JP7421712B2 - ロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物 - Google Patents
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Description
近年では、特定の疾患と生体試料中のLRGとの関連性についての研究が行われている。例えば、特許文献1は、生体試料中のLRGを検出することが、ベーチェット病などの自己免疫疾患の検査に有用であることを報告している。
本発明の目的は、ロイシンリッチα2グリコプロテインを含有する、保存安定性の高いロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を提供することである。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
<1>ロイシンリッチα2グリコプロテインを含む、pHが7.0~9.3であるロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<2>ロイシンリッチα2グリコプロテインを測定するための校正用試料溶液である、<1>記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<3>保存容器に充填されている、<1>又は<2>記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<4>pHが7.8~9.0である、<1>~<3>のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<5>塩濃度が、200mM~800mMである、<1>~<4>のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<6>前記塩が、金属塩である、<5>に記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物、
<7><1>~<6>のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を使用する、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定方法、
<8><1>~<6>のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を含む、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定キット、
<9>pHが7.0~9.3である溶媒にロイシンリッチα2グリコプロテインを接触させる工程を含む、ロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法、
<10>前記溶媒のpHが7.8~9.0である、<9>に記載のロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法、
<11>前記溶媒の塩濃度が、200mM~800mMである、<9>又は<10>に記載のロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法、並びに
<12>前記塩が、金属塩である、<11>に記載のロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法。
ロイシンリッチα2グリコプロテイン又はLRGは、約50kDaの糖タンパク質である。LRGは、血清タンパク質の一種であり、健常人の血清には約3.0μg/mL含まれると言われている。LRGは、好中球から分泌されることが報告されている。体内におけるLRGの量的変化と様々な疾患、例えば、結核又は腫瘍との関連性が近年研究されており、これらの疾患を正確に診断するために、生体内のLRG量を正確に測定する必要がある。
本発明のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物のpHは、LRGの安定性を考慮すると、7.0~9.3であり、好ましくは7.0~9.0であり、より好ましくは7.5~9.0であり、さらに好ましくは7.8~9.0であり、最も好ましくは8.0~9.0である。
pHの調整は、当業者に周知のpH調整用試薬、例えば水酸化ナトリウムを用いて行うことができる。
本発明のLRG組成物における塩濃度は、好ましくは200mM~800mMであり、より好ましくは300mM~700mMであり、最も好ましくは300mM~600mMである。塩濃度を上記の範囲内とすることで、LRGの安定性をさらに向上させることができる。
本明細書において、ロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物(以下、LRG組成物と称することがある)とは、LRGの測定において使用される、LRGを含む溶液を意味する。本発明のLRG組成物は、LRG測定において、校正用試料溶液として好適に用いられることができる。本明細書において、校正用試料溶液とは、測定対象物質の測定を正確に行うために使用する、測定対象物質を一定の濃度で含有する試料溶液を意味し、標準物質、キャリブレーター、コントロール、及び内部標準物質などが該当する。本発明のLRG組成物の供給の形態としては、LRGとpHが7.0~9.3の溶媒とを混合した、あらかじめ溶液状態にした形態が挙げられる。また、本発明のLRG組成物の別の供給の形態としては、それぞれを別個に用意し、使用時に両者を混合して溶液状態にする形態が挙げられる。
本発明のLRG組成物におけるLRGの濃度は、以下に限定されるものではないが、0.1~1000μg/mL、0.1~100μg/mL、1~100μg/mL、1~50μg/mL、又は1~30μg/mLであることができる。
なお、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定方法において「ロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を使用する」とは、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定を正確に行うためにロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を使用することを意味し、例えば、ロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を校正用試料溶液(標準物質、キャリブレーター、コントロール、及び内部標準物質など)として使用することを意味する。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。LRGタンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。
LRGの測定を行うための生体試料としては、LRGの測定が可能であれば特に限定されることはないが、血液、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、尿、便等が挙げられ、血清又は血漿を用いることが好ましく、血清を用いることがさらに好ましい。生体又は対象は、哺乳動物であれば特に限定されることはなく、ヒト又は動物(例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ)を含み、好ましくはヒトである。生体試料には、必要に応じて適宜前処理を実施してもよい。
本発明のロイシンリッチα2グリコプロテイン測定キット(以下、LRG測定キットと称することがある)では、LRG組成物を使用することにより、LRGの測定を正確に行うことが可能である。LRG測定キットとしては、例えば免疫学的手法を用いたキットを挙げることができる。本発明のLRG測定キットは、免疫学的手法によりヒト体内のLRG濃度を測定するための試薬を含むことができる。免疫学的手法としては、ELISA、酵素免疫測定法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法(LTIA)、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、及び高速液体クロマトグラフィー法(HPLC法)等が挙げられる。免疫学的手法は、好ましくはラテックス凝集免疫測定法(LTIA)である。
本発明のLRG測定キットは、自己免疫疾患、結核、腫瘍、炎症性疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病)の診断のために使用することができる。
本発明のLRG組成物の保存安定化方法は、pHが7.0~pH9.3である溶媒にロイシンリッチα2グリコプロテインを接触させる工程を含む。溶媒は、pHが7.0~pH9.3であれば特に限定されることはない。溶媒は、HEPES、MES、CHES及びTris等の緩衝液を含むことができ、緩衝液の濃度は、1~1000mMであることができる。「接触させる」には、溶媒にLRGを投入すること以外に、LRGを含むpHが7.0~9.3以外の溶液のpHを7.0~9.3に調整することも含む。
種々のpHのLRG標準抗原溶液を作製した後保存試験を行い、各々のLRG標準抗原溶液におけるLRG量の経時変化を調査することにより、LRG保存安定性に対するpHの影響を検討した。使用したLRGは、CHO(チャイニーズハムスター細胞)を用いて作製した。具体的には、CHO-K1細胞にヒトLRG遺伝子を、プラスミドを用いて導入し、無血清培地でLRG遺伝子導入CHO-K1細胞を培養し、培養上清からヒトLRGリコンビナントタンパクを回収することにより調製した。
下記表1の組成のLRG標準抗原溶液を作製し、4N水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.5又は8.0に調整した。各々のLRG標準抗原溶液を37℃で29日間保存し、LRG量の経時変化を確認した。サンプル組成と実験結果を表1及び2並びに図1に示す。
〔実施例2〕種々の塩濃度の溶液中におけるLRG量の経時変化の検討
緩衝液として下記表4に記載のものを用いたこと及びpHを6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、又は9.5に調整したこと以外は、実施例1で調製したサンプルと同じ組成のLRG標準抗原溶液を作製した。各々のLRG標準抗原溶液を37℃で29日間保存し、LRG量の経時変化を確認した。サンプル組成と実験結果を表4及び図3に示す。
Claims (7)
- ロイシンリッチα2グリコプロテインを含む、ロイシンリッチα2グリコプロテインを測定するための校正用試料溶液であって、pHが7.0~9.3であり、塩濃度が、200mM~800mMであり、前記塩が金属塩である、ロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物。
- 保存容器に充填されている、請求項1記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物。
- pHが7.8~9.0である、請求項1又は2に記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物。
- 請求項1~3のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を使用する、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定方法。
- 請求項1~4のいずれかに記載のロイシンリッチα2グリコプロテイン組成物を含む、ロイシンリッチα2グリコプロテイン測定キット。
- pHが7.0~9.3である溶媒にロイシンリッチα2グリコプロテインを接触させる工程を含み、前記溶媒の塩濃度が、200mM~800mMであり、前記塩が金属塩である、ロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法。
- 前記溶媒のpHが7.8~9.0である、請求項6に記載のロイシンリッチα2グリコプロテインの保存安定化方法。
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