乏しい化合物はＬＣ－ＭＳにて測定した。薬物の透過係数Ｐｅ（１０－６ｃｍ／ｓｅｃ）を下式により算出した。結果を表１５に示す。
Figure 0007437328000118
Figure 0007437328000119
試験例５の結果から、式（１－１）、式（１－２）及び式（１－３）で表される実施例の化合物が、モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）及びヘミアスタリンよりも細胞膜透過性が低いことが明らかになった。
試験例１～５の結果から、iPS細胞と分化細胞が共存した状態に、式（２－１）及び式（２－２）で表される抗体薬物複合体を作用させると、抗体薬物複合体はiPS細胞選択的に細胞傷害性を示すことが期待される。また、iPS細胞に取り込まれた本発明の抗体薬物複合体が代謝されることで生成される化合物は、低細胞膜透過性のため分化細胞内への移行が抑えられる。それゆえ、本発明の抗体薬物複合体は、iPS細胞と比較して分化細胞に対する細胞傷害性が低いことが期待できる。したがって、本発明の抗体薬物複合体によれば、iPS細胞群を分化誘導させた後、分化細胞と残留iPS細胞の不均一状態から、残留iPS細胞を選択的に除去し、効率的に分化細胞を取得することができる。
以上で説明したように、本発明の抗体薬物複合体は、未分化状態のiPS細胞に対し選択的に細胞傷害活性を示す一方、分化細胞に対しての細胞傷害性が低いことから、細胞選択的な多能性幹細胞の除去剤となることが期待される。

Claims (22)

  1. 式（２－１）：
    Figure 0007437328000120
    ［式中、
    ｍＡｂは、多能性幹細胞表面に発現する抗原を認識する抗体を表し、
    ｑは１～２０の整数を表し、
    ｂは１～５の整数を表し、
    Ｚは、式（Ｚ－１）又は式（Ｚ－２）：
    Figure 0007437328000121
    （式中、
    Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
    Figure 0007437328000122
    （式中、
    Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
    Figure 0007437328000123
    で表される基を表す）
    で表される基を表し、
    ｆは１又は２を表し、
    Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
    ｕは１又は２を表す）
    で表される基である］
    で表される、抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  2. 式（２－２）：
    Figure 0007437328000124
    ［式中、
    ｍＡｂは、多能性幹細胞表面に発現する抗原を認識する抗体を表し、
    ｑは１～２０の整数を表し、
    ｈは１～５の整数を表し、
    Ｚ”は、式（Ｚ－５）、式（Ｚ－６）、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）：
    Figure 0007437328000125
    （式中、
    Ｗは、式（Ｗ－１）又は式（Ｗ－２）：
    Figure 0007437328000126
    （式中、
    Ｑは、式（Ｑ－１）又は式（Ｑ－２）：
    Figure 0007437328000127
    で表される基を表す）
    で表される基を表し、
    Ｙは、単結合又は式（Ｙ－１）：
    Figure 0007437328000128
    で表される基を表し、
    式（Ｙ－１）で表される基の＊１末端は、アミン（ｂ）と共に結合を形成することを表し、
    Ｇは、単結合、＊２－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｌｙｓ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－、＊２－Ｌｙｓ－Ａｌａ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｉｌｅ－、＊２－Ｃｉｔ－Ｔｒｐ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－、＊２－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－、＊２－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、＊２－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－又は＊２－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－を表し、
    Ｇの＊２末端はＹ又は－ＮＨ－と結合していることを表し、
    ｆは１又は２を表し、
    Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｕ－ＣＯＯＨを表し、
    ｕは１又は２を表す）
    で表される基である］
    で表される、抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  3. Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
    Ｙが単結合であり
    Ｇが単結合である、
    請求項２に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  4. Ｚ”が、式（Ｚ－５）又は式（Ｚ－６）で表される基であり、
    Ｙが式（Ｙ－１）で表される基であり，
    Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
    請求項２に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  5. Ｚ”が、式（Ｚ－７）、式（Ｚ－８）又は式（Ｚ－９）で表される基であり、
    Ｇが、＊２－Ｃｉｔ－Ｖａｌ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－、＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－、又は＊２－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－である、
    請求項２に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  6. Ｗが、式（Ｗ－１）で表される基である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  7. ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体、抗ＴＲＡ１－６０抗体、抗ＴＲＡ１－８１抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、又は抗ｒＢＣ２ＬＣＮ抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  8. ｍＡｂが、抗ＣＤ３０抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  9. ｑが１～８の整数である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
  10. 以下の化合物から選択される化合物を放出する、請求項１に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
    Figure 0007437328000129
  11. 以下の化合物から選択される化合物を放出する、請求項２に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
    Figure 0007437328000130
  12. 以下の化合物から選択される化合物を放出する、請求項１又は２に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の除去剤。
    Figure 0007437328000131
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の殺傷剤。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を含有する、多能性幹細胞の減少剤。
  15. 多能性幹細胞が、ES細胞又はiPS細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の多能性幹細胞の除去剤。
  16. 多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の多能性幹細胞の除去剤。
  17. 多能性幹細胞を含む培養液に、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を添加する工程を含む、多能性幹細胞の除去方法。
  18. 多能性幹細胞を培養することによって製造される細胞塊を含む培養液に、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩を添加する工程を含む、多能性幹細胞の除去方法。
  19. 多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項１７又は１８に記載の除去方法。
  20. 実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団を製造するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩の使用。
  21. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩とiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団とを接触させる工程を含む、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団の製造方法。
  22. 以下の工程：
    （１）iPS細胞を含む細胞集団を分化細胞へ分化誘導する工程；及び
    （２）前記工程（１）で得られる分化細胞を含む細胞集団を、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体又はその塩と接触させる工程；
    を含む、実質的にiPS細胞を含まないiPS細胞由来の分化細胞を含む細胞集団の製造方法。
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