JP7330475B2 - 経口用組成物及び皮膚外用組成物 - Google Patents
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Description
また、本発明は、上記発酵物を含む皮膚外用組成物である。
また、本発明は、上記発酵物を含む経口用組成物である。
本発明において、ムコ多糖とは、糖のヒドロキシ基がアミノ基で置換された構造をもつアミノ糖であって、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン及びそれらの塩若しくは誘導体が挙げられる。
ヒアルロン酸2gに精製水200gを加え、撹拌してヒアルロン酸の膨潤液を調整した。これに1mol/Lの塩酸を加え、80℃で加温処理したあと、pH調製を行い、ヒアルロン酸分解物液を得た。
次に、ヒアルロン酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた乳酸菌(Lactococcus lactis subsp. Lactis)を加え、pH調整後、30℃でその乳酸菌を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(1)を145g得た(固形分濃度1.01%)。
まず、製造例1と同様の操作により、ヒアルロン酸分解物液を得た。次に、ヒアルロン酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた酵母(Saccharomyces cerevisiae)を加え、pH調整後、30℃でその酵母を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(2)を136g得た(固形分濃度0.98%)。
まず、製造例1と同様の操作により、ヒアルロン酸分解物液を得た。次に、ヒアルロン酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた麹菌(Aspergillus oryzae)を加え、pH調整後、25℃でその麹菌を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(3)を140g得た(固形分濃度0.91%)。
まず、製造例1と同様の操作により、ヒアルロン酸分解物液を得た。次に、ヒアルロン酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた枯草菌[Bacillus subtilis (natto)]を用いて30℃でその枯草菌を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(4)を143g得た(固形分濃度1.05%)。
ヒアルロン酸2gに精製水200g を加え、撹拌してヒアルロン酸の膨潤液を調整した。これに1mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液を加え、80℃で加温処理したあと、pH調製を行い、ヒアルロン酸分解物液を得た。次に、ヒアルロン酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた乳酸菌(Lactococcus lactis subsp. Lactis)を加え、pH調整後、30℃でその乳酸菌を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(5)を144g得た(固形分濃度1.03%)。
製造例1の製造方法において、乳酸菌(Lactococcus lactis subsp. Lactis)に代えて、乳酸菌(Lactobacillus plantarum)を用いる他は、製造例1と同様にして、発酵液(6)を139g得た(固形分濃度0.90%)。
コンドロイチン硫酸2gに精製水200gを加え、撹拌してコンドロイチン硫酸の膨潤液を調整した。これに1mol/Lの塩酸を加え、80℃で加温処理したあと、pH調製を行い、コンドロイチン硫酸分解物液を得た。次に、コンドロイチン硫酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた乳酸菌(Lactococcus lactis subsp. Lactis)を加え、pH調整後、30℃でその乳酸菌を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(7)を143g得た(固形分濃度1.02%)。
まず、製造例7と同様の操作により、コンドロイチン硫酸分解物液を得た。次に、コンドロイチン硫酸分解物液を殺菌し、予め前培養しておいた酵母(Saccharomyces cerevisiae)を加え、pH調整後、30℃でその酵母を培養し、培養終了後、発酵液を殺菌及び濾過し、発酵液(8)を140g得た(固形分濃度0.96%)。
ヒアルロン酸2gに精製水200g を加え、撹拌してヒアルロン酸の膨潤液を調整した。これにストレプトコッカス属の微生物由来のヒアルロニダーゼを加えて40℃にて処理後、さらに80℃にて加温処理し、pH調製後、濾過して、ヒアルロン酸分解物液138gを得た(固形分濃度0.91%)。
正常表皮角化細胞(NHEK(F))を6×103cell/wellで96ウェルプレートに播種後、HuMedia-KG2培地[倉敷紡績(株)]を用いて、37℃、で24時間培養した。培養後、当該培地に製造例1~8の発酵物(1)~(8)をそれぞれ試料溶液として添加し、さらに、48時間培養した。ここで、試料溶液は、試験培地中の溶液としての発酵液の最終濃度がそれぞれ2.0%となるように添加した。培養終了後、細胞の呼吸活性(MTT活性)をMTT還元法(H.Tada et.al.,J.Immunol.Methods 93, 157, 1986)によって評価した。すなわち、ウェルから培地を除去した後、0.03%のMTT試薬(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide)を添加して37℃、1時間反応させ、生成したホルマザンをイソプロパノールで溶解させた後、570nmに於ける吸光度を測定し、細胞残渣による濁度(吸光度:630nm)を差し引いた値を細胞活性とした。なお、コントロールとして、上記試料溶液に代えてPBS(-)を培地に添加した場合のMTT活性も測定した。さらに、陽性対象として、上記試料溶液に代えて、100mMのグルコースを培地に添加した場合のMTT活性も測定した。本発明の試料溶液のMTT活性は、コントロールのMTT活性値を100とした場合の相対値で表した。
[表1]
<実験方法>
正常ヒト表皮細胞を、増殖添加剤含有HuMediaKG2[クラボウ社製]にて6×104個/mLに調製し、24穴プレートに1mLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。培養1日後、製造例1,5,7の発酵物(1)(5)(7)のいずれかを含んだ培養液(培養液全量に対して溶液として終濃度が1%となるように製造例1,5,7の発酵液それぞれ添加したもの)を添加して培養した。また、比較対照として、試料溶液に代えて、PBS(-)溶液のみを含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(-)の終濃度を1%に調整したもの)を添加した試験区(コントロール区)を設定した。さらに培養1日後、培養器底面からUV-Bランプ(Philips社製TL20W/12RS)を用いて約40mJ/cm2の紫外線照射を行った24時間後の試験区の細胞をTrizol試薬(Invitrogen社製)0.5mLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム(和光純薬工業社製)100μL添加して撹拌混合し遠心分離機(TOMY社製/MX-160)で12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを200μL分取した。回収した水層にイソプロパノール(和光純薬工業社製)500μLを添加して撹拌混合し、12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離してtotalRNAの沈殿物を得た。totalRNAに75%エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、12,500rpm、4℃条件下で15分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal RNAを所定のキット(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製))を用いて逆転写反応し、cDNAを合成した。合成したcDNAをサンプルとして、Thermal Cycler Dice(登録商標)Real Time System Single(タカラバイオ社製)、及びSYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)[タカラバイオ社製]を用いて、各種遺伝子の発現と、内部標準物質G3PDH遺伝子の発現の検出を行った。ここで、G3PDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)は、ハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であって、常に発現され,細胞の維持,増殖に不可欠な遺伝子である)の一つであり、発現量が常に一定とされていることから、PCRの実験では内部標準として用いられるものである。試験結果は、G3PDH遺伝子の発現量を一定とした場合の、それぞれの試験区での各遺伝子の発現量を比較した。本試験系においては、コントロール区のそれぞれの遺伝子の発現量を100としたときの他の試験区でのその遺伝子の発現量の相対値を求めた。
[表2]
正常ヒト表皮細胞を、増殖添加剤含有HuMediaKG2[クラボウ社製]にて6×104個/mLに調製し、24穴プレートに1mLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。培養1日後、製造例1,5,7の発酵物(1)及び(5)のいずれかを含んだ培養液(培養液全量に対して溶液として終濃度が1%となるように製造例1,5の発酵液それぞれ添加したもの)を添加して培養した。また、比較対照として、試料溶液に代えて、PBS(-)溶液のみを含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(-)の終濃度を1%に調整したもの)を添加した試験区(コントロール区)を設定した。添加24時間後の試験区の細胞をTrizol試薬(Invitrogen社製)0.5mLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム(和光純薬工業社製)100μL添加して撹拌混合し遠心分離機(TOMY社製/MX-160)で12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを200μL分取した。回収した水層にイソプロパノール(和光純薬工業社製)500μLを添加して撹拌混合し、12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離してtotalRNAの沈殿物を得た。totalRNAに75%エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、12,500rpm、4℃条件下で15分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal RNAを所定のキット(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製))を用いて逆転写反応し、cDNAを合成した。合成したcDNAをサンプルとして、Thermal Cycler Dice(登録商標)Real Time System Single(タカラバイオ社製)、及びSYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)[タカラバイオ社製]を用いて、各種遺伝子の発現と、内部標準物質G3PDH遺伝子の発現の検出を行った。ここで、G3PDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)は、ハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であって、常に発現され,細胞の維持,増殖に不可欠な遺伝子である)の一つであり、発現量が常に一定とされていることから、PCRの実験では内部標準として用いられるものである。試験結果は、G3PDH遺伝子の発現量を一定とした場合の、それぞれの試験区での各遺伝子の発現量を比較した。本試験系においては、コントロール区のそれぞれの遺伝子の発現量を100としたときの他の試験区でのその遺伝子の発現量の相対値を求めた。
[成分] 部
ホホバ油 6.0
ホホバワックス 4.0
ステアリン酸 1.5
スクワラン 8.0
ステアリルアルコール 0.8
ミスチリルアルコール 0.9
乳酸菌発酵米 2.0
大豆レシチン 0.5
製造例1の発酵物(1) 2.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
マルチトール 1.5
キサンタンガム 0.5
アルギン酸ナトリウム 0.5
アルギニン 0.04
1,3-ブチレングリコール 5.0
1,2-プロピレングリコール 3.0
精製水 全量が100部となる量
香料 適量
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例2の発酵物(2)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例3の発酵物(3)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例4の発酵物(4)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例5の発酵物(5)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例6の発酵物(6)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例7の発酵物(7)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
処方例1のクリームに含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例8の発酵物(8)を用いる他は、処方例1と同様にしてクリームを得た。
[成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
アラントイン 1.0
大豆レシチン 1.5
メチルパラベン 0.15
エチルパラベン 0.03
グリセリン 3.0
製造例1の発酵物(1) 2.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
水溶性コラーゲン 0.1
エデト酸ナトリウム 0.1
精製水 全量が100部となる量
処方例9に含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例2の発酵物(2)を用いる他は、処方例7と同様にして乳液を得た。
処方例9に含まれる製造例1の発酵物(1)に代えて、製造例7の発酵物(7)を用いる他は、処方例9と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2.0
大豆レシチン 1.5
メチルパラベン 0.15
エチルパラベン 0.03
製造例1の発酵物(1) 2.0
加水分解ヒアルロン酸 0.1
アセチル化ヒアルロン酸 0.1
L-アスコルビン酸-2-グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
エデト酸ナトリウム 0.1
精製水 全量が100部となる量
処方例12の成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてL-アスコルビン酸-2-リン酸エステルマグネシウム2.0部を用いるほかは処方例12と同様にして乳液を得た。
処方例12のB成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例12と同様にして乳液を得た。
処方例12のB成分中、L-アスコルビン酸-2-グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン2.0部を用いるほかは処方例12と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
ホホバ油 2.0
ホホバワックス 1.0
スクワラン 2.0
パーム油 0.5
ステアリルアルコール 0.8
大豆レシチン 1.5
ヒアルロン酸ナトリウム 2.0
乳酸菌発酵米 2.0
マルチトール 0.1
キサンタンガム 1.0
製造例1の発酵物(1) 3.0
グリセリン 5.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
メチルパラベン 0.1
製造例1の発酵物(1) 1.0
加水分解ヒアルロン酸 0.1
アセチル化ヒアルロン酸 0.1
グリセリン 5.0
1,3-ブチレングリコール 5.0
クエン酸ナトリウム 0.2
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
エタノール 10.0
グリセリン 3.0
1、3-ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 0.2
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.3
カルボキシビニルポリマー 0.1
エデト酸ナトリウム 0.1
製造例1の発酵物(1) 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
メチルパラベン 0.1
N-ラウロイルメチルアラニンナトリウム 25.0
ヤシ油脂肪酸カリウム液(40%) 26.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 3.0
製造例1の発酵物(1) 5.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
エデト酸ナトリウム 0.1
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
N-ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム 10.0
ポリオキシエチレン(3)アルキルエーテル硫酸ナトリウム 20.0
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 10.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 4.0
メチルパラベン 0.1
クエン酸 0.1
製造例1の発酵物(1) 2.0
1,3-ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
ポリオキシエチレン(10)硬化ヒマシ油 1.0
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム 1.5
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム 2.0
2-エチルヘキサン酸グリセリル 1.0
セタノール 3.2
ステアリルアルコール 1.0
メチルパラベン 0.1
製造例1の発酵物(1) 2.0
1,3-ブチレングリコール 5.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
ヤシ油 10.0
硬化ヒマシ油 26.0
オリーブ油 4.0
水酸化ナトリウム 6.0
黒糖粉末 10.0
グリセリン 5.0
製造例1の発酵物(1) 5.0
エデト酸ナトリウム 0.1
エタノール 20.0
精製水 全量が100部となる量
Claims (2)
- ヒアルロン酸の乳酸菌(Lactococcus lactis)又は乳酸菌(Lactobacillus plantarum)による発酵分解物を含む皮膚外用組成物。
- ヒアルロン酸の乳酸菌(Lactococcus lactis)又は乳酸菌(Lactobacillus plantarum)による発酵分解物を含む経口用組成物。
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JP2009297007A (ja) | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Makoto Yafuji | 低分子コンドロイチン硫酸の製造方法 |
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- 2018-08-06 JP JP2018147993A patent/JP7330475B2/ja active Active
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