JP7403549B2 - 細胞検出装置および細胞検出方法 - Google Patents
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Description
本開示は、細胞増殖を検出する細胞検出装置および細胞検出方法に関するものである。
細胞培養において、細胞の様子や細胞数の増加具合は、位相差顕微鏡を用いて目視で確認されている（例えば、特許文献１～３参照）。また、他の従来技術では、細胞が増殖する様子を確認するために、直接接触型のＣＭＯＳセンサを用いて細胞を撮像して観察を行う技術が知られている（例えば、特許文献４参照）。
しかしながら、上記特許文献１～３に記載される従来技術では、目視による観察に時間がかかり、細胞を大量に培養する際には、作業者に多くの手間および作業時間を要する。また、上記特許文献４に記載される従来技術のＣＭＯＳセンサを用いる観察は、細胞の形状などの詳細な観察には適しているが、局所的な情報しか得られないので、例えばウェル全体の大まかな細胞数を把握するには不向きである。また、特許文献１～４のいずれの従来技術でも、高価な装置が必須であり、高額の設備コストを要する。
さらに、生命工学分野などの発展によって細胞培養が工業化されると、大量の細胞を効率よく培養することが必要となる。
そのため、簡便に効率よく細胞増殖を検出することができる安価な細胞検出装置および細胞検出方法が求められている。
本開示の実施形態に係る細胞検出装置は、
発光部と、
細胞を含む培地を収めている培養容器と、
第１スリットおよび第１遮光部を備える第１スリット部材と、
前記発光部から発光された光のうち前記培地および前記第１スリットを前記の順に通過した光を受光するように構成された受光部と、を備え、
前記第１スリット部材は、前記細胞が前記第１スリットに重なる位置にある場合、前記発光部から発光された光のうち、前記培養容器中の細胞によって散乱した散乱光を前記第１遮光部によって遮光するように構成される。
発光部と、
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前記第１スリット部材は、前記細胞が前記第１スリットに重なる位置にある場合、前記発光部から発光された光のうち、前記培養容器中の細胞によって散乱した散乱光を前記第１遮光部によって遮光するように構成される。
本開示の細胞検出方法は、上記の細胞検出装置を用いた細胞検出方法であって、
前記培養容器に前記培地および細胞を供給する供給工程と、
細胞を培養する培養工程と、
前記発光部から発光された光を前記細胞を含む前記培地に照射する照射工程と、
前記第１スリット部材を通過し前記受光部が受光した光の量、または前記第１スリット部材および前記第２スリット部材を通過し前記受光部が受光した光の量を取得する取得工程と、を含む。
前記培養容器に前記培地および細胞を供給する供給工程と、
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本開示の実施形態に係る細胞検出装置は、第１スリット部材は、発光部から発光された光のうち、培養容器中の細胞によって散乱した散乱光を第１遮光部によって遮光するように構成されることから、第１スリット部材の第１スリットに対応する培地の部位に細胞が存在する場合における受光部の受光強度（受光によって発生する電流値、即ち光電変換による電流値：Ｉp1とする）が、上記の部位に細胞が存在しない場合における受光部の受光強度（光電変換による電流値：Ip0とする）よりも小さくなる（Ip1＜Ip0となる）。これは、上記の部位に細胞が存在すると、散乱光の成分が受光部によって受光されないことによる。その結果、第１スリットに対応する培地の部位における細胞の存否を、確実に検出することができる。従って、細胞が移動しない場合であれば、細胞が２次元的および／または３次元的に増殖することによって、受光部の受光強度が初期にIp0であったものが、経時的にIp1となり、さらにはIp1が小さくなっていく。これにより、培地全体に存在する細胞の数をほぼ正確に推定することができる。また、細胞が移動する場合であれば、単位時間当たり、例えば１分間当たりあるいは１時間当たりの、第１スリットに対応する培地の部位における細胞の存在確率（単位時間当たりの存在時間）、または第１スリットに対応する培地の部位を横切る単位時間当たりの細胞の数を、計測することによって、培地全体に存在する細胞の数をほぼ正確に推定することができる。
また本開示の実施形態に係る細胞検出装置は、第１スリット部材が複数の第１スリットを有する場合、複数の第１スリット間で検出値を平均化処理することによって、より精密に計測することができる。従って、培地全体に存在する細胞の数をより正確に推定することができる。
また本開示の実施形態に係る細胞検出装置は、受光部が第１スリット部材の底面と培養容器の底面との間に配置される場合、例えば、第１スリット部材および受光部を一体化した検出基板を培養容器に収容する構成とする場合、増殖した細胞の数が所定数を超えた場合に検出基板を培養容器から取り出し、使い捨てにすることができる。
また本開示の実施形態に係る細胞検出装置は、第１スリット部材と受光部との間に、第２スリットおよび第２遮光部を備える第２スリット部材をさらに備え、第１スリット部材および第２スリット部材によって散乱光が遮光されることから、散乱光を遮光する効果が向上する。その結果、第１スリットおよび第２スリットに対応する培地の部位における細胞の存否を、より確実に検出することができる。
従って、本開示の実施形態に係る細胞検出装置および細胞検出方法によれば、上述のような構成を有することによって、非常に安価で簡便に細胞増殖を検出することが可能となる。また、本発明の実施形態に係る細胞検出装置は、非常に安価で大量に供給することができるので、使い捨て製品として使用することが可能である。使い捨て製品として使用することによって、夾雑物が培地中に混入することを防ぐことが可能となる。
以下、図面を用いて本発明の実施形態に係る細胞検出装置について説明する。
＜検出装置＞
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態の細胞検出装置１００の概略構成を示す図である。第１実施形態に係る細胞検出装置１００は、発光部１０と、第１スリット９０および第１遮光部９５を備える第１スリット部材２０と、発光部１０から発光された光のうち細胞を含む培地および第１スリット部材２０の第１スリット９０を前記の順に通過した光を受光するように構成された受光部３０と、細胞を培養する培養容器４０とを備える。
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態の細胞検出装置１００の概略構成を示す図である。第１実施形態に係る細胞検出装置１００は、発光部１０と、第１スリット９０および第１遮光部９５を備える第１スリット部材２０と、発光部１０から発光された光のうち細胞を含む培地および第１スリット部材２０の第１スリット９０を前記の順に通過した光を受光するように構成された受光部３０と、細胞を培養する培養容器４０とを備える。
培地７０（以下、培養基または細胞培養培地ともいう）は、細胞の培養において、培養対象の細胞に生育環境を提供するものであり、ブドウ糖等の炭素源、ペプトン，硫酸アンモニウム等の窒素源、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩等の無機塩類などの栄養素の供給源となるものである。また、細胞の増殖に必要な足場（増殖の基礎部）を与えるものでもある。具体的には、培地７０としては、細胞の培養に必要な上記の栄養成分を含む液体から成る液体培地、またはその液体に寒天、ゼラチンなどを加えて固形化した固形培地がある。本実施形態の細胞検出装置１００においては、細胞が平面的（２次元的）に移動して第１スリット９０を横切るのに好適な光透過性の液体培地がよいが、細胞が２次元的に若干移動することができたり、第１スリット９０の上方で重なるように３次元的に増殖することが可能な光透過性の固形培地であってもよい。
第１スリット部材２０は、発光部１０から発光された光のうち、培養容器４０中の細胞６０によって散乱した散乱光を第１遮光部９５によって遮光するように構成される。散乱光は、細胞の表面で反射、散乱される成分と、細胞を透過し細胞膜の部位で屈折する成分と、を含む。即ち、散乱光は、第１スリット部材２０の主面に対してほぼ垂直に入射した光が、細胞によって光路変換された光に相当する。なお、図中の矢印Ｌ（実線）は、発光部１０から発光された光の経路を示し、矢印ＬＳ１（破線）は、細胞６０を透過して直進する光の経路を示し、矢印ＬＳ２（破線）は、細胞６０を透過して散乱した光の経路を示す。
図２は、第１実施形態の細胞検出装置１００のブロック図である。本実施形態の細胞検出装置１００は、発光部１０と、第１スリット部材２０と、受光部３０と、培養容器４０と、細胞６０が十分に増殖したことを判定する判定部５０とを備える。発光部１０、受光部３０および判定部５０は、互いに電気的に接続される。判定部５０は、例えば中央演算処理装置（Central Processing Unit；略称ＣＰＵ）を備えて実現されてもよい。
判定部５０は、本実施形態では必須の構成ではなく、受光部３０から外部に検出結果を出力できるように構成されていればよい。例えば、検出結果を外部のパーソナルコンピューター等に備わった画像表示装置（ディスプレイ）に表示させるように構成される。また、受光部３０と判定部５０との間などの、電気的な接続については、信号ケーブルなどを用いた有線接続であってもよく、送受信部およびアンテナなどを用いた無線通信によって接続されてもよい。
発光部１０は、培養容器４０中の細胞６０に光を照射する機能を有する。発光部１０としては、例えばＬＥＤ（Light Emitting Diode）などの発光素子、電界発光装置（ＥＬ装置）、蛍光灯、半導体レーザ素子等のレーザ光発光装置などを採用することができる。発光部１０は、第１スリット部材２０を挟んで受光部３０と対向して配置される。また、第１スリット部材２０の第１スリット９０と受光部３０は平面視で重なる位置に配置されていることがよい。この場合、第１スリット９０を通過した光を受光部３０によって高感度に受光できる。また、第１スリット部材２０の第１スリット９０に対応する培地７０の部位に細胞６０が存在する場合における受光部３０の受光強度（光電変換による電流値：Ｉp1）と、上記の部位に細胞６０が存在しない場合における受光部３０の受光強度（光電変換による電流値：Ip0）との差（Ip0-Ip1）を大きくすることができる。
第１スリット部材２０は、発光部１０から発光された光のうち、培養容器４０中の細胞６０によって散乱した散乱光が受光部３０に受光されないようにする役割を有する。第１スリット部材２０の第１遮光部９５は、例えば、ガラス基板、プラスチック基板等の透明な基板の下面（受光部３０側の面）に、第１スリット９０以外の部位にクロム（Ｃｒ）層等の黒色金属層、黒色樹脂層（ブラックマトリックス）等から成る遮光性材料を配置して形成することができる。
第１スリット部材２０は、１つの第１スリット９０のみを有してもよく、複数の第１スリット９０を有してもよい。第１スリット部材２０が１つの第１スリット９０を有する場合、第１スリット９０の形状は、平面視において、例えば、十字形、渦巻状、格子状、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形などであってもよく、培養容器４０の形状、細胞６０の形状、大きさ、移動速度等の運動能力、増殖特性などに応じて適切に選択される。第１スリット部材２０が複数の第１スリット９０を有する場合、第１スリット９０の形状は、平面視において、例えば長方形であってもよい。図３に第１スリット９０の形状の一例を示す。
図３に示されるように、長方形の第１スリット９０の幅（Ｗ）方向の寸法は、細胞６０の直径よりも小さく、幅方向に直交する長さ（Ｌ）方向の寸法は、長さ方向における細胞６０の長さ（直径ＲＬ）よりも大きいことが好ましい。この場合、細胞６０を透過し屈折して散乱（光路変換）した散乱光ＬＳ２（図２に記載）が、平面視で長さ方向において受光部３０から逸れるようにして、受光部３０の側へ向かうこととなる。従って、第１スリット部材２０の第１スリット９０を通過して受光部３０に受光されてしまうことを防ぐことができる。例えば、長方形の第１スリット９０の幅方向の寸法は、７μｍ～２５μｍであり、長方形の第１スリット９０の長さ方向の寸法は、２５μｍ～１０００μｍであることがよい。より好ましくは、第１スリット９０の長さ方向の寸法は、２５μｍ～５０μｍであることがよい。なお、細胞６０は、平面視形状が円形状、楕円形状等の全周が曲線的な形状であることが多いことから、図３の例では円形状のものとして描いているが、円形状に限るものではない。
細胞６０の種類は、特に限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞等であってよい。動物細胞としては、筋肉細胞、肝臓等の内蔵細胞、リンパ球、単球及び顆粒球等の血液細胞、神経細胞、免疫細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell）等がある。これらの細胞は、組織由来の初代細胞であってよく、あるいは継代培養細胞であってもよい。なお、ｉＰＳ細胞は、人間の皮膚等の体細胞に、数種類の遺伝子を導入し培養することによって、ＥＳ細胞（embryonic stem cell：胚性幹細胞）のように様々な組織および臓器の細胞に分化できる分化万能性（pluripotency）と、分裂増殖を経てもそれを維持できる自己複製能、即ちほぼ無限に増殖する能力と、を持たせた細胞である。本実施形態の細胞検出装置１００は、増殖能力の高いｉＰＳ細胞の増殖数の管理に好適に用いることができる。さらに、細胞６０は、大腸菌細胞などの原核細胞であってもよく、動物細胞、植物細胞などの真核細胞であってもよい。細胞６０は、例えば、正常細胞、または腫瘍細胞などの異常細胞であってもよく、遺伝子導入された細胞などの人工的に作製された細胞であってもよい。また、細胞６０は、生体組織の一部として培養される細胞であってもよい。細胞培養は、接着培養であってもよく、浮遊培養であってもよい。
第１スリット部材２０の第１遮光部９５は、第１スリット部材２０の上面（発光部１０側の面）のうち第１スリット９０以外の部位に遮光性部材を配置して形成されてもよい。遮光性部材は、特に限定されないが、黒色金属、黒色レジスト等の黒色樹脂であってもよい。
受光部３０は、細胞６０を透過せずに第１スリット部材２０の第１スリット９０を通過した光と、細胞６０を透過した後に直進する光とを受光する。受光部３０は、例えば、シリコンフォトダイオードなどの受光素子を採用することができる。フォトダイオードは、薄膜トランジスタなどの薄膜技術を応用することによって作製することが可能であるので、安価にかつ大量に生産することができる。
細胞６０の直下に第１スリット部材２０を配置し、さらに第１スリット部材２０の直下に受光部３０を配置することによって、細胞６０による光の散乱強度を光検出強度の差として検知することが可能となり、これによって培地７０の第１スリット９０の部位における細胞６０の有無を検出することが可能となる。培地７０の第１スリット９０の部位に細胞６０がない場合に受光部３０で受光される光量Ｉ１を下記数１に、培地７０の第１スリット９０の部位に細胞６０がある場合に受光部３０で受光される光量Ｉ１’を下記数２に示す。
ここで、Ｉ０は発光部１０から発光された光の量を示し、Ａは細胞６０によって吸収された光の量を示し、Ｂは培地７０によって吸収された光の量を示し、ＳＬは細胞６０によって散乱した光の量を示し、Ｉ１およびＩ１’は、受光部３０によって受光された光の量を示す。なお、細胞６０を透過し散乱されずに直進する光の量はＩ０－（Ｂ＋Ａ）で表される。
細胞６０は透過率が高いのでＡは僅かであり、発光部１０から発光された光の量は、細胞６０を透過し直進する成分については、培地７０で吸収された光量Ｂを除き実質的に減少しない。しかし、細胞６０は、固有の屈折率を有するので、細胞６０を透過した光は散乱する。散乱した光を受光部３０が受光しないようにすることによって、細胞６０の数が増えるにつれてＳＬが大きくなり、受光部３０が受光する光の量Ｉ１’が減少する。これは、複数の第１スリット９０がある場合には、より精密に検出できる。
つまり、細胞培養の初期において細胞６０が十分に増殖していない場合には、培養容器４０中の細胞６０の数は少ないので、散乱による光の減少は少なく、発光部１０から発光された光は、ほとんど散乱することなく受光部３０に受光される。細胞６０が十分に増殖していれば、培養容器４０中には多数の細胞６０が密集しているので、発光部１０から発光された光の大部分は、細胞６０を透過して散乱し、受光部３０に受光される光の量はわずかである。培養容器４０中において十分に細胞６０が増殖した際に、細胞６０の増殖数に対応する受光部３０が受光する光の量を予め測定して所定量としてメモリ装置等の記憶テーブルに記憶しておき、受光部３０が受光する光の量が所定量以下（所定の増殖数以上）となった場合に、細胞６０が所定数以上に増殖したと判定することができる。なお、所定数は、単位面積当たり、例えば１ｍｍ2当たり、１ｃｍ2当たり等の、細胞の数であってよい。また所定数は、単位体積当たり、例えば１ｍｍ3当たり、１ｃｍ3当たり等の、細胞の数であってよい。例えば、単位面積当たり1000個～100000個程度、単位体積当たり100個～100000個程度とすることができる。
判定部５０は、受光部３０が受光した光が所定量以下であった場合に、細胞６０が所定数以上に増殖したと判定する役割を有する。「所定量」は、予め定められた量であればよく、例えば、培養容器４０の底面一面または第１スリット部材２０の上面一面に細胞６０が増殖した場合に、細胞６０によって散乱されず、受光部３０に受光された光の量によるものであってもよい。「所定数」とは、予め定められた数であればよく、例えば、培養容器４０の底面一面または第１スリット部材２０の上面一面を細胞が密集して覆い、培地交換が必要となる細胞数であってもよい。細胞６０が十分に増殖したか否かは、細胞６０が培養容器４０中で密集し、増殖速度が低下したか否か（細胞６０がコンフルエントに達したか否か）によって判定することができる。
本実施形態の変形例として、受光部３０は、複数の第１スリット９０の数と同じ数だけ備えられ、各受光部３０の幅方向および長さ方向の寸法は、各第１スリット９０の幅方向および長さ方向の寸法と実質的に等しく、各受光部３０は、各第１スリット９０の幅方向および長さ方向において平面視で実質的に同一位置となるように配置され、受光部３０の上面と第１スリット部材２０の底面との間の距離は、５０μｍ～１０００μｍであってもよい。これによって、細胞６０によって散乱した散乱光のうち第１スリット部材２０の第１スリット９０を通過した散乱光が受光部３０に受光されず、受光部３０を通り過ぎるので、受光部３０が散乱光を受光することを確実に防ぐことが可能となる。よって、細胞増殖をさらに正確に検出することが可能となる。複数の受光部３０は、ガラス基板、プラスチック基板等から成る基体８０（図２に記載）の上面に配置されてもよい。
培養容器４０は、例えばシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート等から成る。培養容器４０の形状、大きさ等は特には限定されないが、一般に細胞６０が増殖するのに適切なスペースを１つ以上有するものであればよい。例えば、シャーレであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが数ｍｍ～数ｃｍ程度であり、フラスコであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが５ｃｍ～数１０ｃｍ程度であり、マルチウェルプレートであれば幅または直径が数ｃｍ～数１０ｃｍ程度、高さが０．５ｃｍ～数ｃｍ程度である。培養容器４０は、外部から内部が観察できるように、光学的に透明な材料、例えばプラスチック、ガラス等の材料から成る。またマルチウェルプレートは、一つのウェルの平面視形状が円形、正方形等の四角形、五角形、六角形等の多角形等である。円形は細胞の等法的な増殖に適した形状であり、細胞６０が増殖しやすいという利点がある。六角形はウェルの最密配置に適した形状であり、マルチウェルプレートの小型化に有利である。このように、培養容器４０は細胞６０および培地７０を収容する役割を有する。より具体的には、培養容器４０は、市販されている細胞培養容器を使用することができ、例えば、細胞培養用プレート、細胞培養用フラスコまたは細胞培養用ディッシュであってもよい。これらの細胞培養容器は通常、蓋を備え、透明な樹脂で作製されている。培養容器４０は、培地７０を収容するための円筒型の収容部を複数有することが好ましい。培養容器４０は、細胞６０および培地７０を収容していない状態で細胞検出装置１００に取り付けられており、その後細胞６０および培地７０を供給されてもよく、細胞６０および培地７０を収容した状態で細胞検出装置１００に取り付けられてもよい。培養容器４０は、細胞６０が十分に増殖すれば、細胞検出装置１００から取り外すことができ、細胞６０および培地７０を回収し、洗浄し、滅菌した後、再び細胞検出装置１００に取り付けて使用することもできる。
受光部３０は、第１スリット部材２０の底面より下方であって培養容器４０の直下に配置されてもよい。この場合、細胞６０は、培地７０を含む培養容器４０中で培養され、第１スリット部材２０上面に接着していてもよく、培地７０中に浮遊していてもよい。これによって、受光部３０に、細胞６０および培地７０が付着することを回避することが可能となるので、受光部３０を、洗浄および滅菌することなく繰り返し使用することが可能となる。
第１スリット部材２０および受光部３０は、培養容器４０の直下に配置されてもよい。この場合、細胞６０は、培地７０を含む培養容器４０中で培養され、培養容器４０の底に接着していてもよく、培地７０中に浮遊していてもよい。これによって、第１スリット部材２０および受光部３０に、細胞６０および培地７０が付着することを回避することが可能となるので、複数の培養容器４０について第１スリット部材２０および受光部３０を、洗浄および滅菌することなく繰り返し使用することが可能となる。
第１スリット部材２０および受光部３０は、培養容器４０の底面の直上に配置されてもよい。例えば、受光部３０は、第１スリット部材２０の底面と培養容器４０の底面との間に配置されてもよい。この場合、第１スリット部材２０および受光部３０は、培地７０中に配置されてもよく、細胞６０は、第１スリット部材２０の上面に接着していてもよく、培地７０中に浮遊していてもよい。第１スリット部材２０および受光部３０は、細胞６０および培地７０を洗浄して取り除き、滅菌する手間を省くために使い捨て製品として作製されてもよい。
培地７０は、市販されている細胞培養培地を使用することができ、使用する細胞６０に応じて選択される。培地７０は、例えば、哺乳類細胞を培養する場合にはダルベッコ改変イーグル培地であってもよい。培地７０は、細胞６０を培養するために必要な成分をさらに含んでいてもよく、例えば、ウシ血清アルブミン、成長因子、アミノ酸、抗生物質などを含んでいてもよい。
一般的には、細胞培養では、２日～４日に１回程度の頻度で培地交換または継代する必要がある。細胞６０が培養容器４０中において十分に増殖すれば、細胞６０および培地７０を回収し、培地交換または継代することが可能である。また、回収した細胞６０および培地７０をさらなる後続の実験に使用することも可能である。
本実施形態の変形例として、細胞検出装置１００は、発光部１０と、細胞６０を含む培地７０を収めている培養容器４０と、第１スリット９０を備える第１スリット部材２０と、発光部１０から発光された光のうち培地７０および第１スリット９０を前記の順に通過した光を受光する受光部３０と、を備え、第１スリット部材２０は、発光部１０から発光された光のうち、培養容器４０中の細胞６０によって散乱した散乱光が受光部３０に受光されないように構成されてもよい。
（第２実施形態）
図４は、第２実施形態の細胞検出装置１０１の概略構成を示す図である。本実施形態に係る細胞検出装置１０１は、発光部１１と、第１スリット９１および第１遮光部９６を備える第１スリット部材２１と、発光部１１から発光された光のうち第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した光を受光するように構成された受光部３１と、細胞を培養する培養容器４１とを備える。
図４は、第２実施形態の細胞検出装置１０１の概略構成を示す図である。本実施形態に係る細胞検出装置１０１は、発光部１１と、第１スリット９１および第１遮光部９６を備える第１スリット部材２１と、発光部１１から発光された光のうち第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した光を受光するように構成された受光部３１と、細胞を培養する培養容器４１とを備える。
第１スリット部材２１は、発光部１１から発光された光のうち、培養容器４１中の細胞６１によって散乱した散乱光を第１遮光部９６によって遮光するように構成され、第１スリット部材２１と受光部３１との間に第２スリット部材２２をさらに備え、第２スリット部材２２は、第２スリット９２および第２遮光部９７を備える。
図５は、第２実施形態の細胞検出装置１０１のブロック図である。本実施形態において、発光部１１、第１スリット部材２１、受光部３１、培養容器４１、判定部５１、細胞６１、培地７１、第１スリット９１、および第１遮光部９６は、特に言及されない場合、それぞれ第１実施形態と同様であり、重複する説明は省略する。
第２スリット部材２２は、第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した光のうち細胞６１によって散乱した散乱光を遮光し、受光部３１に受光されないようにする役割を有する。第２スリット部材２２は、第１スリット部材２１と同一の形状を有し、第１スリット部材２１の幅方向および長さ方向に実質的に同一位置となるように配置されてもよい。第１スリット部材２１の第１スリット９１と第２スリット部材２２の第２スリット９２とは、平面視で実質的に重ねられ、発光部１１から発光された光であって細胞６１を透過せずに第１スリット９１を通過した光は、実質的に全て第２スリット９２を通過することが好ましい。これによって、受光部３１が受光する光の量について散乱光による減少幅を大きくすることができるので、さらに正確に細胞６１の増殖を検出することが可能となる。
第１スリット部材２１の底面と第２スリット部材２２の上面とは、散乱光をより効果的に遮光するように、間隔を開けて配置されてもよい。第１スリット部材２１の底面と第２スリット部材２２の上面との間の距離は、好ましくは１～１００μｍである。これによって、第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した散乱光を第２スリット部材２２によって十分に遮光することが可能となるので、第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した散乱光が第２スリット部材２２の第２スリット９２も通過して受光部３１に受光されることを防ぐことが可能となる。
第２スリット９２は、その形状が第１スリット９１と相似形状であり、それらの寸法が同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、第１スリット部材２１の底面と第２スリット部材２２の上面との間の距離（距離D12とする）が短い場合、第２スリット９２の寸法が第１スリット９１の寸法と同じあり、距離D12が長い場合、第２スリット９２の寸法が第１スリット９１の寸法よりも大きい構成であってもよい。これは、距離D12が長くなると、細胞６１による散乱光の拡散する範囲が広がること、距離D12の部位に存在する培地７１による光の吸収が大きくなることから、受光素子の感度が低下する傾向があるからである。例えば、距離D12が１個の細胞６１の大きさ（１０μｍ～５０μｍ程度）と同程度以下である場合、第２スリット９２の寸法と第１スリット９１の寸法とを同じにしてもよく、距離D12が１個の細胞６１の大きさを超える場合、第２スリット９２の寸法を第１スリット９１の寸法よりも大きくしてもよい。この場合、第２スリット９２の開口面積が第１スリット９１の開口面積の１倍を超え２倍程度以下となるようにしてもよい。
第２スリット部材２２の第２遮光部９７は、例えば、ガラス基板、プラスチック基板等の透明な基板の下面（受光部３１側の面）に、第２スリット９２以外の部位にクロム（Ｃｒ）層等の黒色金属層、黒色樹脂層（ブラックマトリックス）等から成る遮光性材料を配置して形成することができる。遮光部９７は、第２スリット部材２２の上面（発光部１１側の面）のうち第２スリット９２以外の部位に遮光性部材を配置して形成されてもよい。
第１スリット部材２１、第２スリット部材２２および受光部３１は、培養容器４１の直下に配置されてもよい。この場合、細胞６１は、培地７１を含む培養容器４１中で培養され、培養容器４１の底に接着していてもよく、培地７１中に浮遊していてもよい。これによって、第１スリット部材２１、第２スリット部材２２および受光部３１に、細胞６１および培地７１が付着することを回避することが可能となるので、複数の培養容器４１について、第１スリット部材２１、第２スリット部材２２および受光部３１を、洗浄し、滅菌することなく繰り返し使用することが可能となる。
受光部３１は、細胞６１を透過せずに第１スリット部材２１の第１スリット９１および第２スリット部材２２の第２スリット９２を通過した光と、細胞６１を透過した後に直進する光とを受光する役割を有する。受光部３１は、例えば、シリコンフォトダイオードなどの受光素子を採用することができる。
受光部３１は、第２スリット部材２２の第２スリット９２の幅方向および長手方向の寸法よりも大きな幅方向および長手方向の寸法を有してもよい。なぜなら、第１スリット部材２１の第１スリット９１を通過した散乱光は、第２スリット部材２２によって十分に遮光されるからである。受光部３１は、複数の受光素子を備えており、例えば、複数の受光素子の配置領域が培養容器４１の底面を覆うように構成されてもよい。また受光部３１は、図２の構成と同様に、ガラス基板、プラスチック基板等から成る基体８１上に複数の受光部３１が配置された構成であってもよい。
受光部３１は、第２スリット部材２２の底面と培養容器４１の底面との間に配置されてもよい。この場合、第１スリット部材２１、第２スリット部材２２および受光部３１は、培地７１中に配置されてもよく、細胞６１は、第１スリット部材２１の上面に接着していてもよく、培地７１中に浮遊していてもよい。第１スリット部材２１、第２スリット部材２２および受光部３１は、細胞６１および培地７１を洗浄して取り除き、滅菌する手間を省くために使い捨て製品として作製されてもよい。
受光部３１は、第２スリット部材２２の底面より下方であって培養容器４１の直下に配置されてもよい。この場合、第１スリット部材２１および第２スリット部材２２は、培地７１中に配置されてもよく、細胞６１は、第１スリット部材２１の上面に接着していてもよく、培地７１中に浮遊していてもよい。これによって、受光部３１に、細胞６１および培地７１が付着することを回避することが可能となるので、受光部３１を、洗浄および滅菌することなく繰り返し使用することが可能となる。第１スリット部材２１、および第２スリット部材２２は、細胞６１および培地７１を洗浄して取り除き、滅菌する手間を省くために使い捨て製品として作製されてもよい。
細胞６１の直下に第１スリット部材２１を配置し、さらにその直下に第２スリット部材２２を配置し、さらにその直下に受光部３１を配置することによって、光の散乱強度を光検出強度の差として検知することが可能となり、これによって細胞６１の有無を検出することが可能となる。
＜検出方法＞
（第３実施形態）
図６は、第３実施形態の細胞検出方法のフローチャートである。本実施形態に係る細胞検出方法は、本発明の細胞検出装置を用いた細胞検出方法であって、培養容器に培地および細胞を供給する供給工程Ａ１と、細胞を培養する培養工程Ａ２と、発光部から発光された光を細胞を含む培地に照射する照射工程Ａ３と、第１スリット部材を通過した光、または第１スリット部材および第２スリット部材を通過した光を、受光部が受光した光の量を取得する取得工程Ａ４とを含む。
（第３実施形態）
図６は、第３実施形態の細胞検出方法のフローチャートである。本実施形態に係る細胞検出方法は、本発明の細胞検出装置を用いた細胞検出方法であって、培養容器に培地および細胞を供給する供給工程Ａ１と、細胞を培養する培養工程Ａ２と、発光部から発光された光を細胞を含む培地に照射する照射工程Ａ３と、第１スリット部材を通過した光、または第１スリット部材および第２スリット部材を通過した光を、受光部が受光した光の量を取得する取得工程Ａ４とを含む。
供給工程Ａ１は、培養容器に培地および細胞を供給する工程である。培地と細胞とは、同時に供給されてもよく、すなわち細胞を混合した培地を培養容器に供給してもよい。また、培地を培養容器に供給した後、細胞を混合した少量の培地をさらに供給してもよい。培地は、細胞の種類に応じて選択することができる。
培養工程Ａ２は、細胞を培養する工程である。培養温度、培養時間、および培養雰囲気などの培養条件は、細胞および培地に応じて選択することができる。
照射工程Ａ３は、発光部から発光された光を培地中の細胞に照射する工程である。照射工程Ａ３は、例えば、細胞および培地の種類および量に応じて予め定められた期間にわたって細胞を培養した後に行われる。
取得工程Ａ４は、受光部が受光した光の量を取得する工程である。細胞が増殖するにつれて、細胞を透過して散乱する光の量が増加するので、受光部が受光する光の量は減少する。
本実施形態において、取得工程Ａ４の後に、受光部が受光した光が所定量以下であった場合に、細胞が所定数以上に増殖したと判定する判定工程Ａ５がさらに含まれてもよい。判定工程Ａ５では、細胞および培地の種類、培養容器に供給される細胞および培地の量、培養容器の種類などに応じて、十分に増殖した細胞に光を照射して受光部が受光する光の量を予め測定しておき、所定量としてもよい。細胞および培養容器の種類などに応じて、培養容器中に細胞が密集し、増殖速度が低下すれば、所定数以上に細胞が増殖したと判定されてもよい。また、判定工程Ａ５は、受光部が受光した光が所定量以下となるタイミングまでに、周期的に、例えば１分毎、１時間毎あるいは１日毎等に、判定動作を繰り返すことができる。
以上、本発明は、例えば、上記実施形態のように、発光部が細胞を含む培地を収めている培養容器の上方にあり、受光部が培養容器を挟んで発光部と対向する下方にあり、第１スリットおよび第１遮光部を備える第１スリット部材が培養容器の中または外にある構成において、発光部と第１スリット部材と受光部の組が複数組あってもよい。また、発光部が細胞を含む培地を収めている培養容器の側方にあり、受光部が培養容器を挟んで発光部と対向する側方にあり、第１スリットおよび第１遮光部を備える第１スリット部材が培養容器の中または外にあってもよい。この構成において、発光部と第１スリット部材と受光部の組が複数組あってもよい。これらの構成を採用することによって、細胞の数をより正確に推定することができる。
以上、本開示の実施形態について詳細に説明したが、また、本開示は上述の実施の形態に限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲内において、種々の変更、改良等が可能である。上記各実施形態をそれぞれ構成する全部または一部を、適宜、矛盾しない範囲で組み合わせ可能であることは、言うまでもない。
１０，１１ 発光部
２０，２１ 第１スリット部材
２２ 第２スリット部材
３０，３１ 受光部
４０，４１ 培養容器
５０，５１ 判定部
６０，６１ 細胞
７０，７１ 培地
８０ 基体
９０，９１ 第１スリット
９２ 第２スリット
９５，９６ 第１遮光部
９７ 第２遮光部
１００，１０１ 細胞検出装置
２０，２１ 第１スリット部材
２２ 第２スリット部材
３０，３１ 受光部
４０，４１ 培養容器
５０，５１ 判定部
６０，６１ 細胞
７０，７１ 培地
８０ 基体
９０，９１ 第１スリット
９２ 第２スリット
９５，９６ 第１遮光部
９７ 第２遮光部
１００，１０１ 細胞検出装置
Claims (19)
- 発光部と、
細胞を含む培地を収めている培養容器と、
第１スリットおよび第１遮光部を備える第１スリット部材と、
前記発光部から発光された光のうち前記培地および前記第１スリットを前記の順に通過した光を受光する受光部と、を備え、
前記第１スリット部材は、前記細胞が前記第１スリットに重なる位置にある場合、前記発光部から発光された光のうち、前記培養容器中の細胞によって散乱した散乱光を前記第１遮光部によって遮光する、細胞検出装置。 - 前記発光部は、前記第１スリット部材を挟んで前記受光部と対向して配置される、請求項１に記載の細胞検出装置。
- 前記第１スリットと前記受光部は平面視で重なる位置に配置されている請求項１または２に記載の細胞検出装置。
- 前記第１スリット部材は、複数の第１スリットを有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部は、前記複数の第１スリットの数と同じ数だけ備えられ、
各受光部の幅方向およびそれに直交する長さ方向の寸法は、各第１スリットの幅方向およびそれに直交する長さ方向の寸法と実質的に等しく、
各受光部は、各第１スリットと平面視で実質的に同一位置で重なるように配置され、
前記受光部の上面と前記第１スリット部材の底面との間の距離は、５０μｍ～１０００μｍである、請求項４に記載の細胞検出装置。 - 前記複数の第１スリットの幅方向の寸法は、細胞の直径よりも小さく、
前記複数の第１スリットの長さ方向の寸法は、細胞の直径よりも大きい、請求項４または５に記載の細胞検出装置。 - 前記複数の第１スリットの幅方向の寸法は、７～２５μｍであり、
前記複数の第１スリットの長さ方向の寸法は、２５～１０００μｍである、請求項４～６のいずれか１項に記載の細胞検出装置。 - 前記第１スリット部材の上面のうち前記第１スリット以外の部位に遮光性部材が配置されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部は、前記第１スリット部材の底面と前記培養容器の底面との間に配置される、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部は、前記第１スリット部材の底面より下方であって前記培養容器の直下に配置される、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記第１スリット部材と前記受光部との間に、第２スリットおよび第２遮光部を備える第２スリット部材をさらに備える、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記第２スリット部材は、前記第１スリット部材と同一の形状を有し、平面視で前記第１スリット部材の幅方向および長さ方向において実質的に同一位置となるように配置され、
前記第１スリット部材の底面と、前記第２スリット部材の上面との間の距離は、１～１００μｍである、請求項１１に記載の細胞検出装置。 - 前記受光部は、前記第２スリット部材の底面と前記培養容器の底面との間に配置される、請求項１１または１２に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部は、前記第２スリット部材の底面より下方であって前記培養容器の直下に配置される、請求項１１または１２に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部が受光した光が所定量以下であった場合に、細胞が所定数以上に増殖したと判定する判定部をさらに備える、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 前記受光部は、フォトダイオードである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞検出装置。
- 発光部と、
細胞を含む培地を収めている培養容器と、
第１スリットを備える第１スリット部材と、
前記発光部から発光された光のうち前記培地および前記第１スリットを前記の順に通過した光を受光する受光部と、を備え、
前記第１スリット部材は、前記発光部から発光された光のうち、前記培養容器中の細胞によって散乱した散乱光が前記受光部に受光されないように構成される、細胞検出装置。 - 請求項１～１８のいずれか１項に記載の細胞検出装置を用いた細胞検出方法であって、
前記培養容器に前記培地および細胞を供給する供給工程と、
細胞を培養する培養工程と、
前記発光部から発光された光を前記細胞を含む前記培地に照射する照射工程と、
前記第１スリット部材を通過し前記受光部が受光した光の量を取得する取得工程と、を含む細胞検出方法。
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-
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