WO2013129681A1 - 細胞集合装置及びこれに用いられるホルダー、細胞の集合方法、生体組織の形成方法、細胞積層シート及びこの製造方法 - Google Patents

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cell
well
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PCT/JP2013/055799
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香村　幸夫
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株式会社古河電工アドバンストエンジニアリング
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes

Definitions

  • the present invention relates to a cell aggregation device and the like for aggregating cells to form a cell sheet.
  • a cell sheet by stacking cells Conventionally, methods of forming a cell sheet by stacking cells have been studied.
  • a cell tissue structure is formed by stacking the cells in a desired shape and thickness. In this case, it is necessary to assemble and stack appropriate cells at high speed.
  • a method of using such a cell sheet there are a monolayer cell sheet, an identical cell laminated sheet, a laminated layered structure sheet of plural cells, etc., and these sheets can be used properly depending on the tissue cells to be used.
  • Patent Document 1 As a method of laminating such cells, a method of disposing the cells at an arbitrary position on the substrate using an inkjet printing technique has been proposed (for example, Patent Document 1).
  • the cell aggregate contains 15 million or more cells.
  • the ink jet system only about 500 cells / second can be taken out under the condition that the nozzle is not clogged. Therefore, when it is going to form the above-mentioned cell assembly by an inkjet system, four or more hours will be required. In addition, when such a long time is required, internal cells may be damaged even during formation of cell aggregates. Furthermore, in the ink jet method, it is impossible to attach a sensor for identifying appropriate cells in a nozzle with an inner diameter of 30 ⁇ m that ejects cells.
  • the present invention has been made in view of such problems, and an object thereof is to provide a cell aggregation device and the like capable of efficiently collecting appropriate cells in a short time.
  • a first invention is a cell aggregation device, comprising: a holder for holding cells, a tissue table provided under the holder, and a laser source capable of irradiating a laser to the holder.
  • the holder includes a transparent plate, a light absorber provided on the lower surface of the transparent plate, and a well plate having a well provided on the lower surface of the light absorber for retaining cells.
  • the heat generated by irradiating the light absorber with the laser from the laser source generates microbubbles in the culture solution in the well, and the pressure of the bubble causes the light on the tissue table or the tissue table.
  • It is a cell assembly apparatus characterized by striking out the cell hold
  • the holder is formed to be curved in at least one cross section with the well on the inner surface side, and the cells are directed in the normal direction of each position toward the center of curvature at each position of the lower surface of the holder having a curved shape. You may launch it.
  • the cell launch position in the normal direction of the curved curved surface of the holder is a substantially focal position corresponding to the curved shape.
  • the shape of the holder is either a substantially cylindrical surface or a part of a substantially spherical shape, and the shape of the holder is a part of a substantially cylindrical surface
  • the cell launch position is set to the curved shape.
  • the corresponding substantially focal position is one linear position
  • the shape of the holder is a part of a substantially spherical shape
  • the cell launch position is one point which is substantially the focal position corresponding to the curved shape.
  • the shape of the holder is either a substantially cylindrical surface or a portion of a substantially spherical shape
  • the tissue table is disposed at a position deviated from a substantially focal position corresponding to the curved shape
  • the shape of the holder is In the case of a part of a substantially cylindrical surface, the cell launch position is a band shape having a predetermined width, and in the case where the shape of the holder is a part of a substantially spherical shape, a circular shape in which the cell launch position extends in a predetermined range It can also be done.
  • the imaging apparatus further includes an imaging device for imaging the cells accommodated in the holder, and a region where the appropriate cells are held by the imaging device is selected, and the laser is irradiated to the selected region.
  • Cells can be bombarded on the tissue table or on the culture bed.
  • a plurality of the holders are disposed at the top of the tissue table.
  • cells can be efficiently aggregated.
  • a plurality of different cells can be aggregated.
  • At least one of the holder and the tissue table may have a drive unit, and at least one of the holder and the tissue table may be relatively moved by the drive unit to eject cells.
  • the microbubbles can cause cells to be bombarded on the tissue table or culture bed.
  • a laser a high frequency pulse laser can be used, and for example, a laser can be irradiated to a desired portion using a galvano mirror or the like. Therefore, by synchronously controlling the operation of the mirror and the irradiation pulse in the laser source, it is possible to take out a desired cell at extremely high speed.
  • a high frequency laser of about 10 kHz to 100 kHz can be used, and even if a 10 kHz laser source is used, it is possible to form the above-mentioned cell aggregate with several tens of minutes. Therefore, the speed is higher than that of the conventional ink jet method, and there is no risk of nozzle clogging or the like.
  • the cell can be stacked in a desired form by causing the holder to be curved and causing the cell to be punched out at a focal position toward the normal direction of the curved shape.
  • cells can be punched out in the normal direction of the curved surface by using a substantially cylindrical surface or a partially spherical holder. Therefore, by arranging the tissue table so as to be at the focal position of the holder curved surface that forms a part of a substantially cylindrical surface, cells arranged on a plane (two-dimensional) can be arranged on a straight line (one-dimensional) It can be punched out in layers.
  • the cells arranged on a plane can be one point (0 dimensions).
  • tens of thousands of cells are contained in a single well plate, and by collecting them in the focal position as necessary, it is possible to repeatedly accumulate a necessary number of cells in a predetermined position.
  • complex tissues including different cells can be formed. Further, as described later, by disposing slightly offset (offset) from the focus position, it becomes possible to stack a plurality of cells in a predetermined range without moving the holder.
  • cells can be punched out linearly or at one point on the tissue table or culture bed without moving the holder or the like. Furthermore, even if the holder is not moved, the cells can be expanded and punched out in a band-like or circular area by stacking them out by shifting them out of the focal position.
  • a laser a high frequency pulse laser can be used, and for example, a galvano mirror or the like can be used to irradiate the desired portion with the laser.
  • the size and operation of the cells can be detected. Therefore, only appropriate cells can be selectively used.
  • tissue table by arranging a plurality of holders on the tissue table, it is possible to punch out a plurality of types of cells on the tissue table.
  • cells can be stacked in a desired form by striking out the cells while relatively moving the holder and the tissue table.
  • a cell assembly characterized in that cells are repeatedly ejected on the tissue table or the culture bed using the cell assembly device according to the first invention. It is a method. According to this cell aggregation method, only appropriate cells can be reliably extracted and aggregated in a short time. For example, the cells can be stacked in any shape in plan view on the tissue table or the culture bed. In particular, if the shape of the holder is a part of either a substantially cylindrical surface or a substantially spherical shape, it is possible to reliably take out only appropriate cells in a short time and assemble them into a straight line or one point.
  • this method it is also possible to directly stack cells on a tissue collected from a living body using the present technology, and furthermore, it is also possible to directly stack cells on a living body.
  • this cell aggregation method it is possible to obtain a method of forming a living tissue formed by accumulating one or more cells.
  • cells are stacked in a substantially circular shape or a polygonal shape in plan view on the tissue table or on the culture bed, thereby culturing the vicinity of the central portion of the substantially circular shape or the polygonal shape of the stacked cells. It can function as a liquid holding unit. Therefore, even when forming a thick cell sheet, the culture solution can be reliably supplied to the cells inside.
  • a culture bed not directly on the tissue table.
  • a temperature responsive culture bed (culture dish), which is a temperature responsive polymer grafted onto a solid surface with a nanometer scale thickness and developed by Professor Okano of Tokyo Women's Medical University, can be used.
  • the culture bed any known culture bed can be used depending on the purpose of use.
  • the culture bed in the present invention includes, in addition to a simple culture bed, an extracellular matrix and the like which is a matrix at the time of preparation of a cell sheet.
  • a third invention is a method of forming a living tissue in which one or more types of cells are accumulated, using the method of collecting cells according to the second invention. According to the third invention, a desired form of living tissue can be easily obtained.
  • a fourth invention uses the cell aggregation device according to the first invention, repeats relative movement and stop of at least one of the holder or the tissue table, and is arranged on the tissue table or on the culture bed.
  • the method is a method for producing a cell-laminated sheet, characterized in that the cells are repeatedly punched out and the cells are laminated to form a cell-laminated sheet. According to the third invention, it is possible to easily obtain a cell laminate sheet of a desired form.
  • 5th invention is the cell lamination sheet formed by the manufacturing method of the cell lamination sheet concerning 4th invention. According to the fifth invention, a cell laminate sheet of a desired form can be obtained.
  • the same cells can be laminated alone or in combination of a plurality of different cells to form various cell sheets.
  • a type of cell sheet formed by lamination a single layer cell sheet in which the same cell is formed in a single layer, an identical cell laminated sheet in which the predetermined number of identical cells are laminated, and a predetermined number of different cells are laminated
  • a heterogenous cell laminate sheet and further a patterned cell laminate sheet in which another cell is patterned and laminated as needed on a specific cell.
  • these can be formed in a short time in desired dimensions required for regenerative medicine and the like.
  • heterogeneous cell laminate sheet for laminating different types of cells include epidermal cells, and a plurality of cells such as cardiomyocytes and intravascular skin cells in the same layer in the same layer.
  • a composite cell laminate sheet or the like can be obtained which is composited and layered.
  • a sixth invention is a holder for use in a cell aggregation device, wherein the holder includes a transparent plate, a light absorber provided on the transparent plate, and a plurality of wells provided on the light absorber.
  • a holder for a cell aggregation device comprising: a well plate; and a cell containing a gel-like member in the well.
  • the holder includes a transparent plate, a light absorber provided on the transparent plate, and a well plate in which a plurality of wells provided on the light absorber are formed, and the culture is performed in the wells
  • a cell aggregation device characterized in that cells are stored together with a liquid, and a gel-like member is attached to the bottom of the well.
  • the holder is formed such that the well is an inner surface side, and a flat surface is curved so as to form a part of a substantially cylindrical surface having a curvature only in one direction, and the cells housed in the well are curved in the well It becomes possible to gather in a straight line corresponding to the approximate focus of the shape.
  • the holder is formed to be curved so as to form a part of a substantially spherical shape with the well on the inner surface side, and the cell accommodated in the well corresponds to the approximate focus of the curved shape of the well 1 It will be possible to collect in places.
  • the sixth invention it is possible to obtain a holder that can be used in a cell collection device for collecting appropriate cells in a short time.
  • a device for collecting cells capable of efficiently collecting appropriate cells in a short time can be provided, and also a method for collecting cells capable of efficiently collecting appropriate cells in a short time using this device Can be provided.
  • a living tissue and a cell laminate sheet necessary for regenerative medicine and the like can be provided.
  • FIG. 10 is an enlarged view of a portion D of the cell aggregation device 10 a and shows a step of punching out cells on the culture bed 16.
  • FIG. 10 is an enlarged view of a portion D of the cell aggregation device 10 a and shows a step of punching out cells on the culture bed 16.
  • the whole schematic which shows the cell assembly apparatus 20a Schematic which shows the cell assembly apparatus 20a. It is the schematic which shows the cell assembly apparatus 20a, and is the sectional view on the AA line of FIG.
  • FIG. Schematic which shows the state which strikes out a cell from the holder 1a.
  • FIG. Schematic which shows other embodiment. Schematic which shows other embodiment. It is a conceptual diagram which shows the aggregation form of the cell 13, (a), (b) is a top view, (c) is the HH sectional view taken on the line of (a).
  • (A) is a conceptual perspective view which shows the cell sheet 35
  • (b) is a conceptual perspective view which shows the cell sheet 35a.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing a cell aggregation device 10a.
  • the cell aggregation device 10a includes a holder 1, a tissue table 15, a culture bed 16, a laser source 17, a mirror 19, an imaging device 21 and the like.
  • the holder 1 is formed by sequentially laminating the transparent plate 9, the well plate 3 and the light absorber 5.
  • the light absorber 5 is disposed on the lower surface side of the transparent plate 9.
  • the well plate 3 is provided on the lower surface side of the light absorber 5.
  • the light absorber 5 has a light transmittance of about 30 to 50% and a film thickness of several tens of nm, and when the laser is irradiated, a part of the laser is absorbed to generate heat.
  • the light absorber 5 for example, thin films or fine particles of titanium oxide, silicon oxide, gold, platinum, tantalum oxide or the like can be used.
  • thin films of silicon oxide, tantalum oxide, gold and the like can be used.
  • by forming a multilayer film of silicon oxide, tantalum oxide or the like visible light is transmitted but the transmittance of laser light of 1000 to 1100 nm is reduced. This allows the imaging device to always observe cells under the light absorber.
  • a transparent plate 9 is provided on the upper surface side of the light absorber 5.
  • the transparent plate 9 holds the light absorber 5 and the well plate 3 and transmits the laser beam from above.
  • quartz glass having a thickness of about 5 mm can be used.
  • the light absorber 5 is formed into a thin film on the transparent plate 9 by vacuum evaporation or the like.
  • the well plate 3 is adhered thereon by an adhesive or the like.
  • FIG. 2 is a plan view showing the well plate 3.
  • the well plate 3 is provided with a large number of wells 7.
  • Well 13 contains cells 13. That is, the well plate 3 functions as a cell holding unit that holds cells.
  • the cell aggregation device 10a shown in FIG. 1 is an example in which one cell is held in each well 7.
  • the size of the well 7 may be slightly larger than that of the cell 13, for example, about 30 ⁇ m ⁇ .
  • the well plate 3 for example, one made of resin, glass or the like can be used.
  • the gel-like member 11 is applied to the lower surface side of the well plate 3 (the opposite side to the light absorber 5).
  • a biocompatible organic acid salt is used as the gel-like member 11.
  • the gel-like member 11 has a certain degree of viscosity (for example, about several hundred to several thousand cps), and the cells 13 in the well 7 do not fall by gravity onto the tissue table 15 or the culture bed 16. It is held in the well 7.
  • the gel-like member 11 may be any one that does not affect the cells 13, and preferably functions also as nutrients for the cells 13.
  • sodium alginate or the like can be used.
  • the calcium ion calcium ion (calcium aqueous solution) is added to the sodium alginate aqueous solution, it can be easily hardened.
  • the viscosity of the aqueous solution of sodium alginate remains low without adding Ca.
  • Ca ions calcium solution
  • cells 13 are filled in the well 7 and the lower surface of the holder 1 is coated with the gel-like member 11 or the gel-like member is stuck. it can.
  • the gel-like member needs to have a viscosity that allows it to be broken at the pressure of the microbubbles.
  • the viscosity of the culture solution can be increased by adding calcium to the aqueous solution of sodium alginate to the culture solution.
  • a gel-like culture solution is preferable because it acts as an impact relaxation agent that cushions an impact when cells are ejected from a well.
  • tissue table 15 is disposed with a gap.
  • a culture bed 16 is provided on the tissue table 15 as needed.
  • Tissue table 15 or culture bed 16 is a site where a cell assembly (cell sheet) is formed.
  • the holder 1 and the tissue table 15 can be moved relative to each other in the horizontal direction by a drive unit (not shown).
  • the tissue table 15 can be made of glass or resin.
  • a surface of the tissue table 15 is coated with, for example, fibrin glue in advance. You may leave it.
  • the well-known culture bed can be selected suitably and used according to the objective, you may use the above-mentioned temperature-responsive culture bed, for example.
  • a laser source 17 and a mirror 19 are provided on the top of the holder 1.
  • a mirror 19 is disposed below the laser source 17.
  • the laser oscillated from the laser source 17 can be irradiated toward an arbitrary well 7 (in the direction of the arrow C in the figure).
  • the laser source 17 for example, a pulsed laser having a wavelength of 1060 to 1100 nm and a frequency of 10 kHz to 100 kHz may be used.
  • the mirror 19 is driven while the laser is not oscillating. In this case, it is possible to oscillate the laser in a target direction of 10,000 to 100,000 per second.
  • the mirror 19 is only required to operate at high speed and with high accuracy.
  • a galvano mirror, a polygon mirror or the like can be used.
  • An imaging device 21 is provided on the top of the holder 1 as necessary.
  • the imaging device 21 measures the property of the cells stored in the well 7 (in the direction of arrow B in the figure).
  • the imaging device 21 for example, cells captured in the inside of the well 7 of the holder 1 are enlarged by about 100 to 1000 times, and the image analysis is performed to measure the shape and the like of the cells.
  • the cells of the appropriate shape are determined from the measurement results, the positions are stored, and the irradiation of the laser source 17 is coordinated and controlled to launch the appropriate cells.
  • measurement of the same cell can be performed several times with time, and the change of the cell at this time can be grasped to measure the activity of whether or not the operation of the cell is active.
  • the imaging device 21 may be disposed at the upper portion of the holder 1 and the mirror may be disposed at the lower portion of the holder 1 outside the contour of the holder 1. By doing this, it is possible to observe the cells 13 under the light absorber 5 from above the holder 1.
  • the imaging device 21 can be disposed at the lower part of the holder 1 outside the outline of the holder 1 and the cells 13 can be observed from the obliquely lower side of the holder 1.
  • the angle correction may be performed according to the position of each well 7, and the size of the well 7 may be image-processed to a predetermined size.
  • the tissue table 15 is formed of a transparent resin or glass and the culture bed 16 is transparent, the imaging device 21 can be disposed below the tissue table 15.
  • FIG. 3A is an enlarged view of a portion D of FIG. 1 and is an enlarged view of the vicinity of the well 7 of the cell aggregation device 10a.
  • characteristics such as the size and operation (activity) of each cell 13 are measured by the imaging device 21, and the cell 13 having a certain degree of appropriateness or more is selected according to the measurement result.
  • a laser is irradiated from the laser source 17 to the well 7 in which the selected cell 13 is placed (in the direction of the arrow C in the figure).
  • the irradiation direction of the laser is adjusted by the mirror 19.
  • the laser transmits the transparent plate 9 and irradiates the light absorber 5.
  • the light absorber 5 absorbs the laser light and generates heat. Therefore, the culture solution 23 in the well 7 is heated by the heat to generate microbubbles (E in the figure).
  • the gel-like member 11 When microbubbles are generated inside the well 7, as shown in FIG. 3 (b), the gel-like member 11 is pierced by the pressure, and the cells 13 (and the culture fluid 23) inside the well 7 are cultured on the tissue table 15. Launch in 16 directions (direction of arrow F in the figure). Thus, cells 13 in any well can be taken out on the tissue table 15.
  • the holder 1 is moved relative to the tissue table 15 (in the direction of arrow G in the figure), whereby cells can be supplied and stacked. Note that this relative movement is performed continuously, and the laser irradiation may be performed while moving the holder 1.
  • the relative movement of the holder 1 corresponds to one pitch of the wells 7, the wells 7 holding the cells 13 are disposed above the cells 13 on the culture bed 16.
  • the well 7 is irradiated with a laser.
  • the cells 13 can be further stacked on the cells 13 taken out on the culture bed 16.
  • the cells 13 can be three-dimensionally stacked in a desired pattern. That is, on the culture bed 16, the cells 13 can be arranged in a flat pattern in an arbitrary pattern by the mirror 19 or the like, and desired cells can be stacked three-dimensionally to form a cell sheet.
  • the culture bed 16 when the culture bed 16 is not used, as shown to Fig.5 (a), you may make the cell 13 strike on the tissue table 15 directly. Also in this case, the holder 1 has the same configuration. Further, as shown in FIG. 5B, the cells 13 can be stacked by striking out the cells 13 while moving the tissue table 15. That is, the cells 13 can be punched out on the culture bed 16 or the tissue table 15 and stacked.
  • only cells having appropriate properties can be selectively taken out on the tissue table 15 or the culture bed 16.
  • appropriate cells can be punched out on the tissue table 15 or the culture bed 16, and the cells 13 can be stacked in a desired form.
  • the cells 13 are bombarded onto the tissue table 15 or the culture bed 16 by the irradiation of the pulse laser, the cells 13 can be taken out by the number corresponding to the frequency of the laser. At this time, extremely fast pattern irradiation is possible by the irradiation frequency of the pulse laser and the rotation control of the mirror 19. Therefore, a desired cell sheet can be formed in a short time. At this time, even if the speed is increased, there is no risk of nozzle clogging or the like.
  • FIG. 6 is a view showing a cell aggregation device 10b according to the second embodiment.
  • components having the same functions as those of the cell aggregation device 10a are denoted by the same reference numerals as those in FIG. 1, and redundant description will be omitted.
  • a cell can also be directly laminated
  • the cell aggregation device 10 b has substantially the same configuration as the cell aggregation device 10 a, but differs in that a plurality of cells 13 are held in the well 7. That is, the size of the well 7 of the holder 1 c in the cell aggregation device 10 b is larger than the size of the well 7 of the holder 1 so that a plurality of cells 13 can be held.
  • the size of the well 7 is, for example, about 100 ⁇ m ⁇ .
  • the number of cells 13 held in the well 7 is not limited to the illustrated example, but may be, for example, about 4 to 10.
  • the cells 13 contained in the well 7 are ejected onto the tissue table 15 or the culture bed 16.
  • multiple cells 13 can be simultaneously placed on the tissue table 15 or culture bed 16.
  • the position of each of the plurality of cells 13 relative to the well 7 is not necessarily constant, the cells 13 can be generally disposed in a desired pattern because the respective cells 13 can be disposed under the well 7 . Also in this case, the cells 13 can be stacked by striking out the cells 13 at the same position.
  • a desired cell sheet can be formed more quickly.
  • FIG. 7 is a view showing a cell aggregation device 10c according to the third embodiment.
  • the cell aggregation device 10c has substantially the same configuration as the cell aggregation device 10a, but differs in that the well plate 3 is not used. That is, the plurality of cells 13 are directly held by the gel-like member 11 on the lower surface of the light absorber 5. Therefore, the cells 13 are dispersed and held substantially uniformly over the entire lower surface of the light absorber 5, not the well 7. That is, the gel-like member 11 functions as a cell holding unit that holds the cells 13.
  • a holder 31 is a stack of the transparent plate 9 and the light absorber 5.
  • the cell aggregation device 10c As in the cell aggregation device 10a, when a desired site is irradiated with laser light from the laser source 17, the light absorber 5 of the site generates heat, and the gel-like member 11 in the corresponding site is generated. A micro bubble occurs. Therefore, due to the pressure of the microbubbles, the cells 13 and the gel-like member 11 in the vicinity are ejected onto the tissue table 15 or the culture bed 16.
  • the cells 13 can be disposed generally under the laser irradiation unit. Therefore, the cells 13 can be arranged in a generally desired pattern. Also in this case, the cells 13 can be stacked by striking out the cells 13 at the same position.
  • a desired cell sheet can be formed at high speed with an extremely simple structure.
  • FIG. 8 is an overall schematic view showing a cell aggregation device 20a according to the fourth embodiment
  • FIG. 9 is a schematic cross sectional view showing the cell aggregation device 20a
  • 10 is a cross-sectional view taken along the line AA of FIG. 9, and is a schematic cross-sectional view in the direction perpendicular to FIG.
  • FIG. 11 is a perspective view showing the holder 1a.
  • the cell aggregation device 20a includes a holder 1a, a tissue table 15, a culture bed 16, a laser source 17, a mirror 19, an imaging device 21 and the like.
  • a cell table 29 moved by a drive mechanism 27 is disposed above the tissue table 15 and the like.
  • the holder 1 a is placed on the cell table 29 by the robot 2.
  • a plurality of holders 1 a can be mounted on the cell table 29. Therefore, below the laser source 17, the holder 1a and the tissue table 15 (culture bed 16) can move horizontally relative to each other (in the direction of arrow G in the figure).
  • the imaging device 21 is disposed on a precision table 30 provided with a window at the center, and images cells in the holder 1 a from the bottom of the precision table 30 through the window by the imaging device 21.
  • the holder 1a placed on the cell table 29 may be imaged, but in this case, since the imaging device 21 is driven, the driving mechanism 27 becomes larger than when the holder 1a is driven. . After measuring the cells in the holder 1a, the robot 2 transfers the cells onto the cell table 29.
  • the holder 1a is formed by sequentially laminating the transparent plate 9, the well plate 3 and the light absorber 5.
  • the laminated structure of the holder 1 a is the same as that of the holder 1.
  • the transparent plate 9 for example, quartz glass or transparent resin having a thickness of about 0.2 mm is used.
  • the holder 1a has a circular-arc-shaped cross-sectional shape (for example, a part of cylindrical surface shape) curved in the at least one cross section.
  • the light absorber 5 may be laminated on the transparent plate 9 and the well plate 3 curved in advance may be laminated on the transparent plate 9 to form the holder 1a. However, for the flat transparent plate 9 etc. After stacking, as shown in FIG. 10, the holder 1a may be formed by curving so that the well 7 side is the inner surface side.
  • Such a well plate 3 is formed, for example, by forming a light absorber 5 (a thin film of several 10 nm to 300 nm in thickness) on a quartz glass substrate having a thickness of about 0.1 to 0.3 mm.
  • a resin well 7 a sheet with a 30 .mu.m hole.
  • the base material may be made of resin and the light absorber 5 may be bonded.
  • the well 7 may be formed by etching on a glass substrate, and the light absorber 5 may be coated thereon (the bottom of the well 7).
  • the holder 1a forms a predetermined number of regions in which 300 wells ⁇ 350 wells 7 are arrayed by arranging the wells 7 with a depth of 30 ⁇ m ⁇ 30 ⁇ m in a range of about 18 mm ⁇ 21 mm at a pitch of 60 ⁇ m. be able to. If such regions are arranged in 12 (3 rows x 4 examples: 12) in a holder 1a of a predetermined size, a well 7 capable of storing about 1,200,000 or more cells can be formed in the holder 1a.
  • each well 7 of the well plate 3 cells 13 are filled with the culture solution.
  • the culture solution for example, a biocompatible organic acid salt is used.
  • the culture solution has a certain degree of viscosity (for example, about several hundred to several thousand cps), and the cells 13 in the well 7 are not dropped by gravity onto the tissue table 15 or the culture bed 16. It can be held within.
  • the culture solution is not particularly limited as long as it does not affect the cells 13, and preferably functions also as nutrients for the cells 13.
  • sodium alginate or the like can be used.
  • the viscosity of the culture solution can be increased by adding calcium to sodium alginate.
  • a gel-like culture solution can be used.
  • the viscosity of the culture solution used here can be set to a predetermined viscosity such that the culture solution does not flow, not only sodium alginate but also a known culture solution can be used. In this case, since the cells are held in the well by the viscosity of the gel-like member, it is not necessary to attach the gel-like member to the bottom of the well.
  • a tissue table 15 is disposed below the holder 1a with a gap.
  • a culture bed 16 is provided on the tissue table 15 as needed.
  • Tissue table 15 or culture bed 16 is a site where a cell assembly (cell sheet) is formed. The distance between the holder 1a and the tissue table 15 (culture floor 16) will be described in detail later.
  • an F ⁇ lens 18, a laser source 17 and a mirror 19 which is a galvano mirror are provided at the top of the holder 1a.
  • a mirror 19 is disposed on the side of the laser source 17.
  • the F ⁇ lens 18 irradiates the laser light whose direction is changed by the mirror 19 substantially perpendicularly to the holder 1 a. That is, the laser beam can be irradiated toward an arbitrary well 7 by the F ⁇ lens 18 and the mirror 19 (direction of arrow C in FIG. 10).
  • a pulsed laser having a wavelength of 1000 to 1100 nm and a frequency of 10 kHz to 100 kHz may be used.
  • the mirror 19 is driven while the laser is not oscillating. In this case, it is possible to oscillate the laser in a target direction of 10,000 to 100,000 per second. By controlling the rotation of the mirror 19 in a desired direction during this pulse, it is possible to irradiate the laser to the well 7 at the desired position rapidly and reliably.
  • the mirror 19 is a control device (not shown) and controlled in the same manner as the laser pulse of the laser source 17. Also, the mirror 19 may be capable of operating at high speed and with high accuracy.
  • FIG. 12 is a conceptual view showing the positional relationship between the holder 1a and the tissue table 15 (culture floor 16).
  • the holder 1a is curved with the tissue table 15 side as the inner surface side.
  • the shape of the holder 1a and the distance between the holder 1a and the tissue table 15 or the like are set such that the focal position 25 in each part of the holder 1a is in the vicinity of the surface of the tissue table 15 (culture floor 16).
  • FIG. 13 is a detailed view of FIG.
  • the laser emitted from the laser source 17 can control the irradiation direction by the mirror 19. Therefore, for example, the laser can be irradiated to each well 7 of the holder 1 a having a curved shape. In the interior of the well 7 irradiated with the laser, as described above, microbubbles are generated. Therefore, the cell 13 is ejected from the well 7 in which the microbubbles are generated toward the focal position in the normal direction of the curved surface of the holder 1a together with the gel-like culture solution holding the cell (in the direction of arrow F in the figure). .
  • the cells 13 of each well 7 of the holder 1a can be gathered at the focal position without moving the holder 1a.
  • the laser can be distributed by the mirror 19 also in a direction perpendicular to the sheet of FIG. 13 (that is, the moving direction of the holder 1a). Therefore, the cells 13 can be stacked. Such irradiation can also be performed while moving the holder 1a.
  • the position of the tissue table 15 can be arranged slightly offset from the focal position with respect to the curved surface of the holder 1a. By doing this, the cells 13 can be punched out in a predetermined range on the tissue table. Therefore, the cells 13 can also be stacked in a band (with the cells 13 in parallel) of a predetermined width.
  • the cells 13 can be three-dimensionally in any form on the tissue table 15 (culture bed 16). Can be stacked. That is, on the culture bed 16, the cells 13 can be arranged in a flat pattern in an arbitrary pattern by the mirror 19 or the like, and desired cells can be stacked three-dimensionally to form a cell sheet.
  • the cells 13 may be directly ejected on the tissue table 15. Also in this case, the holder 1a has the same configuration. Alternatively, the cells 13 can be ejected while moving the tissue table 15.
  • the fourth embodiment only cells of appropriate characteristics can be selectively taken out on the tissue table 15 or the culture bed 16 in an arbitrary form.
  • the cells 13 can be ejected in the focal direction. Therefore, cell stacking is easy.
  • a predetermined amount of cells 13 is stacked in a substantially straight line.
  • the movement of the holder 1a is stopped and the cell 13 is ejected again.
  • the cells 13 can be stacked such that a plurality of the cells 13 stacked linearly are juxtaposed.
  • the cells 13 can be stacked in a desired form by repeating stopping and moving the holder 1a. At this time, since it is not necessary to move the holder 1a continuously at all times, position control between the holder 1a and the tissue table 15 is easy and high speed can be achieved.
  • the cells 13 are bombarded on the tissue table 15 or the culture bed 16 by the irradiation of the pulse laser, the cells 13 can be taken out by the number corresponding to the frequency of the laser. At this time, extremely fast pattern irradiation is possible by the irradiation frequency of the pulse laser and the rotation control of the mirror 19. Therefore, a desired cell sheet can be formed in a short time. At this time, even if the speed is increased, there is no fear of nozzle clogging or the like as in the ink jet method.
  • FIG. 14 is a view showing a cell aggregation device 20b according to the fifth embodiment.
  • a cell can also be laminated
  • the imaging device 21 is omitted.
  • the cell aggregation device 20b has substantially the same configuration as the cell aggregation device 20a, but differs in that a plurality of holders 1a are juxtaposed. That is, the laser source 17 and the imaging device 21 (not shown) are arranged for each of the plurality of holders 1a. In this case, the focal positions 25 of the respective holders 1a may be disposed so as to substantially coincide with each other, or may be slightly deviated.
  • the holders 1a are arranged in two rows, but the present invention is not limited to this. For example, a large number of holders 1a may be arranged. Further, the shape of the holder 1a may not be all the same. Further, the holder 1a may be arranged in different directions without setting the arrangement direction (the bending direction) of the holder 1a to the same direction.
  • FIG. 15 is a view showing a holder 1 b which is still another embodiment.
  • the holder 1 b has a shape that is a part of a substantially spherical shape. That is, the cells in the well are three-dimensionally arranged on a substantially spherical curved surface, but the cells to be ejected are zero-dimensional because they gather at a focal point (or one point).
  • the holder 1a is straight without being curved in one cross sectional direction, and has the largest curved shape with respect to the cross section orthogonal thereto. However, the holder 1b can be used in any cross section. It becomes curved shape.
  • a plurality of wells 7 are formed on the inner surface side of such a holder 1 b. Therefore, by irradiating the laser from above the holder 1 b, the cells 13 can be ejected toward the focal direction of each well 7. Therefore, regardless of the cell position on the holder 1b, the cells 13 are punched out at one point, so that coordinated control of the cell table 29 and the tissue table 15 is facilitated.
  • the position of the tissue table 15 may be arranged slightly offset from the focal position with respect to the curved surface of the holder 1 b. By doing this, the cells 13 can be punched out in a predetermined range on the tissue table 15. Therefore, the cells 13 can be stacked in a substantially circular shape that has spread to a predetermined range.
  • FIG. 16 (a) and 16 (b) are plan views showing an example of the pattern of cells 13 on the tissue table 15, and FIG. 16 (c) is a sectional view taken along the line HH of FIG. 16 (a).
  • FIG. 16 shows an example in which the cells 13 are stacked on the culture bed 16, the cells may be stacked directly on the tissue table 15 as described above.
  • the cells 13 can be arranged in an arbitrary pattern also in the planar direction by using the above-described cell aggregation device. Therefore, as shown in FIG. 16A, the cells 13 can be arranged in a substantially hexagonal shape in a honeycomb shape and stacked. The arrangement of the cells 13 may not be completely arranged on each side of the substantially hexagonal shape as illustrated. Further, the number of cells 13 arranged on each side and the number of stacked layers are not limited to the illustrated example. Further, as shown in FIG. 16 (b), cells can be arranged and stacked in a substantially circular shape. In this case, in FIG. 16 (b), in the portion where the three circular cell arrangements are adjacent to each other, the number of cells is larger than that to which the two circular cell arrangements are adjacent. The cells 13 do not necessarily have to be arranged in a line, and a plurality of cells 13 may be provided side by side.
  • the culture solution holding portion 33 in which the cells 13 are not arranged is formed at the central portion of a substantially hexagonal or circular shape.
  • the culture solution holding unit 33 receives the culture solution of the cells 13. Therefore, when the cells 13 are stacked, the culture solution can be reliably supplied to the cells 13 located in the central portion. Therefore, for example, even with a thick cell sheet having a thickness of several tens to several hundreds of cells, preventing the cells from being damaged without feeding the inner cells is required. it can.
  • FIG. 17 (a) is a view showing a cell sheet 35 formed using the above-described cell aggregation device.
  • the cell sheet 35 is formed by stacking the cells 13.
  • stacking form of the cell 13 is not restricted to the example shown in figure, It can also be set as the structure shown in FIG. According to the present invention, cells 13 can be stacked on the culture bed 16 to obtain a cell sheet 35 of desired size and thickness.
  • a plurality of types of cells 13a and 13b can be stacked to form a cell sheet 35a.
  • the stacking method of the cells 13a and 13b may be changed for each layer as illustrated, but the cells 13a and 13b can be disposed at desired positions even in the same layer.
  • a cell sheet and a living tissue using the same can be obtained by accumulating one or more kinds of cells.

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Abstract

　撮像装置２１によってウェル７内の適正細胞を選択し、その情報に基づいて適正細胞１３が入っているウェル７に対して、レーザ源１７からレーザを照射する。レーザ源１７を用い、透明プレート９の上方からレーザを照射すると、当該レーザは透明プレート９を透過し、光吸収体５に照射される。光吸収体５では、レーザ光が吸収されて熱が発生し、この熱によってウェル７内部の培養液２３が加熱されてマイクロバブルが発生する。ウェル７内部でマイクロバブルが発生すると、その圧力によってウェル７内部の細胞１３（および培養液）がテーブル１５方向に打ち出しする。以上によって任意の場所の細胞１３をテーブル１５または培養床１６上に取り出すことができる。

Description

細胞集合装置及びこれに用いられるホルダー、細胞の集合方法、生体組織の形成方法、細胞積層シート及びこの製造方法
　本発明は、細胞を集合させて細胞シートを作成するための細胞集合装置等に関するものである。
　従来、細胞を積み上げることにより、細胞シートを形成する方法が研究されている。このようにして得られる細胞シートにおいては、細胞を所望の形状と厚みに積み上げることで、例えば細胞組織構造が形成される。この場合、適正細胞を高速で集合・積層させる必要がある。このような細胞シートの利用法としては、単層細胞シート、同一細胞積層化シート、複数細胞の積層層状構造シートなどがあり、使用する組織細胞によりこれらのシートは使い分けられる。
　このような細胞を積層させる方法としては、インクジェット印刷技術を利用して基板上の任意の位置に細胞を配置する方法が提案されている（例えば特許文献１）。
特開２００９－１３１２４０号公報
　しかし、特許文献１に記載されたようなインクジェット方式では、通常、細胞のサイズは一定ではないため、サイズの異なる細胞をノズルから打ち出そうとすると、ノズル詰まりの問題がある。また、インクジェット方式では、このようなノズル詰まりを回避するため、その打出速度には限界があり、細胞の取り出し速度が遅いという問題がある。さらに、この方式では、打ち出し時に適正細胞を見分けることが出来ない問題もある。
　例えば、５ｍｍ角の立方体の大きさの細胞集合体を形成しようとする。この場合、細胞のサイズを２０μｍ角、空隙率を０とすると、上記細胞集合体には、１５００万個以上の細胞が含まれることになる。これに対し、インクジェット方式においては、ノズルが詰まらないような条件では、最大でも５００個／秒程度の細胞しか取り出すことができない。したがって、インクジェット方式で上述の細胞集合体を形成しようとすると、４時間以上の時間を要することとなる。また、このように長時間を要すると、細胞集合体の形成中にも、内部の細胞がダメージを受ける恐れがある。さらに、インクジェット方式では細胞を打ち出す内径３０μｍのノズル内に適正細胞の見分けを行うセンサーを取り付けることは出来ない。
　また、例えば、複数種類の細胞を集合させて所望の立体形状の細胞組織に組み立てる場合には、適正細胞を適正位置に積層するための装置制御がより困難となる。
　本発明はこのような問題に鑑みてなされたもので、短時間で適正細胞を効率良く集合可能な細胞の集合装置等を提供することを目的とする。
　前述した目的を達するために第１の発明は、細胞集合装置であって、細胞を保持するホルダーと、前記ホルダーの下部に設けられる組織テーブルと、前記ホルダーにレーザを照射可能なレーザ源と、を具備し、前記ホルダーは、透明プレートと、前記透明プレートの下面に設けられた光吸収体と、前記光吸収体の下面に設けられ、細胞が保持されるウェルを有するウェルプレートとを有し、前記レーザ源から前記光吸収体にレーザを照射することで生じる熱により、前記ウェル内の培養液にマイクロバブルを発生させ、前記バブルの圧力によって、前記組織テーブルの上、または前記組織テーブルの上に設けられる培養床の上へ、前記ウェル内に保持された細胞を打ち出しすることを特徴とする細胞集合装置である。
　前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、少なくとも一方向の断面において湾曲するように形成され、湾曲形状である前記ホルダーの下面の各位置における曲率中心に向かって各位置の法線方向に細胞を打ち出ししてもよい。
　ここで、前記ホルダーの湾曲した曲面の法線方向における細胞打ち出し位置が、前記湾曲形状に対応する略焦点位置であることが望ましい。また、前記ホルダーの形状が略円柱面状かあるいは略球面状のいずれかの一部であり、前記ホルダーの形状が略円柱面状の一部である場合は、細胞打ち出し位置を前記湾曲形状に対応する略焦点位置である１直線状位置とし、前記ホルダーの形状が略球面状の一部である場合には、細胞打ち出し位置を前記湾曲形状に対応する略焦点位置である１点とすることができる。前記ホルダーの形状が略円柱面状かあるいは略球面状のいずれかの一部であり、前記組織テーブルは、前記湾曲形状に対応する略焦点位置からずれた位置に配置され、前記ホルダーの形状が略円柱面状の一部である場合は、細胞打ち出し位置が所定幅の帯状となり、前記ホルダーの形状が略球面状の一部である場合には、細胞打ち出し位置が所定範囲に広がった円状とすることもできる。
　また、前記ホルダーに収容された細胞を撮像する撮像装置をさらに有し、前記撮像装置によって適正細胞が保持される部位を選定して、選定された部位に対して前記レーザを照射することで、細胞を前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に打ち出させることが可能である。
　また、前記ホルダーが前記組織テーブルの上部に複数配置される。前記ホルダーを前記組織テーブルの上部に複数配置することにより効率的に細胞を集合させることができる。さらに、この時、複数のホルダーに異なる細胞を配置し、それぞれのホルダーから異なる細胞を打ち出すことで、複数の異なる細胞を集合させることができる。
　また、前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方に駆動部を有し、前記駆動部により、前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方を相対的に移動させて、細胞を打ち出ししてもよい。
　第１の発明によれば、レーザを光吸収体に照射することで、当該部位で熱が発生し、これによって培養液にマイクロバブルを発生させることができる。したがって、このマイクロバブルによって、細胞を組織テーブル上または培養床上に打ち出させることができる。このようなレーザとしては、高周波パルスレーザを用い、例えばガルバノミラー等を用いて所望の部位にレーザを照射することができる。このため、ミラーの動作とレーザ源における照射パルスとを同調制御することで、極めて高速に所望の細胞を取り出すことができる。高周波レーザとしては、１０ｋＨｚ～１００ｋＨｚ程度のものが使用でき、仮に１０ｋＨｚのレーザ源を用いたとしても、前述した細胞集合体を数十分で形成可能となる。したがって、従来のインクジェット方式よりも高速である上にノズル詰まり等の恐れもない。
　また、ホルダーが湾曲しており、その湾曲形状の法線方向に向かう焦点位置に細胞を打ち出させることで、細胞を所望の形態で積層することができる。例えば、略円柱面状または略球面状の一部形状をなすホルダーを用いることで、細胞を曲面の法線方向に打ち出すことができる。したがって、略円柱面状の一部をなす形状のホルダー曲面の焦点位置にくるように組織テーブルを配置することで、平面（２次元）上に配置された細胞を、直線（１次元）上に積層するように打ち出すことができる。
　このように、ホルダーに２次元配置された細胞を打出すときに例えば１次元配列に変換することにより、ホルダーと組織テーブルの相対位置制御をしやすくすることができる。例えば、組織テーブルとホルダーとの相対的な移動を停止させた状態においても、組織テーブルの培養床上に細胞を積層させて集合させることができる。したがって、ホルダーの移動を少なくすることができる。その結果、細胞の集積作業を高速化することが可能となる。また、細胞を１直線上に積層する際には、ホルダーの相対移動を停止し、直線状の積層位置を変える場合にのみホルダーを相対動させればよいため、ホルダーを常に移動させることなく、最低限の移動によって細胞シートを形成することができる。
　同様に、略球面状の一部をなす形状の湾曲形状のホルダー曲面の焦点位置にくるように組織テーブルを配置することで、平面（２次元）上に配置された細胞を、一点（０次元）上に積層するように打ち出すこともできる。通常、１枚のウェルプレートには数万個の細胞が含まれることから、これを必要に応じて焦点位置に集めることで、必要な数の細胞を多数所定位置に繰り返して集積することができる。また、このような略球面状の組織を複数用意することで、異なる細胞を含む複雑な組織も形成することができる。また、後述するように、焦点位置から僅かにずらして（オフセットして）配置することで、ホルダーを移動せずに複数の細胞を所定範囲に複数積層することが可能になる。
　このように、本発明では、ホルダー等を移動させなくとも、細胞を組織テーブル上または培養床上に、直線上または１点に打ち出させることができる。さらに、ホルダーを移動させないでも、焦点位置からずらして打ち出すことにより、帯状または円状の領域に拡大して細胞を打ち出し、細胞を積層することができる。なお、レーザとしては、高周波パルスレーザを用い、例えばガルバノミラー等を用いて所望の部位にレーザを照射することができる。
　また、ホルダーに収容された細胞を撮像する撮像装置を用いることで、細胞のサイズや動作を検知することができる。したがって、適正な細胞のみを選択的に使用することができる。
　また、組織テーブル上にホルダーを複数配置することで、複数種類の細胞を組織テーブル上に打ち出すことができる。
　また、ホルダーと組織テーブルとを相対的に移動させながら細胞を打ち出させることで、細胞を所望の形態で積層することもできる。
　第２の発明は、第１の発明にかかる細胞集合装置を用い、前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に細胞を繰り返し打ち出させて、細胞を積層させることを特徴とする細胞の集合方法である。この細胞の集合方法によれば、短時間で確実に適正細胞のみを取り出して集合することができる。たとえば、前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に細胞を平面視において、任意の形状に細胞を積層することができる。特に、前記ホルダーの形状が略円柱面状かあるいは略球面状のいずれかの一部であれば、短時間で確実に適正細胞のみを取り出して一直線状または１点に集合させることができる。また、この方法を用いれば、本技術を用いて生体から採取した組織上に直接細胞を積層することも可能であり、さらには、直接生体に細胞を積層することも可能である。この細胞集合方法を用いれば、１種または２種以上の細胞を集積することにより形成する生体組織の形成方法を得ることができる。
　また、前記組織テーブル上の上、または前記培養床の上に平面視において略円形状または多角形状に細胞を積層させることで、積層された細胞の略円形状または多角形状の中央部近傍を培養液の保持部として機能させることができる。したがって、厚い細胞シートを形成する場合であっても、内部の細胞に対して確実に培養液を供給することができる。
　なお、細胞を積層する際には、前記組織テーブル上に直接積層するのではなく、培養床上に積層することが望ましい。例えば、東京女子医科大学の岡野教授らにより開発された、温度応答性高分子をナノメートルスケールの厚みで固体表面にグラフトした温度応答性培養床（培養皿）を用いることができる。尚、培養床としては公知の培養床であれば、その使用目的に応じていかなるものも用いることができる。ここで、本発明における培養床とは、単なる培養床の他、細胞シート作成時の基材となる細胞外基材などを含むものする。
　第３の発明は、第２の発明にかかる細胞の集合方法を用い、１種または２種以上の細胞を集積する生体組織の形成方法である。第３の発明によれば、所望の形態の生体組織を容易に得ることができる。
　第４の発明は、第１の発明にかかる細胞集合装置を用い、前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方の相対的に移動と停止とを繰り返し、前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に細胞を繰り返し打ち出し、細胞を積層させることで細胞積層シートを形成することを特徴とする細胞積層シートの製造方法である。第３の発明によれば、所望の形態の細胞積層シートを容易に得ることができる。
　第５の発明は、第４の発明にかかる細胞積層シートの製造方法により形成された細胞積層シートである。第５の発明によれば、所望の形態の細胞積層シートを得ることができる。
　このように、細胞を組織テーブルの上に設けられる培養床上に打ち出すことにより、同一細胞を単独で、あるいは複数の異種細胞を組合せて積層して種々の細胞シートを形成することができる。ここで、積層化により形成される細胞シートの種類としては、同一細胞を単層で形成する単層細胞シート、同一細胞を所定層数積層した同一細胞積層シート、異種細胞を所定層数積層化した異種細胞積層シート、さらに特定細胞上に、別の細胞を必要に応じてパターン化して積層したパターン化細胞積層シートなどがある。本発明では、これらを短時間で、再生医療などに必要とする所望の寸法に形成することができる。また、たとえば、異種細胞を積層する異種細胞積層シートの具体例としては、表皮細胞などがあり、また、同一層内で心筋細胞や血管内皮膚細胞などの複数の細胞を同一積層面内にて複合化して積層する複合化細胞積層シートなどを得ることができる。
　第６の発明は、細胞集合装置に用いられるホルダーであって、前記ホルダーは、透明プレートと、前記透明プレート上に設けられる光吸収体と、前記光吸収体上に設けられる複数のウェルが形成されたウェルプレートと、を具備し、前記ウェル内にゲル状部材とともに細胞を収納することを特徴とする細胞集合装置用のホルダーである。
　また、前記ホルダーは、透明プレートと、前記透明プレート上に設けられる光吸収体と、前記光吸収体上に設けられる複数のウェルが形成されたウェルプレートと、を具備し、前記ウェル内に培養液とともに細胞を収納し、前記ウェルの底部にはゲル状部材が貼り付けられることを特徴とする細胞集合装置用のホルダーである。
　前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、平面を一方向にのみ曲率を有する略円柱面状の一部をなすように湾曲させて形成され、前記ウェル内に収納された細胞を前記ウェルの湾曲形状の略焦点に相当する一直線状に集めることが可能となる。また、前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、略球面状の一部をなすように湾曲させて形成され、前記ウェル内に収納された細胞を前記ウェルの湾曲形状の略焦点に相当する１個所に集めることが可能になる。
　第６の発明によれば、適正細胞を短時間で集合するための細胞集合装置に使用可能なホルダーを得ることができる。
　本発明によれば、短時間で適正細胞を効率良く集合可能な細胞の集合装置等を提供するとともに、この装置を用いて、短時間で適正細胞を効率良く集合可能な細胞の集合方法をも提供することができる。その結果、再生医療などに必要な生体組織や細胞積層シートを得ることができる。
細胞集合装置１０ａを示す全体概略図。 プレート３を示す平面図。 細胞集合装置１０ａのＤ部拡大図であり、培養床１６上に細胞を打ち出しする工程を示す図。 細胞集合装置１０ａのＤ部拡大図であり、培養床１６上に細胞を打ち出しする工程を示す図。 組織テーブル上１５に細胞を打ち出しする工程を示す図。 細胞集合装置１０ｂを示す概略図。 細胞収集装置１０ｃを示す概略図。 細胞集合装置２０ａを示す全体概略図。 細胞集合装置２０ａを示す概略図。 細胞集合装置２０ａを示す概略図であり、図９のＡ－Ａ線断面図。 ホルダー１ａを示す斜視図。 ホルダー１ａから細胞を打ち出しする状態を示す概略図。 細胞１３を積層する概念図。 他の実施の形態を示す概略図。 さらに他の実施の形態を示す概略図。 細胞１３の集合形態を示す概念図であり、（ａ）、（ｂ）は平面図、（ｃ）は（ａ）のＨ－Ｈ線断面図。 （ａ）は細胞シート３５を示す概念斜視図、（ｂ）は細胞シート３５ａを示す概念斜視図。
　以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は、細胞集合装置１０ａを示す概略断面図である。細胞集合装置１０ａは、ホルダー１、組織テーブル１５、培養床１６、レーザ源１７、ミラー１９、撮像装置２１等から構成される。
　ホルダー１は、透明プレート９、ウェルプレート３および光吸収体５が順に積層されて形成される。透明プレート９の下面側には、光吸収体５が配置される。また、光吸収体５の下面側には、ウェルプレート３が設けられる。光吸収体５は、光の透過率が３０～５０％程度で膜厚数１０ｎｍであって、レーザを照射するとレーザの一部が吸収されて熱を発生するものである。光吸収体５としては、例えば、酸化チタン、酸化ケイ素、金、白金、酸化タンタル等の薄膜又は微粒子を使用することができる。好ましくは酸化ケイ素、酸化タンタル、金などの薄膜を使用することができる。また、酸化ケイ素、酸化タンタルなどの多層膜を被覆形成することによって、可視光は透過するが１０００～１１００ｎｍのレーザ光の透過率を小さくする。これによって、光吸収体の下にある、細胞の観測を撮像装置が常時行える。
　光吸収体５の上面側には、透明プレート９が設けられる。透明プレート９は、光吸収体５およびウェルプレート３を保持し、上方からのレーザ光を透過するものである。透明プレート９としては、例えば５ｍｍ厚さ程度の石英ガラスを用いることができる。なお、透明プレート９の上に光吸収体５は真空蒸着等によって薄膜形成する。さらに、その上にウェルプレート３を接着剤等によって接着する。
　図２は、ウェルプレート３を示す平面図である。ウェルプレート３には、多数のウェル７が設けられる。ウェル７には細胞１３が入れられる。すなわち、ウェルプレート３は、細胞を保持する細胞保持部として機能する。
　なお、図１に示した細胞集合装置１０ａは、それぞれのウェル７に細胞が一つずつ保持されている例を示すものである。この場合には、ウェル７のサイズは、細胞１３よりもわずかに大きければよく、例えば３０μｍΦ程度であればよい。なお、ウェルプレート３としては、例えば樹脂製やガラス製などのものを使用することができる。
　ウェルプレート３の下面側（光吸収体５とは反対側）には、ゲル状部材１１が塗布される。例えば、ゲル状部材１１は、生体適合性を有する有機酸塩が用いられる。ゲル状部材１１は、ある程度の粘度（例えば数百～数千ｃｐ程度）を有し、ウェル７内の細胞１３が、組織テーブル１５または培養床１６上に重力によって落下しないように、細胞１３をウェル７内に保持するものである。ゲル状部材１１は、細胞１３に対して影響を与えないものであればよく、好ましくは細胞１３の栄養としても機能するものであり、例えばアルギン酸ナトリウム等を用いることができる。ここで、アルギン酸ナトリウム水溶液にＣａイオン（カルシウム水溶液）を加えると容易に硬くすることができる。たとえば、細胞をウェルに入れる時は、Ｃａを加えずにアルギン酸ナトリム水溶液のままの粘度が低い状態とする。ウェル７に細胞を注入後に、Ｃａイオン（カルシウム水溶液）を吹き付けることで、カルシウムのアルギン酸の陰イオン間を繋げる作用（いわゆるイオン架橋）を起こすことができる。したがって、アルギン酸ナトリウムにカルシウムを加えると粘度を高くできる。なお、本発明においては、ホルダー１に対し、細胞１３がウェル７内に充填され、ホルダー１の下面にゲル状部材１１が塗布されたもの、またはゲル状部材が貼り付けられたもの用いることができる。ここで、ゲル状部材を塗布又は貼り付ける場合には、ゲル状部材は、マイクロバブルの圧力で破れる強度とすることが可能な粘度である必要がある。また、後述するように、培養液にアルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムを加えることで、培養液の粘度を高めることができる。このような培養液を使用する場合は、培養液自体で細胞を保持できるため、ホルダー下面への培養液の塗布は不要である。また、アルギン酸ナトリウムを用いた培養液にカルシウムを加えてゲル状にすると、ゲル状の培養液が、細胞がウェルから打ち出されるときの衝撃を和らげる衝撃緩和剤として働くので好ましい。
　ホルダー１の下方には、隙間をあけて組織テーブル１５が配置される。組織テーブル１５上には必要に応じて培養床１６が設けられる。組織テーブル１５または培養床１６は細胞集合体（細胞シート）が形成される部位である。ここで、ホルダー１および組織テーブル１５は、図示を省略する駆動部によって、互いに相対的に水平方向に移動が可能である。組織テーブル１５としては、ガラス製や樹脂製のものを使用することができる。なお、組織テーブル１５または培養床１６上に細胞１３を集合させた後、形成された細胞シート等を組織テーブル１５から剥離するためには、組織テーブル１５の表面に、例えばフィブリン糊等を予めコーティングしておいてもよい。また、培養床を用いる場合には、その目的に応じて公知の培養床を適宜選択して用いることができるが、例えば、前述の温度応答性培養床を用いても良い。
　ホルダー１の上部には、レーザ源１７およびミラー１９が設けられる。レーザ源１７の下部にはミラー１９が配置される。ミラー１９を動作することで、レーザ源１７から発振されるレーザを、任意のウェル７に向けて照射することができる（図中矢印Ｃ方向）。レーザ源１７としては例えば波長が１０６０～１１００ｎｍであり、周波数が１０ｋＨｚ～１００ｋＨｚのパルスレーザを用いればよい。ミラー１９は、レーザが発振されていない間に駆動される。この場合には、１秒間に１万～１０万の対象方向にレーザを発振することが可能である。このパルスの間にミラーを所望の方向に回転駆動制御することによって、高速かつ確実に所望の位置のウェル７にレーザを照射することができる。なお、ミラー１９は、図示を省略した制御装置で、レーザ源１７のレーザパルスと同様に制御される。
　なお、ミラー１９は、高速かつ精度良く動作可能であればよく、例えば、ガルバノミラーやポリゴンミラー等を使用することができる。
　ホルダー１の上部には、必要に応じて撮像装置２１が設けられる。撮像装置２１は、ウェル７に収められる細胞の性状を計測するものである（図中矢印Ｂ方向）。撮像装置２１としては、例えば、ホルダー１のウェル７内部に収められた細胞を１００～１０００倍程度に拡大撮影し、その画像解析を行い細胞の形状等を計測するものである。計測結果から適正形状の細胞を判断し、その位置を記憶してレーザ源１７の照射を協調制御することによって、適正細胞を打ち出しする。さらに、同一細胞の計測を、時間をおいて複数回行い、この際の細胞の変化を把握して、細胞の動作が活発であるかどうかの活動度を計測することもできる。
　また、撮像装置２１をホルダー１上部に配置し、ホルダー１輪郭よりも外側のホルダー１下部にミラーを配置してもよい。このようにすることで、ホルダー１の上方から、光吸収体５の下にある細胞１３の観測を行うことができる。また、撮像装置２１をホルダー１輪郭よりも外側のホルダー１下部に配置して、ホルダー１の斜め下側から細胞１３を観測することもできる。特に、これらの場合には、各ウェル７位置に応じて角度補正を行って、ウェル７の大きさを所定サイズに画像処理により行うこともできる。また、組織テーブル１５が透明な樹脂やガラスで形成され、培養床１６が透明な場合には、組織テーブル１５の下側に撮像装置２１を配置することもできる。
　次に、細胞集合装置１０ａを用いて細胞を収集する方法について説明する。図３（ａ）は、図１のＤ部拡大図であり、細胞集合装置１０ａのウェル７近傍の拡大図である。まず、撮像装置２１により各細胞１３の大きさや動作（活発度）などの性状を測定し、計測結果により、一定以上の適正度の細胞１３を選択する。
　次に、選択された細胞１３が入れられるウェル７に対して、レーザ源１７からレーザを照射する（図中矢印Ｃ方向）。なお、レーザの照射方向はミラー１９によって調整される。レーザ源１７を用い、透明プレート９の上方からレーザを照射すると（図中矢印Ｃ方向）、当該レーザは透明プレート９を透過し、光吸収体５を照射する。光吸収体５では、レーザ光が吸収されて熱が発生する。したがって、この熱によってウェル７内部の培養液２３が加熱されてマイクロバブルが発生する（図中Ｅ）。
　ウェル７内部でマイクロバブルが発生すると、図３（ｂ）に示すように、その圧力によってゲル状部材１１を突き破り、ウェル７内部の細胞１３（および培養液２３）が組織テーブル１５上の培養床１６方向に打ち出しする（図中矢印Ｆ方向）。以上によって任意のウェルの細胞１３を組織テーブル１５上に取り出すことができる。
　次に、図４（ａ）に示すように、ホルダー１が組織テーブル１５に対して相対的に移動する（図中矢印Ｇ方向）ことによって、細胞が供給されて積層することができる。なお、この相対的な移動は、連続して行われ、レーザの照射は、ホルダー１を移動させながら行えばよい。ホルダー１の相対的な移動が、ウェル７の１ピッチ分となると、培養床１６上の細胞１３の上方には、細胞１３が保持されたウェル７が配置される。当該ウェル７に充填されている細胞１３が適正細胞である場合には、このウェル７に対してレーザが照射される。
　このようにすることで、図４（ｂ）に示すように、培養床１６上に取り出された細胞１３上にさらに細胞１３を積み上げることができる。以上を繰り返すことで、細胞１３を所望のパターンで３次元的に積み上げることができる。すなわち、培養床１６上には、ミラー１９等によって平面状に任意のパターンで細胞１３を配置することができるとともに、３次元的に所望の細胞を積み上げて細胞シートを形成することができる。
　なお、培養床１６を用いない場合には、図５（ａ）に示すように、細胞１３を直接組織テーブル１５上に打ち出させてもよい。この場合にも、ホルダー１は同様の構成である。また、図５（ｂ）に示すように、組織テーブル１５を移動させながら細胞１３を打ち出させることで、細胞１３を積層させることができる。すなわち、細胞１３を、培養床１６または組織テーブル１５上に打ち出して、積層することができる。
　以上、第１の実施形態によれば、適切な性状の細胞のみを選択的に組織テーブル１５上または培養床１６に取り出すことができる。この際、ホルダー１を連続的に移動しながら細胞を供給することによって組織テーブル１５または培養床１６上に適正細胞を打ち出しし、細胞１３を所望の形態に積み上げることが可能である。
　また、細胞１３は、パルスレーザの照射によって組織テーブル１５または培養床１６上に打ち出されるため、当該レーザの周波数に対応する数だけ、細胞１３を取り出すことができる。この際、パルスレーザの照射頻度及びミラー１９の回転制御によって、極めて高速なパターン照射が可能である。したがって、短時間で所望の細胞シートを形成することができる。この際、速度を上げても、ノズル詰まり等の恐れがない。
　次に、第２の実施形態について説明する。図６は第２の実施の形態にかかる細胞集合装置１０ｂを示す図である。なお、以下の説明において、細胞集合装置１０ａと同一の機能を奏する構成には、図１と同様の符号を付し、重複する説明を省略する。なお、図６では、培養床１６を設けた例を示すが、前述のように、細胞を直接組織テーブル１５上に積層することもできる。
　細胞集合装置１０ｂは、細胞集合装置１０ａと略同様の構成であるが、ウェル７に複数の細胞１３が保持される点で異なる。すなわち、複数の細胞１３が保持可能なように、細胞集合装置１０ｂにおけるホルダー１ｃのウェル７は、ホルダー１におけるウェル７の大きさよりもが大きい。ウェル７の大きさは、例えば１００μｍΦ程度である。なお、ウェル７に保持される細胞１３の個数は、図示した例に限られないが、例えば４～１０個程度とすることができる。
　細胞集合装置１０ｂでは、一つのウェル７にレーザを照射すると、当該ウェル７に入っていた細胞１３が、全て組織テーブル１５または培養床１６上に打ち出しする。したがって、複数の細胞１３を同時に組織テーブル１５または培養床１６上に配置することができる。なお、ウェル７に対する複数の細胞１３のそれぞれの位置は、必ずしも一定にはならないが、概ねウェル７の下部にそれぞれの細胞１３を配置できるため、概ね所望のパターンで細胞１３を配置することができる。なお、この場合にも、同一位置で細胞１３を打ち出しすることで、細胞１３を積み上げることが可能である。
　細胞集合装置１０ｂによれば、一度のレーザ照射によって複数の細胞１３を取り出すことができるため、より高速に、所望の細胞シートを形成することができる。
　次に、第３の実施形態について説明する。図７は第３の実施の形態にかかる細胞集合装置１０ｃを示す図である。細胞集合装置１０ｃは、細胞集合装置１０ａと略同様の構成であるが、ウェルプレート３が用いられない点で異なる。すなわち、複数の細胞１３は、光吸収体５の下面にゲル状部材１１によって直接保持される。したがって、細胞１３はウェル７ではなく、光吸収体５の下面全体に略均一に分散して保持される。すなわち、ゲル状部材１１が、細胞１３を保持する細胞保持部として機能する。この場合、透明プレート９と光吸収体５が積層されたものをホルダー３１とする。
　細胞集合装置１０ｃでも、細胞集合装置１０ａと同様に、レーザ源１７から所望の部位にレーザを照射すると、当該部位の光吸収体５が熱を発生し、対応する部位のゲル状部材１１内部にマイクロバブルが発生する。したがって、マイクロバブルの圧力によって、近傍の細胞１３およびゲル状部材１１が組織テーブル１５または培養床１６に打ち出す。
　なお、細胞集合装置１０ｃでは、一度のレーザ照射によって、打ち出しする細胞１３の個数およびそれぞれの位置は、必ずしも一定にはならないが、概ねレーザ照射部の下部に細胞１３を配置できる。このため、概ね所望のパターンで細胞１３を配置することができる。なお、この場合にも、同一位置で細胞１３を打ち出しすることで、細胞１３を積み上げることが可能である。
　細胞集合装置１０ｃによれば、極めて簡易な構造によって、高速に、所望の細胞シートを形成することができる。
　次に、第４の実施形態について説明する。図８は第４の実施の形態にかかる細胞集合装置２０ａを示す全体概略図、図９は、細胞集合装置２０ａを示す概略断面図である。また、図１０は、図９のＡ－Ａ線断面図であり、図９に対して垂直な方向の概略断面図である。また、図１１は、ホルダー１ａを示す斜視図である。細胞集合装置２０ａは、ホルダー１ａ、組織テーブル１５、培養床１６、レーザ源１７、ミラー１９、撮像装置２１等から構成される。
　図８に示すように、組織テーブル１５等の上方には、駆動機構２７によって移動する細胞テーブル２９が配置される。撮像装置２１によって、予め細胞の性状が撮像された後、ロボット２によって、ホルダー１ａが細胞テーブル２９上に配置される。細胞テーブル２９上には、複数のホルダー１ａを載置可能である。したがって、レーザ源１７の下方において、ホルダー１ａおよび組織テーブル１５（培養床１６）は、互いに相対的に水平方向に移動が可能である（図中矢印Ｇ方向）。なお、撮像装置２１は、中央に窓が設けられた精密台３０上に配置され、精密台３０の下から前記窓を通してホルダー１ａ内の細胞を撮像装置２１で撮像する。この際、細胞テーブル２９上に載置されたホルダー１ａに対して撮像してもよいが、この場合は撮像装置２１を駆動するので、ホルダー１ａを駆動する場合に比べて駆動機構２７が大きくなる。ホルダー１ａ内の細胞を計測後はロボット２により、細胞テーブル２９上に移し換える。
　図９に示すように、ホルダー１ａは、透明プレート９、ウェルプレート３および光吸収体５が順に積層されて形成される。ホルダー１ａの積層構造等は、ホルダー１と同様である。なお、透明プレート９としては、例えば０.２ｍｍ厚さ程度の石英ガラスや透明樹脂を用いる。
　図１０、図１１に示すように、ホルダー１ａは、少なくとも一方の断面において湾曲した円弧状の断面形状（例えば円柱面状の一部）を有する。
　なお、透明プレート９に光吸収体５を積層させ、これにあらかじめ湾曲させたウェルプレート３を積層させてホルダー１ａを形成してもよいが、平坦な透明プレート９等に対し、ウェルプレート３を積層させた後に、図１０に示すようにウェル７側を内面側とするように湾曲させてホルダー１ａを形成してもよい。
　このようなウェルプレート３は、例えば、厚さ０．１～０．３ｍｍ程度の石英ガラス製の基材上に光吸収体５（厚さ数１０ｎｍ～３００ｎｍの薄膜）を形成し、さらにその上に樹脂製のウェル７（３０μｍの穴のあいたシート）を接着して形成することができる。また、基材を樹脂製とし、光吸収体５を接着することもできる。また、ガラス基材に対して、ウェル７をエッチングにより形成し、その上（ウェル７の底面）に光吸収体５を被覆することもできる。
　なお、ウェルプレート３としては、例えば樹脂製やガラス製などのものを使用することができる。例えば、ホルダー１ａは、約１８ｍｍ×２１ｍｍの範囲に、深さ３０μｍ×３０μｍΦのウェル７を、６０μｍピッチで縦横に配列させるとして、３００個×３５０個のウェル７を配列した領域を所定個数形成することができる。このような領域を所定サイズのホルダー１ａに１２個（３行×４例：１２個）に並べれば、約１，２００，０００個以上の細胞を収納できるウェル７をホルダー１ａに形成できる。
　ウェルプレート３のそれぞれのウェル７には、細胞１３が培養液とともに充填される。培養液は、例えば生体適合性を有する有機酸塩が用いられる。培養液は、ある程度の粘度（例えば数百～数千ｃｐ程度）を有し、ウェル７内の細胞１３が、組織テーブル１５または培養床１６上に重力によって落下しないように、細胞１３をウェル７内に保持することができる。
　培養液は、細胞１３に対して影響を与えないものであればよく、好ましくは細胞１３の栄養としても機能するものであり、例えばアルギン酸ナトリウム等を用いることができる。ここで、前述したように、アルギン酸ナトリウムにカルシウムを加えると培養液の粘度を高くできる。このように、ゲル状の培養液を用いることができる。また、ここで使用する培養液の粘度を、培養液が流れださないような所定粘度とすることができれば、アルギン酸ナトリウムに限らず公知の培養液を用いることができる。この場合、ゲル状部材の粘性により、細胞がウェル内に保持されることから、ウェル下面にゲル状部材を貼り付ける必要がない。
　ホルダー１ａの下方には、隙間をあけて組織テーブル１５が配置される。組織テーブル１５上には必要に応じて培養床１６が設けられる。組織テーブル１５または培養床１６は細胞集合体（細胞シート）が形成される部位である。なお、ホルダー１ａと組織テーブル１５（培養床１６）との距離については、詳細を後述する。
　ホルダー１ａの上部には、Ｆθレンズ１８、レーザ源１７およびガルバノミラーであるミラー１９が設けられる。レーザ源１７の側方にはミラー１９が配置される。ミラー１９を動作することで、レーザ源１７から発振されるレーザを、任意の方向に照射することができる。Ｆθレンズ１８は、ミラー１９によって方向が変えられたレーザ光を、ホルダー１ａに対して略垂直に照射するものである。すなわち、Ｆθレンズ１８およびミラー１９によって、任意のウェル７に向けてレーザ光を照射することができる（図１０矢印Ｃ方向）。レーザ源１７としては例えば波長が１０００～１１００ｎｍであり、周波数が１０ｋＨｚ～１００ｋＨｚのパルスレーザを用いればよい。ミラー１９は、レーザが発振されていない間に駆動される。この場合には、１秒間に１万～１０万の対象方向にレーザを発振することが可能である。このパルスの間にミラー１９を所望の方向に回転駆動制御することによって、高速かつ確実に所望の位置のウェル７にレーザを照射することができる。
　なお、ミラー１９は、図示を省略した制御装置で、レーザ源１７のレーザパルスと同様に制御される。また、ミラー１９は、高速かつ精度良く動作可能であればよい。
　図１２は、ホルダー１ａと組織テーブル１５（培養床１６）との位置関係を示す概念図である。前述したように、ホルダー１ａは、組織テーブル１５側を内面側として湾曲している。この際、ホルダー１ａの各部における焦点位置２５が、組織テーブル１５（培養床１６）表面近傍となるように、ホルダー１ａの形状およびホルダー１ａと組織テーブル１５等との距離が設定される。
　次に、細胞１３を積層する工程について説明する。図１３は、図１２の詳細図である。前述の通り、レーザ源１７から照射されたレーザは、ミラー１９によって、照射方向を制御することができる。したがって、例えば、湾曲形状のホルダー１ａの各ウェル７に対して、レーザを照射することができる。レーザが照射されたウェル７の内部においては、前述したように、マイクロバブルが発生する。したがって、マイクロバブルが生じたウェル７から、ホルダー１ａの曲面の法線方向の焦点位置に向かって、細胞を保持していたゲル状の培養液とともに細胞１３が打ち出される（図中矢印Ｆ方向）。
　このようにすることで、ホルダー１ａの各ウェル７の細胞１３を、ホルダー１ａを移動させることなく焦点位置に集合することができる。例えば、ホルダー１ａ等を移動させずに、図１３の紙面に垂直な方向（すなわちホルダー１ａの移動方向）に対しても、ミラー１９によってレーザを振り分けることもできる。したがって、細胞１３を積層することができる。なお、このような照射は、ホルダー１ａを移動させながら行うこともできる。
　なお、ホルダー１ａの曲面に対して、組織テーブル１５の位置をあえて焦点位置と僅かにずらして配置することもできる。このようにすることで、組織テーブル上の所定範囲に細胞１３を打ち出すことができる。したがって、所定の幅の（細胞１３が並列した）帯状に細胞１３を積層することもできる。
　さらに、ホルダー１ａの形状や、ホルダー１ａと組織テーブル１５（培養床１６）との距離などを適宜設定することで、組織テーブル１５（培養床１６）上に任意の形態で３次元的に細胞１３を積層することができる。すなわち、培養床１６上には、ミラー１９等によって平面状に任意のパターンで細胞１３を配置することができるとともに、３次元的に所望の細胞を積み上げて細胞シートを形成することができる。
　なお、培養床１６を用いない場合には、細胞１３を直接組織テーブル１５上に直接打ち出させてもよい。この場合にも、ホルダー１ａは同様の構成である。また、組織テーブル１５を移動させながら細胞１３を打ち出させることもできる。
　以上、第４の実施形態によれば、適切な性状の細胞のみを選択的に組織テーブル１５上または培養床１６に任意の形態で取り出すことができる。また、ホルダー１ａが湾曲しているため、焦点方向に向けて細胞１３を打ち出すことができる。したがって、細胞の積層が容易である。
　この際、ホルダー１ａを連続的に移動しながら組織テーブル１５または培養床１６上に適正細胞を打ち出し、細胞１３を所望の形態に積み上げることが可能であるが、本実施形態では、ホルダーを停止させた状態でも、細胞１３を積層させることができる。
　例えば、まず、ホルダー１ａと組織テーブル１５の相対移動を停止した状態で、略一直線状に細胞１３を所定量積層する。次いで、細胞１３のサイズ分だけ左右にホルダーを相対移動させた後に、ホルダー１ａの移動を停止して再度細胞１３を打ち出す。以上により、直線状に積層された細胞１３が複数併設されるように、細胞１３を積層することができる。
　このように、ホルダー１ａの停止と移動とを繰り返すことで、細胞１３を所望の形態に積層させることができる。この際、ホルダー１ａを常に連続して移動させる必要がないため、ホルダー１ａと組織テーブル１５との位置制御が容易であるとともに、高速化が可能となる。
　また、細胞１３が、パルスレーザの照射によって組織テーブル１５または培養床１６上に打ち出されるため、当該レーザの周波数に対応する数だけ、細胞１３を取り出すことができる。この際、パルスレーザの照射頻度及びミラー１９の回転制御によって、極めて高速なパターン照射が可能である。したがって、短時間で所望の細胞シートを形成することができる。この際、速度を上げても、インクジェット方式のようなノズル詰まり等の恐れがない。
　次に、第５の実施形態について説明する。図１４は第５の実施の形態にかかる細胞集合装置２０ｂを示す図である。なお、図１４では、培養床１６を設けた例を示すが、前述のように、細胞を直接組織テーブル１５上に積層することもできる。また、以下の図において、撮像装置２１は図示を省略する。
　細胞集合装置２０ｂは、細胞集合装置２０ａと略同様の構成であるが、複数のホルダー１ａが併設される点で異なる。すなわち、複数のホルダー１ａのそれぞれに対して、レーザ源１７および撮像装置２１（図示省略）が配置される。この場合、それぞれのホルダー１ａの焦点位置２５が略一致するように配置してもよく、多少ずれていてもよい。
　このようにすることで、それぞれのホルダー１ａに異なる細胞を保持することもできる。したがって、異なる細胞１３を任意の形態で積層することもできる。なお、図示した例では、ホルダー１ａを２列配置したが、本発明はこれに限られない。例えば、ホルダー１ａをさらに多数枚配置してもよい。また、ホルダー１ａの形状は、全て同一でなくてもよい。また、ホルダー１ａの配置方向（湾曲方向）を同一方向とせず、異なる向きにホルダー１ａを配置してもよい。
　次に、第６の実施形態について説明する。図１５は、さらに異なる実施形態であるホルダー１ｂを示す図である。ホルダー１ｂは、略球面状の一部をなす形状である。すなわち、ウェル内の細胞は略球面状の曲面上に３次元的に配置されているが、打ち出される細胞は焦点（又は一点）に集まるので０次元となる。ホルダー１ａは、一方の断面方向に対しては湾曲せずに直線状であり、これと直交する断面に対して、最も大きな湾曲形状であったが、ホルダー１ｂは、いずれの断面に対しても湾曲形状となる。
　このようなホルダー１ｂの内面側には、複数のウェル７が形成される。したがって、ホルダー１ｂ上からレーザを照射することで、各ウェル７の焦点方向に向けて、細胞１３を打ち出させることができる。したがって、ホルダー１ｂ上の細胞位置に関係なく、細胞１３が一点に打ち出されるので、細胞テーブル２９と組織テーブル１５の協調制御が容易となる。
　なお、ホルダー１ｂの曲面に対して、組織テーブル１５の位置をあえて焦点位置と僅かにずらして配置することもできる。このようにすることで、組織テーブル１５上の所定範囲に細胞１３を打ち出すことができる。したがって、所定範囲に広がった略円状に細胞１３を積層することもできる。
　次に、上述した細胞集合装置を用いて組織テーブル１５または培養床１６上に形成した細胞１３のパターンの一例について説明する。図１６（ａ）、図１６（ｂ）は、組織テーブル１５上における細胞１３のパターンの一例を示す平面図、図１６（ｃ）は図１６（ａ）のＨ－Ｈ線断面図である。なお、図１６は、細胞１３を培養床１６上に積層した例を示すが、前述のように、細胞を直接組織テーブル１５上に積層することもできる。
　本発明では、上述の細胞集合装置を用いることで、平面方向にも任意のパターンで細胞１３を配置することができる。したがって、図１６（ａ）に示したように、細胞１３をハニカム形状に略六角形に配置し、積層することができる。なお、細胞１３の配置は、図示したように、略六角形の各辺上に完全に配置されなくてもよい。また、各辺に配置される細胞１３の個数や、積層数は図示した例に限られない。また、図１６（ｂ）に示したように、略円状に細胞を配置し、積層することができる。この場合、図１６（ｂ）では、３つの円状の細胞配置が隣接する部分は、２つの円状の細胞の配置が隣接する部分よりも、細胞の数が多く配置されている。なお、細胞１３は、必ずしも一列に並ぶ必要はなく、複数個の細胞１３が併設してもよい。
　細胞１３を多角形または円形に配置することで、例えば略六角形や円形の中央部に、細胞１３が配置されない培養液保持部３３が形成される。培養液保持部３３には、細胞１３の培養液が入れられる。したがって、細胞１３を積層した際に、中央部に位置する細胞１３にも、確実に培養液を供給することができる。したがって、例えば、数十～数百個の細胞が積層するような厚さの厚い細胞シートであっても、内部の細胞に栄養がいきわたらずに、細胞がダメージを受けることを防止することができる。
　図１７（ａ）は、上述の細胞集合装置を用いて形成した細胞シート３５を示す図である。細胞シート３５は、細胞１３が積層されて形成される。なお、細胞１３の積層形態は、図示した例には限られず、図１７に示した構造とすることもできる。本発明によれば、細胞１３を培養床１６上に積層し、所望の大きさ、厚みの細胞シート３５を得ることができる。
　また、図１７（ｂ）に示すように、複数種類の細胞１３ａ、１３ｂを積層して細胞シート３５ａを形成することもできる。なお、細胞１３ａ、１３ｂの積層方法は、図示したように、層ごとに変えても良いが、同一層内においても、細胞１３ａ、１３ｂを所望の位置に配置することもできる。
　このように、１種または２種以上の細胞を集積することにより、細胞シートやこれを用いた生体組織を得ることができる。
　以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
１、１ａ、１ｂ、１ｃ、３１………ホルダー
２………ロボット
３………ウェルプレート
５………光吸収体
７………ウェル
９………透明プレート
１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、２０ａ、２０ｂ………細胞集合装置
１１………ゲル状部材
１３………細胞
１５………組織テーブル
１６………培養床
１７………レーザ源
１８………Ｆθレンズ
１９………ミラー
２１………撮像装置
２３………培養液
２５………焦点位置
２７………駆動機構
２９………細胞テーブル
３０………精密台
３３………培養液保持部
３５、３５ａ………細胞シート
 

Claims (17)

  1. 　細胞集合装置であって、
    　細胞を保持するホルダーと、
    　前記ホルダーの下部に設けられる組織テーブルと、
    　前記ホルダーにレーザを照射可能なレーザ源と、
    　を具備し、
    　前記ホルダーは、透明プレートと、前記透明プレートの下面に設けられた光吸収体と、前記光吸収体の下面に設けられ、細胞が保持されるウェルを有するウェルプレートとを有し、
    　前記レーザ源から前記光吸収体にレーザを照射することで生じる熱により、前記ウェル内の培養液にマイクロバブルを発生させ、前記マイクロバブルの圧力によって、前記組織テーブルの上、または前記組織テーブルの上に設けられる培養床の上へ、前記ウェル内に保持された細胞を打ち出すことを特徴とする細胞集合装置。
  2. 　前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、少なくとも一方向の断面において湾曲するように形成され、湾曲形状である前記ホルダーの下面の各位置における曲率中心に向かって各位置の法線方向に細胞を打ち出すことを特徴とする請求項１記載の細胞集合装置。
  3. 　前記ホルダーの湾曲した曲面の法線方向における細胞打ち出し位置が、前記湾曲形状に対応する略焦点位置であることを特徴とする請求項２に記載の細胞集合装置。
  4. 　前記ホルダーの形状が略円柱面状かあるいは略球面状のいずれかの一部であり、前記ホルダーの形状が略円柱面状の一部である場合は、細胞打ち出し位置が前記湾曲形状に対応する略焦点位置である１直線状位置をなし、前記ホルダーの形状が略球面状の一部である場合には、細胞打ち出し位置が前記湾曲形状に対応する略焦点位置である１点であることを特徴とする請求項２に記載の細胞集合装置。
  5. 　前記ホルダーの形状が略円柱面状かあるいは略球面状のいずれかの一部であり、
    　前記組織テーブルは、前記湾曲形状に対応する略焦点位置からずれた位置に配置され、
    　前記ホルダーの形状が略円柱面状の一部である場合は、細胞打ち出し位置が所定幅の帯状となり、前記ホルダーの形状が略球面状の一部である場合には、細胞打ち出し位置が所定範囲に広がった略円状となることを特徴とする請求項２に記載の細胞集合装置。
  6. 　前記ホルダーに収容された細胞を撮像する撮像装置をさらに有し、
    　前記撮像装置によって適正細胞が保持される部位を選定して、選定された部位に対して前記レーザを照射することで、細胞を前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に打ち出すことを特徴とする請求項１記載の細胞集合装置。
  7. 　前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方に駆動部を有し、前記駆動部により、前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方を相対的に移動させて、細胞を打ち出すことを特徴とする請求項１記載の細胞集合装置。
  8. 　前記ホルダーが前記組織テーブルの上部に複数配置されることを特徴とする請求項１記載の細胞集合装置。
  9. 　請求項１から請求項８のいずれかに記載の細胞集合装置を用い、前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に細胞を繰り返し打ち出させて、細胞を積層させることを特徴とする細胞の集合方法。
  10. 　前記組織テーブル上の上、または前記培養床の上に平面視において略円形状または略多角形状に細胞を積層させ、積層された細胞の略円形状または略多角形状の中央部近傍を培養液の保持部とすることを特徴とする請求項９記載の細胞の集合方法。
  11. 　請求項９記載の細胞の集合方法を用い、１種または２種以上の細胞を集積する生体組織の形成方法。
  12. 　請求項１から請求項８のいずれかに記載の細胞集合装置を用い、
    　前記ホルダーまたは前記組織テーブルの少なくとも一方の相対的な移動と停止とを繰り返し、前記組織テーブルの上、または前記培養床の上に細胞を繰り返し打ち出し、細胞を積層させることで細胞積層シートを形成することを特徴とする細胞積層シートの製造方法。
  13. 　請求項１２に記載の細胞積層シートの製造方法により形成されたことを特徴とする細胞積層シート。
  14. 　細胞集合装置に用いられるホルダーであって、前記ホルダーは、
    　透明プレートと、
    　前記透明プレート上に設けられる光吸収体と、
    　前記光吸収体上に設けられる複数のウェルが形成されたウェルプレートと、
    　を具備し、前記ウェル内にゲル状部材とともに細胞を収納することを特徴とする細胞集合装置用のホルダー。
  15. 　細胞集合装置に用いられるホルダーであって、前記ホルダーは、
    　透明プレートと、
    　前記透明プレート上に設けられる光吸収体と、
    　前記光吸収体上に設けられる複数のウェルが形成されたウェルプレートと、
    　を具備し、前記ウェル内に培養液とともに細胞を収納し、前記ウェルの底部にはゲル状部材が貼り付けられることを特徴とする細胞集合装置用のホルダー。
  16. 　前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、平面を一方向にのみ曲率を有する略円柱面状の一部をなすように湾曲させて形成され、前記ウェル内に収納された細胞を前記ウェルの湾曲形状の略焦点に相当する一直線状に集めることを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載の細胞集合装置用のホルダー。
  17. 　前記ホルダーは、前記ウェルを内面側として、略球面状の一部をなすように湾曲させて形成され、前記ウェル内に収納された細胞を前記ウェルの湾曲形状の略焦点に相当する１個所に集めることを特徴とする請求項１４または請求項１５に記載の細胞集合装置用のホルダー。
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