JP7335634B2 - 二重特異性タンパク質およびその製造方法 - Google Patents
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Description
第一は、所望しない重鎖の結合の生成が挙げられる。相異なるエピトープを有する2つの抗体からそれぞれ起源する重鎖(AおよびB)間の結合がランダムに行われる場合、2つの同一起源の重鎖間の結合(AAおよびBB)と1つの異種起源の重鎖間の結合(ABまたはBA)が形成される。二重特異性抗体を製造するにあたり、同一起源の重鎖間の結合は、所望しない不純物になって、二重特異性抗体の純度を低下させ、これを除去する工程が伴わなければならないので、抗体の分離精製に困難を誘発し、所望しない免疫反応または信号伝達を引き起こして副作用を誘発するなどの不利な効果につながることがある。したがって、純粋に異種起源の重鎖間の結合だけを形成しながら、同一起源の重鎖間の結合が形成されなかったり、少なくとも相当水準以下でのみ形成されるようにする技術が必要である。
(1)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異;
(2)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異;および
(3)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換された変異。
前記第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対が、次の1つ以上の変異によって変異された変異CH3ドメインまたは前記変異CH3ドメインを含む変異Fc領域を含む、互いに異なる2種の標的を標的化する二重特異性タンパク質を提供する:
(1)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異;
(2)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸が互いに交換された変異;および
(3)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸に置換された変異。
第1CH1ドメインおよび第1CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸に置換;および
第2CH1ドメインおよび第2CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
第1CH1ドメインおよび第1CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のうち第1CH1ドメインに位置するアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第1アミノ酸対のうち第1CLドメインに位置するアミノ酸は、前記第1CH1ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
第2CH1ドメインおよび第2CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のうち第2CH1ドメインに位置するアミノ酸は、前記第1CH1ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、負電荷を有するアミノ酸に置換され、
前記第2アミノ酸対のうち第2CLドメインに位置するアミノ酸は、前記第2CH1ドメインに置換されたアミノ酸と相異なる電荷を有する、つまり、正電荷を有するアミノ酸に置換されたものであってもよい。
(1)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異;
(2)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異;および
(3)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸(例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に置換され、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸)に置換された変異。
(1)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換;
(2)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸を互いに交換;および
(3)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸(例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に置換。
第1エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第1CH1ドメインおよび第1CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換;および
第2エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第2CH1ドメインおよび第2CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
(1)第1エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第1CH3ドメインと第2エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換;
(2)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸を互いに交換;および
(3)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のそれぞれのアミノ酸対をなす2つのアミノ酸のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸(例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸)に置換。
(1)第1エピトープを認識する重鎖由来の第1CH3ドメインと第2エピトープを認識する重鎖由来の第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換;
(2)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のアミノ酸を互いに交換;および
(3)第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸(例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸)に置換。
第1エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第1CH1ドメインおよび第1CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換;および
第2エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第2CH1ドメインおよび第2CLドメイン間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換。
互いに異なる標的化ドメインと連結(融合)されたFc保存領域(CH3ドメイン)にアミノ酸変異を導入させることによって、互いに異なる標的化ドメインと連結されたFc保存領域間の結合率を高めて異種二量体形成率を増加させ、同一の標的化ドメインと連結されたFc間に結合した同種二量体形成率を減少させたり;および/または
互いに異なる標的化ドメインと連結されたFab保存領域にアミノ酸変異を導入させることによって、同一の標的化ドメインと連結されたFab保存領域間の結合力を高めて同一の標的化ドメインおよびこれと連結されたFab保存領域間の二量体形成率を増加させ、
互いに異なる標的化ドメインを有する二重特異性タンパク質の生成率を増進させる技術を提供する。
(1)CH1ドメイン(配列番号1)は、1番目のアミノ酸(Ala)を118番目の位置にして一連番号でナンバリングされ(つまり、配列番号1のCH1ドメインの108個のアミノ酸は、IgG1の118番目から215番目までの位置に相当する);
(2)CH3ドメイン(配列番号15)は、1番目のアミノ酸(Lys)を340番目の位置にして一連番号でナンバリングされる(つまり、配列番号15のCH3ドメインの108個アミノ酸は、IgG1の340番目から447番目までの位置に相当する(以上、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html参照)。
ヒトカッパ不変領域(タンパク質:GenBank Accession No.AAA58989.1遺伝子:GenBank Accession No.J00241.1)のCLドメイン(配列番号10)は、1番目のアミノ酸(Val)を110番目の位置にして一連番号でナンバリングされ(つまり、配列番号10のCLドメインの105個のアミノ酸は、110番目から214番目までの位置に相当する;http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html参照);
ヒトラムダ不変領域(配列番号11(Lambda1)、配列番号12(Lambda2)、配列番号13(Lambda3)、および配列番号14(Lambda7))では、1番目のアミノ酸(Lys)を110番目の位置にして一連番号でナンバリングされる(ただし、ラムダ不変領域の場合、一連番号から169、201および202番目が脱落する;つまり、配列番号11または配列番号12のCLドメインの103個のアミノ酸は、110番目から168番目、170番目から200番目、および203番目から215番目までの位置に相当する;http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGLCnber.html参照)。本明細書におけるCLドメインのアミノ酸位置およびこれに相当するアミノ酸種類は、ヒトカッパ不変領域を基準として記載する。
145番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);
183番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);
147番目の位置のリシンをアルギニンに置換;
170番目の位置のフェニルアラニンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);
171番目の位置のプロリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);および
185番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、アルギニンに置換)。
145番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、グルタミン酸に置換);
147番目の位置のリシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換);
183番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、グルタミン酸に置換);
185番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換);
170番目の位置のフェニルアラニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換);および
171番目の位置のプロリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換)。
131番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);
133番目の位置のバリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);
135番目の位置のロイシンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、アルギニンに置換);
162番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、リシンに置換);および
180番目の位置のトレオニンをリシンまたはアルギニンに置換(例えば、アルギニンに置換)。
131番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、グルタミン酸に置換);
133番目の位置のバリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、グルタミン酸に置換);
135番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換);
162番目の位置のセリンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換);および
180番目の位置のトレオニンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換(例えば、アスパラギン酸に置換)。
(1)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対(2つのアミノ酸のうち1つ以上は疎水性アミノ酸でない)のうちいずれか1つのアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他の1つのアミノ酸は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異(以下、「静電的相互作用導入変異」);
(2)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のアミノ酸が互いに交換された変異(以下、「スワッピング変異」);および
(3)CH3ドメイン間の1つ以上のアミノ酸対のうちいずれか1つのアミノ酸は大きさの大きいアミノ酸(例えば、トリプトファン、フェニルアラニンなどといった大きさの大きい疎水性アミノ酸)に置換され、他の1つのアミノ酸は大きさの小さいアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン、バリンなどといった大きさの小さい疎水性アミノ酸)に置換された変異(以下、「サイズ変異」)。
より具体的には、
(1)静電的相互作用導入変異(表2および図2にてCharge(J)で表示);
(2)スワッピング変異(表2および図2にてSwap(O)で表示);および
(3)サイズ変異(表2および図2にてSize(B)で表示)
のうちいずれか1つ以上が導入される第1CH3ドメインと第2CH3ドメインとの間のアミノ酸対は、下記の表2および図2に提示されたIgG1のCH3ドメイン(配列番号15)間のアミノ酸対、およびこれに対応する位置のIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、およびIgMのCH3ドメイン(順次に、配列番号16~23)間のアミノ酸対からなる群より選択された1つ以上、例えば、1つ、2つ以上(例えば、2つ)、3つ以上(例えば、3つ)、または4つ以上(例えば、4つ)であってもよい:
前記表2に記載の変異位置は、IgG1を基準として表示されたが、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、およびIgMのCH3ドメインのこれに対応する位置にも適用される)
本明細書に使用されたものであって、例えば、「Q347」は、配列番号15のヒトIgG1のCH3ドメインの347番目のアミノ酸位置のグルタミンを意味し、これは、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、およびIgMのCH3ドメイン(順次に、配列番号16~23)におけるこれに対応する位置のアミノ酸残基にも適用される(以下、同一である)。
364番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、368番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
394番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、394番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
357番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、370番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
357番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、349番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
366番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、407番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
394番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、397番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換;および
349番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、357番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。
364番目の位置のセリンをリシンに、370番目の位置のリシンをセリンに置換;
405番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、409番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換;
407番目の位置のチロシンをトレオニンに、366番目の位置のトレオニンをチロシンに置換;
357番目の位置のグルタミン酸をリシンに、370番目の位置のリシンをグルタミン酸に置換;および
357番目の位置のグルタミン酸をチロシンに、349番目の位置のチロシンをセリンに置換。
409番目の位置のリシンをトリプトファンに、407番目の位置のチロシンをアラニンに置換;および
409番目の位置のリシンをトリプトファンに、405番目の位置のフェニルアラニンをアラニンに置換。
(a)364番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、368番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
(b)364番目の位置のセリンをリシンに、370番目の位置のリシンをセリンに置換;および
(c)405番目の位置のフェニルアラニンをリシンに、409番目の位置のリシンをフェニルアラニンに置換。
364番目の位置のセリンのリシンへの置換と368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換;
364番目の位置のセリンのリシンへの置換と370番目の位置のリシンのセリンへの置換;
405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換;
405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換;
405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換と409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換;および
405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換と409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換。
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;または
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換。
1.ターゲットとなる遺伝子を発現ベクター(pcDNA3(Invitrogen;図)にクローニングした。
2つのFc領域(CH3ドメイン;配列番号15)(IgG1基準)の異種二量体化(heterodimerization)のための突然変異位置は図2に示した。静電的相互作用による関連突然変異(静電的相互作用導入変異)のために39個の位置が選定され(「Charge J」で表示)、スワッピングによる関連突然変異(スワッピング変異)のために14個の位置が選定され(「Swap O」で表示)、サイズによる関連突然変異(サイズ変異)のために40個の位置が選定された(「Size B」で表示)。最終的に選定されたCH3ドメインの位置および突然変異したアミノ酸を表3に示した。各突然変異対を互いに異なる抗体に由来する2つのFc領域(それぞれA鎖とB鎖で表現)に適用してクローニングして共同-発現した。静電気相互作用による関連突然変異の場合は、A鎖の当該アミノ酸を正電荷を含むアミノ酸を代表してK(リシン)に、B鎖の場合には、負電荷を含むアミノ酸を代表してD(アスパラギン酸)に変えた。スワッピングによる関連突然変異の場合には、A鎖とB鎖のアミノ酸を互いに置き換えた。サイズによる関連突然変異の場合には、A鎖はW(トリプトファン)に、B鎖はサイズの小さいA(アラニン)に変えた。
Fc-融合タンパク質において同種二量体(homodimer)と異種二量体(heterodimer)をSDS-PAGEにより容易に区別するために、pcDNA3vector(図26参照;Invitrogen)をバックボーンとして用いて、一方の鎖(鎖A:Enbrel)にはTNF-アルファ受容体(TNFRSF1B:NP_001057.1(暗号化遺伝子:NM_001066.2のCDS;配列番号24))の細胞外ドメイン(配列番号24の1-771部位の暗号化配列)をFc(暗号化遺伝子:配列番号26)に融合させ、他方(鎖B:Fas)にはFas受容体(NP_000034.1(暗号化遺伝子:NM_000043.5のCDS;配列番号25))の細胞外ドメイン(配列番号25の1-519部位の暗号化配列)をFc(暗号化遺伝子:配列番号26)に融合させた。A鎖のモノマーは53kDであり、B鎖のモノマーは約44kDである。前記Fc-細胞外ドメインが融合されている鎖AとBのサイズが相異なるため、SDS-PAGEで2つの同型結合(AAおよびBB)および異種結合(AB)が容易に区別される。
前記表4~6中、異種二量体(heterodimer)形成率(%;SAB)が70%を超える突然変異を太い文字で表した。前記表4~6から確認されるように、試験された突然変異対は60%以上の異種二量体形成率を示した。
それぞれのキー突然変異が起こる位置のアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、先に説明したような単一変異による異種二量体化(heterodimerization)効果を試験して、前記位置から異種二量体化に効果が良い突然変異の種類を確認した。S364において、K(リシン)に置換される場合、異種二量体化効果が最も良く現れ、N(アスパラギン)とR(アルギニン)に置換された場合にも、異種二量体化効果が優れていた(図6B参照)。F405においては、KとRに置換される場合、類似する程度の優れた異種二量体化効果を示し、NとQ(グルタミン)に置換される場合にも、優れた異種二量体化効果を示した(図6C参照)。
<実施例2>単一突然変異によるFc領域の異種二量体化試験
前記実施例1で選択された3つのkey-lock突然変異対であるS364K-L368D、S364K-K370S、およびF405K-K409Fと、key突然変異位置のF405をKの代わりにRに変異させたF405RK409F突然変異対の異種二量体化効果をSDS-PAGE上で測定して、すでに知られた異種二量体Fc突然変異対の対照群KiH、CPC、およびAzSの結果と比較した。
前記Tmは次の方法で測定した:
Reagent:Invitrogen4461146「Protein Thermal ShiftTM」Dye Kit
Instrument:Chromo4-PTC200(MJ Research)
Reaction mixture:20μl in total
Protein 10μl
DW 3μl
Protein Thermal ShiftTM Buffer 5μl
1/100 diluted Protein Thermal ShiftTM Dye 2μl
Protocol:
1.Incubate at 50.0℃ for 30sec;
2.Melting Curve from 50.0℃ to 90.0℃、read every 0.2℃、hold for 2sec;
3.Incubate at 90.0℃ for 2min
4.Incubate at 10.0℃ forever
5.End
表10および図7のように、A鎖とB鎖をそれぞれ単一発現した場合、キー(key)が入っているA鎖は同種二量体(homodimer)をほとんど形成せずモノマーで発現し、共同-発現した試料からも、同種二量体(homodimer)はほとんどなく異種二量体(heterodimer)としてのみ存在することが確認された(図7参照)。
キー突然変異がA、B鎖のうち一方にのみ存在することより両方ともに存在する場合、同種二量体(homodimer)化の可能性を低下させることから、実施例1で選択された3つの突然変異対を組み合わせて2つの二重突然変異対を得て、それぞれの対でF405をKとRの2種類に作って計4種類の二重突然変異対を得た。これら4つの二重突然変異対の異種二量体化効果をSDS-PAGE上で測定して、対照群KiH、CPC、AzSの結果と比較した。
表11および図8のように、4つの突然変異対とも、両鎖に入っているキー突然変異によって単一発現した場合、同種二量体(homodimer)が別に形成されず、共同-発現した試料から、ほぼすべてのタンパク質が異種二量体(heterodimer)としてのみ発現することが確認された(図8参照)。また、F405KよりF405Rが導入された二重突然変異対がより高い熱的安定性を示した(表11)。
抗体の重鎖と軽鎖の突然変異を選択するために、静電的相互作用関連する突然変異、サイズ関連突然変異、スワッピング関連突然変異を行った。重鎖と軽鎖における相互作用の位置を図10に示した。
4D9と2B9の両抗体の重鎖不変領域はIgG1の不変領域を、軽鎖不変領域はカッパ不変領域をそれぞれ使用した。
まず、4D9と2B9を用いて、すでに効果的と報告されている従来の重鎖と軽鎖との間の突然変異対をクローニングして共同-発現して、変異させた2つの重鎖と1つの軽鎖のcompetitionにより形成されたペアリング様相をSDS-PAGEで確認した(Competitive Pairing(CPP) Assay)。前記Competitive Pairing(CPP) Assay過程を図11に模式的に示し、得られた結果を図12に示した。図12のように、すでに報告されたすべての突然変異対が正常なペア(pair)と異常ペア(mispair)のように起こることが確認された。
4D9(A鎖)および2B9(B鎖)抗体を用いた突然変異対のリストのうち、SDS-PAGE上で比較した結果、比較的正確にペアリングが起こる突然変異対のいくつかを発見することができた(表15で太い文字で表示)。これに対する追加の研究をするために、前記30番目の突然変異(c30Φf30で表示)を表16のように変形した。
30番目の突然変異は重鎖のL145と軽鎖のV133をそれぞれKとDに変えたものであり、前記表16のように、重鎖のL145と軽鎖のV133をRとDに変えた変形形態の場合も効果(ペアリング精度:AaペアまたはBbペア比率)が良かった(図14参照(Aaペアリング精度75%、Bbペアリング精度:60%))。
図14および図15から確認されるように、重鎖のL145と軽鎖のV133をそれぞれKとDに変えた30番目の突然変異だけでなく、重鎖のL145と軽鎖のV133をそれぞれRとDに置換した場合と、重鎖のL145をRまたはEに、軽鎖のS131およびV133をそれぞれKとR、またはDとEに置換した場合もペアリング精度に優れていた。
先に説明した29番目の突然変異、30番目の突然変異、および48番目の突然変異を組み合わせた突然変異対(c29c30c48FФ29f30f48)またはその変形突然変異対を含む抗体を作製し(表19参照)、これらのペアリング精度を試験して、その結果を図18に示した(図18にて、下側バンドがAaペアを、上側バンドがBbペアを示す):
また、先に説明した29番目の突然変異、30番目の突然変異、および48番目の突然変異のうち1つ以上を組み合わせた変形突然変異対(表20参照)を含む抗体についてペアリング精度を測定して、図19に示した(図19にて、下側バンドがAaペアを、上側バンドがBbペアを示す):
また、先に説明した29番目の突然変異、30番目の突然変異、および48番目の突然変異の組み合わせにおいて、DとEを互いに変えながら比較的に正確なペアリングを可能にする組み合わせを得た(表21および図20)。
前記表21と図20に示されるように、試験された突然変異対ab、gh、およびabghとも65%以上または95%以上のペアリング精度を示した。このうちabghを選択して、これをc’29c’30c48Фf’29f’30f’48突然変異対と名付けた。
また、表15の34番目の突然変異対と51番目の突然変異対においてKをRに、DをEに置換してペアリング程度を試験して、ペアリング精度が改善された組み合わせを探した。その組み合わせは、軽鎖のL135とT180をそれぞれEに変えた突然変異対で、これをc34Фf51突然変異対と名付けた(表23および図22参照)。
<実施例5>重鎖間および重鎖および軽鎖間の結合による二重抗体形成
5.1.c’29c’30c48Фf’29f’30f’48突然変異対が導入された二重抗体
5.1.1.4D9/2B9抗体を用いた重鎖および軽鎖間の結合試験
前記試験されたc’29c’30c48Фf’29f’30f’48突然変異対を含む重鎖と軽鎖を結合して抗体を作製した(表25参照):
前記二重抗体のA鎖、B鎖、a鎖およびb鎖のペアリング精度を確認するために、それぞれ重鎖と軽鎖を正常ペアおよび異常ペアの形態に可能なすべての組み合わせで共同-発現した後、発現程度をSDS-PAGEで確認した結果を下記の表26に示し、熱的安定性(Tm)を測定して、その結果を表27および図25に示した:
熱的安定性(Tm)は、実施例2に記載の方法を参照して測定した。
Trastuzumab(HerceptinR;Roche)、Bevacizumab(AvastinTM;Roche)、およびAdalimumab(HumiraR;Abbvie)を購入してアミノ酸配列をシーケンシングし(基礎科学支援センター(KBSI);韓国)、これに相当するcDNAを合成し、これを用いて下記の表28の組み合わせでc’29c’30c48Фf’29f’30f’48突然変異対と実施例3で選択されたCH3ドメインのAWBB突然変異対が導入された二重抗体を作製した(pcDNA3 vector(図26参照)使用)。
前記得られた二重抗体TrabevとAdabevについて、次の条件でHydrophobic Interaction Chromatography(HIC)を行って、その結果を図27(y軸:Value(mAU)、x軸:時間(min))にそれぞれ示した:
装備:HPLC-U3000
カラム:MAbPac Hic-20
Flow rate:0.2mL/min
Detection:UV、280nm
Mobile Phase:0.10M Ammonium acetate、pH7.0
前記得られたタンパク質をHIC Columnに通過させると、タンパク質の疎水性程度に応じて互いに異なる時間帯にピークが生成され、これにより二重抗体がよく作られたかを確認できる。図27に示されているように、2つの同種二量体抗体(TrastuzumabとBevacizumabまたはAdalimumabとBevacizumab)のピークのうち、異種二量体の二重抗体(TrabevとAdabev)のピークが明確に観察される。これは、それぞれの抗体のhalf antibodyで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
装備:HPLC-U3000
カラム:Size-exclusion chromatography T SKgel G3000SWXL Tosoh Bioscience
Flow rate:1.0mL/min
Detection:UV、280nm
Mobile Phase:25mM Tris-HCl(pH8.5、150mM NaCl
前記SEC分析においてタンパク質の大きさに応じてpeakが出ており、タンパク質間の凝集状態などが分かる。表29、図28および図29に示されるように、二重抗体のピークが2つの単一抗体ピークの中間時間帯に位置することを確認できる。これは、二重抗体がよく生成されていることを意味する。
Reagent
Detection antibody:goat anti-human kappa-HRP(southern biotech、2060-05)
TMB single solution(LIFE TECHNOLOGY、002023)
Instrument
Emax precision microplate reader(Molecular devices)
Protocol
Coating buffer:Carbonate buffer pH9.6
Blocking buffer:protein-free(TBS) blocking buffer(Thermo scientific)
Wash buffer:0.05%(w/v) Tween20 in TBS、pH7.4(TBST)
Diluent:0.05%(w/v) Tween20 in TBS、pH7.4
Stop buffer:1N Hydrochloric acid solution(HCl)
過程
Coating:antigenをcoating bufferに希釈して、wellあたり100ulずつloading、4℃ overnight incubation(Her2、VEGF:50ng/well、TNF-alpha:100ng/well);
Washing 3times with washing buffer;
Blocking:blocking buffer300ul分注、incubation at room temperature(RT) for 1hour;
Washing 3times with washing buffer;
Binding:antibodies 100ng/wellでloading、incubation RT 1hr;
Washing 3times with washing buffer;
Detection Antibody:goat anti-human kappa-HRPをTBSTに1:4000で稀釈、incubation RT 1hr;
Washing 3times with washing buffer
Detection:TMB solution 100ulずつloading、incubation RT 3min in the dark;
Stop solution:1N HCl 100ulずつloading;
Reading:optical density 450nmで測定
前記得られた結果を表30と図31(以上、Trabevに関する結果)、および表31と図32(以上、Adabevに関する結果)にそれぞれ示した:
表29および図31に示されるように、二重抗体Trabevは、Trastuzumabの抗原であるHer2と、Bevacizumabの抗原であるVEGFともに結合することが確認され、表30および図32に示されるように、二重抗体Adabevも、Adalimumabの抗原であるTNF-alphaとBevacizumabの抗原であるVEGFともに結合することが確認された。このような結果は、意図した機能を正常に発揮する2つの二重抗体が生成に成功したことを改めて確認させるものである。
実施例5.1.1を参照して、4D9(Aa)と2B9(Bb)にc34Фf51突然変異対(表23参照)が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖aとbと共に発現させて、SDS-PAGE上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し(重鎖AおよびBに対してそれぞれ実施する)、実施例2を参照してTmを測定して、その結果を下記の表32および図34に示した。
表33と図35および表34と図36に示されるように、2つの同種二量体抗体(TrastuzumabとBevacizumabまたはAdalimumabとBevacizumab)のピークのうち、異種二量体の二重抗体(TrabevとAdabev)のピークが明確に観察される。これは、c34Фf51突然変異対およびAWBB突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のhalf antibodyで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。
実施例5.1.1を参照して、4D9(Aa)と2B9(Bb)にc40Фf44突然変異対(表24参照)が導入された抗体を作製した。各重鎖別に軽鎖aとbと共に発現させて、SDS-PAGE上で軽鎖と重鎖との間のペアリング程度を測定し(重鎖AおよびBに対してそれぞれ実施する)、実施例2を参照してTmを測定して、その結果を下記の表35および図38に示した。
表36と図39および表37と図40に示されるように、2つの同種二量体抗体(TrastuzumabとBevacizumabまたはAdalimumabとBevacizumab)のピークのうち、異種二量体の二重抗体(TrabevとAdabev)のピークが明確に観察される。これは、c40Фf44突然変異対およびAWBB突然変異対が導入されたそれぞれの抗体のhalf antibodyで作られた二重抗体がよく生成されていることを意味する。また、2つの同種二量体抗体の間に明確なpeakがただ1つだけが現れることから、2つの重鎖の間、そしてそれぞれ重鎖と軽鎖との間に誤ったペアリングが起こらずただ1種類の正常にペアリングされた二重特異性抗体だけが作られたことが分かる。
本明細書で提示されるCH3ドメインの突然変異において、同一のアミノ酸対でも実施例1~3で提示される突然変異と相異なる突然変異が導入される場合の異種二量体形成率を試験した。
本明細書で提示されるCH3ドメインの突然変異を代表するために、実施例3で選択されたCH3ドメイン突然変異を含むTNFRSF1B-Fc融合タンパク質(A鎖)とFas-Fc融合タンパク質(つまり、S364KおよびK409Wが導入されたA鎖およびK370SおよびF405Rが導入されたB鎖)(表38にてAW/BBで表示)を準備した。
Claims (17)
- 第1CH3ドメインまたは該第1CH3ドメインを含む第1Fc領域、および第2CH3ドメインまたは該第2CH3ドメインを含む第2Fc領域を含む、異なる2種の標的を標的化するための二重特異性タンパク質であって、
該第1CH3ドメインおよび該第2CH3ドメインが変異されており、その結果、該第1CH3ドメインと該第2CH3ドメインとの間のそれぞれのアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対から選択された少なくとも1つが、以下の(1)または(2)によって改変されている、二重特異性タンパク質:
(1)IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、
(i)405番目の位置のフェニルアラニンをリシン、アルギニン、またはアラニンに、409番目の位置のリシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに置換;
(ii)409番目の位置のリシンをトリプトファンに、407番目の位置のチロシンをアラニンに置換;および
(iii)407番目の位置のチロシンと366番目の位置のトレオニンとの対、357番目の位置のグルタミン酸と370番目の位置のリシンとの対、および357番目の位置のグルタミン酸と349番目の位置のチロシンとの対からなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸対における2つの対のアミノ酸残基の間で交換がなされた置換
からなる群より選択された少なくとも1つの変異;あるいは
(2)IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける該少なくとも1つの変異に対応する少なくとも1つの変異。 - (i)、(ii)、または(i)と(ii)との組み合わせの変異によって改変されており更に、静電的相互作用導入変異によって改変されている、請求項1に記載の二重特異性タンパク質であって、
該静電的相互作用導入変異は、
IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、364番目の位置のセリンと368番目の位置のロイシン、394番目の位置のトレオニンと394番目の位置のトレオニン、357番目の位置のグルタミン酸と370番目の位置のリシン、357番目の位置のグルタミン酸と349番目の位置のチロシン、366番目の位置のトレオニンと407番目の位置のチロシン、および394番目の位置のトレオニンと397番目の位置のバリンからなる群より選択された1つ以上のアミノ酸対、または
IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも1つのアミノ酸対
を構成する2つのアミノ酸のうち、一方は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換されている変異である、
二重特異性タンパク質。 - 前記静電的相互作用導入変異は、IgG1を基準として(EUナンバリング)、次の変異の少なくとも1つ、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける対応する変異の少なくとも1つを含むものである、請求項2に記載の二重特異性タンパク質:
364番目の位置のセリンを正電荷を有するアミノ酸に、368番目の位置のロイシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
394番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、394番目の位置のトレオニンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
357番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、370番目の位置のリシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
357番目の位置のグルタミン酸を正電荷を有するアミノ酸に、349番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
366番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、407番目の位置のチロシンを負電荷を有するアミノ酸に置換;
394番目の位置のトレオニンを正電荷を有するアミノ酸に、397番目の位置のバリンを負電荷を有するアミノ酸に置換;および
349番目の位置のチロシンを正電荷を有するアミノ酸に、357番目の位置のグルタミン酸を負電荷を有するアミノ酸に置換。 - 更に、スワッピング変異によって変異されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の二重特異性タンパク質であって、
該スワッピング変異は、
IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、364番目の位置のセリンと370番目の位置のリシンとの対;または
IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおけるそれに対応するアミノ酸対
中の2つの対のアミノ酸残基の間で交換がなされる変異である、
二重特異性タンパク質。 - IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、以下の変異、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける対応する変異を含む、請求項4に記載の二重特異性タンパク質:
(a)405番目の位置のフェニルアラニンをリシンまたはアルギニンに、409番目の位置のリシンをフェニルアラニンまたはトリプトファンに置換;
(b)(a)と、364番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに、370番目の位置のリシンをセリンに置換との組み合わせ。 - IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、以下の変異、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける対応する変異を更に含む、請求項5に記載の二重特異性タンパク質:
368番目の位置のロイシンをアスパラギン酸またはグルタミン酸に、364番目の位置のセリンをリシンまたはアルギニンに置換。 - IgG1のCH3ドメインを基準として(EUナンバリング)、以下の変異、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH3ドメインにおける対応する変異を含む、請求項5または6に記載の二重特異性タンパク質:
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのフェニルアラニンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの368番目の位置のロイシンのアスパラギン酸への置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換;
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのリシンへの置換;または
第1CH3ドメインの364番目の位置のセリンのリシンへの置換と第2CH3ドメインの370番目の位置のリシンのセリンへの置換、および第1CH3ドメインの409番目の位置のリシンのトリプトファンへの置換と第2CH3ドメインの405番目の位置のフェニルアラニンのアルギニンへの置換。 - 第1エピトープを認識する抗体の重鎖および軽鎖にぞれぞれ由来する第1CH1ドメインおよび第1CL(軽鎖定常領域)ドメイン、ならびに第2エピトープを認識する抗体の重鎖および軽鎖にそれぞれ由来する第2CH1ドメインおよび第2CLドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合断片である、請求項1~7のいずれか1項に記載の二重特異性タンパク質であって、
該二重特異性抗体またはその抗原結合断片が、CH1ドメインおよびCLドメイン中に、以下の変異のうちの少なくとも1つを更に含み:
第1CH1ドメインおよび第1CLドメイン間のそれぞれのアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のそれぞれの対を構成する2つのアミノ酸のうち、一方は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換される変異;および
第2CH1ドメインと第2CLドメインとの間のそれぞれのアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のそれぞれの対を構成する2つのアミノ酸のうち、一方は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換される変異;
ここで、該正電荷を有するアミノ酸はリシンまたはアルギニンであり、該負電荷を有するアミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である、二重特異性タンパク質。 - 前記第1CH1ドメインおよび前記第2CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有し、
前記第1CLドメインおよび該第1CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有し、
前記第2CLドメインおよび該第2CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有する、
請求項8に記載の二重特異性タンパク質。 - 前記CH1ドメイン中の正または負電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸が、IgG1のCH1ドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸のうちの少なくとも1つであるか、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH1ドメイン中の次のアミノ酸のうちの少なくとも1つに対応する位置のアミノ酸であり:
145番目の位置のロイシン、
183番目の位置のセリン、
147番目の位置のリシン、
170番目の位置のフェニルアラニン、
171番目の位置のプロリン、および
185番目の位置のバリン、
前記CLドメイン中の正または負電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸が、カッパタイプのCLドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸のうちの少なくとも1つであるか、またはラムダタイプのCLドメインの次のアミノ酸のうちの少なくとも1つに対応する位置のアミノ酸である、請求項8または9に記載の二重特異性タンパク質:
131番目の位置のセリン、
133番目の位置のバリン、
135番目の位置のロイシン、
162番目の位置のセリン、および
180番目の位置のトレオニン。 - 前記CH1ドメインと前記CLドメインとの間のアミノ酸対を形成する2つのアミノ酸のセットが、IgG1のCH1ドメインとカッパタイプのCLドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸対のうちの少なくとも1つであるか、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH1ドメインとラムダタイプのCLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも1つのアミノ酸対である、請求項10に記載の二重特異性タンパク質:
CH1ドメインの145番目の位置のロイシンとCLドメインの131番目の位置のセリンとの対、
CH1ドメインの145番目の位置のロイシンとCLドメインの133番目の位置のバリンとの対、
CH1ドメインの183番目の位置のセリンとCLドメインの133番目の位置のバリンとの対、
CH1ドメインの147番目の位置のリシンとCLドメインの180番目の位置のトレオニンとの対、
CH1ドメインの185番目の位置のバリンとCLドメインの135番目の位置のロイシンとの対、
CH1ドメインの170番目の位置のフェニルアラニンとCLドメインの135番目の位置のロイシンとの対、および
CH1ドメインの171番目の位置のプロリンとCLドメインの162番目の位置のセリンとの対。 - 第1エピトープを認識する抗体が、配列番号27の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザB抗体であり、
第2エピトープを認識する抗体が、配列番号29の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザA抗体である、
請求項8~11のいずれか1項に記載の二重特異性タンパク質。 - 配列番号27の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザB抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号27の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザB抗体、および配列番号29の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザA抗体を含む、抗-インフルエンザA/抗-インフルエンザB二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
- 第1エピトープを認識する抗体の重鎖および軽鎖にそれぞれ由来する第1CH1ドメインおよび第1CL(軽鎖定常領域)ドメイン、ならびに第2エピトープを認識する抗体の重鎖および軽鎖にそれぞれ由来する第2CH1ドメインおよび第2CLドメインを含み、
CH1ドメインおよびCLドメインが、以下の変異のうちの少なくとも1つを含むように変異された、二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって:
第1CH1ドメインと第1CLドメインとの間のそれぞれのアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第1アミノ酸対のそれぞれの対を構成する2つのアミノ酸のうち、一方は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換される変異;および
第2CH1ドメインと第2CLドメインとの間のそれぞれのアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された1つ以上の第2アミノ酸対のそれぞれの対を構成する2つのアミノ酸のうち、一方は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換される変異;
前記第1CH1ドメインおよび第2CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有し、
前記第1CLドメインおよび該第1CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有し、
前記第2CLドメインおよび該第2CH1ドメインのそれぞれにおける置換されたアミノ酸は、反対の電荷を有し、
前記正電荷を有するアミノ酸は、リシンまたはアルギニンであり、
前記負電荷を有するアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記CH1ドメイン中の正または負電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、IgG1のCH1ドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸のうちの少なくとも1つであるか、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH1ドメイン中の次のアミノ酸のうちの少なくとも1つに対応する位置のアミノ酸であり:
145番目の位置のロイシン、
183番目の位置のセリン、
147番目の位置のリシン、
170番目の位置のフェニルアラニン、
171番目の位置のプロリン、および
185番目の位置のバリン、
前記CLドメイン中の正または負電荷を有するアミノ酸に置換されるアミノ酸は、カッパタイプのCLドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸のうちの少なくとも1つであるか、またはラムダタイプのCLドメインの次のアミノ酸のうちの少なくとも1つに対応する位置のアミノ酸であり:
131番目の位置のセリン、
133番目の位置のバリン、
135番目の位置のロイシン、
162番目の位置のセリン、および
180番目の位置のトレオニン、
前記CH1ドメインと前記CLドメインとの間のアミノ酸対を形成する2つのアミノ酸のセットが、IgG1のCH1ドメインとカッパタイプのCLドメインを基準として(EUナンバリング)、次のアミノ酸対のうちの少なくとも1つであるか、またはIgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、もしくはIgMのCH1ドメインとラムダタイプのCLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸対に対応する位置の少なくとも1つのアミノ酸対である、二重特異性抗体またはその抗原結合断片:
CH1ドメインの145番目の位置のロイシンとCLドメインの131番目の位置のセリンとの対、
CH1ドメインの145番目の位置のロイシンとCLドメインの133番目の位置のバリンとの対、
CH1ドメインの183番目の位置のセリンとCLドメインの133番目の位置のバリンとの対、
CH1ドメインの147番目の位置のリシンとCLドメインの180番目の位置のトレオニンとの対、
CH1ドメインの185番目の位置のバリンとCLドメインの135番目の位置のロイシンとの対、
CH1ドメインの170番目の位置のフェニルアラニンとCLドメインの135番目の位置のロイシンとの対、および
CH1ドメインの171番目の位置のプロリンとCLドメインの162番目の位置のセリンとの対。 - 前記CH1ドメイン及び前記CLドメインに加えて、改変されたCH3ドメインまたは該改変されたCH3ドメインを含む変異Fc領域を含む、請求項15に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片であって、該改変されたCH3ドメインは、第1CH3ドメインおよび第2CH3ドメインを含み、これらは変異されており、その結果、第1エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第1CH3ドメインと第2エピトープを認識する抗体の重鎖由来の第2CH3ドメインとの間のアミノ酸-アミノ酸結合を形成するアミノ酸対の中から選択された少なくとも1つが、次の変異のうちの少なくとも1つを有する、二重特異性抗体またはその抗原結合断片:
CH3ドメイン間の少なくとも1つのアミノ酸対中のアミノ酸が互いに交換された変異(スワッピング変異)、
CH3ドメイン間の少なくとも1つのアミノ酸対のうち、一方のアミノ酸は正電荷を有するアミノ酸に置換され、他方は負電荷を有するアミノ酸に置換された変異であって、前記アミノ酸対中の2つのアミノ酸残基のうち少なくとも1つは疎水性でない、変異(静電的相互作用導入変異);および
CH3ドメイン間の少なくとも1つのアミノ酸対のうち、一方のアミノ酸は大きさの大きい疎水性アミノ酸に置換され、他方は大きさの小さい疎水性アミノ酸に置換された変異(サイズ変異)、ここで、該大きさの大きいアミノ酸は、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択され、該大きさの小さいアミノ酸は、アラニン、グリシン、およびバリンからなる群より選択される。 - 前記第1エピトープを認識する抗体は、配列番号27の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザB抗体であり、
前記第2エピトープを認識する抗体は、配列番号29の重鎖可変領域および配列番号31の軽鎖可変領域を含む抗-インフルエンザA抗体である、請求項15または16に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
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