JP7297820B2 - ベータ－（１，４）－ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体を用いる糖タンパク質の改変方法 - Google Patents

ベータ－（１，４）－ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体を用いる糖タンパク質の改変方法 Download PDF

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Description

本発明は、糖タンパク質の酵素的改変方法に関する。より詳細には、本発明は、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、又はその突然変異体を用いる、糖誘導体ヌクレオチドによる糖タンパク質の改変方法、及びβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ突然変異体に関する。
グリコシルトランスフェラーゼは糖タンパク質及び糖脂質に存在する複合糖質の合成に関与する酵素のスーパーファミリーを構成する。グリコシルトランスフェラーゼの基本的な役割はヌクレオチド誘導体のグリコシル部分を特定の糖受容体に転移することである。β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４Ｇａｌ－Ｔｓ）（ＥＣ ２．４．１．３８）は少なくとも７つのメンバーＧａｌ－Ｔ１～Ｇａｌ－Ｔ７を含むグリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのサブファミリーの１つを構成しており、ＵＤＰ－Ｇａｌから様々な糖受容体へのガラクトース（Ｇａｌ）の転移を触媒する。末端ＧｌｃＮＡｃ残基へのガラクトーストランスフェラーゼの結果得られる共通のモチーフはラクトサミン配列Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ－Ｒ（ＬａｃＮＡｃ又はＬＮ）であり、これはその後他の糖及び硫酸基の付加によって多様な方法で修飾される。膜複合糖質の最も一般的で重要な糖構造はポリ－Ｎ－アセチルラクトサミン（ポリ－ＬＮ）であり、これはタンパク質（又は脂質）に結合し、細胞の伝達、接着、及びシグナル伝達において重要な役割を果たし、免疫応答の制御において重要な分子である。
脊椎動物及び無脊椎動物の複合糖質に見られるもう１つ別の共通な末端モチーフはＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ－Ｒ（ＬａｃｄｉＮＡｃ又はＬＤＮ）配列である。ＬＤＮモチーフは哺乳類下垂体の糖タンパク質ホルモンに存在し、末端ＧａｌＮＡｃ残基が４－Ｏ－硫酸化されており、内皮細胞のＭａｎ／Ｓ４ＧＧｎＭ受容体によるクリアランスのための認識マーカーとして機能している。しかしながら、非下垂体の哺乳類糖タンパク質もＬＤＮ決定基を含有している。更に、ＬＤＮ及びＬＤＮ配列の改変体は多くの寄生性の線虫及び吸虫に共通の抗原決定基である。ＬＤＮの生合成には、極めて特異的なＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼにより実行されるプロセスである末端ＧｌｃＮＡｃへのＧａｌＮＡｃの転移が関与している。例えば、Ｍｉｌｌｅｒらにより、参照により組み込まれるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８、２８３、ｐ．１９８５に、２つの密接に関連するβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるβ４ＧａｌＮＡｃ－Ｔ３及びβ４ＧａｌＮＡｃ－Ｔ４は、糖タンパク質黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び炭酸脱水酵素－６（ＣＡ６）を含む幾つかの糖タンパク質のＡｓｎ－結合オリゴ糖へのβ１，４－結合ＧａｌＮＡｃのタンパク質－特異的な付加を担うと考えられることが報告されている。
β－（１，４）－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴｓ）は、ヒト、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｋａｗａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、３４９２４）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７、３１６、１６２５、参照により組み込まれる）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｖａｄａｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４、２７９、３３５０１、参照により組み込まれる）を含む様々な生物で同定されている。
最後に、Ｎ－糖タンパク質修飾に関与するＧａｌＴｓ及びＧａｌＮＡｃＴｓ以外に、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓとも称される）と呼ばれる関連のない種類の酵素が、ムチン型連結（ＧａｌＮＡｃ－α－１－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の生合成を担っている。これらの酵素は糖供与体ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃをセリン及びスレオニン残基に転移して、Ｏ－糖タンパク質に典型的なアルファアノマー結合を形成する。ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓ触媒機能の見かけ上の単純さにも関わらず、インシリコ解析に基づいて、２４の独特なｐｐＧａｌＮＡｃＴｓヒト遺伝子が独立に存在すると見積もられている。Ｏ－結合グリコシル化は段階的に進行するので、ＧａｌＮＡｃのセリン又はスレオニンへの付加はムチン生合成に関係する最初のステップに相当する。この見かけ上の単純さにも関わらず、そのタンパク質基質を完全にグリコシル化するには複数のｐｐＧａｌＮＡｃＴｓファミリーメンバーが必要なようである。
β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（β４Ｇａｌ－Ｔ１）は、その自然の基質ＵＤＰ－Ｇａｌに加えて、様々な非天然のガラクトース誘導体を受容体ＧｌｃＮＡｃ基質に転移することができることが示されている。特に、参照により組み込まれるＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２３、２０８３３により報告されているように、ウシβ４Ｇａｌ－Ｔ１のＴｙｒ２８９残基のＬｅｕ２８９への突然変異は、酵素の触媒ポケット内に、Ｃ２に２－ケト－Ｇａｌのような化学的Ｃ－２ハンドルを有するＵＤＰ－Ｇａｌ分子を収容することができる空洞を創り出す。非天然のガラクトース部分の最初の転移とその後のＣ－２ハンドル上へのオキシム連結との２ステップ法により、この突然変異体酵素β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）は、タンパク質上のＯ－ＧｌｃＮＡｃ残基又は通常及び悪性の腫瘍組織の細胞表面グリカン上の末端ＧｌｃＮＡｃ部分の存在のインビトロ検出に使用される。
例えば、参照により組み込まれるＫｈｉｄｅｋｅｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３、１２５、１６１６２は、β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）をもつＯ－ＧｌｃＮＡｃ改変タンパク質への非天然のケトン官能性の化学選択的な設置を開示している。ケトン部分は、オキシム連結を用いてＯ－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化タンパク質をビオチンで「タグ付けする」のに独特なマーカーとして機能する。一旦ビオチニル化されたら、複合糖質は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたストレプトアビジンを用いて化学発光により容易に検出することができる。
例えば、いずれも参照により組み込まれる国際公開第２００７／０９５５０６号、国際公開第２００８／０２９２８１号（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、国際公開第２０１４／０６５６６１号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）及びＣｌａｒｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８、１３０、１１５７６は、β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）及びガラクトサミンのアジドアセチル変異体を用いて同様の成功を修めた同様な手法を報告している。
Ｚｅｇｌｉｓらにより、参照により組み込まれるＢｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１３、２４、１０５７に報告されているように、ごく最近、突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）はまた、抗体の重鎖グリカンの部位－選択的な放射性標識にも調製的に応用された。特に、アジド改変Ｎ－アセチルガラクトサミン単糖類（ＧａｌＮＡｚ）の抗体のグリカンへの組み込みにより、適当なキレート剤のクリック化学導入後８９Ｚｒによる制御された標識が可能になった。
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎらは、参照により組み込まれるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４、４３、１２５１３において、二重突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ，Ｍ３４４Ｈ）が、そのＭｎ２＋－依存性の活性の９８％を失うが、にもかかわらずＭｇ２＋の存在下でＣ－２改変ガラクトース基質に転移する能力を含めて２５～３０％の活性を示すことを記載している。二重突然変異体β４ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ、Ｍ３４４Ｈ）は、５～１０ｍＭのＭｎ２＋の典型的な要件が細胞に対して潜在的な細胞毒性効果を有することが知られているので、インビトロガラクトシル化アッセイに有用であることが見出された。
参照により組み込まれるＭｅｒｃｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１３、２４、１４４は、二重突然変異体Ｙ２８９Ｌ－Ｍ３４４Ｈ－β４Ｇａｌ－Ｔ１酵素がＭｇ２＋の存在下でＧａｌＮＡｃ及び類似の糖を受容体ＧｌｃＮＡｃに転移することを記載している。
本明細書中ではβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴとも称される野生型β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをＣ－２改変ＧａｌＮＡｃの転移のために使用する試みは今まで殆ど成功していない。
Ｂｅｒｔｏｚｚｉらは、参照により本明細書に組み込まれるＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９、４、１０６８で、バイオ直交型の化学レポーター技術を生きたＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）でムチン型Ｏ－グリカンの分子イメージングに応用した。蠕虫をＮ－アセチルガラクトサミンのアジド－糖変異体（ＧａｌＮＡｚ）で処理してこの非天然の糖のインビボ取り込みを起こさせた。ＧａｌＮＡｚの糖タンパク質への代謝取り込みが観察されたが、Ｃ．エレガンス溶解物のコンドロイチナーゼＡＢＣ及びペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）消化、それに続くホスフィン－Ｆｌａｇタグを用いるＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション及びその後のα－Ｆｌａｇ抗体を利用したウェスタンブロッティングによる糖タンパク質のプローブ探査により、糖タンパク質のＧａｌＮＡｚ残基の大部分がＮ－グリカンより他の型のグリカンに位置していることが示された。更に、アジド－標識糖タンパク質のＮ－グリカン特異的レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）への検出可能な結合は観察されなかったが、これは標識グリカンの大部分がＯ－結合しており、Ｎ－結合していないという仮説と一致している。これらの観察に基づいて、ＧａｌＮＡｚはこの生物ではＮ－ＧｌｃＮアシル化タンパク質に代謝的に取り込まれないと結論できる。
ごく最近、Ｂｕｒｎｈａｍ－Ｍａｒｕｓｉｃｈらにより、参照により本明細書に組み込まれるＰｌｏｓ Ｏｎｅ ２０１２、７、ｅ４９０２０において同様な結論が導かれた。ここでも、ＰＮＧＡｓｅ処理の際の信号低下の欠如（これは、ＧａｌＮＡｚのＮ－糖タンパク質への明らかな取り込みがないことを示す）が観察された。Ｂｕｒｎｈａｍ－Ｍａｒｕｓｉｃｈらは、代謝的に標識された糖タンパク質を検出するために、アジド標識糖タンパク質による末端アルキン－プローブのＣｕ（Ｉ）に触媒されるアジド－アルキン付加環化反応を用いた研究を記載している。結果は、ＧａｌＮＡｚ標識の大部分が、ｐＮＧａｓｅ Ｆに対して感受性でない、したがって、Ｎ－糖タンパク質ではないグリカン種に取り込まれることを示している。
参照により組み込まれるＫａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、３４９２４に報告されているように、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃに対するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴの高い基質特異性は、それぞれ０．７％、０．２％及び１％のトランスフェラーゼ活性が残存しているＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ及びＵＤＰ－Ｇａｌの不良な認識から明らかになる。
上記に基づき、２－ケト又は２－アジドアセチル誘導体のような非天然のＧａｌＮＡｃ誘導体のＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼによる糖タンパク質の改変のためのインビトロ方法が報告されていないことは驚くべきことではない。
参照により組み込まれるＴａｒｏｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０１２、３６２、６２は、ＧＰＩ－アンカーにおけるＧａｌＮＡｚのインビボ代謝取り込みを記載している。
本発明は、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体の存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップを含む、糖タンパク質の改変のための方法であって、
（ｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
Figure 0007297820000001
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖類、又は２～２０の糖部分を含む直鎖又は分岐オリゴ糖である）
に従い、
（ｉｉ）糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（３）：
Figure 0007297820000002
（式中：
ａは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここで、ｎは０～２４の範囲の整数であり；ｏは０～１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１は独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群から選択され；
ＴはＣ３～Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）－Ｎ３
（ｂ）－Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４
（ここでＲ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）－ＳＨ
（ｅ）－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１からＣ２４アルキル基である）；
（ｆ）－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｇ）－Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１１
（ここでＲ１１は任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｊ）Ｒ１２ｓ
（ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基である）；
（ｋ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ２４アレニル基である）
からなる群から選択される）
に従う、方法に関する。
更なる局面において、本発明は、本発明の方法で使用するのに適切なβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ突然変異体に関する。
本発明の方法によって改変され得る、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質の例を示す図である。 糖タンパク質が抗体である場合の糖タンパク質の改変方法の１つの実施形態を示す図である。この実施形態では、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの作用の下で糖誘導体Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃを抗体グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分に結合させて改変抗体を形成する。 抗体グリカンの様々な糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆを示す図である。 糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物をシアリダーゼ及びガラクトシダーゼで処理することによって式（２７）に従うグリカンを含む糖タンパク質を提供する方法、並びに糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物をエンドグリコシダーゼで処理することによって式（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質を提供する方法を示す図である。式（２７）又は（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質を、アジド－改変されたＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ誘導体、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚと共にインキュベーションして、それぞれアジド－改変された糖タンパク質（３３）又は（３２）が得られる。 ＣＨＯでの一過性発現後の粗製の様々なβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃ－ＴｓのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。 様々なβ－（１，４）－ＣｅＧａｌＮＡｃ－Ｔ突然変異体の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。 ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚのＧｌｃＮＡｃへの転移について、β－（１，４）－ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）突然変異体と比較した様々なβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴｓの、Ｒ＆Ｄシステムグリコシルトランスフェラーゼ活性キットにより決定された活性プロットを示す図である。 ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚのＧｌｃＮＡｃへの転移について、様々なβ－（１，４）－ＣｅＧａｌＮＡｃＴ突然変異体Ｙ２５７Ｌ、Ｙ２５７Ｍ及びＹ２５７Ａの、Ｒ＆Ｄシステムグリコシルトランスフェラーゼ活性キットにより決定された活性プロットを示す図である。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、動詞「含む」及びその活用形態は、その非限定的な意味で使用されており、その単語の後に記載される事項が包含されるが、具体的に述べられていない事項が排除されないことを意味する。更に、不定冠詞によるある要素への言及は、文脈から１つ及び１つのみの要素が存在することが明白に求められない限り、１つより多くの要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
非置換アルキル基は一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有し、直鎖状でも分岐状でもよい。非置換アルキル基はまた環状の部分を含有してもよく、したがって、付随する一般式ＣｎＨ２ｎ－１を有し得る。任意選択で、アルキル基は本明細書中で更に特定されている１又は複数の置換基により置換される。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、２－プロピル、ｔ－ブチル、１－ヘキシル、１－ドデシル、等がある。
アリール基は６～１２個の炭素原子を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、アリール基は本明細書で更に特定されている１又は複数の置換基によって置換されていてもよい。アリール基の例はフェニル及びナフチルである。
アリールアルキル基及びアルキルアリール基は少なくとも７個の炭素原子を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、アリールアルキル基及びアルキルアリールは本明細書で更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリールアルキル基は例えばベンジルである。アルキルアリール基は例えば４－ｔ－ブチルフェニルである。
ヘテロアリール基は少なくとも２個の炭素原子（即ち少なくともＣ２）及び１個又は複数のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、Ｐ又はＳを含む。ヘテロアリール基は単環状の又は二環状の構造を有し得る。任意選択で、ヘテロアリール基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。適切なヘテロアリール基の例としては、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピロリル、フラニル、トリアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾキサゾリル、チエニル、ホスホリル及びオキサゾリルがある。
ヘテロアリールアルキル基及びアルキルヘテロアリール基は少なくとも３個の炭素原子（即ち少なくともＣ３）を含み、単環状及び二環状の構造を含み得る。任意選択で、ヘテロアリール基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されていてもよい。
アリール基が（ヘテロ）アリール基と表示されている場合、この表記はアリール基及びヘテロアリール基を包含することを意味する。同様に、アルキル（ヘテロ）アリール基はアルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を包含して意味し、（ヘテロ）アリールアルキルはアリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を包含することを意味する。したがって、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基はＣ２～Ｃ２４ヘテロアリール基及びＣ６～Ｃ２４アリール基を包含するものと解釈される。同様に、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基はＣ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ３～Ｃ２４アルキルヘテロアリール基を包含して意味し、Ｃ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキルはＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基及びＣ３～Ｃ２４ヘテロアリールアルキル基を包含することを意味する。
別段の指定がない限り、アルキル基、アルケニル基、アルケン、アルキン、（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、アルキル（ヘテロ）アリール基、アルキレン基、アルケニレン基、シクロアルキレン基、（ヘテロ）アリーレン基、アルキル（ヘテロ）アリーレン基、（ヘテロ）アリールアルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、（ヘテロ）アリールオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８～Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ及びシリル基からなる群から独立して選択される１又は複数の置換基で置換されていてもよく、ここでシリル基は式（Ｒ２）３Ｓｉ－で表すことができ、式中Ｒ２はＣ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、ここでアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されていてもよく、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、任意選択でＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により中断されてもよい。
アルキニル基は炭素－炭素三重結合を含む。１つの三重結合を含む非置換アルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ－３を有する。末端アルキニルは、三重結合が炭素鎖の末端位置に位置するアルキニル基である。任意選択で、アルキニル基は、本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されているか、及び／又は酸素、窒素及びイオウの群から選択されるヘテロ原子により中断されている。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニル、等がある。
シクロアルキニル基は環状のアルキニル基である。１つの三重結合を含む非置換のシクロアルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ－５を有する。任意選択で、シクロアルキニル基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されている。シクロアルキニル基の一例はシクロオクチニルである。
ヘテロシクロアルキニル基は酸素、窒素及びイオウの群から選択されるヘテロ原子により中断されているシクロアルキニル基である。任意選択で、ヘテロシクロアルキニル基は本明細書に更に特定されている１又は複数の置換基により置換されている。ヘテロシクロアルキニル基の一例はアザシクロオクチニルである。
（ヘテロ）アリール基はアリール基及びヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基はアルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基はアリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基はアルキニル基及びヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基はシクロアルキニル基及びヘテロシクロアルキニル基を含む。
（ヘテロ）シクロアルキン化合物は、本明細書中で、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物と定義される。
本明細書及び特許請求の範囲に開示されている化合物の幾つかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、即ち第２の環構造が（ヘテロ）シクロアルキニル基に縮合、即ち環付加している（ヘテロ）シクロアルキン化合物と記述され得る。例えば、縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物において、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）又はアレーン（例えばベンゼン）は（ヘテロ）シクロオクチニル基に環付加し得る。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は３つの可能な位置のいずれか１つ、即ちシクロオクチン部分の２、３又は４位に位置し得る（番号付けは「ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｒｕｌｅ Ａ３１．２による）。本明細書及び特許請求の範囲における縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載は、シクロオクチン部分の３つの個々の位置異性体の全てを包含することを意味する。
総括的用語「糖」は、本明細書中で、単糖類、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）を指すために使用される。用語「糖誘導体」は、本明細書中で、単糖類の糖の誘導体、即ち置換基及び／又は官能基を含む単糖類の糖を指すために使用される。糖誘導体の例としては、アミノ糖及び糖酸、例えばグルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＨ２）Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも称されるシアル酸（Ｓｉａ）、及びＮ－アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）がある。
用語「ヌクレオチド」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオ塩基、五炭糖（リボース又は２－デオキシリボース）、及び１、２又は３つのリン酸基から構成される分子を指す。リン酸基がないと、ヌクレオ塩基及び糖はヌクレオシドを構成する。したがって、ヌクレオチドはヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド三リン酸と呼ばれる場合もある。ヌクレオ塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンであり得る。ヌクレオチドの例として、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）がある。
用語「タンパク質」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。ここで、約１０又は複数のアミノ酸を含むポリペプチドはタンパク質と考えられる。タンパク質は天然のアミノ酸を含むが、非天然のアミノ酸を含んでいてもよい。
用語「糖タンパク質」は、本明細書中でその通常の科学的な意味で使用されており、タンパク質に共有結合された１又は複数の単糖類又はオリゴ糖鎖（「グリカン」）を含むタンパク質を指す。グリカンは、タンパク質のヒドロキシル基（Ｏ－結合した－グリカン）、例えばセリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン若しくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、又はタンパク質のアミド機能（Ｎ－糖タンパク質）、例えばアスパラギン若しくはアルギニン、又はタンパク質の炭素（Ｃ－糖タンパク質）、例えばトリプトファンに結合し得る。糖タンパク質は、１より多くのグリカンを含んでもよいし、１又は複数の単糖類及び１又は複数のオリゴ糖グリカンの組合せを含んでもよく、Ｎ－結合、Ｏ－結合した及びＣ－結合したグリカンの組合せを含んでもよい。全てのタンパク質の５０％より多くが何らかの形態のグリコシル化を有し、したがって、糖タンパク質の資格があると見積もられる。糖タンパク質の例には、ＰＳＭＡ（前立腺－特異的膜抗原）、ＣＡＬ（カンジダ・アンタルティカ（ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼ）、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、凍結防止タンパク質及び抗体がある。
用語「グリカン」は、本明細書中でその通常の科学的な意味で使用されており、タンパク質に結合した単糖類又はオリゴ糖鎖を指す。したがって、用語グリカンは、糖タンパク質の糖質部分を指す。グリカンは１つの糖のＣ－１炭素を介してタンパク質に結合し、その糖は更なる置換がなくてもよいし（単糖類）、又はそのヒドロキシル基の１又は複数で更に置換されていてもよい（オリゴ糖）。天然のグリカンは典型的には１～約１０の単糖類部分を含む。しかしながら、より長い単糖類鎖がタンパク質に結合しているとき、上記単糖類鎖も本明細書中ではグリカンと考えられる。
糖タンパク質のグリカンは単糖類であり得る。典型的には、糖タンパク質の単糖類グリカンはタンパク質に共有結合した単一のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）又はフコース（Ｆｕｃ）からなる。
また、グリカンはオリゴ糖であってもよい。糖タンパク質のオリゴ糖鎖は直鎖状でも分岐状でもよい。オリゴ糖の場合、タンパク質に直接結合している糖はコア糖と呼ばれる。オリゴ糖において、タンパク質に直接結合していないが、少なくとも２つの他の糖に結合している糖は内部糖と呼ばれる。オリゴ糖において、タンパク質に直接結合していないが、単一の他の糖に結合している、即ちその他のヒドロキシル基のうちの１つ又は複数に更なる糖置換基を担持しない糖は末端糖と呼ばれる。誤解を避けるために、糖タンパク質のオリゴ糖内には複数の末端糖が存在してもよいが、コア糖は１つのみである。
グリカンはＯ－結合したグリカン、Ｎ－結合したグリカン又はＣ－結合したグリカンであり得る。Ｏ－結合したグリカンの場合、単糖類又はオリゴ糖グリカンは、典型的にはセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基を介してタンパク質のアミノ酸のＯ－原子に結合している。Ｎ－結合したグリカンの場合、単糖類又はオリゴ糖グリカンはタンパク質のアミノ酸のＮ－原子を介して、典型的にはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖のアミド窒素を介してタンパク質に結合している。Ｃ－結合したグリカンの場合、単糖類又はオリゴ糖グリカンは、タンパク質のアミノ酸のＣ－原子に、典型的にはトリプトファン（Ｔｒｐ）のＣ－原子に結合している。
オリゴ糖の、タンパク質に直接結合している末端はグリカンの還元末端と呼ばれる。オリゴ糖の他の末端はグリカンの非還元末端と呼ばれる。
Ｏ－結合したグリカンには、極めて多様な鎖が存在する。天然のＯ－結合したグリカンは典型的にはセリン又はスレオニン－結合したα－Ｏ－ＧａｌＮＡｃ部分を特徴とし、これが別のＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸及び／又はフコース、好ましくはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸及び／又はフコースにより更に置換されている。グリカン置換を有するヒドロキシル化されたアミノ酸はタンパク質のアミノ酸配列の一部であってもよい。
Ｎ－結合したグリカンには、極めて多様な鎖が存在する。天然のＮ－結合したグリカンは典型的にはアスパラギン－結合したβ－Ｎ－ＧｌｃＮＡｃ部分を特徴とし、次いでその４－ＯＨでβ－ＧｌｃＮＡｃにより更に置換され、次いでその４－ＯＨでβ－Ｍａｎにより更に置換され、次いでさらにその３－ＯＨ及び６－ＯＨでα－Ｍａｎにより更に置換されて、グリカン五糖類Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２となる。コアのＧｌｃＮＡｃ部分はその６－ＯＨでα－Ｆｕｃにより更に置換されていてもよい。五糖類Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は殆ど全てのＮ－結合した糖タンパク質に共通のオリゴ糖足場であり、限定されることはないがＭａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びシアル酸を始めとする広範な他の置換基を担持し得る。その側鎖でグリカンにより置換されたアスパラギンは典型的には配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はスレオニンのいずれかである。
用語「抗体」は本明細書中でその通常の科学的な意味で使用される。抗体は、免疫システムにより産生され、特定の抗原を認識し結合することができるタンパク質である。抗体は糖タンパク質の一例である。用語抗体は本明細書中でその最も広い意味で使用されており、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、抗体断片、並びに二本鎖及び一本鎖抗体を包含する。また、用語「抗体」は本明細書中でヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び癌抗原に特異的に結合する抗体を包含することも意味する。用語「抗体」は全抗体を包含するが、抗体の断片、例えば抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、開裂抗体に由来するＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又はｓｃＦｖを包含することも意味する。また、この用語は遺伝子操作された抗体及び抗体の誘導体を包含する。抗体、抗体の断片及び遺伝子操作された抗体は当技術分野で公知の方法によって得ることができる。適切な市販抗体としては、特に、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ－Ｉ１３１、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ及びブレンツキシマブがある。
同一性/類似性
本発明の文脈において、タンパク質又はタンパク質断片はアミノ酸配列によって表される。
本明細書中で所与の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）によって同定される各々のタンパク質若しくはタンパク質断片又はペプチド若しくは誘導されたペプチド若しくはポリペプチドは開示されているこの特定の配列に限定されないと理解されたい。「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列の間の関係と定義される。当技術分野で、「同一性」とは、場合によってアミノ酸配列の鎖間の一致により決定されるかかる配列間の配列類似性の程度も意味する。本明細書中他に示さない限り、所与の配列番号の同一性又は類似性は上記配列の全長に基づく（即ち、その全長にわたる、又は全体としての）同一性又は類似性を意味する。
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定されることはないが（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含めて公知の方法により容易に計算することができる。
同一性を決定するために好ましい方法は試験される２以上の配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は公的に入手可能なコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するのに好ましいコンピュータープログラム方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０（１９９０）がある。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するのに使用できる。
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには次のものが含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）；比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆによるＢＬＯＳＳＵＭ６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５－１０９１９（１９９２）；Ｇａｐペナルティー：１２；及びＧａｐ長ペナルティー：４。これらのパラメーターと共に有用なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメーターはアミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップのペナルティーなし）。任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者には明らかなように、当業者はいわゆる「保存的な」アミノ酸置換も考慮し得る。保存的なアミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり、アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、イオウを含有する側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換のグループは：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列内の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその代わりに挿入されているものである。アミノ酸の変更は保存的であることが好ましい。各天然のアミノ酸に対する好ましい保存的な置換は：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎからＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ又はＨｉｓ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及び、ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕである。
糖タンパク質の改変方法
本発明は、改変された糖タンパク質を得るための、糖タンパク質の改変のインビトロ方法に関し、上記方法はβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを使用する。方法はインビトロ方法であることが好ましい。特に、本発明は糖タンパク質の改変方法に関し、この方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体の存在下で、より特定的にはその作用の下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップを含み、
ここで：
（ｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
Figure 0007297820000003
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖類、又は２～２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
に従い、
（ｉｉ）糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（３）：
Figure 0007297820000004
（式中：
ａは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｎは０～２４の範囲の整数であり；ｏは０～１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され；
ＴはＣ３～Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）－Ｎ３
（ｂ）－Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４
（ここでＲ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）－ＳＨ
（ｅ）－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｆ）－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｇ）－Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１１
（ここで、Ｒ１１は任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｊ）Ｒ１２
（ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基である）；
（ｋ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ２４アレニル基である）
からなる群から選択される）
に従う。
上に記載したように、糖タンパク質の改変のための本発明の方法により、改変された糖タンパク質が得られる。改変された糖タンパク質は、本明細書で、式（４）又は（５）に従うグリカンを含む糖タンパク質として定義され：
Figure 0007297820000005
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ及びＧは上記定義の通りであり；
Ｓｕ（Ａ）は式（６）に従う糖誘導体である）：
Figure 0007297820000006
（式中：
ａ、Ｕ、Ａ及びＴは上記定義の通りである）。
改変された糖タンパク質の式（４）及び（５）に従うグリカンにおいて、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）のＣ１はβ－１，４－Ｏ－グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合している。
糖タンパク質の改変のための方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップを更に含み得る。したがって、本発明はまた、糖タンパク質の改変のための方法であって、
（１）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップであり、ここで末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）又は（２）に従う、ステップ；及び
（２）β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体の存在下で上記糖タンパク質を糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップであり、ここでＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは上記定義の式（３）に従う、ステップ
を含む、方法にも関する。
β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃ及び改変された糖タンパク質、並びにこれらの好ましい実施形態について、以下により詳細に記載する。
酵素
本発明の方法は、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、又はその突然変異体の存在下で、より特定的にはその作用の下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップを含む。第２の態様において、本発明は、本明細書に記載されているβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの突然変異体に関し、これは本発明の方法を実施するために特に設計されている。β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの突然変異体は天然のβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼに由来する。β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本明細書中で、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素、又はβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ、又はＧａｌＮＡｃＴとも称される。用語「β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、又はその突然変異体」は、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼを指す。
β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ）は当技術分野で公知である。典型的には、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴは、ウリジン二リン酸－ＧａｌＮＡｃ（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、またＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰとも称される）から、糖タンパク質グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分への、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の転移を触媒する酵素であり、ここでＧａｌＮＡｃ部分のＣ１がβ－１，４－Ｏ－グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合する。以下により詳細に記載するように、ｂが１である式（１）に従うグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分、即ちフコシル化されたＧｌｃＮＡｃからなるグリカンのＧｌｃＮＡｃ部分は、本明細書中で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分とも考えられる。
本発明の方法において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素、又はその突然変異体は、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃから糖タンパク質グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分への糖誘導体Ｓｕ（Ａ）の転移を触媒し、ここで、上に記載したように、Ｓｕ（Ａ）は式（６）に従い、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（３）に従い、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）に従う。この方法において、Ｓｕ（Ａ）部分のＣ１はβ－１，４－Ｏ－グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合する。
本発明の方法で使用するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来し、即ち無脊椎動物種に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来することが好ましい。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は当業者に公知の無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であることができるか、又はそれに由来することができる。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、好ましくはクロマドラ綱（Ｃｈｒｏｍａｄｏｒｅａ）若しくは双腺綱（Ｓｅｃｅｒｎｅｎｔｅａ）、又は節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）、好ましくは昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来することが好ましい。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、カエノラブディティス・エレガンス、カエノラブディティス・レマネイ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｒｅｍａｎｅｉ）、カエノラブディティス・ブリグサエ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエ、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ ｌｏａ）、クビレハリアリ（Ｃｅｒａｐａｃｈｙｓ ｂｉｒｏｉ）、ネバダオオシロアリ（Ｚｏｏｔｅｒｍｏｐｓｉｓ ｎｅｖａｄｅｎｓｉｓ）、フロリダオオアリ（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ）、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）又はオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）、好ましくはカエノラブディティス・エレガンス、豚回虫、イラクサギンウワバ又はキイロショウジョウバエに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することが好ましい。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、カエノラブディティス・エレガンス、豚回虫又はイラクサギンウワバに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することがより好ましい。更に好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、豚回虫に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。別の更に好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、イラクサギンウワバに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。別の更に好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はカエノラブディティス・エレガンスに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来する。
本明細書中で、カエノラブディティス・エレガンスはＣｅと、豚回虫はＡｓと、イラクサギンウワバはＴｎと、キイロショウジョウバエはＤｍとも称される。
本発明の方法で使用するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、配列番号２～５及び１５～２３からなる群から選択される配列、より好ましくは配列番号２～５からなる群から選択される配列、即ち配列番号２、３、４又は５に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中でＣｅＧａｌＮＡｃＴと命名されたカエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）、本明細書中でＡｓＧａｌＮＡｃＴと命名された豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号３）、本明細書中でＴｎＧａｌＮＡｃＴと命名されたイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号４）、本明細書中でＤｍＧａｌＮＡｃＴと命名されたキイロショウジョウバエβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号５）、カエノラブディティス・レマネイβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１５）、カエノラブディティス・ブリグサエβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１６）、バンクロフト糸状虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１７）、ロア糸状虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１８）、クビレハリアリβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号１９）、ネバダオオシロアリβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２０）、フロリダオオアリβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２１）、マガキβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２２）及びオオカバマダラβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２３）からなる群から選択される天然又は野生型のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来することが好ましい。
線形動物門、好ましくはクロマドラ綱、好ましくはカンセンチュウ目（Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ）、好ましくはラブジチス科（Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａｅ）、好ましくはカエノラブディティス属（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）の無脊椎動物種に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素が更に好ましい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号２、１５及び１６からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。上記無脊椎動物種はカエノラブディティス・エレガンスのものであることが最も好ましい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号２に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、線虫門、好ましくは双腺綱（Ｓｅｃｅｍｅｎｔｅａ）、好ましくは回虫目（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ）、好ましくは回虫科（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａｅ）、好ましくは回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）の無脊椎動物種に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種は豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ Ｓｕｍ）のものであることがより好ましい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号３からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、節足動物門（Ａｎｔｈｒｏｐｏｄａ）、好ましくは昆虫綱、好ましくはチョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、好ましくはヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、好ましくはトリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の無脊椎動物種に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種はイラクサギンウワバのものであることがより好ましい。イラクサギンウワバはときにフィトメトラ・ブラシカエ（Ｐｈｙｔｏｍｅｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、プルシア・インナタ（Ｐｌｕｓｉａ ｉｎｎａｔａ）又はキャベツシャクトリムシと称されることもある。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号４からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、節足動物門、好ましくは昆虫綱、好ましくはハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、好ましくはショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、好ましくはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の無脊椎動物種に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。上記無脊椎動物種はキイロショウジョウバエのものであることがより好ましい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号５からなる群の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
「由来する」とは、本明細書中で、１又は複数の、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０又はそれより多くのアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は付加により天然のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素から変更されたアミノ酸配列を有するものと理解されたい。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、本明細書中で、誘導されたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又は改変されたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体酵素又はβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体とも称される。
上記誘導されたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、安定性、溶解性、活性及び／又は精製の容易さを増大するように、追加のＮ－若しくはＣ－末端アミノ酸又は化学的部分を付加するか又はＮ－若しくはＣ－末端アミノ酸を欠失することにより改変されることが好ましい。
β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＮ－末端細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失することによって改変されることが好ましく、これは本明細書中でトランケート型酵素と命名される。
例えば、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）は本明細書中で、配列番号２の位置３０～３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型カエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解されたい。これらのドメインの欠失は水溶液への増大した溶解性を示す酵素となることは当技術分野で公知である。
同様に、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）は本明細書中で、配列番号３の位置３０～３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）は本明細書中で、配列番号４の位置３３～４２１のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型イラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、ＤｍＧａｌＮＡｃＴ（４７－４０３）は本明細書中で、配列番号５の位置４７～４０３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型キイロショウジョウバエβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解されたい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号６～９の配列のいずれかに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有するが好ましい。本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列のいずれか、より好ましくは配列番号６、配列番号７又は配列番号８の配列のいずれか、更により好ましくは配列番号７又は配列番号８の配列のいずれか、更により好ましくは配列番号８の配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有することがより好ましい。
１又は複数のアミノ酸が置換、付加又は欠失されているβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は本明細書中で突然変異体β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又は誘導されたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素とも称される。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、Ｎ－末端細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失させることによって改変し、１又は複数のアミノ酸を置換することによって突然変異させることが好ましい。１又は複数のアミノ酸の置換は本明細書中で突然変異とも称される。１又は複数の置換されたアミノ酸を含む酵素はまた突然変異体酵素とも称される。
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼがカエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置２５７のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）の、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌとも称される）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）又はアラニン（Ａｌａ、またＡとも称される）による置換を含む。好ましい突然変異はまた、位置３１２のメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）のヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）による置換も含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＣｅＧａｌＮＡｃＴ又はＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）に由来するとき、酵素はＩ２５７Ｌ、Ｉ２５７Ｍ又はＩ２５７Ａの突然変異、及び／又はＭ３１２Ｈの突然変異を含むことが好ましい。
アミノ酸位置の番号付けは本明細書中で野生型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素のアミノ酸位置の番号付けに基づくことに留意すべきである。β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素が例えばトランケート型酵素であるとき、本明細書中で例えばアミノ酸置換の位置を示すために使用される番号は対応する野生型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素のアミノ酸位置の番号付けに対応する。
一例を挙げると、野生型ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（配列番号２）ではイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）がアミノ酸位置２５７に存在する。ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｌ）では、位置２５７のイソロイシンアミノ酸がロイシンアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｌ）で置換されている。上に記載したように、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）は本明細書中で配列番号２の位置３０～３８３のアミノ酸により表されるアミノ酸配列からなるトランケート型ＣｅＧａｌＮＡｃＴ酵素と理解され、一方ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）自体は配列番号６により表される。ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ｌ）で、Ｉ２５７Ｌの番号「２５７」は、対応する野生型ＣｅＧａｌＮＡｃＴの位置２５７（即ち配列番号２の番号２５７のＩアミノ酸がＬアミノ酸で置換されていることを示す。配列番号２の位置２５７のイソロイシンアミノ酸は配列番号６の位置２２８のイソロイシンアミノ酸により表される。
好ましいトランケート型カエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体酵素には、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ｌ）（配列番号１０）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ｍ）（配列番号１１）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ａ）（配列番号１２）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｍ３１２Ｈ）（配列番号１３）がある。
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼがイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型イラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置３３６のトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗとも称される）のフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆとも称される）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）又はバリン（Ｖａｌ、Ｖとも称される）による置換を含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）に由来するとき、酵素はＷ３３６Ｆ、Ｗ３３６Ｈ又はＷ３３６Ｖの突然変異を含むことが好ましい。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）の好ましい突然変異はまた、位置３３９のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅとも称される）のアラニン（Ａｌａ、Ａとも称される）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄとも称される）又はセリン（Ｓｅｒ、Ｓとも称される）による置換も含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）に由来するとき、酵素はＥ３３９Ａ、Ｅ３３９Ｄ又はＥ３３９Ｓの突然変異を含むことが好ましい。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）の別の好ましい突然変異は位置３０２のロイシン（Ｌｅｕ、Ｌとも称される）のアラニン（Ａｌａ、Ａとも称される）又はグリシン（Ｇｌｙ、Ｇとも称される）による置換を含む。他の好ましい突然変異は位置２９９のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）のメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）、アラニン（Ａｌａ、Ａとも称される）又はグリシン（Ｇｌｙ、Ｇとも称される）による置換を含む。もう１つ別の好ましい突然変異は位置３１１のイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉとも称される）のメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）による置換を含む。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）の最も好ましい突然変異体はＬ３０２Ａの突然変異を含む。
ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）に由来するグリコシルトランスフェラーゼは、上に記載したような位置３３６及び３３９の両方の突然変異のような１より多くの突然変異を含有し得る。１つの実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）に由来するグリコシルトランスフェラーゼはＷ３３６Ｆ、Ｗ３３６Ｈ又はＷ３３６Ｖの突然変異及びＥ３３９Ａ、Ｅ３３９Ｇ、Ｅ３３９Ｄ又はＥ３３９Ｓの突然変異を含む。
本発明の方法の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号２５）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号２６）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号２７）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号２８）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号３０）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｓ）（配列番号３１）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）（配列番号２９）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）（配列番号３５）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）（配列番号３６）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）（配列番号３７）；ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）（配列番号３８）；及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）（配列番号３９）からなる群から選択されるイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である。
本発明の方法で使用されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか、又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼはまた、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ａ）（配列番号３２）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｄ）（配列番号３３）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ、Ｅ３３９Ｓ）（配列番号３４）のようなイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素の１より多くの突然変異も含有し得る。
本発明の方法において、グリコシルトランスフェラーゼが豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素又はトランケート型豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素に由来するとき、酵素は１又は複数の突然変異を更に含むことが好ましい。好ましい突然変異は、位置２８２のトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗとも称される）のヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈとも称される）による置換、及び／又は位置２８５のグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅとも称される）のアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄとも称される）による置換、及び／又は位置２４８のフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆとも称される）のアラニン（Ａｌａ、Ａとも称される）による置換、及び／又は位置２４８のフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆとも称される）のグリシン（Ｇｌｙ、Ｇとも称される）による置換、及び／又は位置２４５のバリン（Ｖａｌ、Ｖとも称される）のメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍとも称される）による置換を含む。その結果として、グリコシルトランスフェラーゼがＡｓＧａｌＮＡｃＴ又はＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）に由来するとき、酵素はＷ２８２Ｈの突然変異、及び／又はＥ２８５Ｄの突然変異を含むことが好ましい。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｆ２４８Ａ）（配列番号４０）、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｆ２４８Ｇ）（配列番号４１）及びＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｖ２４５Ｍ）（配列番号４２）からなる群から選択される豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴである。
本発明の方法の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素であるか又はそれに由来するグリコシルトランスフェラーゼは、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｗ２８２Ｈ）（配列番号４６）及びＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｅ２８５Ｄ）（配列番号４７）からなる群から選択される豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴである。
好ましい実施形態において、本明細書で規定されるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、精製を容易にするためのタグをコードする配列を含む。上記タグは、限定されることはないが、ＦＬＡＧ－タグ、ポリ（Ｈｉｓ）－タグ、ＨＡ－タグ、Ｍｙｃ－タグ、ＳＵＭＯ－タグ、ＧＳＴ－タグ、ＭＢＰ－タグ又はＣＢＰ－タグからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくは上記タグが６ｘＨｉｓタグである。上記タグはβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素のＣ－末端で酵素に共有結合することが好ましい。別の更に好ましい実施形態において、上記タグはβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素のＮ－末端で酵素に共有結合する。
β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素がＣ．エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴに由来するとき、Ｈｉｓ－タグ付けしたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素のＣ－末端で酵素に結合されることが好ましく、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）－Ｈｉｓ６（配列番号１４）と表示される。
本発明の方法の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ－タグ付けしたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）（配列番号４９）であるか、又はそれに由来する。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素がイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ－タグ付けしたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号５１）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；３３９Ａ）（配列番号５３）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号５５）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｓ）（配列番号５６）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）（配列番号４３）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）（配列番号４４）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）（配列番号４５）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）（配列番号４８）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）（配列番号５４）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）（配列番号６０）であるか、又はそれに由来する。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素が豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ－タグ付けしたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ６－ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）（配列番号７１）であるか、又はそれに由来する。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素が豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか、又はそれに由来するとき、Ｈｉｓ－タグ付けしたβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＨｉｓ６－ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｗ２８２Ｈ）（配列番号７２）、Ｈｉｓ６－ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｅ２８５Ｄ）（配列番号７３）であるか、又はそれに由来する。
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２～２３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。
上に記載したように、用語「由来する」は例えばトランケート型酵素、突然変異体酵素及び精製を容易にするためのタグを含む酵素を含み、これらの改変体は上により詳細に記載されている。用語「由来する」はまた上により詳細に記載した修飾の組合せを含む酵素を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２～２３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。本発明の方法において使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することがより好ましい。
本方法の別の好ましい実施形態において、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、野生型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ、好ましくは無脊椎動物β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。本方法の別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは無脊椎動物β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴであるか又はそれに由来する。更に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、カエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）又はイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか又はそれに由来する。（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）、（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）又は（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか又はそれに由来するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴｓは上により詳細に記載されている。この実施形態において、本方法で使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２～９からなる群から、即ち配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することが特に好ましい。β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群、更により好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群、尚更により好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来することがより好ましい。本方法で使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号８であるか、又はそれに由来することが最も好ましい。
別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２～９からなる群、即ち配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。本方法で使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群、より好ましくは配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群、更により好ましくは配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することがより好ましい。本方法で使用されるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有することが最も好ましい。
本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼはカエノラブディティス・エレガンスβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。別の特に好ましい実施形態において、ＣｅＧａｌＮＡｃＴは配列番号２又は配列番号６であるか、又はそれに由来する。
別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４であるか、又はそれに由来する。
別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは、配列番号２又は配列番号６に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。別の特に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＣｅＧａｌＮＡｃＴは配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４の配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼはイラクサギンウワバβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＴｎＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。本方法の更に好ましい実施形態において、ＴｎＧａｌＮＡｃＴは配列番号４又は配列番号８であるか又はそれに由来する。別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは配列番号４又は配列番号８に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９及び配列番号６０からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。別の好ましい実施形態において、本方法で使用されるＴｎＧａｌＮＡｃＴは配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９及び配列番号６０からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
本発明の方法の別の特に好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは豚回虫β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ（ＡｓＧａｌＮＡｃＴ）であるか、又はそれに由来する。この実施形態において、ＡｓＧａｌＮＡｃＴは配列番号３又は配列番号７であるか又はそれに由来することが更に好ましい。別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは配列番号３又は配列番号７に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列であるか、又はそれに由来する。本方法の別の更に好ましい実施形態において、本方法で使用されるＡｓＧａｌＮＡｃＴは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は好ましくは１００％の配列同一性を有する。
本発明の方法で使用される誘導された又は野生型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素はＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ転移活性を有することが好ましい。ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚは式（１８）に従う糖誘導体ヌクレオチドであり、以下でより詳細に記載する。ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ転移活性は好ましくは本明細書に例示されている方法により、即ちＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓグリコシルトランスフェラーゼ活性キットの方法によって評価される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｄｅｔａｉｌ＿ｏｂｊｅｃｔｎａｍｅ＿ｇｌｙｃｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ＿ａｓｓａｙ＿ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ．ａｓｐｘ、製品番号ＥＡ００１）。
簡単に言えば、グリコシルトランスフェラーゼキットは、（糖－ＵＤＰヌクレオチドからの）供与体糖の受容体糖への転移の際に遊離するＵＤＰの放出を検出するカップル化アッセイによって特定のグリコシルトランスフェラーゼの活性を決定する。より詳細には、糖の転移の際に遊離するＵＤＰが特定の酵素（ＣＤ３９Ｌ３／エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－３、ＮＴＰＤａｓｅ－３とも知られている）により加水分解されて、ＵＭＰと１当量のリン酸（Ｐｉ）を生成する。後者のリン酸は次に、やはり混合物に加えられたマラカイトグリーンによって検出される。放出される無機リン酸の量に比例して緑色が生じ、その色の６２０ｎｍの吸光度をグリコシルトランスフェラーゼの活性の直接的尺度として測定する。本件の場合、ＵＤＰ－基質からタンパク質のＧｌｃＮＡｃへのＦ２－ＧａｌＮＡｚの転移にはＵＤＰの放出が伴い、このＵＤＰがＣＤ３９Ｌ３により加水分解されてリン酸を生成する。本発明の方法において使用される誘導体又は野生型β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素は、β－（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ突然変異体酵素ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＧａｌＴ－Ｙ２８９Ｌ（配列番号１）のＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ転移活性と比較して、少なくとも３０％、３３％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、又はそれより高く、好ましくは少なくとも３００％のＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ転移活性を有することが好ましい。ここで、転移活性は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓグリコシルトランスフェラーゼ活性キットを使用し、実施例１８に詳細に示される条件を適用し、等量の試験される酵素及びβ－（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ突然変異体酵素ウシＧａｌＴ－Ｙ２８９Ｌ（配列番号１）を用いて評価される。
本発明の第２の態様によるβ－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの突然変異体は、配列番号１、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号７２及び配列番号７３からなる群から選択される配列の１つに対して少なくとも５０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが好ましい。
糖タンパク質及び改変された糖タンパク質
本発明の方法において改変される糖タンパク質はグリカンを含み、上記グリカンは末端ＧｌｃＮＡｃ部分、即ちグリカンの非還元末端に存在するＧｌｃ－ＮＡｃ部分を含む。上記グリカンは１又は複数の単糖類部分を含み、直鎖状でも分岐状でもよい。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２）：
Figure 0007297820000007
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｄは０又は１であり；
ｅは０又は１であり；
Ｇは単糖類、又は２～２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
に従う。
改変される糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む１より多くのグリカンを含んでいてもよい。糖タンパク質はまた、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含まない追加のグリカンも含み得る。
コア－ＧｌｃＮＡｃ－部分、即ちタンパク質に結合しているＧｌｃＮＡｃ－部分は任意選択でフコシル化される（ｂは０又は１である）。コア－ＧｌｃＮＡｃ－部分がフコシル化されているとき、フコースは上記ＧｌｃＮＡｃ－部分のＣ６にα－１，６結合していることが最も一般的である。
ｂが１である場合の式（１）に従うグリカンのＧｌｃＮＡｃ－部分、即ちフコシル化されたＧｌｃＮＡｃからなるグリカンのＧｌｃＮＡｃ－部分は本明細書中で末端ＧｌｃＮＡｃ部分とも考えられることに留意すべきである。
１つの実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは１つのＧｌｃＮＡｃ－部分からなり、グリカンはｂが０の場合の式（１）に従うグリカンである。別の実施形態において、上記グリカンはフコシル化されたＧｌｃＮＡｃ－部分からなり、グリカンはｂが１の場合の式（１）に従うグリカンである。
別の実施形態において、上記グリカンは式（２）に従うグリカンであり、ここでコア－ＧｌｃＮＡｃは、存在するならば、任意選択でフコシル化されている（ｂは０又は１である）。式（２）に従うグリカンで、Ｇは単糖類、又は２～２０、好ましくは２～１２、より好ましくは２～１０、更により好ましくは２、３、４、５、６、７若しくは８、最も好ましくは２、３、４、５若しくは６個の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である。Ｇが分岐オリゴ糖であるとき、Ｇは１又は複数の末端ＧｌｃＮＡｃ－部分を含んでいてもよい。したがって、式（２）に従うグリカンは１より多くの末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含み得る。グリカン（２）で、ｄが０のときはｅが１であり、ｅが０のときはｄが１であることが好ましい。グリカン（２）で、ｄが１であることがより好ましく、ｄが１で、ｅが１であることが更により好ましい。
グリカンに存在し得る糖部分は当業者に公知であり、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）又はシアル酸及びキシロース（Ｘｙｌ）がある。
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）に従う。別の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（２）に従う。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンが式（２）に従うとき、式（２）に従うグリカンは式（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）：
Figure 0007297820000008
（式中、ｂは０又は１である）
に従うグリカンであることが更に好ましい。
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）に従うグリカンであり、より好ましくは式（１）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）に従うＮ－結合したグリカンである。更に好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（２６）又は（２７）に従うグリカンであり、より好ましくは式（１）、（２６）又は（２７）に従うＮ－結合したグリカンである。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２７）に従うグリカンであることが最も好ましく、式（１）又は（２７）に従うＮ－結合したグリカンであることがより好ましい。
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は好ましくは式（７）又は（８）：
Figure 0007297820000009
（式中：
ｂ、ｄ、ｅ及びＧ、並びにそれらの好ましい実施形態は上記定義の通りであり；
ｙは１～２４の範囲の整数であり；
Ｐｒはタンパク質である）
に従う。
本発明の方法において改変される糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む１又は複数のグリカンを含む（ｙは１～２４である）。ｙは１～１２の範囲の整数であることが好ましく、１～１０の範囲の整数であることがより好ましい。ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｙは１、２、３、４、５又は６であることが更により好ましい。ｙは１、２、３又は４であることが更により好ましい。上記したように、糖タンパク質は末端ＧｌｃＮＡｃ部分を持たない１又は複数のグリカンを更に含んでいてもよい。
本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（７）又は（８）に従うとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは、上に記載したような式（１）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）に従う、より好ましくは式（１）、（２６）又は（２７）に従う、最も好ましくは式（１）又は（２７）に従うグリカン、好ましくはＮ－結合したグリカンであるのも好ましい。末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）又は（２７）に従うＮ－結合したグリカンであることが最も好ましい。
本発明の方法の好ましい実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は抗体、より好ましくは式（７）又は（８）に従う抗体であり、ここでタンパク質（Ｐｒ）は抗体（Ａｂ）である。また、改変される糖タンパク質が抗体であるとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記定義の式（１）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）に従う、より好ましくは式（１）、（２６）又は（２７）に従う、更により好ましくは式（１）又は（２７）に従うグリカンであることが好ましい。この実施形態において、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは式（１）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）又は（３０）に従うＮ－結合したグリカン、より好ましくは式（１）、（２６）又は（２７）に従うＮ－結合したグリカン、最も好ましくは式（１）又は（２７）に従うＮ－結合したグリカンであることが更に好ましい。
改変される糖タンパク質が抗体であるとき、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることが好ましく、より好ましくはｙが１、２、４、６又は８であり、更により好ましくはｙが１、２又は４であり、最も好ましくはｙが１又は２である。
上記で定義した通り、上記抗体は全抗体でもよいが、抗体断片であってもよい。抗体が全抗体であるとき、上記抗体は好ましくは各々の重鎖に１又は複数の、より好ましくは１つの末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンを含む。したがって、上記全抗体は好ましくは２以上の、好ましくは２、４、６又は８の上記グリカン、より好ましくは２又は４、最も好ましくは２のグリカンを含む。言い換えると、上記抗体が全抗体であるとき、ｙは好ましくは２、４、６又は８であり、より好ましくはｙは２又は４であり、最も好ましくはｙは２である。抗体が抗体断片であるとき、ｙは１、２、３又は４であり、より好ましくはｙが１又は２であることが好ましい。
好ましい実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。上記抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されることが好ましい。上記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体であることがより好ましく、上記抗体はＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。
本発明の方法において、フコシル化された並びにフコシル化されてないグリカンを含む糖タンパク質混合物を出発糖タンパク質として使用してもよい。上記混合物は例えば１又は複数のフコシル化された（ｂが１）グリカン（１）及び／又は（２）及び／又は１又は複数のフコシル化されてない（ｂが０）グリカン（１）及び／又は（２）を含む糖タンパク質を含み得る。したがって、本発明の方法の前にフコシル化されたグリカンからフコースを除去することは必要ではないが、任意選択である。
末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質は本明細書中で「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質」とも称され、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは本明細書中で「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカン」とも称される。用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質」はｂが１である式（７）のタンパク質を含み、用語「末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカン」はｂが１である式（１）のグリカンを含むことに注意すべきである。
末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質は１又は複数の直鎖及び／又は１又は複数の分岐末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンを含み得る。グリカンはグリカンコア－糖－部分のＣ１を介してタンパク質に結合し、上記コア－糖－部分はコア－ＧｌｃＮＡｃ－部分であることが好ましい。その結果として、タンパク質に結合した末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンが式（２）に従うグリカンであるとき、ｄは１であることが好ましい。グリカンが式（２）に従うとき、ｄは１であり、ｅは１であることがより好ましい。
好ましい実施形態において、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンのコア－糖部分のＣ１は、Ｎ－グリコシド結合を介して、上記タンパク質のアミノ酸残基の窒素原子、より好ましくはアスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸の側鎖のアミド窒素原子に結合する。しかしながら、非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンのコア－糖－部分のＣ１はまた、Ｏ－グリコシド結合を介して、上記タンパク質のアミノ酸残基の酸素原子、より好ましくはセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸の側鎖の酸素原子に結合してもよい。この実施形態において、上記グリカンのコア－糖－部分はＯ－ＧｌｃＮＡｃ－部分又はＯ－ＧａｌＮＡｃ部分、好ましくはＯ－ＧｌｃＮＡｃ部分であることが好ましい。非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンのコア－糖－部分のＣ１はまた、Ｃ－グリコシド結合を介して、タンパク質の炭素原子、例えばトリプトファン（Ｔｒｐ）に結合してもよい。上に記載したように、糖タンパク質は１より多くのグリカンを含み得、Ｎ－結合した、Ｏ－結合した及び／又はＣ－結合した糖タンパク質の組合せを含み得る。
末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンはタンパク質の生来のグリコシル化部位に存在し得るが、タンパク質の異なる部位に導入してもよい。
糖タンパク質が抗体であるとき、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンはＦｃ－断片の領域２９０～３０５のアスパラギン、典型的にはＮ２９７で保存Ｎ－グリコシル化部位に結合することが好ましい。
本発明の方法において改変され得る末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質の幾つかの例を図１に示す。図１（Ａ）は、単一の任意選択でフコシル化されたＧｌｃＮＡｃ－部分を含む糖タンパク質を示す。このＧｌｃＮＡｃ－グリカンは例えばＮ－グリコシド又はＯ－グリコシド結合を介してタンパク質に結合され得る。図１（Ａ）の糖タンパク質は例えば正常な発現の後エンドグリコシダーゼ又はエンドグリコシダーゼの組合せを用いてトリミングすることによって得られる。図１（Ｂ）は、枝の１つが末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む分岐オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質を示す（このグリカンはＧｎＭ５とも表される）。コア－ＧｌｃＮＡｃ部分は任意選択でフコシル化されてもよい。図１（Ｂ）の糖タンパク質は、例えば、スワインソニンの存在下哺乳類システムでの糖タンパク質の発現により、又は工学処理した宿主生物、例えばＬｅｃ１ ＣＨＯ又はピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現により得られる。図１（Ｃ）は、コア－ＧｌｃＮＡｃ部分が任意選択でフコシル化され、全ての枝が末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む分岐オリゴ糖グリカンを含む抗体を示す。図１（Ｃ）の糖タンパク質は、例えば、シアリダーゼ及びガラクトシダーゼの複合作用の際抗体糖型（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）の正常の混合物のトリミングにより得られる。
図２に、糖タンパク質が抗体である場合の糖タンパク質の改変方法の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを用いて、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）が、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃから抗体グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ部分へ転移されて改変抗体を形成する。
上に記載したように、糖タンパク質の改変のための本発明の方法は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップを更に含み得、したがって、本発明はまた、
（１）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を用意するステップであり、ここで末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンは上記で定義された式（１）又は（２）に従う、ステップ；及び
（２）β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体の存在下で上記糖タンパク質を糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップであり、ここでＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは上記で定義された式（３）に従う、ステップ
を含む、糖タンパク質の改変方法にも関する。
例えば、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（１）に従うグリカンを含むとき、方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、適切な酵素、好ましくはエンド－グリコシダーゼの作用により、オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質をトリミングするステップを含む方法によって用意され得る。
非常に多くのグリカンにおいて、第２のＧｌｃＮＡｃ－残基は、図１（Ｂ）及び（Ｃ）にも見られるように、糖タンパク質に直接結合しているＧｌｃＮａｃ－残基に結合している。糖タンパク質に直接結合しているＧｌｃＮＡｃ－残基に第２のＧｌｃＮＡｃ－残基が結合しているグリカンは、式（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質を得るためにトリミングすることができる。トリミングは上記２つのＧｌｃＮＡｃ－残基の間で起こる。
「適切な酵素」は、トリミングされるグリカンが基質である酵素と定義される。本発明の方法のこの特定の実施形態のステップ（１）で使用される好ましい種類の酵素は、トリミングされる特定の１又は複数のグリカンに依存する。本発明の方法のこの特定の実施形態の好ましい実施形態において、本方法のこの特定の実施形態のステップ（１）の酵素はエンド－グリコシダーゼの群から選択される。
エンドグリコシダーゼはグリカン構造の内部のグリコシド結合を開裂することができ、改造及び合成の試みに利することができる。例えば、エンドグリコシダーゼは、保存されたグリカン領域内の予測可能な部位で開裂するとき、不均一なグリカン集団の容易な均質化のために使用することができる。この点において最も重要な種類のエンドグリコシダーゼの１つはエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．９６、一般にエンド及びＥＮＧａｓｅとして知られている）を含み、これはＮ，Ｎ’－ジアセチルキトビオースコア内のβ－１，４－グリコシド結合を加水分解する（概説として参照により本明細書に組み込まれるＷｏｎｇら Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１、１１１、４２５９）ことによって糖タンパク質からＮ－グリカンを除去して単一コアＮ－結合ＧｌｃＮＡｃ残基を残す加水分解酵素の１種である。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは自然界に広く分布しており、一般的な化学酵素的変異体として、微量のマンノースに特異的なエンドＤ；高マンノースに特異的なエンドＡ及びエンドＨ；高マンノース型から二分岐複合型までの範囲のエンドＦサブタイプ；並びにフコシル化されたグリカンを除く殆どのＮ－グリカン構造（高マンノース型／複合型／混合型）を開裂することができるエンドＭがあり、高マンノース型オリゴ糖に対する加水分解活性は複合型及び混合型オリゴ糖に対するよりも有意に高い。これらのＥＮＧａｓｅは末端のＮ－グリカン構造に対して特異性を示すが、その構造を表示するタンパク質には特異性を示さないので、殆どのＮ－結合したグリカンを生来の条件下で糖タンパク質から開裂するのに有用である。
エンドグリコシダーゼＦ１、Ｆ２、及びＦ３は生来のタンパク質の脱グリコシル化に最も適している。エンドＦ１、Ｆ２、及びＦ３の結合特異性は、タンパク質を変性させることなくあらゆる種類のＮ－結合したオリゴ糖を除去し得るタンパク質の脱グリコシル化の一般的な方策を示唆している。二分岐及び三分岐の構造はそれぞれエンドグリコシダーゼＦ２及びＦ３により直ちに除去することができる。オリゴ－マンノース及び混合構造はエンドＦ１により除去することができる。
エンドＦ３は、その開裂がオリゴ糖のペプチド結合の状態、並びにコアフコシル化の状態に感受性であるという点で独特である。エンドグリコシダーゼＦ３はアスパラギン－結合した二分岐及び三分岐の複合オリゴ糖を開裂する。またフコシル化されてない二分岐及び三分岐構造を遅い速度で、しかしペプチド－結合されている場合にのみ開裂する。コアフコシル化された二分岐構造はエンドＦ３に対する効率的な基質であり、その活性は４００倍にもなる。オリゴマンノース及び混合分子に対しては活性がない。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｒｅｎｔｉｎｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９５、５、５９９を参照。
Ｃｏｌｌｉｎら（参照により本明細書に組み込まれるＥＭＢＯ Ｊ．２００１、２０、３０４６）により開示されているように、エンドＳは化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分泌されるエンドグリコシダーゼであり、またグリコシドヒドロラーゼファミリー１８に属する。しかしながら、上述のＥＮＧａｓｅと対照的に、エンドＳはより明確な特異性を有し、ヒトＩｇＧのＦｃドメインの保存Ｎ－グリカンのみを特異的に開裂し（他の基質は今まで同定されていない）、酵素とＩｇＧとのタンパク質－タンパク質相互作用がこの特異性をもたらすことを示唆している。
エンドＳ２としても知られているエンドＳ４９は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０３７８２４号（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ）に記載されている。エンドＳ４９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｙｏｇｅｎｅｓ）ＮＺ１３１から単離され、エンドＳの同族体である。エンドＳ４９は生来のＩｇＧに対して特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有しており、エンドＳより大きい様々なＦｃグリカンを開裂する。
好ましい実施形態において、この実施形態のステップ（１）の酵素はエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである。更に好ましい実施形態において、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ及びエンドＡ、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
トリミングされるグリカンが複合型の二分岐構造であるとき、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
糖タンパク質が抗体であり、トリミングされるオリゴ糖が複合型の二分岐構造（即ち図１（Ｃ）に従う）であり、Ｎ２９７のＩｇＧ保存されたＮ－グリコシル化部位に存在するとき、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群、より好ましくはエンドＳ及びエンドＳ４９、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
糖タンパク質が抗体であり、トリミングされるグリカンが複合型の二分岐構造であり、Ｎ２９７のＩｇＧ保存されたＮ－グリコシル化部位に存在しないとき、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＦ１、エンドＦ２及びエンドＦ３、又はこれらの組合せからなる群から選択される。
トリミングされるグリカンが高マンノースであるとき、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは好ましくはエンドＨ、エンドＭ、エンドＡ及びエンドＦ１からなる群から選択される。
したがって、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（１）に従うグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、好ましくは、オリゴ糖グリカンを含む糖タンパク質のグリカンをエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの作用によりトリミングして、式（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質を提供するステップを含む方法によって用意される。
更に好ましい実施形態において、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＨ、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されることがより好ましい。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼはエンドＳ又はエンドＳ４９であることが最も好ましい。
糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のエンドグリコシダーゼによる処理によって式（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質を用意する方法を図４に示す。図４は、糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ（上記糖型は図２に示されている）の混合物を含む糖タンパク質、この場合は抗体のエンドグリコシダーゼによる処理と、続く例えばβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素を用いたＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚからのＮ－アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）の転移により、式（３２）に従う改変抗体が得られることを示す。
例えば本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（２６）に従うグリカンを含むとき、「ＧｎＭ５」とも称される式（２６）の任意選択でフコシル化されたグリカンを含む糖タンパク質は様々な手段で提供され得る。この実施形態において、糖タンパク質は、例えば参照により組み込まれるＫａｎｄａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００６、１７、１０４～１１８に記載されているように、スワインソニンの存在下での混合Ｎ－糖タンパク質の発現、及び必要であれば続くシアリダーゼ／ガラクトシダーゼ処理によって提供されることが好ましい。代わりの手法には、宿主生物の遺伝子操作がある。例えば、Ｌｅｃ１ ＣＨＯはＭｎｓ－ＩＩの発現のための遺伝子を欠如するノックアウトＣＨＯ細胞株である。結果として、Ｎ－グリカンの生合成はグリカンのＧｎＭ５－段階で停止せざるを得ず、これは上清から純粋な形で単離することができる。より広範な手法により、正常にプログラムされてない酵母又は昆虫細胞のような宿主生物の遺伝子操作を伴い、混合又は複合Ｎ－グリカンを生成する。しかしながら、これらの非哺乳類宿主細胞（例えばＧｌｙｃｏｓｗｉｔｃｈ（商標））も、ＧｎＭ５－型及びＭ５－型のグリカンを含む特定のＮ－糖タンパク質の単一の糖型の選択的な発現のために使用することができることは十分に立証されている。
したがって、本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（２６）に従うグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、式（２６）の任意選択でフコシル化されたグリカンを含む糖タンパク質は、スワインソニンの存在下での宿主生物内における糖タンパク質の発現を含む方法によって提供されることが好ましい。上記宿主生物は、哺乳類の細胞株、例えばＨＥＫ２９３又はＮＳ０又はＣＨＯ－細胞株であることが好ましい。得られる糖タンパク質は、式（２６）のグリカン（ＧｎＭ５とも称される）、ＧａｌＧｎＭ５と称されるグリカン、ＳｉａＧａｌＧｎＭ５と称されるシアル化されたグリカン及び／又はこれらの混合物を含むタンパク質の混合物として得ることができる。非還元シアル酸及び／又はガラクトース部分は、存在する場合、糖タンパク質のシアリダーゼによる処理（シアル酸部分の除去）及び／又はβ－ガラクトシダーゼによる処理（ガラクトース部分の除去）によって除去することができ、それにより式（２６）のグリカンを含む糖タンパク質が得られる。シアリダーゼ及びβ－ガラクトシダーゼによる処理は（１ｂ）の単一のステップで行うことが好ましい。この実施形態において、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、
（１ａ）スワインソニンの存在下における宿主生物での糖タンパク質の発現；及び
（１ｂ）式（２６）のグリカンを含む糖タンパク質を得るための、得られた糖タンパク質のシアリダーゼ及び／又はβ－ガラクトシダーゼによる処理
のステップを含む方法によって提供されることが更に好ましい。
本発明の方法において改変される糖タンパク質が式（２７）に従うグリカンを含むとき、本方法のステップ（１）において、改変される糖タンパク質は、例えば、糖タンパク質の糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のシアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる処理を含む方法によって提供され得る。図３に、二分岐のグリカンを含む抗体の糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆを示す。
図４は、糖型Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの混合物のシアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる処理、それに続く、β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴを用いたＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚからの例えばＮ－アジドアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｚ）の転移により式（３３）に従う改変抗体を提供することによって、式（２７）に従うグリカンを含む糖タンパク質、この場合は抗体を提供する方法を示す。
糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃ
本発明の糖タンパク質の改変のための方法において、式（１）又は（２）に従うグリカンを含む糖タンパク質を、（突然変異体）β－（１，４）－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの作用の下で、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させる。糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（３）：
Figure 0007297820000010
（式中：
ａは０又は１であり；
Ｎｕｃはヌクレオチドであり；
Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｎは０～２４の範囲の整数であり；ｏは０～１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択され；
ＴはＣ３～Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよく；
Ａは、
（ａ）－Ｎ３
（ｂ）－Ｃ（Ｏ）Ｒ３
（ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｃ）－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４
（ここでＲ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｄ）－ＳＨ
（ｅ）－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８
（ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｆ）－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８
（ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｇ）－Ｘ
（ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）；
（ｈ）－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５
（ここでＲ５はＣ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい）；
（ｉ）Ｒ１１
（ここでＲ１１は任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ２４アルキル基である）；
（ｊ）Ｒ１２
（ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基である）；
（ｋ）Ｒ１３
（ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ２４アレニル基である）
からなる群から選択される）
に従う。
Ｎｕｃは本明細書中でヌクレオチドと定義される。Ｎｕｃは好ましくはヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸からなる群から、より好ましくはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）からなる群から、より好ましくはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択される。Ｎｕｃはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）であることが最も好ましい。したがって、好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）はＳｕ（Ａ）－ＵＤＰ（３１）：
Figure 0007297820000011
（式中、Ｕ、ａ、Ｔ及びＡは上記定義の通りである）
である。
１つの実施形態において、Ａはアジド基－Ｎ３である。
別の実施形態において、Ａはケト基－Ｃ（Ｏ）Ｒ３であり、ここでＲ３は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基、好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基、より好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基である。Ｒ３はメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルであることが更により好ましく、Ｒ３はメチルであることが最も好ましい。
別の実施形態において、Ａはアルキニル基である。好ましい実施形態において、アルキニル基は（ヘテロ）シクロアルキニル基、好ましくは（ヘテロ）シクロオクチニル基である。別の好ましい実施形態において、アルキニル基－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４であり、ここでＲ４は水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基、好ましくは水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基、より好ましくは水素又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基である。Ｒ４は水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルであることが最も好ましい。この実施形態において、アルキニル基は末端アルキニル基であることが更に好ましく、即ちＲ４は好ましくは水素である。
別の実施形態において、Ａはチオール基－ＳＨである。
別の実施形態において、Ａはチオール基の前駆体－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である。Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基であることが好ましく、Ｒ８が任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であるとより好ましく、Ｒ８がメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルであることが更により好ましい。Ｒ８がメチルであることが最も好ましい。糖タンパク質の改変のための本発明の方法において、Ａがチオール基の前駆体である糖誘導体ヌクレオチドを使用し得る。この方法中に、チオール－前駆体はチオール基に変換される。
別の実施形態において、Ａは－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８であり、ここでＶはＯ又はＳであり、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基である。好ましい実施形態において、Ａは－ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８である。別の好ましい実施形態において、Ａは－ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８である。Ａが－ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８であるときとＡが－ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８であるときの両方で、Ｒ８は好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基であり、より好ましくはＲ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であり、更により好ましくはＲ８はメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。Ｒ８はメチルであることが最も好ましい。
別の実施形態において、ＡはハロゲンＸである。ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から、好ましくはＣｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から、より好ましくはＣｌ及びＢｒからなる群から選択される。ＸはＣｌであることが最も好ましい。
別の実施形態において、Ａはスルホニルオキシ基－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５であり、ここでＲ５はＣ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキルアリール基及びＣ７～Ｃ２４アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は任意選択で置換されていてもよい。Ｒ５はＣ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ６～Ｃ１２アリール基、Ｃ７～Ｃ１２アルキルアリール基又はＣ７～Ｃ１２アリールアルキル基であることが好ましい。Ｒ５は－ＣＨ３、－Ｃ２Ｈ５、Ｃ３直鎖又は分岐アルキル基、Ｃ４直鎖又は分岐アルキル基、Ｃ６～Ｃ１０アリール基及びＣ７アルキルアリール基からなる群から選択されることがより好ましい。Ｒ５はメチル基、エチル基、フェニル基又はｐ－トリル基であると更により好ましい。スルホニルオキシ基がメシレート基－ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、ベンゼンスルホネート基（－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ５））又はトシレート基（－ＯＳ（Ｏ）２（Ｃ６Ｈ４ＣＨ３））であることが最も好ましい。
別の実施形態において、ＡはＲ１１であり、ここでＲ１１は任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ２４アルキル基、好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ１２アルキル基、より好ましくは任意選択で置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキル基である。Ｒ１１はエチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルであることが更により好ましく、Ｒ１１がエチルであることが最も好ましい。
別の実施形態において、ＡはＲ１２であり、ここでＲ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基である。本明細書中で、用語「末端アルケニル基」は、炭素－炭素二重結合がアルケニル基の末端に位置するアルケニル基を指す。したがって、末端Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基は末端がＣ＝ＣＨ２部分で終了する。Ｒ１２は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基であることが好ましく、任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ２～Ｃ６アルケニル基であることがより好ましい。末端アルケニル基は直鎖アルケニル基、好ましくは非置換の直鎖アルケニル基であることがより好ましい。Ｒ１２は－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及び－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から選択されることが更により好ましい。Ｒ１２は－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２、－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２及び－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２からなる群から選択されることが尚更により好ましい。Ｒ１２は－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２であることが最も好ましい。
別の実施形態において、ＡはＲ１３であり、ここでＲ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ２４アレニル基である。本明細書中で、用語「末端アレニル基」は、Ｃ＝Ｃ＝Ｃ部分がアレニル基の末端に位置するアレニル基を指す。したがって、末端Ｃ３～Ｃ２４アルケニル基は末端が－Ｃ＝Ｃ＝ＣＨ２部分で終了する。Ｒ１３は任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ１２アルケニル基、より好ましくは任意選択で置換されていてもよい末端Ｃ３～Ｃ６アルケニル基であることが好ましい。末端アレニル基は直鎖アレニル基、好ましくは非置換の直鎖アレニル基であることがより好ましい。Ｒ１３は－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２、－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２及び－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２からなる群から選択されることが更により好ましい。Ｒ１３は－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２及び－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２からなる群から選択されることが尚更により好ましい。Ｒ１３は－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２であることが最も好ましい。ＡがＲ１３であるとき、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）で、ＵとＴが両方とも存在しないことが特に好ましい。即ち、ａが０であり、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは０であり、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏ、ｐ及びｑは全て０であることが特に好ましい。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）で、ＴはＣ３～Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン基であり、ここで（ヘテロ）アリーレン基は任意選択で置換されていてもよい。好ましい実施形態において、Ｔは存在しない（ａが０である）。別の好ましい実施形態において、Ｔが存在する（ａは１である）。ａが１であるとき、（３）の（ヘテロ）アリーレン基ＴはＡで置換されており、ここでＡは上記定義の通りである。
（ヘテロ）アリーレン基Ｔは任意選択で１又は複数の置換基Ｒ２により更に置換されており、ここでＲ２はハロゲン（－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、好ましくは－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ）、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ９、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８～Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、アミノ基（好ましくは－Ｎ（Ｒ１０）２）、オキソ基及び－Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基はＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子により任意選択で中断され、Ｒ７はＣ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３～Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３～Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、ここでアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されていてもよく、Ｒ９はＣ１～Ｃ１２アルキル基であり、Ｒ１０は独立して水素及びＣ１～Ｃ１２アルキル基から選択される。Ｒ９はＣ１～Ｃ６アルキル基、更により好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチル基であることが好ましい。Ｒ１０は水素又はＣ１～Ｃ６アルキル基、より好ましくは水素又はＣ１～Ｃ４アルキル基であることが好ましく、Ｒ１０が水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチル基であることが最も好ましい。
Ｒ２が－Ｓｉ（Ｒ７）３基であるとき、Ｒ７は独立してＣ１～Ｃ１２アルキル基、より好ましくは独立してＣ１～Ｃ６アルキル基、更により好ましくは独立してＣ１～Ｃ４アルキル基であることが好ましく、最も好ましくはＲ７は、独立して、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチル基である。
Ｒ２は存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ９、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１～Ｃ１２アルキル基、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ基、アミノ基（－Ｎ（Ｒ１０）２）、オキソ基及び－Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択されることが好ましく、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０並びにＲ７、Ｒ９、Ｒ１０の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ９、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、オキソ基及び－Ｓｉ（Ｒ７）３基からなる群から独立して選択されることがより好ましく、ここでＲ７、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ７、Ｒ９、Ｒ１０の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ９、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１～Ｃ４アルキル基及びＣ１～Ｃ４アルコキシ基からなる群から独立して選択されることが更により好ましく、ここでＲ９及びＲ１０、並びにＲ９及びＲ１の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、メチル、メトキシ、エチル、エトキシ、ｎ－プロピル、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロピル、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブチル、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブチル、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブチル及びｔ－ブトキシからなる群から独立して選択されることが尚更により好ましい。Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、メチル及びメトキシからなる群から独立して選択されることが最も好ましい。
好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基は置換されていない。別の好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基は１又は複数の置換基Ｒ２を含み、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上に定義されている。
用語「（ヘテロ）アリーレン基」は本明細書中で、アリーレン基及びヘテロアリーレン基を指す。用語「（ヘテロ）アリーレン基」は本明細書中で、単環状の（ヘテロ）アリーレン基及び二環状の（ヘテロ）アリーレン基を指す。Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）中の（ヘテロ）アリーレン基はあらゆるアリーレン基又はあらゆるヘテロアリーレン基であり得る。
本発明の方法の好ましい実施形態において、（３）中の（ヘテロ）アリーレン基Ｔは、フェニレン基、ナフチレン基、アントラシレン基（anthracylene）、ピロリレン基、ピロリウミレン基、フラニレン基、チオフェニレン基（即ちチオフラニレン基）、ピラゾリレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、イソオキサゾリレン基、オキサゾリレン基、オキサゾリウミレン基、イソチアゾリレン基、チアゾリレン基、１，２，３－トリアゾリレン基、１，３，４－トリアゾリレン基、ジアゾリレン基、１－オキサ－２，３－ジアゾリレン基、１－オキサ－２，４－ジアゾリレン基、１－オキサ－２，５－ジアゾリレン基、１－オキサ－３，４－ジアゾリレン基、１－チア－２，３－ジアゾリレン基、１－チア－２，４－ジアゾリレン基、１－チア－２，５－ジアゾリレン基、１－チア－３，４－ジアゾリレン基、テトラゾリレン基、ピリジニレン基、ピリダジニレン基、ピリミジニレン基、ピラジニレン基、ピラジジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニウミレン基、ベンゾフラニレン基、ベンゾチオフェニレン基、ベンズイミダゾリレン基、インダゾリレン基、ベンゾトリアゾリレン基、ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニレン基、ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニレン基、ピロロ［３，２－ｃ］ピリジニレン基、ピロロ［３，２－ｂ］ピリジニレン基、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジニレン基、イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［４，３－ｄ］ピリジニレン基、ピラゾロ［４，３－ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［３，４－ｃ］ピリジニレン基、ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジニレン基、イソインドリレン基、インダゾリレン基、プリニレン基、インドリニレン基、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジニレン基、イミダゾ［１，５－ａ］ピリジニレン基、ピラゾロ［１，５－ａ］ピリジニレン基、ピロロ［１，２－ｂ］ピリダジニレン基、イミダゾ［１，２－ｃ］ピリミジニレン基、キノリニレン基、イソキノリニレン基、シノリニレン基、キナゾリニレン基、キノキサリニレン基、フタラジニレン基、１，６－ナフチリジニレン基、１，７－ナフチリジニレン基、１，８－ナフチリジニレン基、１，５－ナフチリジニレン基、２，６－ナフチリジニレン基、２，７－ナフチリジニレン基、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［４，３－ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［２，３－ｄ］ピリミジニレン基、ピリド［２，３－ｂ］ピラジニレン基、ピリド［３，４－ｂ］ピラジニレン基、ピリミド［５，４－ｄ］ピリミジニレン基、ピラジノ［２，３－ｂ］ピラジニレン基及びピリミド［４，５－ｄ］ピリミジニレン基からなる群から選択され、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
更に好ましい実施形態において、（ヘテロ）アリーレン基Ｔはフェニレン基、ピリジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニレン基、ピリミジニウミレン基、ピラジニレン基、ピラジジニレン基、ピロリレン基、ピロリウミレン基、フラニレン基、チオフェニレン基（即ちチオフラニレン基）、ジアゾリレン基、キノリニレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、オキサゾリレン基及びオキサゾリウミレン基からなる群から選択され、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
（ヘテロ）アリーレン基Ｔは、フェニレン基、ピリジニレン基、ピリジニウミレン基、ピリミジニレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリレン基、ピリミジニウミレン基、イミダゾリウミレン基、ピロリレン基、フラニレン基及びチオフェニレン基からなる群から選択されることが更により好ましく、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
（ヘテロ）アリール基Ｔは、フェニレン基、イミダゾリレン基、イミダゾリウミレン基、ピリミジニウミレン基、ピリジニレン基及びピリジニウミレン基からなる群から選択されることが最も好ましく、全ての基は１又は複数の置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよく、ここでＲ２及びＲ２の好ましい実施形態は上記定義の通りである。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）において、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ここでｎは０～２４の範囲の整数であり；ｏは０～１２の範囲の整数であり；ｐ及びｑは独立して０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであることが好ましい。
本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｕは存在しない、即ちｎ、ｐ、ｏ及びｑが全て０である。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、Ｕが存在する、即ちｎ、ｐ、ｏ及びｑは全てが０ではない。その結果として、この実施形態において、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは１～２４の範囲の整数であり、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏは１～１２の範囲の整数であり、及び／又はｐは１若しくは２であり、及び／又はｑは１若しくは２である。言い換えると、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏ、ｐ及びｑの少なくとも１つは０ではない。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは０～２４の範囲の整数である。好ましい実施形態において、ｎは１～２４の範囲、好ましくは１～１２の範囲の整数である。この実施形態において、より好ましくは、ｎは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくは、ｎは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくは、ｎは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくは、ｎは１、２又は３であり、尚更により好ましくは、ｎは１又は２であり、最も好ましくはｎは１である。別の好ましい実施形態において、ｎは０である。ｎか０又は１であることが特に好ましい。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが１以上であるとき、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基からなる群、より好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓ－ブチル基又はｔ－ブチル基からなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ及びメチルからなる群から独立して選択されることが更により好ましく、Ｒ１がＨ及びＦからなる群から独立して選択されることが最も好ましい。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが１又は２であるとき、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃの－［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ－部分の好ましい例には－（ＣＨ２）－、－（ＣＦ２）－、－（ＣＣｌ２）－、－（ＣＢｒ２）－、－（ＣＭｅ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＨ２ＣＢｒ２）－、－（ＣＨ２ＣＩ２）－、－（ＣＨ２ＣＭｅ２）－、－（ＣＦ２ＣＦ２）－、－（ＣＣｌ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＢｒ２ＣＢｒ２）－及び－（ＣＭｅ２ＣＭｅ２）－、より好ましくは－（ＣＨ２）－、－（ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＦ２）－及び－（ＣＦ２ＣＦ２）－がある。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが３以上であるとき、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃの－［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ－部分の好ましい例には、－（ＣｎＨ２ｎ）－、－（ＣｎＦ２ｎ）－、－（ＣｎＣｌ２ｎ）－、－（ＣｎＢｒ２ｎ）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＦ２）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＣｌ２）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＢｒ２）－及び－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＭｅ２）－、例えば－（Ｃ３Ｈ６）－、－（Ｃ３Ｆ６）－、－（Ｃ３Ｃｌ６）－、－（Ｃ３Ｂｒ６）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＢｒ２）－及び－（Ｃ４Ｈ８）－がある。より好ましい例には、－（ＣｎＨ２ｎ）－、－（ＣｎＦ２ｎ）－、例えば－（Ｃ３Ｈ６）－、－（Ｃ４Ｈ８）－、－（Ｃ３Ｆ６）－及び－（Ｃ４Ｆ８）－がある。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏは０～１２の範囲の整数であり、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。ｏは１～１０の範囲の整数であることが好ましく、より好ましくはｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはｏは１、２又は３であり、尚更により好ましくは、ｏは１又は２であり、最も好ましくはｏは１である。別の好ましい実施形態において、ｏは０である。ｏは０、１又は２であることが特に好ましい。ｏが０である場合、ｐが０であるとき、ｑは１又は２であり、ｑが０であるとき、ｐは１又は２であることが更に好ましい。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏ及び／又はｐ及び／又はｑが１以上であるとき、Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基からなる群、より好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択される。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓ－ブチル基又はｔ－ブチル基からなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１はＨ、Ｆ、Ｃｌ及びメチルからなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ１がＨであることが最も好ましい。
Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃの－［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑ－部分の好ましい例には－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－ＣＨ２－及び－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｏ－（ＣＨ２）２－があり、ここでｏは１、２、３、４、５又は６であり、好ましくはｏは１、２、３又は４であり、より好ましくはｏは１又は２であり、最も好ましくはｏは１である。
本発明の方法において、ａ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは全てが０ではないことが好ましい。したがって、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏ、ｐ及びｑが０であるとき、ａは好ましくは０ではなく、及び／又はＵが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが０であるとき、ａは好ましくは０ではない。言い換えると、Ｕが存在しないと（即ちｏ、ｐ及びｑが０であり、ｎが０であるとき）、ａは０ではないことが好ましい。
本発明の方法の好ましい実施形態において、ａは０であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎは１～２４の範囲の整数である。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは以下に定義される式（９）（ここでＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎである）に従う。この実施形態において、ａが０であり、ｎが１～１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａは０であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはａが０であり、ｎは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａが０であり、ｎは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａが０であり、ｎは１又は２であり、最も好ましくはａは０であり、ｎは１である。
［Ｃ（Ｒ１）２］ｎの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ａは０であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｐ、ｏ及びｑは全てが０ではなく、即ちｏは１～１２の範囲の整数であり、及び／又はｐは１若しくは２であり、及び／又はｑは１若しくは２である。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは以下に定義される式（９）（ここでＵは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑである）に従う。この実施形態において、ａは０であり、ｏは１～１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａは０であり、ｏは１～１０の範囲であり、更により好ましくはａは０であり、ｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａは０であり、ｏは１又は２であり、最も好ましくはａは０であり、ｏは１である。また、この実施形態において、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
更にもう１つ別の好ましい実施形態において、ａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎは１～２４の範囲の整数である。この実施形態において、ａが１であり、ｎが１～１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａが１であり、ｎが１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはａが１であり、ｎが１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａが１であり、ｎが１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａが１であり、ｎが１又は２であり、最も好ましくはａが１であり、ｎが１である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｎの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
更にもう１つ別の好ましい実施形態において、ａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１～１２の範囲の整数であり、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。この実施形態において、ａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１～１０の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１又は２であり、最も好ましくはａは１であり、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｏは１である。また、この実施形態において、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である。［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑの好ましい例は上により詳細に記載した通りである。
本発明の方法の好ましい実施形態において、ａが０であり、Ｕが存在し、即ちａが０であり、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは１～２４の範囲の整数であり、又はａが０であり、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏは１～１２の範囲の整数であり、及び／又はｐは１若しくは２であり、及び／又はｑは１若しくは２である。言い換えると、この実施形態において、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、ｏ、ｐ及びｑの少なくとも１つは０ではなく、ａは０である。
本発明の方法の更にもう１つ別の好ましい実施形態において、ａは１であり、Ｕは存在しない。Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｐ、ｏ及びｑが全て０であるとき、又はＵが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ｎが０であるとき、Ｕは存在しない。この実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは以下に定義される式（１０）に従う。
本発明の方法の好ましい実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（９）又は（１０）：
Figure 0007297820000012
（式中、Ｎｕｃ、Ａ、Ｔ及びＵ、並びにそれらの好ましい実施形態は上記定義の通りである）
に従う。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従うとき、Ｕは存在しても存在しなくてもよい。上に記載したように、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ又は［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであり、ｎ、ｐ、ｏ及びｑが全て０であるときＵは存在しない。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従い、Ｕが存在しないとき、ＡはＲ１２及びＲ１３からなる群から選択されることが好ましい。Ｒ１２及びＲ１３の好ましい実施形態は上により詳細に記載されている。（９）にＵが存在しないとき、Ｒ１２は－Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ２であり、Ｒ１３は－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２であることが特に好ましい。Ｎｕｃは好ましくはＵＤＰである。特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（９）に従い、Ｕは存在せず、ＡはＲ１３であり、ここでＲ１３は－Ｃ（Ｈ）＝Ｃ＝ＣＨ２である。したがって、特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（４４）に従う：
Figure 0007297820000013
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従い、Ｕが存在するとき、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであることが好ましい。この実施形態において、ｎは１～２４の範囲の整数であることが好ましく、上に記載したように、ｎは１～１２の範囲であることが更に好ましく、より好ましくはｎは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、更により好ましくはｎは１、２、３、４、５又は６であり、尚更により好ましくはｎは１、２、３又は４であり、尚更により好ましくはｎは１又は２であり、最も好ましくはｎは１である。
また、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従うとき、かつＵが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、（９）の－［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ－部分の好ましい例としては、ｎが１又は２であるとき、－（ＣＨ２）－、－（ＣＦ２）－、－（ＣＣｌ２）－、－（ＣＢｒ２）－、－（ＣＭｅ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、－（ＣＨ２ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＨ２ＣＢｒ２）－、－（ＣＨ２ＣＩ２）－、－（ＣＨ２ＣＭｅ２）－、（ＣＦ２ＣＦ２）－、－（ＣＣｌ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＢｒ２ＣＢｒ２）－及び－（ＣＭｅ２ＣＭｅ２）－があり、ｎが３以上であるとき、－（ＣｎＨ２ｎ）－、－（ＣｎＦ２ｎ）－、－（ＣｎＣｌ２ｎ）－、－（ＣｎＢｒ２ｎ）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＦ２）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＣｌ２）－、－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＢｒ２）－及び－（Ｃ（ｎ－１）Ｈ２（ｎ－１）ＣＭｅ２）－、例えば－（Ｃ３Ｈ６）－、－（Ｃ３Ｆ６）－、－（Ｃ３Ｃｌ６）－、－（Ｃ３Ｂｒ６）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＣｌ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＢｒ２）－、－（Ｃ４Ｈ８）－、－（Ｃ４Ｆ８）－、－（Ｃ４Ｃｌ８）－及び－（Ｃ４Ｂｒ８）－がある。
特に好ましい実施形態において、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるとき、ｎは１又は２であり、Ｒ１はＨ又はＦである。その結果として、特に好ましい実施形態において、Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、（９）の－［Ｃ（Ｒ１）２］ｎ－部分は－（ＣＨ２）－、－（ＣＦ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２）－、－（ＣＦ２ＣＦ２）－又は－（ＣＨ２ＣＦ２）－である。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従うとき、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるときとＵが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるときの両方で、Ａは－Ｎ３、－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４、－ＳＨ、－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８、－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８、－Ｘ及び－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５からなる群から選択されることが好ましく、ここでＶ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、及びこれらの好ましい実施形態は上記定義の通りである。ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、ＡがＸであるとき、ＸはＣｌ又はＢｒであることが好ましく、最も好ましくはＸはＣｌである。Ａは－Ｎ３、－ＳＨ、－ＳＣ（Ｏ）ＣＨ３及び－Ｘからなる群から選択されることがより好ましく、ここでＸは好ましくはＣｌ又はＢｒ、より好ましくはＣｌである。Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであると更に好ましい。
また、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従うとき、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであるときとＵが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるときの両方で、ＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであることが更に好ましい。
式（９）に従う幾つかの特に好ましい糖誘導体ヌクレオチドを以下に示す。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）又は（２２）：
Figure 0007297820000014
（式中：
ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり；
ＶはＯ又はＳであり；
Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基であり；
ｒは０又は１であり；
ｓは１～１０の範囲の整数であり；
ｔは１～１０の範囲の整数であり；
ｕは０～１０の範囲の整数である）
に従う。
（１９）で、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択され、好ましくはＸはＣｌ又はＢｒであり、より好ましくはＸはＣｌである。
（２０）において、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、ｓは１、２、３、４、５又は６であることが好ましい。ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、ｓは１、２、３又は４であることがより好ましく、更により好ましくは、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、ｓは１、２又は３であり、より好ましくは、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、ｓは２又は３である。特にｓが２又は３であるとき、本発明の方法のこの実施形態により得られる改変された糖タンパク質のその後のマレイミドを介したコンジュゲーションによって特に安定なマレイミドコンジュゲートが得られる。ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、好ましくは、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基であり、より好ましくは、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であり、更により好ましくは、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８はメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８はメチルであることが最も好ましい。（２０）において、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８がメチルであり、ｓが１、２、３又は４であることが特に好ましく、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８がメチルであり、ｓが１、２又は３であることが更に特に好ましく、ｒが０であるときとｒが１であるときの両方で、Ｒ８がメチルであり、ｓが１であることが最も好ましい。ｒは０であることが更に好ましい。
（２１）において、ｔは１、２、３、４、５又は６であることが好ましい。ｔは１、２、３又は４であることがより好ましく、ｔは１、２又は３であることが更により好ましく、ｔは２又は３であることが最も好ましい。特に、ｔが２又は３であるとき、本発明の方法のこの実施形態により得られた改変された糖タンパク質のその後のマレイミドを介したコンジュゲーションの結果特に安定なマレイミドコンジュゲートが得られる。
（２２）において、ｕは１、２、３、４、５又は６であることが好ましい。ｕは１、２、３又は４であることがより好ましく、ｕは１又は２であることが最も好ましい。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（９）に従い、Ｕが［Ｃ（Ｒ１）２］ｐ－Ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２Ｃ（Ｒ１）２Ｏ］ｏ－［Ｃ（Ｒ１）２］ｑであるとき、式（９）に従う幾つかの好ましい糖誘導体ヌクレオチドを下に示す。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（３６）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）、（４２）又は（４３）：
Figure 0007297820000015
（式中、ｐ及びｑは独立して０、１又は２である）
に従う。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（３６）、（３７）、（３８）、（３９）、（４０）、（４１）、（４２）又は（４３）に従うとき、ｐ及びｑは１又は２であることがより好ましい。
本発明の方法の別の実施形態において、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）は式（４５）、（４６）又は（４７）に従う：
Figure 0007297820000016
この実施形態において、Ａは任意選択で置換されていてもよいシクロプロペニル基又は任意選択で置換されていてもよいシクロプロペニレン基を含む。Ａは任意選択で置換されていてもよいＣ３～Ｃ１２シクロプロペニル基又は任意選択で置換されていてもよいＣ３～Ｃ１２シクロプロペニレン基を含むことがより好ましく、任意選択で置換されていてもよいＣ３～Ｃ８シクロプロペニル基又は任意選択で置換されていてもよいＣ３～Ｃ８シクロプロペニレン基であることが更により好ましい。Ａは任意選択で置換されていてもよいＣ４～Ｃ１２シクロプロペニル基又は任意選択で置換されていてもよいＣ４～Ｃ１２シクロプロペニレン基を含むことが更により好ましく、任意選択で置換されていてもよいＣ４～Ｃ８シクロプロペニル基又は任意選択で置換されていてもよいＣ４～Ｃ８シクロプロペニレン基であることが尚更により好ましい。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（１０）に従うとき、ＮｕｃがＵＤＰであるのも好ましい。（１０）の（ヘテロ）アリーレン基Ｔ及びＴの好ましい実施形態は（３）について上により詳細に記載した通りである。また、（１０）において、Ｔは１又は複数の独立して選択される置換基Ｒ２により任意選択で置換されていてもよい。（１０）のＲ２及びその好ましい実施形態は（３）について上でより詳細に記載した通りである。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃが式（１０）に従うとき、Ａは－Ｎ３、－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４、－ＳＨ、－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８、－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８及び－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５からなる群から選択されることが好ましく、ここでＶ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、及びそれらの好ましい実施形態は上記定義の通りである。Ａは－Ｎ３、－ＳＨ及び－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８からなる群から選択されることがより好ましい。
式（１０）に従う幾つかの特に好ましい糖誘導体ヌクレオチドを下に示す。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（３４）又は（３５）：
Figure 0007297820000017
（式中：
Ｎｕｃ、Ａ及びＲ２、並びにこれらの好ましい実施形態は（３）について上記定義の通りであり；
ｍは０、１、２、３又は４であり；
Ｒ６はＨ及び任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ２４アルキル基からなる群から選択される）に従う。
（１１）において、ｍは０、１、２、３又は４であり；（１２）において、ｍは０、１、２又は３であり；（１３）において、ｍは０、１、２又は３であり；（１４）において、ｍは０、１又は２であり；（１５）において、ｍは０、１又は２であり；（１６）において、ｍは０又は１である。
（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）において、Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｃ（Ｏ）Ｒ９、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ９、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１０）２、Ｃ１～Ｃ４アルキル基及びＣ１～Ｃ４アルコキシ基からなる群から独立して選択されることが好ましく、ここでＲ９はＣ１～Ｃ１２アルキル基であり、Ｒ１０は水素及びＣ１～Ｃ１２アルキル基から独立して選択される。Ｒ９はＣ１～Ｃ６アルキル基、更により好ましくはＣ１～Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチル基であることが好ましい。Ｒ１０は水素又はＣ１～Ｃ６アルキル基、より好ましくは水素又はＣ１～Ｃ４アルキル基であることが好ましく、Ｒ１０は水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチル基であることが最も好ましい。Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、メチル、メトキシ、エチル、エトキシ、ｎ－プロピル、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロピル、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブチル、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブチル、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブチル及びｔ－ブトキシからなる群から独立して選択されることがより好ましい。Ｒ２は、存在するとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＣＮ、－ＮＯ２、メチル及びメトキシからなる群から独立して選択されることが更により好ましい。Ｒ２は、存在するときＦ及びＣｌからなる群から選択されることが最も好ましい。更に好ましい実施形態において、ｍは１又は２である。別の好ましい実施形態において、ｍは０である。
（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）において、Ａは－Ｎ３、－Ｃ≡Ｃ－Ｒ４、－ＳＨ、－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８、－ＳＣ（Ｖ）ＯＲ８及び－ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５からなる群から選択されるのも好ましく、ここでＶ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、及びこれらの好ましい実施形態上記定義の通りである。Ａは－Ｎ３、－ＳＨ及び－ＳＣ（Ｏ）Ｒ８からなる群から選択されることがより好ましい。更にＮｕｃはＵＤＰであることが好ましい。
（１３）において、Ｒ６はＨ又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ１２アルキル基であることが好ましく、Ｒ６はＨ又は任意選択で置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基であることがより好ましく、Ｒ６はＨ、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓ－ブチル基又はｔ－ブチル基であることが更により好ましく、Ｒ６はＨ又はメチル基であることが最も好ましい。
Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（１０）の特に好ましい実施形態において、Ａは－Ｎ３であり、ＮｕｃはＵＤＰであり、ｍは０、１、２、３又は４であり、Ｒ２（ｍが１、２、３又は４であるとき）はＸであり、ここでＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。この実施形態において、ＸはＦ又はＣｌであることが更に好ましい。
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、Ｓｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（２３）、（２４）又は（２５）に従う：
Figure 0007297820000018
（２４）及び（２５）において、Ｘは同一でも異なってもよい。Ｘは同一であることが好ましい。ＸはＦ、Ｃｌ又はＢｒ、より好ましくはＦ又はＣｌであることが更に好ましい。特に好ましい実施形態において、（２４）及び（２５）のＸはＦである。別の特に好ましい実施形態において、（２４）及び（２５）のＸはＣｌである。
本発明による改変された糖タンパク質の製造方法は、例えば適切な濃度のＭｎ２＋又はＭｇ２＋イオンを含有するリン酸で緩衝化された生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水、トリス－緩衝生理食塩水）、クエン酸、ＨＥＰＥＳ、トリス及びグリシンのような適切な緩衝溶液中で実施することが好ましい。適切な緩衝液は当技術分野で公知である。緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はトリス緩衝液であることが好ましい。
本方法は、約４～約５０℃の範囲、より好ましくは約１０～約４５℃の範囲、更により好ましくは約１５～約４０℃の範囲、最も好ましくは約２０～約３７℃の範囲の温度で実施することが好ましい。
本方法は、約５～約９の範囲、好ましくは約５．５～約８．５の範囲、より好ましくは約６～約８の範囲のｐＨで実施することが好ましい。本方法は約７～約８の範囲のｐＨで実施することが最も好ましい。
特定の実施形態において、特定の突然変異体β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ、例えばＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）を用いて本発明の方法を実施するとき、本方法はまた、Ｍｎ２＋イオンの代わりにＭｇ２＋イオンを含有する適切な緩衝溶液中でも実施し得る。
本発明の方法は幾つかの利点を有する。まず第１に、本方法はβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素を用いて行われる。酵素は野生型のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ、又はその突然変異体であり得る。様々な生物に由来する広範囲のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴが天然に入手可能である。加えて、広範囲のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴがＣＨＯの一過性発現とその後の直接的なカチオン交換カラム精製で容易に得られる。この方法で、酵素は典型的には少なくとも７５％の純度で得られる。
加えて、上により詳細に記載した糖誘導体Ｓｕ（Ａ）のような非天然のＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ誘導体の転移に関するβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴのトランスフェラーゼ活性は、従来技術で知られているβ－（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）突然変異体のトランスフェラーゼ活性より高く、又は更に有意に高い可能性がある。
例えば、本発明の方法において、幾つかのβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ及びその突然変異体のトランスフェラーゼ活性は、幾つかの糖誘導体Ｓｕ（Ａ）に対して（有意に）より高いことが決定された。特に、図７から明らかになるように、ＣｅＧａｌＮＡｃＴは、アジド－ＧａｌＮＡｃ誘導体の末端ＧｌｃＮＡｃを含有する糖タンパク質への転移に関して、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）より１０倍高い活性を示すことが見出された。
図７は、上により詳細に記載したＲ＆Ｄシステムグリコシルトランスフェラーゼ活性キットにより決定された、式（１８）に従う糖誘導体Ｓｕ（Ａ）からＧｌｃＮＡｃへのＦ２－ＧａｌＮＡｚの転移に関する、様々な異なるβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴの活性プロットを、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）突然変異体と比較して示す。図７から、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ－Ｈｉｓ及びＴｎＧａｌＮＡｃＴが、同じプロセスに対するＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）のトランスフェラーゼ活性より有意に高いトランスフェラーゼ活性を有することが明白に理解できる。
同様に、図８は、Ｒ＆Ｄシステムグリコシルトランスフェラーゼ活性キットにより決定された、ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ（１８）からＧｌｃＮＡｃへのＦ２－ＧａｌＮＡｚの転移に対する、様々な異なるＣｅＧａｌＮＡｃＴ突然変異体、即ちＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ｌ）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ｍ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ａ）の活性プロットを示す。図８は、突然変異体β－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴのＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ｌ）、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ｍ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｙ２５７Ａ）はまた、同じプロセスに対するＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）のトランスフェラーゼ活性より有意に高いトランスフェラーゼ活性も有することを明白に示している。
実施例１．ＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼの選択及び設計
初期の評価のために、５つの特定の配列、特にＵｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＧＵＭ２（Ｃ．エレガンス；本明細書中では配列番号２として識別される）、Ｕ１ＭＥＶ９（豚回虫（Ａ．ｓｕｕｍ）；本明細書中では配列番号３として識別される）、Ｑ６Ｊ４Ｔ９（イラクサギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）；本明細書中では配列番号４として識別される）、Ｑ７ＫＮ９２（キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）；本明細書中では配列番号５として識別される）及びＱ６Ｌ９Ｗ６（ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ））を選択した。
以下のポリペプチドを予測される細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの欠失に基づいて構築した。これらのポリペプチドは予測される配列を含む：
Ｃ．エレガンス（配列番号６で識別されるＣｅＧａｌＮＡｃＴ［３０－３８３］）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAIFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
豚回虫（配列番号７で識別されるＡｓＧａｌＮＡｃＴ［３０－３８３］）
DYSFWSPAFIISAPKTLTTLQPFSQSTSTNDLAVSALESVEFSMLDNSSILHASDNWTNDELVMRAQNENLQLCPMTPPALVGPIKVWMDAPSFAELERLYPFLEPGGHGMPTACRARHRVAIVVPYRDRESHLRTFLHNLHSLLTKQQLDYAIFVVEQTANETFNRAKLMNVGYAEAIRLYDWRCFIFHDVDLLPEDDRNLYSCPDEPRHMSVAVDKFNYKLPYGSIFGGISALTREQFEGINGFSNDYWGWGGEDDDLSTRVTLAGYKISRYPAEIARYKMIKHNSEKKNPVNRCRYKLMSATKSRWRNDGLSSLSYDLISLGRLPLYTHIKVDLLEKQSRRYLRTHGFPTC
イラクサギンウワバ（配列番号８で識別されるＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１］）
SPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKLHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGEDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
キイロショウジョウバエ（配列番号９で識別されるＤｍＧａｌＮＡｃＴ［４７－４０３］）
HKYAHIYGNASSDGAGGSEASRLPASPLALSKDRERDQELNGGPNSTIRTVIATANFTSIPQDLTRFLLGTKKFLPPRQKSTSALLANCTDPDPRDGGPITPNTTLESLDVIEAELGPLLRPGGAFEPENCNAQHHVAIVVPFRDRYAHLLLFLRNIHPFLMKQRIAYRIFIVEQTNGKPFNRAAMMNIGYLEALKLYQWDCFIFHDVDLLPLDDRNLYNCPRQPRHMSVAIDTLNFRLPYRSIFGGVSAMTREHFQAVNGFSNSFFGWGGEDDDMSNRLKHANLFISRYPVNIARYKMLKHQKEKANPKRYENLQNGMSKIEQDGINSIKYSIYSIKQFPTFTWYLAELKNSERKS
ヒト（配列番号２４で識別されるＨｕＧａｌＮＡｃＴ［５７－９９８］）
RYGSWRELAKALASRNIPAVDPHLQFYHPQRLSLEDHDIDQGVSSNSSYLKWNKPVPWLSEFRGRANLHVFEDWCGSSIQQLRRNLHFPLYPHIRTTLRKLAVSPKWTNYGLRIFGYLHPFTDGKIQFAIAADDNAEFWLSLDDQVSGLQLLASVGKTGKEWTAPGEFGKFRSQISKPVSLSASHRYYFEVLHKQNEEGTDHVEVAWRRNDPGAKFTIIDSLSLSLFTNETFLQMDEVGHIPQTAASHVDSSNALPRDEQPPADMLRPDPRDTLYRVPLIPKSHLRHVLPDCPYKPSYLVDGLPLQRYQGLRFVHLSFVYPNDYTRLSHMETHNKCFYQENAYYQDRFSFQEYIKIDQPEKQGLEQPGFEENLLEESQYGEVAEETPASNNQNARMLEGRQTPASTLEQDATDYRLRSLRKLLAQPREGLLAPFSKRNSTASFPGRTSHIPVQQPEKRKQKPSPEPSQDSPHSDKWPPGHPVKNLPQMRGPRPRPAGDSPRKTQWLNQVESYIAEQRRGDRMRPQAPGRGWHGEEEVVAAAGQEGQVEGEEEGEEEEEEEDMSEVFEYVPVFDPVVNWDQTFSARNLDFQALRTDWIDLSCNTSGNLLLPEQEALEVTRVFLKKLNQRSRGRYQLQRIVNVEKRQDQLRGGRYLLELELLEQGQRVVRLSEYVSARGWQGIDPAGGEEVEARNLQGLVWDPHNRRRQVLNTRAQEPKLCWPQGFSWSHRAVVHFVVPVKNQARWVQQFIKDMENLFQVTGDPHFNIVITDYSSEDMDVEMALKRSKLRSYQYVKLSGNFERSAGLQAGIDLVKDPHSIIFLCDLHIHFPAGVIDAIRKHCVEGKMAFAPMVMRLHCGATPQWPEGYWEVNGFGLLGIYKSDLDRIGGMNTKEFRDRWGGEDWELLDRILQGLDVERLSLRNFFHHFHSKRGMWSRRQMKTL
加えて、Ｎ－末端Ｈｉｓ－タグを含有するポリペプチド変異体を、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）：（配列番号７１で識別されるＨｉｓ６－ＡｓＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３））及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）（配列番号４９で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１））に対して構築した。
実施例２．Ｉ２５７のＣ．エレガンスＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＣｅＧａｌＮＡｃＴとＧａｌＴの配列アラインメントに基づいて、３つの活性部位突然変異体を、イソロイシン２５７からロイシン、メチオニン又はアラニンへの突然変異（下線）によって設計した。
配列番号１０で識別されるＣｅＧａｌＮａｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ｌ）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSALFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
配列番号１１で識別されるＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ｍ）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAMFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
配列番号１２で識別されるＣｅＧａｌＮａｃＴ（３０－３８３；Ｉ２５７Ａ）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAAFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
実施例３．Ｍ３１２のＣ．エレガンスＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
メチオニン３１２からヒスチジンへの突然変異によってＣｅＧａｌＮＡｃＴ突然変異体を設計した。
配列番号１３で識別されるＣｅＧａｌＮａｃＴ（３０－３８３；Ｍ３１２Ｈ）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAIFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKHIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
実施例４．Ｃ－末端Ｈｉｓ６－タグ付きＣｅＧａｌＮＡｃＴの設計
Ｃ－末端Ｈｉｓ６－タグが付いたＣｅＧａｌＮＡｃＴを設計した（ＣｅＧａｌＮＡｃＴ－Ｈｉｓ６）。
配列番号１４で識別されるＣｅＧａｌＮＡｃＴ（３０－３８３）－Ｈｉｓ６）
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAIFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCFHHHHHH
実施例５．ＣＨＯによる酵素の一過性発現
Ｅｖｉｔｒｉａ（チューリッヒ、スイス）により２０ｍＬの規模でタンパク質をＣＨＯ Ｋ１細胞内で一過性に発現させた。図５及び図６に可視化したように、ＨｕＧａｌＮＡｃＴを除く全てのＧａｌＮＡｃＴが十分に発現した。
図５は、ＣＨＯで一過性発現した後の粗製の様々なβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン２～６は還元型酵素であり、レーン７～１１は同じ酵素の非還元型である。レーン１：マーカー、Ｂｉｏｒａｄ 精密プラスタンパク質標準；ＭＷ上から下に向かって：２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ。レーン２＋７：ＴｎＧａｌＮＡｃ。レーン３＋８：ＤｍＧａｌＮＡｃＴ。レーン４＋９：ＡｓＧａｌＮＡｃＴ。レーン５＋１０：Ｃ－末端Ｈｉｓ６－タグ付きＣｅＧａｌＮＡｃＴ。レーン６＋１１：ｈｕＧａｌＮＡｃＴ。５０～５５ｋＤａに見えるタンパク質バンドが所望のＧａｌＮＡｃＴであり、ｈｕＧａｌＮＡｃＴを除く全ての変異体が十分に発現した。
図６は、様々なβ－（１，４）－ＣｅＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。レーン１：マーカー：ＧＥレインボー分子量マーカー；ＭＷ 上から下に向かって：２２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１０２ｋＤａ、７６ｋＤａ、５２ｋＤａ、３８ｋＤａ、３３ｋＤａ、２４ｋＤａ、１７ｋＤａ。レーン２：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）。レーン３：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）。レーン４：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ａ）。レーン５：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ａ）。レーン６：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｌ）。レーン７：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｌ）。レーン８：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｍ）。レーン９：ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２５７Ｌ）。レーン１０：Ｈｉｓ６－タグ付きＣｅＧａｌＮＡｃＴ。約５２ｋＤａに見えるタンパク質バンドはモノマー性のＣｅＧａｌＮＡｃＴ種であり、約１０２ｋＤａに見えるバンドは二量体性のＣｅＧａｌＮＡｃＴ種である。より高いＭＷ（＞２２５ｋＤａ）のタンパク質バンドは特性決定しなかった。
実施例６．Ｈｉｓタグ付けしてないＧａｌＮＡｃＴタンパク質の精製プロトコル
精製プロトコルはＳＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのカチオン交換とそれに続くサイズ排除を基にした。
典型的な精製実験において、発現したＧａｌＮＡｃＴを含有するＣＨＯで産生した上清を２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析した。上清（典型的には２５ｍＬ）を０．４５μＭの孔径のフィルターに通してろ過し、続いて使用前に２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化したカチオン交換カラム（ＳＰカラム、５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製は外部画分収集機を備えたＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムで実施した。サンプルをシステムポンプＡから装填した。結合していないタンパク質を、１０カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５でカラムを洗浄することによってカラムから溶出した。保持されたタンパク質は溶離緩衝液（２０ｍＭトリス、１ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＬ）で溶出した。収集した画分をポリアクリルアミドゲル（１２％）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、標的タンパク質を含有する画分を合わせ、スピンろ過を用いて０．５ｍＬの体積に濃縮した。次に、タンパク質をＡＫＴＡ清浄機系（ＵＮＩＣＯＲＮ ｖ６．３）で調製用Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィーカラムにより精製した。この精製ステップにより、標的タンパク質の二量体、及びモノマー画分が同定、分離された。両方の画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、更に使用するまで－８０℃で保存した。
実施例７．ＣｅＧａｌＮＡｃＴ－Ｈｉｓ６の精製
典型的な精製実験において、ＣＨＯ上清を０．４５μＭ孔径のフィルターに通してろ過し、使用前に緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス緩衝液、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化させたＮｉ－ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ）にかけた。ろ過の前、カラムに対する非特異的な結合を最小にするために、イミダゾールを最終濃度２０ｍＭまでＣＨＯ上清に加えた。最初にカラムを緩衝液Ａ（５０ｍＬ）で洗浄した。保持されたタンパク質は、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、１０ｍＬ）で溶出した。画分をポリアクリルアミドゲル（１２％）上ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、精製された標的タンパク質を含有する画分を合わせ、４℃で一晩行った透析により緩衝液を２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に交換した。精製されたタンパク質は更に使用するまで－８０℃に保存した。注意：モノマー性及び二量体性のＣｅＧａｌＮＡｃＴ－Ｈｉｓ６種の同定のためには（上に記載したように）追加のＳＥＣ精製を実施した。
実施例８．２－アジド－２，２－ジフルオロ酢酸エチルの合成
乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中２－ブロモ－２，２－ジフルオロ酢酸エチル（９５０ｍｇ、４．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（３６５ｍｇ、５．６２ｍｍｏｌ）を加えた。一晩室温で撹拌した後、反応混合物を水（１５０ｍＬ）中に注ぎ入れた。層を分離し、ジクロロメタンを有機層に加え、層を硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、溶媒を減圧下（３００ｍｂａｒ）３５℃で除去して、粗製２－アジド－２，２－ジフルオロ酢酸エチル（２５０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、３２％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．４１（ｑ，Ｊ＝７．２ｈｚ，２Ｈ）、１．３８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
実施例９．α－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸の合成
参照により組み込まれるＬｉｎｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２、７７、１４４９～１４５６にＤ－グルコサミンについて記載された手順に従って、Ｄ－ガラクトサミンから２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸を調製した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ５．６９（ｄｄ，Ｊ＝７．２，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４３～５．４２（ｍ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．５３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２１～４．１３（ｍ，１Ｈ）、４．０７～４．００（ｍ，１Ｈ）、３．８２（ｄｔ，Ｊ＝１０．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１２Ｈ１７Ｎ３Ｏ１１Ｐ（Ｍ－Ｈ＋）の計算値４１０．０６、実測値４１０．００。
実施例１０．α－２－アミノ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸の合成
ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中のα－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（１０５ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を加えた。反応物を水素雰囲気下で２時間撹拌し、セライトでろ過した。フィルターをＭｅＯＨ（１０ｍｌ）で濯ぎ、ろ液を真空中で濃縮して、遊離のアミン（９４ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ５．８７～５．７６（ｍ，１Ｈ）、５．４４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．３０～５．２０（ｍ，１Ｈ）、４．５５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．２８～４．００（ｍ，３Ｈ）、２．１１（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ１１Ｐ（Ｍ－Ｈ＋）の計算値３８４．０７、実測値３８４．１０。
実施例１１．α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸の合成
乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中のα－２－アミノ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸（９４ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジフルオロアジド酢酸エチル（４８ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（６８μＬ、０．４８８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を６時間撹拌し、その後真空中で濃縮して粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（１００：０～５０：５０ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）により、α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸（６３ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、５１％）を得た。
実施例１２．ＵＤＰ－α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースの合成
参照により組み込まれるＢａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３～３９１に従って、α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸をＵＭＰにカップリングした。
したがって、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のＤ－ウリジン－５’－一リン酸二ナトリウム塩（９８ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ）の溶液をＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ８（Ｈ＋形態）で４０分処理し、ろ過した。ろ液を室温で激しく撹拌しながらトリブチルアミン（６３μＬ、０．２６６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。更に３０分撹拌した後、反応混合物を凍結乾燥し、Ｐ２Ｏ５上で、真空下で５時間更に乾燥した。
得られたトリブチルアンモニウムウリジン－５’－一リン酸をアルゴン雰囲気下乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（３５ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（４．６３μＬ）を加え、１５分撹拌して過剰のカルボニルジイミダゾールを除去した。残りのＭｅＯＨを高真空下で１５分間除去した。その後、Ｎ－メチルイミダゾールＨＣｌ塩（６１ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、得られた化合物（６３ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、反応混合物に滴下して加えた。反応物を室温で一晩撹拌した後真空中で濃縮した。イミダゾール－ＵＭＰ中間体の消費をＭＳでモニターした。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ－α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９１３～５．８５（ｍ，２Ｈ）、５．６７（ｄｄ，Ｊ＝６．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．５６～５．５０（ｍ，１Ｈ）、５．４７～５．４３（ｍ，１Ｈ）、５．３１～５．２５（ｍ，２Ｈ）、４．６１～４．４３（ｍ，２Ｈ）、４．３１～４．０５（ｍ，５Ｈ）、２．１６（ｓ，３Ｈ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ２３Ｈ２９Ｆ２Ｎ６Ｏ２０Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値８０９．０９、実測値８０９．１。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ５．６４（ｍ，１Ｈ）、５．４７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，３．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５８～４．４８（ｍ，２Ｈ）、４．２５～４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．０９～４．００（ｍ，１Ｈ）、２．１４（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１４Ｈ１８Ｆ２Ｎ４Ｏ１２Ｐ（Ｍ－Ｈ＋）の計算値５０３．０６、実測値５０３．０。
実施例１３．α－ＵＤＰ－２－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース（ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ、１８）の合成
参照により組み込まれるＫｉｓｏら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、２００６、２３、５６５に従ってＵＤＰ－α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースの脱アセチル化を実施した。
したがって、ＵＤＰ－α－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースをＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２．４ｍＬ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌した後真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、
α－ＵＤＰ－２－（２’－アジド－２’，２’－ジフルオロアセトアミド）－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース（１８）が得られた。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９１～５．８５（ｍ，２Ｈ）、５．５４（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．３１～３．９５（ｍ，９Ｈ）、３．７４～３．６２（ｍ，２Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１７Ｈ２３Ｆ２Ｎ６Ｏ１７Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値６８３．０６、実測値６８３．１０。
実施例１４．α－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースの合成
実施例９で調製したα－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース１－リン酸を、Ｂａｉｓｃｈら Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、５、３８３～３９１に従ってＵＭＰに結合した。
したがって、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）中のＤ－ウリジン－５’－一リン酸二ナトリウム塩（１．４９ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）の溶液をＤＯＷＥＸ ５０Ｗｘ８（Ｈ＋形態）で３０分処理し、ろ過した。ろ液を室温で激しく撹拌しながらトリブチルアミン（０．９６６ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。更に３０分撹拌した後、反応混合物を凍結乾燥し、Ｐ２Ｏ５上で、真空下５時間更に乾燥した。
得られたトリブチルアンモニウムウリジン－５’－一リン酸をアルゴン雰囲気中で乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１．３８ｇ、８．５１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１８０μＬ）を加え、１５分間撹拌して過剰のカルボニルジイミダゾールを除去した。残りのＭｅＯＨを高真空下で１５分かけて除去した。得られた化合物（２．０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、滴下して反応混合物に加えた。反応物を室温で２日間撹拌した後真空中で濃縮した。イミダゾール－ＵＭＰ中間体の消費をＭＳでモニターした。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、α－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（１．０８ｇ、１．５１ｍｍｏｌ、３７％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．９８～５．９４（ｍ，２Ｈ）、５．８１～５．７９（ｍ，１Ｈ）、５．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３０（ｄｄｄ，Ｊ＝１８．５，１１．０，３．２Ｈｚ，２Ｈ）、４．５７（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．３５～４．１６（ｍ，９Ｈ）、４．０７～３．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１７（ｓ，３Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ２１Ｈ２９Ｎ５Ｏ１９Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値７１６．０９、実測値７１６．３。
実施例１５．α－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトースの合成
実施例１４で調製したα－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトースの脱アセチル化を、Ｋｉｓｏら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、２００６、２３、５６５に従って実施した。
したがって、α－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（２２２ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）及びＭｅＯＨ（６ｍＬ）を加えた。反応混合物を３時間撹拌した後真空中で濃縮して粗製α－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトースを得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．０２～５．９８（ｍ，２Ｈ）、５．７３（ｄｄ，Ｊ＝７．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．４２～４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．３０～４．１８（ｍ，４Ｈ）、４．１４～４．０４（ｍ，２Ｈ）、３．８０～３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．６５～３．５８（ｍ，１Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１５Ｈ２３Ｎ５Ｏ１６Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値５９０．０５、実測値５９０．２。
実施例１６．α－ＵＤＰ－Ｄ－ガラクトサミン（Ｇａｌ－ＮＨ２）の合成
Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ １：１（４ｍＬ）中、実施例１５で調製したα－ＵＤＰ－２－アジド－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトースの溶液にリンドラー触媒（５０ｍｇ）を加えた。反応物を水素雰囲気下で５時間撹拌し、セライトでろ過した。フィルターをＨ２Ｏ（１０ｍｌ）で濯ぎ、ろ液を真空中で濃縮してα－ＵＤＰ－Ｄ－ガラクトサミン（ＵＤＰ－ＧａｌＮＨ２）（１６９ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ、２ステップの収率９２％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９９～５．９０（ｍ，２Ｈ）、５．７６～５．６９（ｍ，１Ｈ）、４．３９～４．３４（ｍ，２Ｈ）、４．３１～４．１７（ｍ，５Ｈ）、４．０５～４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９４～３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．８２～３．７０（ｍ，３Ｈ）、３．３０～３．１６（ｍ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１５Ｈ２５Ｎ３Ｏ１６Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値５６４．０６、実測値５６４．１０。
実施例１７．α－ＵＤＰ－Ｎ－（４’－アジド－３’，５’－ジフルオロベンゾイル）－Ｄ－ガラクトサミン（２４、Ｘ＝Ｆ）の合成
参照により組み込まれるＲａｄｅｍａｎｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、２０１２、５１、９４４１～９４４７の４－ペンチン酸スクシンイミジルエステルに対する手順に従って４－アジド－３，５－ジフルオロ安息香酸スクシンイミジルエステルを調製した。
したがって、４－アジド－３，５－ジフルオロ安息香酸の溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１当量）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１．２当量）を加え、得られた懸濁液を一晩撹拌した後真空ろ過した。ろ液を濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解し、その後飽和ＮａＨＣＯ３とブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮し、粗製物を次の反応に使用した。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７４～７．６６（ｍ，２Ｈ）、２．９１（ｓ，４Ｈ）。
次に、実施例１６で調製したＵＤＰ－ＧａｌＮＨ２（３０ｍｇ、０．０５３１ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａＨＣＯ３（０．２Ｍ）に溶解し、ＤＭＦ（０．２Ｍ）に溶解した４－アジド－３，５－ジフルオロ安息香酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（３１ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。反応物を一晩室温で撹拌し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、生成物２４（Ｘ＝Ｆ）（８ｍｇ、０．０１０７ｍｍｏｌ、２０％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．７３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５２～７．３１（ｍ，２Ｈ）、５．８７～５．７１（ｍ，２Ｈ）、５．６５～５．５７（ｍ，１Ｈ）、５．４７～５．３３（ｍ，１Ｈ）、４．４３～３．９６（ｍ，８Ｈ）、３．７６～３．６０（ｍ，２Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ２２Ｈ２５Ｆ２Ｎ６Ｏ１７Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値７４５．０７、実測値７４４．９。
実施例１８．酵素の比活性の決定
ＷｕらによりＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、２１、７２３～７３３（参照により組み込まれる）に記載されており、Ｒ＆Ｄシステム：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＥＡ００１（アクセス日、２０１４年７月３１日）からキットとして市販されているカップリング化グリコシルトランスフェラーゼ法によって酵素の比活性を決定した。
簡単に言えば、９６－ウェルプレートの５０μＬの反応緩衝液（２５ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５）中、室温で２０分グリコシルトランスフェラーゼ反応を実施した。グリコシルトランスフェラーゼの動態パラメーターを決定するために、カップリングホスファターゼ１（ＥＮＴＰＤ３／ＣＤ３９Ｌ３）（２．５μＬの２０ｎｇ／μＬ溶液）を含む固定量の他の全ての成分（ＧｌｃＮＡｃ：２０ｍＭ、ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ：５００μＭ）の存在下で、様々な量の酵素（０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１０及び０．１２μｇの酵素）を用いて複数の反応を同時に実施した。酵素を除く全ての成分を含有するウェルがブランクコントロールの役目を果たした。反応は、基質及びホスファターゼを酵素に添加することによって開始し、３０μＬのマラカイト試薬Ａ及び１００μＬの水を各ウェルに加えることによって停止した。３０μＬのマラカイト試薬Ｂを各ウェルに添加し、次いで穏やかに混合し、室温で２０分インキュベーションすることによって発色させた。発色後、マルチウェルプレートリーダーを用いてプレートを６２０ｎｍで読み取った。リン酸標準曲線も実施して、吸光度と無機リン酸含量との変換係数を決定した。ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚの調製は実施例１３に記載されている。
本明細書に記載したＧａｌＮＡｃＴの比活性を、国際公開第２００７／０９５５０６号及び同第２００８／０２９２８１号（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に以前に開示されたようにＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚを転移することが知られている酵素ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）と比較した。
幾つかの酵素の比活性の決定で収集されたデータを表１及び表２に示す。
Figure 0007297820000019
Figure 0007297820000020
酵素の量に対してプロットした変換（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）を描いたグラフを図７（表１に対応する）及び図８（表２に対応する）に示す。これらのプロットから線形回帰によって比活性を計算した。
実施例１９．ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）の活性決定
ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）の活性も、実施例１４に記載したのと同じ手順で測定したが、この場合はＭｎ２＋の代わりにＭｇ２＋を用いた。この場合、比活性は１５ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇと決定された。
実施例２０．エンドＳによるＩｇＧグリカンのトリミング（一般的なプロトコル）
ＩｇＧグリカンのトリミングは、化膿レンサ球菌に由来するエンドＳ（Ｇｅｎｏｖｉｓ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎから市販）を用いて実施した。ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）をエンドＳ（４０Ｕ／ｍＬ）と共に、２５ｍＭトリスｐＨ８．０中でおよそ１６時間３７℃でインキュベートした。脱グリコシル化されたＩｇＧを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０で洗浄した。
実施例２１．トラスツズマブのトリミング
トラスツズマブを上記のトリミングプロトコルに供した。トリミングされた抗体の分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣを備えたＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴｏＦで行った。サンプル（２μＬ）をＤＴＴ（２μＬ）で１０分間還元し、その後Ｈ２Ｏ（４０μＬ）で希釈してから注入した。ピークの解析後、質量スペクトルは軽鎖の１つのピークと重鎖の２つのピークを示した。重鎖の２つのピークは、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブに由来する１つの主要な生成物（４９４９６Ｄａ、全重鎖の９０％）と、コアＧｌｃＮａｃ置換トラスツズマブに由来する少ない生成物（４９３５１Ｄａ、全重鎖の±１０％）に属していた。これは、式（１）に従うグリカンを含む糖タンパク質の一例である。
実施例２２．スワインソニンの存在下でのトラスツズマブの発現
トラスツズマブを、ＣＨＯ Ｋ１細胞でＥｖｉｔｒｉａ（チューリッヒ、スイス）により１０又は２５μｇ／ｍＬのスワインソニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販）の存在下で一過性に発現させ、プロテインＡセファローズを用いて精製し、質量分析により分析した。両方の濃度のスワインソニンで、ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）－（ｃ＝ｄ＝０、５０７１２Ｄａ、全重鎖生成物の±２０％）、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）－（ｃ＝１、ｄ＝０、５０８７４Ｄａ、全重鎖生成物の±３５％）、及びＳｉａｌ－Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）－（ｃ＝ｄ＝１、５１１６４Ｄａ、全重鎖生成物の±３５％）で置換されたトラスツズマブ重鎖に相当するトラスツズマブの３つの主要な重鎖生成物が得られた。
実施例２３．ｔｒａｓｔ－Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃを与えるシアリダーゼ／ガラクトシダーゼによるトリミング
実施例１８に記載したようにスワインソニンの存在下で一過性に発現させたトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のノイラミニダーゼ（０．５ｍＵ／ｍｇＩｇＧ）（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈから市販）と共に、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０及び２ｍＭ ＣａＣｌ２中で１６時間インキュベートした。これによりシアル酸が完全に除去された。（全重鎖生成物のおよそ２０及び７０％に相当する５０７１２及び５０８７４Ｄａの２つの主要な重鎖生成物）。同じ反応を、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のβ（１，４）－ガラクトシダーゼ（３ｍＵ／ｍｇＩｇＧ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販）の存在下で行ったとき、ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）－置換重鎖を有するトラスツズマブ（ｃ＝ｄ＝０、５０７１２Ｄａ、全重鎖生成物の±９０％）に相当する単一の主要な重鎖生成物と、少ない重鎖生成物（５０７００及び５０９００Ｄａ）とが観察された。これは、式（２６）に従うグリカンを含む糖タンパク質の一例である。
実施例２４．ｔｒａｓｔ－Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を与えるガラクトシダーゼによるトリミング
５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０中トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）及び肺炎レンサ球菌由来のβ（１，４）－ガラクトシダーゼ（３ｍＵ／ｍｇＩｇＧ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販）を３７℃で１６時間撹拌した後ＭＳで分析した。ＧｌｃＮＡｃ２－Ｍａｎ３－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）で置換された重鎖を有するトラスツズマブ（ｃ＝ｄ＝０、５０５９２Ｄａ）に相当する単一の主要な重鎖生成物が観察された。
これは、式（２７）に従うグリカンを含む糖タンパク質の一例である。
ＩｇＧの質量スペクトル解析のための一般的なプロトコル
５０μｇの（改変された）ＩｇＧ、１Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び３０ｍＭ ＤＴＴの、全体積がおよそ７０μＬの溶液を２０分間３７℃でインキュベートしてジスルフィド架橋を還元することで軽鎖と重鎖の両方の分析を可能にした。存在する場合、アジド－官能性はこれらの条件下でアミンに還元される。還元されたサンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてｍｉｌｌｉＱで２回洗浄し、１０μＭの（改変された）ＩｇＧまで濃縮した。還元ＩｇＧをＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦでエレクトロスプレイイオン化飛行時間（ＥＳＩ－ＴＯＦ）により分析した。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを用いて解析されたスペクトルを得た。
ガラクトース誘導体（例えばアジド糖）のＧａｌＮＡｃＴによるグリコシル転移（一般的なプロトコル）
ＩｇＧへのガラクトース誘導体（例えばアジドを含有する糖）の酵素的導入をＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼ又はその突然変異体によって実施した。脱グリコシル化されたＩｇＧ（上に記載したように調製した、１０ｍｇ／ｍＬ）を、改変されたＵＤＰ－ガラクトース誘導体（例えばアジドで改変された糖－ＵＤＰ誘導体）（０．４ｍＭ）及びＧａｌＮＡｃＴ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０中、３０℃で１６時間インキュベートした。官能化されたＩｇＧ（例えばアジドで官能化されたＩｇＧ）を、プロテインＡアガロース（４０μＬ／ｍｇＩｇＧ）と共に４℃で２時間インキュベートした。プロテインＡアガロースを３回ＰＢＳで洗浄し、ＩｇＧを１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出したＩｇＧを１Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和し、濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳで洗浄して１５～２０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
実施例２５．トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２
トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－Ｎ－アジドアセチルガラクトサミン（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴによるグリコシル転移プロトコルにかけた。プロテインＡ親和性精製の後、小さいサンプルをＤＴＴで還元し、その後ＭＳ解析にかけたところ、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＡｚ転移に由来する（４９７１３Ｄａ、全重鎖の９０％）の１つの主要な生成物、及びコアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブへのＧａｌＮＡｚ転移に由来する少ない生成物（４９５６６Ｄａ、全重鎖の±１０％）の形成が示された。
実施例２６．トラスツズマブ（Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ）２
トリミングされたトラスツズマブを、ＵＤＰ－Ｎ－アジドジフルオロアセチルガラクトサミン（ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ）と、ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（又は上に記載したようなその突然変異体）、ＡｓＧａｌＮＡｃＴ、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ又はＤｍＧａｌＮＡｃＴから選択されたＧａｌＮＡｃＴとを用いたグリコシル転移プロトコルにかけた。プロテインＡ親和性精製の後、小さいサンプルをＤＴＴで還元した後にＭＳ解析にかけたところ、サンプル調製中にＤＴＴと反応していたコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＡｚ転移に由来する１つの主要な重鎖生成物（４９８６５Ｄａ、全重鎖のおよそ９０％）の形成が示された。
実施例２７．トラスツズマブ－（Ｆ２－ＧａｌＮＢＡｚ）２
式１中のようなトラスツズマブのエンドＳ処理により得られたトリミングされたトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）を、ＵＤＰ－Ｆ２ＧａｌＮＢＡｚ（２４、Ｘ＝Ｆ、７ｍＭ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（２ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０中３０℃で一晩インキュベートした。還元されたサンプルの質量スペクトル解析で、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ重鎖へのＦ２－ＧａｌＮＢＡｚ転移に由来する１つの主要な生成物（４９８１５Ｄａ、全重鎖のおよそ９０％）の形成が示された。
実施例２８．トラスツズマブ－（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ－ＧａｌＮＡｚ）２
ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）で置換されたトラスツズマブ（式２６の場合と同様であり、スワインソニンの存在下でのトラスツズマブの一過性発現により得られ、実施例１９に記載したようにノイラミニダーゼ及びガラクトシダーゼによりトリミングされたもの）を、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ及びＧａｌＮＡｃＴを用いるグリコシル転移プロトコルに供した。トリミングされた抗体を、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ（０．５ｍＭ）（Ｇｌｙｃｏｈｕｂ，Ｉｎｃから市販）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（０．１ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０中で１６時間３０℃でインキュベートしたところ、ＧａｌＮＡｚ－ＧｌｃＮＡｃ－Ｍａｎ５－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）で置換されたトラスツズマブ（５０９２９Ｄａの主要な重鎖生成物、全重鎖生成物の±９０％）に完全に変換された。
実施例２９．トラスツズマブ－（Ｍａｎ３（ＧｌｃＮＡｃ－ＧａｌＮＡｚ）２）２
ガラクトシダーゼによるトリミングの後に得られたトラスツズマブ（式２７の場合と同様であり、実施例２４に記載したように調製）を、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ及びＧａｌＮＡｃＴを用いたグリコシル転移プロトコルにかけた。トリミングされた抗体を、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ（０．５ｍＭ）（Ｇｌｙｃｏｈｕｂ、Ｉｎｃから市販）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（０．１ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２５ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０中で１６時間２２℃でインキュベートしたところ、（ＧａｌＮＡｚ－ＧｌｃＮＡｃ）２－Ｍａｎ３－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）で置換されたトラスツズマブ（５１０２７Ｄａの主要な重鎖生成物、全重鎖生成物の±９０％）に完全に変換された。
実施例３０．ＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）及びＭｇ２＋を用いるトラスツズマブ（Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ）２
トリミングされたトラスツズマブを、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でＧａｌＮＡｃＴ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ＵＤＰ－Ｎ－アジドジフルオロアセチルガラクトサミン（ＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（Ｍ３１２Ｈ）によるグリコシル転移プロトコルにかけた。プロテインＡ親和性精製の後、小さいサンプルをＤＴＴで還元し、その後ＭＳ解析にかけたところ、サンプル調製中に反応しているコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＡｚ転移に由来する主要な重鎖生成物（４９８７３Ｄａ、全重鎖のおよそ２５％、残りは残存するトリミングされた抗体）の形成が示された。
追加の糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃ（３）の合成
式（３）に従う追加の糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えばいずれも参照により組み込まれる国際公開第２０１４／０６５６６１号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
実施例３１．ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（（２０）、ここでＶはＯ、ｒは０、Ｒ８はＣＨ３）の合成
ＵＤＰ－Ｄ－ガラクトサミン（実施例１６）（４５ｍｇ、０．０７９６ｍｍｏｌ）を緩衝液ｐＨ７（０．５Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）（２ｍＬ）に溶解した。Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（３７ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加え、反応物を一晩室温で撹拌した。更に３６ｍｇのＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテートを加え、３時間後反応物を真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、５２％）が得られた。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９０～５．８２（ｍ，２Ｈ）、５．４８～５．４１（ｍ，１Ｈ）、４．２９～４．２２（ｍ，２Ｈ）、４．２０～４．００（ｍ，５Ｈ）、３．９８～３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７９～３．５９（ｍ，４Ｈ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１９Ｈ２９Ｎ３Ｏ１８Ｐ２Ｓ（Ｍ－Ｈ＋）の計算値６８０．０６、実測値６８０．１。
実施例３２．ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ（（１９）、ここでＸはＣｌ）の合成
ＵＤＰ－Ｄ－ガラクトサミン（実施例１６）（４２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ－（クロロアセトキシ）スクシンイミド（２９ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）（Ｈｏｓｚｔａｆｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６、７９、１３３～１３６に従って調製）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を加えた。反応物を一晩室温で撹拌し、更に１０ｍｇのＮ－（クロロアセトキシ）スクシンイミドを加え、撹拌を一晩続けた。反応物を真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）によって精製してＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ（２５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、５３％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．８９～５．８４（ｍ，２Ｈ）、５．５３～５．４６（ｍ，１Ｈ）、４．３３～４．００（ｍ，９Ｈ）、３．９９～３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．７７～３．５９（ｍ，２Ｈ）、１．８３（ｓ，１Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１７Ｈ２６ＣｌＮ３Ｏ１７Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値６４０．０３（１００％）、６４２．０３（３２％）、実測値６４０．１（１００％）、６４２．２（３５％）。
実施例３３．ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＢｒ（（１９）、ここでＸはＢｒ）の合成
ＵＤＰ－Ｄ－ガラクトサミン（実施例１６）（４２ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（３ｍＬ）に溶解し、Ｎ－（ブロモアセトキシ）スクシンイミド６３ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）（Ｈｏｓｚｔａｆｉら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９６、７９、１３３～１３６に従って調製）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。反応物を一晩室温で撹拌し、真空中で濃縮した。化合物をフラッシュクロマトグラフィー（７：２：１－５：２：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）によって精製してＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＢｒ（２８ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ、６５％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ７．８６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．９７～５．８４（ｍ，２Ｈ）、５．５４～５．４６（ｍ，１Ｈ）、４．３３～４．０４（ｍ，６Ｈ）、３．９９～３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．７９～３．６０（ｍ，２Ｈ）、２．７５～２．６８（ｍ，３Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－）Ｃ１７Ｈ２６ＢｒＮ３Ｏ１７Ｐ２（Ｍ－Ｈ＋）の計算値６８３．９８（１００％）、６８５．９８（９８％）、実測値６８７．１（１００％）、６８８．０（９２％）、６８６．０（８５％）、６８９．０（７２％）。
実施例３４．イラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体及び豚回虫ＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴの突然変異体を、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＰＤＢエントリー１ＯＱＭ）と複合体を形成したウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１及びＱａｓｂａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：２０８３３～２０８３９、参照により組み込まれる）により報告されたβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）突然変異体に対する結晶構造を基にして設計した。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴの突然変異体をＴｎＧａｌＮＡｃＴ及びＡｓＧａｌＮＡｃＴとウシβ（１，４）Ｇａｌ－Ｔ１との配列アラインメントに基づいて設計した。これらのタンパク質間の対応するアミノ酸残基を表３に示す。
Figure 0007297820000021
実施例３５．Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）突然変異体の部位特異的突然変異誘発
ＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位間のＴｎＧａｌＮＡｃＴの残基３３－４２１（配列番号８で識別される）をコードするコドン最適化配列を含有するｐＥＴ１５ｂ－ベクターをＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手し、その結果Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）（配列番号４９で識別される）を得た。ＴｎＧａｌＮａｃＴ突然変異遺伝子を、一組の重複するプライマーを用いて線形増幅ＰＣＲにより上述した構築体から増幅した。各々の突然変異体のために用いた重複するプライマーセットを表４に示す。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号７９及び配列番号８０として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ）（配列番号５１で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８１及び配列番号８２として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８３及び配列番号８４として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号５３で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８５及び配列番号８６として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ）（配列番号５５で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号８８及び配列番号８９として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）（配列番号４５で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号６１及び配列番号６２として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）（配列番号４８で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号６３及び配列番号６４として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）（配列番号５４で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号６５及び配列番号６６として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）（配列番号４３で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号６７及び配列番号６８として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）（配列番号４４で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号６９及び配列番号７０として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）（配列番号６０で識別される）の構築には、本明細書中で配列番号７４及び配列番号８７として規定される一対のプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ増幅の後、反応混合物をＤｐｎＩで処理してテンプレートＤＮＡを消化し、続いてＮＥＢ １０－ベータコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手）に形質転換した。ＤＮＡを単離し、突然変異体Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）（配列番号５０で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）（配列番号５２で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ａ）（配列番号５３で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）（配列番号４５で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）（配列番号４８で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）（配列番号５４で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）（配列番号４３で識別される）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）（配列番号４４で識別される）及びＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）（配列番号６０で識別される）に対する配列解析によって配列を確認した。
Figure 0007297820000022
実施例３６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ）及びＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ａ）の発現及びリフォールディング
Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ａ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ａ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ）、Ｈｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ）及びＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３－４２１；Ｅ３３９Ａ）を、実施例３５に記載したようにして得られた対応するｐＥＴ１５ｂ－構築体から発現させた。発現、封入体単離及びリフォールディングは、Ｑａｓｂａら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３、３０、２１９～７６２２９、参照により組み込まれる）により報告された手順に従って行った。リフォールディング後、不溶性のタンパク質を遠心分離（１０分、４℃、１４．０００×ｇ）及びそれに続く０．４５μＭ－孔径のフィルターに通すろ過によって除去した。可溶性のタンパク質は、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し濃縮した。最初にカラムを緩衝液Ａ（５ｍＭトリス緩衝液、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、１０ｍＬ）で溶出した。画分をポリアクリルアミドゲル（１２％）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、精製された標的タンパク質を含有する画分を合わせ、緩衝液を、一晩４℃で実施した透析によって２０ｍＭトリス ｐＨ７．５及び５００ｍＭ ＮａＣｌに対して交換した。精製されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、更に使用するまで－８０℃で保存した。
実施例３７．Ｗ３３６のイラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴとＧａｌＴの配列アラインメントに基づき、３つの活性部位突然変異体を、トリプトファン３３６からフェニルアラニン、ヒスチジン又はバリンへの突然変異（下線）によって設計した。
イラクサギンウワバ（配列番号５０で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｗ３３６Ｆ］）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKLHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGFGGEDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
イラクサギンウワバ（配列番号５１で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｗ３３６Ｈ］）
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イラクサギンウワバ（配列番号５２で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｗ３３６Ｖ］）
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実施例３８．Ｌ３０２のイラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴとＧａｌＴの配列アラインメントに基づき、２つの活性部位突然変異体をロイシン３０２からグリシン又はアラニンへの突然変異（下線）によって設計した。
イラクサギンウワバ（配列番号４４で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｌ３０２Ｇ］）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKGHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGEDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
イラクサギンウワバ（配列番号４３で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｌ３０２Ａ］）
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実施例３９．Ｅ３３９のイラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴとＧａｌＴの配列アラインメントに基づき、２つの活性部位突然変異体をグルタミン酸３３９からグリシン、アラニン又はアスパラギン酸への突然変異（下線）によって設計した。
イラクサギンウワバ（配列番号５３で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｅ３３９Ａ］）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKLHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGADDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
イラクサギンウワバ（配列番号５５で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｅ３３９Ｄ］）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKLHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGDDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
実施例４０．Ｉ２９９ＭのイラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体の設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴとＧａｌＴの配列アラインメントに基づき、３つの活性部位突然変異体をイソロイシン２９９からメチオニン、アラニン又はグリシンへの突然変異（下線）によって設計した。
イラクサギンウワバ（配列番号４５で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｉ２９９Ｍ］）
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASMDKLHFKLPYEDIFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGEDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
イラクサギンウワバ（配列番号４８で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｉ２９９Ａ］）
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イラクサギンウワバ（配列番号５４で識別されるＨｉｓ６－ＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｉ２９９Ｇ］）
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実施例４１．イラクサギンウワバＧａｌＮＡｃＴ突然変異体Ｉ３１１Ｍの設計
ＴｎＧａｌＮＡｃＴ突然変異体をイソロイシン３１１からメチオニンへの突然変異によって設計した。
イラクサギンウワバ（配列番号６０で識別されるＴｎＧａｌＮＡｃＴ［３３－４２１；Ｉ３１１Ｍ］）
SPLRTYLYTPLYNATQPTLRNVERLAANWPKKIPSNYIEDSEEYSIKNISLSNHTTRASVVHPPSSITETASKLDKNMTIQDGAFAMISPTPLLITKLMDSIKSYVTTEDGVKKAEAVVTLPLCDSMPPDLGPITLNKTELELEWVEKKFPEVEWGGRYSPPNCTARHRVAIIVPYRDRQQHLAIFLNHMHPFLMKQQIEYGIFIVEQEGNKDFNRAKLMNVGFVESQKLVAEGWQCFVFHDIDLLPLDTRNLYSCPRQPRHMSASIDKLHFKLPYEDMFGGVSAMTLEQFTRVNGFSNKYWGWGGEDDDMSYRLKKINYHIARYKMSIARYAMLDHKKSTPNPKRYQLLSQTSKTFQKDGLSTLEYELVQVVQYHLYTHILVNIDERS
実施例４２．ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏｐＮ３（（９）、ここで、Ｕは［ＣＨ２］２、Ａ＝Ｎ３）の合成
ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏｐＮ３、即ち式（３）に従う糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えば全て参照により組み込まれる国際公開第２０１４／０６５６６１号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
実施例４３．ＵＤＰ－ＧａｌＮＢｕｔＮ３（（９）、ここで、Ｕは［ＣＨ２］３、Ａ＝Ｎ３）の合成
ＵＤＰ－ＧａｌＮＢｕｔＮ３、即ち式（３）に従う糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えば全て参照により組み込まれる国際公開第２０１４／０６５６６１号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
実施例４４．ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（（２１）、ここで、ｔ＝２）の合成
ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ、即ち式（３）に従う糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えば全て参照により組み込まれる国際公開第２０１５／０５７０６３号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
実施例４５．ＵＤＰ－ＧａｌＮＢｚＮ３（（２３）、ここで、ＸはＨ）の合成
ＵＤＰ－ＧａｌＮＢｚＮ３、即ち式（３）に従う糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えば全て参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１１２０１３号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
実施例４６．ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｙｒＮ３（（１２）、ここで、ＡはＮ３、Ｒ２はＨ）の合成
ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｙｒＮ３、即ち式（３）に従う糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃを、なかでも、例えば全て参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１１２０１３号（ＳｙｎＡｆｆｉｘ Ｂ．Ｖ．）、Ｐｏｕｉｌｌｙら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、７５３及びＧｕａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０、１６、１３３４３に開示されている手順に従って調製した。
ＧａｌＮＡｃＴを用いたガラクトース誘導体（例えばチオ糖）のグリコシル転移（一般的なプロトコル）
ガラクトース誘導体（例えばチオ含有糖２１）のＩｇＧへの酵素的な導入を、ＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼ又はその突然変異体を用いて実施した。脱グリコシル化されたＩｇＧ（上に記載したように調製、１０ｍｇ／ｍＬ）を、改変ＵＤＰ－ガラクトース誘導体（例えばチオ改変糖－ＵＤＰ誘導体）（２ｍＭ）及びＧａｌＮＡｃＴ（０．２ｍｇ／ｍＬ）と共に、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ６．０中で、１６時間３０℃でインキュベートした。官能化されたＩｇＧ（例えばチオ官能化トラスツズマブ）をプロテインＡアガロース（４０μＬ／ｍｇＩｇＧ）と共に１時間室温でインキュベートした。プロテインＡアガロースをＴＢＳ（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、ＩｇＧを１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．５で溶出した。溶出したＩｇＧを１Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．０で中和し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ６．０で１５～２０ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮し洗浄した。
実施例４７．ＣｅＧａｌＮＡｃＴによるＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（（２１）、ここで、ｔ＝２）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２の調製
トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（２ｍＭ）及びＣｅＧａｌＮＡｃＴ（１ｍｇ／ｍＬ）によるグリコシル転移プロトコルにかけた。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、その後Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した後スペクトル分析にかけた。出発材料の２つの生成物への完全な変換が観察された。主要な生成物（２４３８７Ｄａ、期待質量２４３８８）は脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（トラスツズマブ－（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２）に相当し、一方少ない生成物（２５０３７Ｄａ、期待質量２５０３８）は脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳ－ＵＤＰＧａｌＮＰｒｏＳジスルフィドに相当した。２つの生成物間の比は約６０：４０である。
実施例４８．ＴｎＧａｌＮＡｃＴによるＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（（２１）、ここで、ｔ＝２）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２の調製
トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（２ｍＭ）及びＴｎＧａｌＮＡｃＴ（０．２ｍｇ／ｍＬ）によるグリコシル転移プロトコルにかけた。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、その後Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した後スペクトル分析にかけた。出発材料の２つの生成物への完全な変換が観察された。主要な生成物（２４３８７Ｄａ、期待質量２４３８８）は脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（トラスツズマブ－（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２）に相当し、一方少ない生成物（２５０３７Ｄａ、期待質量２５０３８）は脱グリコシル化トラスツズマブ＋ＧａｌＮＰｒｏＳ－ＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳジスルフィドに相当した。２つの生成物間の比は約６０：４０である。
実施例４９．ＡｓＧａｌＮＡｃＴによるＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（（２１）、ここで、ｔ＝２）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２の調製
トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ（２ｍＭ）及びＡｓＧａｌＮＡｃＴ（０．２ｍｇ／ｍＬ）によるグリコシル転移プロトコルにかけた。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＤＴＴで還元し、その後ＭＳ分析にかけたところ、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＰｒｏＳＨ転移に由来する１つの主要な生成物（４９７５５Ｄａ、全重鎖の９５％）の形成が示された。
実施例５０．ＴｎＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－ＧａｌＮＰｙｒＮ３（（１２）、ここで、ＡはＮ３、Ｒ２はＨ））のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＰｙｒＮ３）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＰｙｒＮ３（（１２）、ここでＡはＮ３であり、Ｒ２はＨである））（４ｍＭ）の存在下でＴｎＧａｌＮＡｃＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）により処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、その後Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した後スペクトル分析にかけた。約５０％の変換が観察された。形成された生成物（２４４４５Ｄａ、期待質量２４４４５）はコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＰｙｒＮ３転移の結果である。
実施例５１．ＴｎＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ（１８）のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＡｚ（１８、１ｍＭ）の存在下で濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＴｎＧａｌＮＡｃＴ（ｗｔ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｖ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｆ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｅ３３９Ａ）又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ａ）によって処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した後スペクトル分析にかけた。ＭＳ分析は、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＡｚ転移の結果である主要な生成物（ＭＷ＝２４４２０Ｄａ）と、コアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＡｚ転移の結果である少ない生成物（ＭＷ＝２４２７３Ｄａ）との形成が示された。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（ｗｔ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｖ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｆ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｅ３３９Ａ）又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ａ）に対する主要な生成物と少ない生成物の観察された累積変換はそれぞれ９５％、２７％、２４％、５％及び９５％であった。
実施例５２．ＴｎＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－ＧａｌＮＢｚＮ３（（２３）、ここで、ＸはＨ）のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＢｚＮ３）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＢｚＮ３（４ｍＭ）（（２３）、ここでＸはＨである）の存在下でＴｎＧａｌＮＡｃＴ（０．７ｍｇ／ｍＬ）により処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、その後Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した後スペクトル分析にかけた。約７０％の変換が観察された。形成された生成物（２４４４４Ｄａ、期待質量２４４４３）はコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＢｚＮ３転移の結果である。
実施例５３．ＴｎＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＢｚＮ３（２４）のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（Ｆ２－ＧａｌＮＢｚＮ３）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－Ｆ２－ＧａｌＮＢｚＮ３（２４、１ｍＭ）の存在下で濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＴｎＧａｌＮＡｃＴ（ｗｔ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｈ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２９９Ｍ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ａ）又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ｇ）によって処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（５０Ｕ、１０μＬのＰＢＳ ｐＨ６．６中）で消化し、その後Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＭｉｌｉＱで洗浄した。ＭＳ分析により、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＢｚＮ３転移の結果である主要な生成物（ＭＷ＝２４４７９Ｄａ）と、コアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブへのＦ２－ＧａｌＮＢｚＮ３転移の結果である少ない生成物（ＭＷ＝２４３３２Ｄａ）との形成が示された。ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（ｗｔ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｗ３３６Ｈ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｉ２９９Ｍ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ａ）又はＴｎＧａｌＮＡｃＴ（Ｌ３０２Ｇ）で観察された主要な生成物と少ない生成物の累積変換はそれぞれ１４％、６２％、２６％、３７％及び１４％であった。
実施例５４．ＡｓＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－ ＧａｌＮＰｒｏｐＮ３（（３１）、ここで、Ｕは［ＣＨ２］２、Ａ＝Ｎ３）のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＮＰｒｏｐＮ３）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＰｒｏｐＮ３（（３１）、ここで、Ｕは［ＣＨ２］２であり、Ａ＝Ｎ３、０．７ｍＭ）の存在下で濃度０．２ｍｇ／ｍＬのＡｓＧａｌＮＡｃＴで処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＤＴＴで還元した後ＭＳ分析にかけたところ、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＰｒｏｐＮ３転移の結果である１つの主要な生成物（４９７５９Ｄａ、全重鎖の７０％）の形成が示された。
実施例５５．ＡｓＧａｌＮＡｃＴによる脱グリコシル化トラスツズマブへのＵＤＰ－ＧａｌＮＢｕｔＮ３（（３１）、ここでＵは［ＣＨ２］３、Ａ＝Ｎ３）のグリコシル転移を介したトラスツズマブ（ＧａｌＮＢｕｔＮ３）２の調製
グリコシル転移の一般的なプロトコルに従って、トリミングされたトラスツズマブをＵＤＰ－ＧａｌＮＢｕｔＮ３（（３１）、ここでＵは［ＣＨ２］３、Ａ＝Ｎ３、０．７ｍＭ）の存在下で濃度０．２ｍｇ／ｍＬのＡｓＧａｌＮＡｃＴ（ｗｔ）で処理した。一晩インキュベーションした後、小さいサンプルをＤＴＴで還元した後ＭＳ分析にかけたところ、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＢｕｔＮ３転移の結果である１つの主要な生成物（４９７７２Ｄａ、全重鎖の５０％）の形成が示された。

Claims (19)

  1. β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの存在下で、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む糖タンパク質を、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃと接触させるステップを含む、改変された糖タンパク質を得るための、糖タンパク質の改変の方法であって、
    （ｉ）末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む前記グリカンは式（１）又は（２）：
    Figure 0007297820000023
    （式中：
    ｂは０又は１であり；
    ｄは０又は１であり；
    ｅは０又は１であり；
    Ｇは単糖類、又は２～２０の糖部分を含む直鎖若しくは分岐オリゴ糖である）
    に従い、
    （ｉｉ）前記糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（９）：
    Figure 0007297820000024
    （式中：
    Ｎｕｃはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択されるヌクレオチドであり；
    Ｕは［Ｃ（Ｒ１）２］ｎであり、ここでｎは１、２、３又は４であり；Ｒ１はＨ、及びＦからなる群から独立して選択され；
    Ａは、－Ｎ ３ 及び－ＳＨからなる群から選択される）
    に従い、或いは
    前記糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）－Ｎｕｃは式（１１）：
    Figure 0007297820000025
    （式中：
    Ａは－Ｎ ３ 及び－ＳＨからなる群から選択され；
    ｍは０～４の範囲の整数であり；
    Ｒ ２ は－Ｆ、及び－Ｃｌからなる群から独立して選択される）
    に従い、
    前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有し、
    前記改変された糖タンパク質は、式（４）又は（５）に従うグリカンを含む糖タンパク質である
    Figure 0007297820000026
    （式中：
    ｂ、ｄ、ｅ及びＧは上記定義の通りであり；
    糖誘導体Ｓｕ（Ａ）のＣ１はβ－１，４－Ｏ－グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に結合している）、方法。
  2. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（９）に従い、前記ｎが１又は２であり、前記Ｒ １ はＨ又はＦである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ヌクレオチドがＵＤＰである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）又は（２１）：
    Figure 0007297820000027
    （式中：
    ｔは１、２又は３である）
    に従う、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（２３）、（２４）又は（２５）：
    Figure 0007297820000028
    （式中ＸはＦ又はＣｌである）
    に従う、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＦである、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含む前記グリカンが式（１）、（２６）又は（２７）：
    Figure 0007297820000029
    （式中：
    ｂは請求項１に定義されている通りである）
    に従う、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む前記糖タンパク質が式（７）又は（８）：
    Figure 0007297820000030
    （式中：
    ｂ、ｄ、ｅ及びＧは請求項１に定義されている通りであり；
    ｙは１～２４の範囲の整数であり；
    Ｐｒはタンパク質である）
    に従う、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 末端ＧｌｃＮＡｃ部分を含むグリカンを含む前記糖タンパク質が抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記無脊椎動物のβ－（１，４）－ＧａｌＮＡｃＴ酵素が、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）に由来する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも９７％の同一性を有する、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記β－（１，４）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、配列番号２、３、４、５、６、７、８及び９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有し、前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＣｌ又はＦである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＣｌ又はＦである、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＣｌ又はＦである、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＣｌ又はＦである、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記糖誘導体ヌクレオチドが式（１７）、（１８）、（２３）又は（２４）に従っており、ここで式（１７）及び（１８）は請求項４に定義されている通りであり、式（２３）及び（２４）は請求項５に定義されている通りであり、ＸはＣｌ又はＦである、請求項１４に記載の方法。
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