JP7290905B2 - カテキン代謝物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は嫌気性微生物によるカテキン代謝物の製造方法に関する。

カテキン類の優れた生理機能が数多く報告される一方で、カテキン類の生体内動態に関する研究も広く行われている。
カテキン類は生体内への吸収量が非常に低く、経口摂取した大部分のカテキン類は腸内において腸内微生物（腸内細菌）の作用により分解され、代謝物として生体内へ吸収されることが示されている。腸内微生物によるカテキン類の代謝に関する報告は多く（非特許文献１乃至４参照）、主な代謝物として５－フェニル－γ－バレロラクトンや５－フェニル－４－ヒドロキシ吉草酸などが挙げられる。また、５－フェニル吉草酸、３－フェニルプロピオン酸、フェニル酢酸、安息香酸など様々な代謝物が尿中から見出されている（非特許文献５乃至７参照）。
近年、茶カテキン代謝物は、様々な有効な作用について研究されておきており、なかでも、５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸が幅広い機能を発揮することが知られている。これらの化合物の機能として、例えば、血圧上昇抑制効果（特許文献１）、ナチュラルキラー細胞活性促進効果（特許文献２）、免疫細胞増殖促進効果（特許文献３）、子宮頸癌増殖抑制効果（特許文献４）、脳神経細胞増殖促進効果（特許文献５）、糖取り込み促進効果（特許文献６）、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害効果（特許文献７）などが挙げられる。

５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンは、化学合成法で製造できることが知られている（非特許文献８）。しかし、化学合成法では合成のステップが多く煩雑である。また、化学合成ゆえに食品として利用する目的としては適さないものであるという問題点がある。

上記の問題点を解決するために、特許文献８、非特許文献９には、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ－５、ユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２及び大腸菌Ｋ１２の３菌株の培養により、５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）γ－バレロラクトンを得る生物学的な製造方法が開示されている。この製造方法は、フェニル基の４’位の水酸基を水素にする（脱水酸基）ために、培地中に水素や蟻酸を添加するか、水素および／または蟻酸生成微生物である大腸菌を共存させるものである。

特開２０１２－１４４５３２号公報 特開２０１６－１６０２３８号公報 特開２０１６－００３２００号公報 特開２０１５－０３０７２４号公報 特開２０１７－０６１４３８号公報 特開２０１７－１０１０１０号公報 特開２０１８－１１８９３９号公報 特開２０１１－８７４８６号公報

Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４９，４１０２－４１１２，２００１ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１３，１７７－１８４，２０００ Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５１，５５６１－５５６６，２００３ Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５１，６８９３－６８９８，２００３ Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５８，１３１３－１３２１，２０１０ Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５８，１２９６－１３０４，２０１０ Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４５，８８８－８９３，１９９７ Ｈａｍａｄａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ９， １５１２－１５２０，２０１０ Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９６（１０），６８１－６９５，２０１４

しかし、特許文献８と非特許文献９に開示された製造方法においては、いずれも水素を添加すること、あるいは、水素および／または蟻酸生成微生物である大腸菌を共存させることが必要であり、製造上安全性を保つためには、特別な製造設備が必要である。また、３菌株を使用するために、製造コスト、製造管理の面で課題がある。
そこで、本発明は、培地中に水素や蟻酸を添加をしない場合、又は、水素及び／又は蟻酸生成微生物である大腸菌を共存させない場合であっても、嫌気性微生物を培養することによってカテキン代謝物である５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）γ－バレロラクトンを製造できる方法を提供する。

本発明者らは、鋭意研究の結果、五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖を培地に使用することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］ 嫌気性条件下で、嫌気性微生物によるカテキン類から５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの少なくとも一種を製造する製造方法において、五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を含む培地を使用することを特徴とする製造方法。
［２］ 前記嫌気性微生物がエガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及びフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株の少なくとも一種であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記カテキン類がエピガロカテキンである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記糖類において、単糖である五炭糖又は多糖の構成糖である五炭糖が、キシロース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース及びリボースからなる群から選択される、［１］乃至［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記培地中の前記糖類の濃度が、１～２０ｇ／Ｌである、［１］乃至［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 嫌気性条件下で、嫌気性微生物によるカテキン類から５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの少なくとも一種を製造する製造方法において、キシロース及びキシロースを構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を含む培地を用いることを特徴とし、前記嫌気性微生物が、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及びフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株である、製造方法。
［７］ 前記キシロース及びキシロースを構成糖として含む多糖が、キシロース、キシロビオース、キシロオリゴ糖及びキシランからなる群から選択される、［６］に記載の製造方法。
［８］ カテキン類がエピガロカテキンである［６］又は［７］に記載の製造方法。

本発明によれば、嫌気性微生物を利用して、カテキン類を出発原料とした５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸および５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの効率的、かつ、安全な製造が実現できる。また、当該製造方法は、高い変換率で上記化合物を製造できる。

図１は、実施例１乃至７及び比較例１乃至８の代謝物の変換率を示し、（Ａ）は４日間培養後の代謝物の変換率であり、（Ｂ）は７日間培養後の代謝物の変換率である。

以下、発明を実施するための形態について説明するが、本発明は、発明を実施するための形態に限定されるものではない。

［カテキン代謝物］
本発明は、嫌気性微生物によりカテキン類からカテキン代謝物を製造する方法である。本発明のカテキン代謝物とは、式（Ｉ）

（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
で示される５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（以下、化合物Ｉで記載する場合もある）、及び式（ＩＩ）

（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
で示される５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸（以下、化合物ＩＩで記載する場合もある）である。

式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物は、カテキン類を出発物質として、製造することができる。ここでカテキン類とは、主にお茶に含まれるポリフェノールの一種である。基質として加えるカテキン類としては、非ガレート型カテキン類であるエピガロカテキン、ガロカテキンや、ガレート型カテキン類である（－）－ガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキンガレートを挙げることができ、特に、（－）－エピガロカテキン、（－）－ガロカテキンを挙げることができ、（－）－エピガロカテキンを好適に用いることができる。ガレート型カテキン類を使用する場合は、タンナーゼを工程中に添加させて、加水分解してから使用してもよい。本明細書において、エピガロカテキンは、式（ＩＩＩ）で示される化合物をいうものとする。

エピガロカテキンを出発物質として嫌気性微生物によってカテキン代謝物を生成する一例として、エピガロカテキンから式（ＩＶ）、式（Ｖ）の化合物を生成し、その後さらに反応が進み、フェニル基の４’位の水酸基を水素に変換された化合物Ｉ、ＩＩが生成される。４位が水素に置換されることで、酸化安定性に優れ、様々な生理機能性素材としての利用範囲が広がり、あるいは生理機能において高い活性が期待できる。

（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）

（式中、波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）

好適な基質として挙げられた（－）－エピガロカテキンは、ツバキ属の常緑樹であるチャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子やこれらの混合物もしくはそれらの粉砕物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物等により抽出し精製することにより得られる。また、生成物の形態的には液体、固体（粉末を含む）の別を問わない。
また、（－）－エピガロカテキンは、シグマアルドリッチ株式会社、富士フィルム和光純薬（株）、Ｈｕｎａｎ Ｓｕｎｆｕｌｌ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈ社などから入手したものを使用することができる。

［嫌気性微生物］
本発明で用いられる嫌気性微生物は、カテキン類を式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の化合物へ変換する能力を有する嫌気性微生物であれば、特に制限されるものではない。ここで、嫌気性微生物とは、増殖に酸素を必要としない生物である。そのような嫌気性微生物の好ましい例としては、エガーテラ属細菌に属する細菌及びフラボニフラクター属細菌に属する細菌を挙げることができる。
エガーテラ属細菌に属する細菌の中でも、エガーテラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ）ＪＣＭ９９７９株がより好ましい。また、フラボニフラクター属細菌に属する細菌としては、フラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ２９８６３株、ＡＴＣＣ４９５３１株がより好ましい。また、これらを組み合わせてもよく、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株と、フラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株とを組み合わせて使用することが最も好ましい。

［培養方法］
本発明において、嫌気性微生物は、下記する培地において、嫌気性条件下でカテキン類と共存させて培養することができる。この培養方法は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。培養装置は、嫌気性培養装置（ジャーファーメンター）を使用することができ、具体例としては、実施例において用いた嫌気性培養装置ＢＭＥ－０５ＮＣＳ－Ｍ（エイブル社製）等を用いることができる。
嫌気性培養装置は、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器を備え、当該容器の内部を大気中の酸素から遮断することができる構造になっている。

さらに、ガスボンベ等から任意の気体を嫌気性培養装置へと供給することができる。供給ガスを構成する気体の組み合わせは特に制限されるものではなく、水素、二酸化炭素、窒素などから選択される１種類以上の気体を構成成分として用いることが可能である。酸素を含まないことが好ましい。
供給ガスの培養装置への通気量は嫌気性微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。好ましくは０．００５～１．０ｖｖｍであり、さらに好ましくは０．０１～０．１ｖｖｍである。「ｖｖｍ」とは、１分間で、液容量に対して何倍の通気をするかということを示すものである。
なお、嫌気性微生物を培養する際の圧力条件は、当該嫌気性微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、好ましい加圧条件としては、０．０２～０．２ＭＰａの範囲を挙げることができる。
本発明において、カテキン類から５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸および５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを製造する際には、従来は、水素を用いる必要があった。これは、水素が存在すると反応途中の脱水酸基が進行しやすくなるためだと推測される。しかしながら、本発明では、雰囲気を形成するガスに水素を添加しなくても反応が進行し、さらには、培地に蟻酸生成微生物である大腸菌等を共存させなくても、反応が進行するという特徴を有する。五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を添加することにより、水素を添加しなくても反応が進行する理由としては、（１）使用菌でも水素が発生する、（２）使用菌の生育が良くなる（代謝の変化）、（３）脱水酸基に関連する遺伝子の発現が増える、などの理由が考えられる。
なお、本発明においては、水素を添加しなくても、カテキン代謝物の生成は進行するが、水素の使用を除外するものではない。水素を使用すれば、製造装置の負荷や安全面がやや不安になるものの、生成の進行速度は高くなると推測される。本明細書において、「水素を添加しない」とは、外部から系の中に積極的に水素を供給することを意味し、外部から系の中に積極的に水素を供給しなければ、不可避的に存在してしまう水素や、何らかの理由により反応中に発生してしまう水素が存在していてもよいものとする。

培養時のｐＨ及び温度は、嫌気性微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。ｐＨは、好ましくは６．０～８．０、より好ましくはｐＨ６．５～７．５であり、温度は、好ましくは３５～４０℃、より好ましくは３７～３９℃である。培養時間は好ましくは１０～３００時間、より好ましくは２４～２００時間である。上述した各種の培養時のｐＨ、温度や培養時間は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、最適条件を選択することができる。

カテキン類を含む培地においてカテキン代謝物（化合物Ｉ及びＩＩ）を生産する際に、嫌気性微生物を植菌する方法は一般的な嫌気性微生物を植菌する方法を採用することができる。例えば、ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬（株）製）のような一般的な嫌気性微生物が生育する培地にて嫌気性微生物を２～５日間培養して得られた前培養液を、カテキン類を含む培地に少量添加する方法が挙げられる。ここで前培養液とは、反応に用いられる嫌気性微生物を含んだ培養液をいう。好ましくは、実施例で用いた方法のようにエガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株、フラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株等の異なる株の菌を別々のＧＡＭブイヨン培地にて２～５日間培養して得られた前培養液を共存させて植菌に用いる。なお、ここでいう前培養液とは、カテキン類を用いて培養する前の培養した液をいう。

［培地］
本発明において、嫌気性微生物の培養に用いられる培地としては、五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を添加する以外は、嫌気性微生物が生育できる培地であれば特に限定されないが、当業者は、適切な培地を選択することができる。

［培地に添加する糖類］
培地に添加する糖類として、五炭糖の単糖又は五炭糖を構成糖として含む多糖からなる糖類を使用することが、本発明の特徴の一つである。五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖からなる糖類は、これらのいずれかを培地に添加してもよく、複数種用いる場合は、混合して用いることもできる。

五炭糖の具体例としては、キシロース、Ｄ－アラビノース（特にＤ－（－）－アラビノース）、Ｌ－アラビノース（特にＬ－（＋）－アラビノース）、リボース等が挙げられる。また、これらの五炭糖は、多糖を構成する五炭糖としても好ましい。

本発明において、多糖とは、２分子又はそれ以上の単糖で構成される糖をいう。すなわち、ここでいう多糖は、二糖やオリゴ糖も含まれる。多糖は、直鎖状であってもよく、分岐鎖を有していてもよい。多糖は、１種の単糖で構成されていてもよく、２種又はそれ以上の単糖で構成されていてもよく、重合度は特に制限されない。
そして、本発明で用いることができる多糖は、多糖を構成する単糖の一部または全部が五炭糖であるという特徴を有する。したがって、多糖を構成する単糖のすべてが五炭糖である必要はなく、例えば、六炭糖などの他の単糖を構成糖として含んでもよい。多糖としては、二糖であるキシロビオース（構成単糖はキシロースの２分子）、プリメベロース（構成単糖はキシロース、グルコースの２分子）、ビシアノース（構成単糖はアラビノース、グルコースの２分子）、そのほか多糖としては、キシロースを構成糖としたオリゴ糖であるキシロオリゴ糖、キシロースを主要な構成糖とした高分子多糖であるキシランなどが挙げられる。

本発明において、キシロースを構成単位として含む糖類を用いることも好ましい。キシロースを構成単位として用いる糖類としては、キシロビオース、キシロトリオース、キシロオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、キシラン、アラビノキシラン（アラビノースとキシロースを構成とする）、ヘミセルロースが挙げられ、これらを二種以上で混合して用いてもよい。

五炭糖の単糖及び／又は五炭糖を構成糖として含む多糖かなる糖類の培地に添加する濃度範囲は、培地１Ｌあたり、１～２０ｇ／Ｌであり、より好ましくは３～１０ｇ／Ｌである。
キシロースを構成単位として含む糖類の好ましい濃度範囲は、培地１Ｌあたり、１～２０ｇ／Ｌであり、より好ましくは３～１０ｇ／Ｌである。
その他の炭素源として、ソルボース、フルクトース、グルコース、ガラクトース、デキストリン、吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸をさらに用いてもよい。

本発明で用いられる培地には、通常の発酵に用いうる各種の栄養源をさらに用いることができる。栄養源としてはアミノ酸類、ペプトン類、酵母エキス、肉エキス、魚エキス、肝臓エキス、麦芽エキス、消化血清末などが好ましく、アルギニン、シトルリン、オルニチン、酵母エキス、ペプトン類がより好ましい。特に、酵母エキスが好ましい。

栄養源であるペプトン類とはタンパク質の加水分解物であり、例えば、カゼインの酵素分解物（例えば、ハイポリペプトン（日本製薬社））、カゼインの膵液分解物（例えば、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ及びＢＢＬ，Ｔｒｙｐｉｃａｓｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ（いずれもＢｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製）、大豆の酵素分解物（例えばハイポリペプトンＳ、ハイポリペプトンＮ、ハイポリペプトンＮＳ（いずれも日本製薬社製））、又は大豆のパパイン分解物（例えば、ＢＢＬ，Ｐｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製））などが挙げられる。これらの中でも、カゼインの分解物が好ましい。

さらに嫌気性微生物の培養に適した他の無機化合物、ビタミン剤、動植物由来の微生物増殖補助因子を培地に加えることもできる。例えば、ビタミンなどの補助因子や各種の塩類等の無機化合物を培地中に加えることによって、嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。無機化合物、ビタミン類として以下のものを挙げることができる。
無機化合物として、例えば、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。
また、ビタミン類として、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ－アミノ安息香酸が挙げられる。さらに、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加するとよい場合がある。

培地の成分としてカゼインの分解物及び酵母エキスを含む培地を利用することによって、化合物Ｉ、ＩＩのカテキン代謝物を効率よく製造することができる。

本発明において、カテキン類の添加量は、嫌気性微生物による変化が可能な範囲内で適宜選択することができる。通常は、培養液１ｍｌあたり０．０００１～０．５ｇであり、好ましくは１ｍｌあたり０．００１～０．１ｇであり、さらに好ましくは１ｍｌあたり０．００５～０．０１ｇである。

［単離方法］
生成されたカテキン代謝物（化合物Ｉ、ＩＩ）を単離するには、種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、ブタノール、エーテルなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製することができる。

本発明で得られた化合物Ｉ及び／又はＩＩは、血圧上昇抑制効果、ナチュラルキラー細胞活性促進効果、免疫細胞増殖促進効果、子宮頸癌増殖抑制効果、脳神経細胞増殖促進効果、糖取り込み促進効果、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害効果が期待されるため、これらの化合物を有効成分とする飲食品、サプリメント、医薬品等に利用できる。

以下、本発明について具体的な例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下、各実施例においては、以下の方法により、エピガロカテキン、５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸、５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの定量を行った。
すなわち、反応後の培養液を１ｍＬ採取し、カテキン類を安定化するために、採取した培養液に２５μＬの２Ｍ塩酸を加え、その後、高速遠心分離（９０００×ｇ、１０分、２５℃）して、菌体を除去し、上清を０．４５μｍのＰＴＦＥ膜で濾過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、以下の条件で分析を行った。

（ＨＰＬＣ条件）
・システム：Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社）
・カラム：ＭｉｇｈｔｙＳｉｌ ＲＰ－１８ＧＰ １５０－４．６（４．６×１５０．０ｍｍ，５μｍ 関東化学（株））
・カラム温度：４０℃
・流速：１．０ｍＬ／分
・移動相：
移動相Ａ；水／メタノ－ル／燐酸＝９７／３／０．０１（体積比）
移動相Ｂ；水／メタノ－ル／燐酸＝５０／５０／０．０１（体積比）
・グラジエント条件：０～２分 Ａ；９０％ Ｂ；１０％、２～１４．５分 Ａ；９０→７２％ Ｂ；１０→２８％、１４．５～１６．５分 Ａ；７２→１５％ Ｂ；２８→８５％、１６．５～１８分 Ａ；１５％ Ｂ；８５％、１８～１８．１分 Ａ；１５→９０％ Ｂ；８５→１０％、１８．１～２５分 Ａ；９０％ Ｂ；１０％、※グラジエントはリニアグラジエント
・検出：ＵＶ（２７０ｎｍ）
・サンプル注入量：１０μＬ

なお、各実施例及び比較例において、変換率は培養開始直後の培養液中のエピガロカテキンのモル濃度（ｍＭ）に対する５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ（以下化合物ＩＩ）及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（以下化合物Ｉ）各化合物のモル濃度（ｍＭ）であり、変換率は、以下の式により算出した。
変換率（％）＝（各化合物のモル濃度）／（培養開始直後のエピガロカテキンのモル濃度）×１００

（前培養液の製作）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株及びフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ４９５３１）株をそれぞれ５ｍＬのＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）で７２時間嫌気培養し、２菌株の前培養液を得た。

＜培地に添加する糖類の検討＞
（培地）
試験用の培地（代謝物生産培地Ａ）は、以下のものを使用した。

上記の成分を純水に溶解し、ｐＨを７．１に調整し、代謝物生産培地Ａとした。

（実施例１乃至７、比較例１乃至８）
代謝物生産培地Ａにさらに、添加糖類として、表２に記載した各種糖類（実施例６のキシロオリゴ糖は、物産フードサイエンス（株）製、実施例７のキシランは、東京化成化学工業（株）製、その他の糖類はすべて富士フィルム和光純薬製）を滅菌前に終濃度３ｇ／Ｌとなるように添加し、実験培地とした。調製後の実験培地は１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌をした。上記実験培地（５ｍＬ）に、フィルター滅菌したエピガロカテキン（式（ＩＩＩ）で表される化合物）（純度９５％、Ｈｕｎａｎ Ｓｕｎｆｕｌｌ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈ社製）溶液を、終濃度が１ｍＭとなるように上記実験培地に加えた。さらに上記２菌株の前培養液１００μＬを植菌し、嫌気性条件下（アネロパックケンキ（三菱ガス化学（株）社製）を使用）において、３７℃に保持しながら試験管にて７日間嫌気培養した。嫌気培養開始直後および開始から４日間後と７日間後に培養液を１ｍＬ採取し、高速液体クロマトグラフィーにより５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＩ）と５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（化合物Ｉ）を定量して、化合物ＩとＩＩの合計の変換率を算出した。
結果を表２に示す。

４日間の嫌気培養後では、五炭糖の単糖（キシロ－ス、Ｄ－（－）－アラビノ－ス、Ｌ－（＋）－アラビノース、リボ－ス）を含む実験培地において、４日間の嫌気培養後の化合物ＩとＩＩの合計で、変換率は５０％以上（生産量０．５ｍＭ以上）であった。
７日間の嫌気培養後では、いずれの培地においても化合物Ｉ及び化合物ＩＩが生産されており、その生産量は、その他の糖類および糖類の添加なしの条件に比べて多く、五炭糖を含む培地では、７日間の嫌気培養後の化合物ＩとＩＩの合計で、変換率は８６％以上（生産量０．８６ｍＭ以上）であった。
以上の結果より、水素の添加がない場合でも、五炭糖を使用した場合において化合物Ｉ、ＩＩが効率的に生産されることが確認できた。

４日間の嫌気培養後では、五炭糖を構成糖として含む多糖（キシロ－ス、キシロビオース、キシロオリゴ糖、キシラン）を含む実験培地において、４日間の嫌気培養後の化合物Ｉと化合物ＩＩの合計で、変換率は５０％以上（生産量０．５ｍＭ以上）であった。特にキシロビオースは、４日間で変換率が非常に高かったのが、その一方、糖類を添加しない培地および、グルコースを添加した培地では、化合物Ｉ及びＩＩがほとんど生産されなかった。
７日間の嫌気培養後では、いずれの培地においても化合物Ｉ及び化合物ＩＩが生産されていた。その量は、五炭糖を構成糖として含む多糖 ＞ グルコース ＞ 糖類なしの順に多かった。五炭糖を構成糖として含む多糖を含む培地では７日間の嫌気培養後の化合物Ｉと化合物ＩＩへの変換率が合計で１００％又は１００％近い値であった。
以上の結果より、水素添加がない場合でも五炭糖又は五炭糖を構成糖として含む多糖ともに短期間で化合物Ｉ、ＩＩが効率よく製造できることが確認できた。

＜添加糖類の濃度＞
（実施例８乃至１２）
実施例１のキシロースの濃度を１ｇ／Ｌ（実施例８）、２ｇ／Ｌ（実施例９）、６ｇ／Ｌ（実施例１０）、１０ｇ／Ｌ（実施例１１）、２０ｇ／Ｌ（実施例１２）に変更し、実施例１と同様の方法で培養を行った。実施例１（キシロース濃度３ｇ／Ｌ）及び比較例１（キシロース濃度０ｇ／Ｌ）と併せて、結果を表３に示す。

４日間の嫌気培養後では、１～２０ｇ／Ｌのキシロ－スを添加した培地のいずれでも化合物Ｉ及び化合物ＩＩが生産されていた。その生産量は０～３ｇ／Ｌのキシロース添加濃度では濃度の増加とともに増加し、３～１０ｇ／Ｌの添加濃度ではほぼ一定となった。

７日間の嫌気培養後においても同様の傾向が見られ、３～１０ｇ／Ｌの添加濃度で化合物Ｉと化合物ＩＩの生産量が最大となった。このとき、３～１０ｇ／Ｌのキシロ－スを添加した培地における化合物Ｉと化合物ＩＩの合計の生産量は０．７５ｍＭを超え、変換率は７５％を超える値を示した。
以上の結果より、五炭糖を培地１Ｌあたり１～２０ｇ／Ｌ、特に３～１０ｇ／Ｌの濃度範囲で、水素を添加しない条件においても化合物Ｉ、ＩＩが効率的に生産されることが確認できた。
２０ｇ／Ｌの添加濃度では、生産速度が低下したが生産は進行しているため、長時間培養することで生産することができる。

＜栄養源の検討その１＞
（培地）
試験用の培地（代謝物生産培地Ｂ）は、以下のものを使用した。

上記の成分を純水に溶解し、ｐＨを７．１に調整し、代謝物生産培地Ｂとした。

（比較例９乃至１３）
代謝物生産培地Ｂにペプトン類として、１０ｇ／Ｌの表５に示す各種ペプトン類を添加し、実験培地とした。調製後の実験培地は１１５℃、１５分間のオートクレーブ滅菌をした。上記実験培地（５ｍＬ）にエピガロカテキン（式（ＩＩＩ）で表される化合物）を終濃度が１．１ ｍＭとなるように滅菌後の培地に加えた。さらに上記２菌株の前培養液１００μＬを植菌し、３７℃に保持しながら試験管にて７日間嫌気培養した。
なお、前培養液の製造方法は、前述の「（前培養液の製作）」の項目に記載されている方法と同様の方法で行った。
嫌気培養開始直後および開始から４日間後と７日間後に培養液を１ｍＬ採取し、高速液体クロマトグラフィーにより化合物Ｉと化合物ＩＩを定量して、化合物ＩとＩＩの合計の変換率を算出した。

ペプトン類は下記の製品を使用した。
ハイペプトン： 日水製薬（株）製
ハイポリペプトンＳ： 日本製薬（株）製
Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ： Ｂｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製）
ＢＢＬ， Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ： Ｂｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製
ＢＢＬ，Ｐｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ： Ｂｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製

（実施例１３乃至１７）
比較例９乃至１３において使用したそれぞれの実験培地に、添加糖類として、キシロースを３ｇ／Ｌ添加した他は、比較例９乃至１３と同様の方法で培養を行い、化合物Ｉと化合物ＩＩを定量して、化合物ＩとＩＩの合計の変換率を算出した。
比較例９乃至１３、実施例１３乃至１７の結果を表５に示す。

４日間の嫌気培養後では、キシロ－スを含む実験培地では添加したペプトン類の種類によらず化合物Ｉ及び化合物ＩＩが生産されていた。一方、糖類を添加しない培地では化合物Ｉ及び化合物ＩＩはほとんど生産されなかった。

７日間の嫌気培養後においても、培地中のキシロースの有無によって、化合物Ｉ及び化合物ＩＩの生産量が大きく異なった。化合物Ｉ及び化合物ＩＩは、キシロースを添加した実験培地においてはいずれの培地でも、７日間の嫌気培養後の化合物ＩとＩＩの合計で、変換率は４５％以上（生産量０．４ｍＭ以上）を示す一方、キシロースを添加しない実験培地においてはいずれの培地でも変換率は１３％以下（０．２ｍＭ以下）にとどまった。
以上により、キシロースを添加することによって、無添加の場合と比較して、ペプトン類の種類にかかわらず、化合物Ｉ、ＩＩが生成できることが確認できた。
また、ペプトン類の中では、カゼイン酵素分解物が最も高い変換率を示した。

＜栄養源の検討その２＞
（培地）
試験用の培地（代謝物生産培地Ｃ）は、以下のものを使用した。

上記の成分を純水に溶解し、ｐＨを７．１に調整し、代謝物生産培地Ｃとした。

（比較例９及び比較例１４乃至１７）
代謝物生産培地Ｃにエキス類として、１０ｇ／Ｌの各種エキスを添加し、実験培地とした。調製後の実験培地を１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。上記実験培地（５ｍＬ）にエピガロカテキンを終濃度が１．１ｍＭとなるように滅菌後の培地に加えた。さらに上記２菌株の前培養液１００μＬを植菌し、３７℃に保持しながら試験管にて７日間嫌気培養した。
なお、前培養液の製造方法は、前述の「（前培養液の製作）」の項目に記載されている方法と同様の方法で行った。
嫌気培養開始直後および開始から４日後と７日後に培養液を１ｍＬ採取し、高速液体クロマトグラフィーにより化合物Ｉと化合物ＩＩを定量して、化合物ＩとＩＩの合計の変換率を算出した。なお、粉末酵母エキスを使用したものは、前記の比較例９と同じ内容であるため、表７中も比較例９とした。

使用したエキスは、下記のとおりである。
粉末酵母エキス： 極東製薬工業（株）製
粉末肉エキス： 極東製薬工業（株）製
細菌用魚エキス： 極東製薬工業（株）製
３５％エルリッヒカツオエキス： 極東製薬工業（株）製（表７では、「カツオエキス」と表記）
Ｂａｃｔｏ，Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ： Ｂｅｃｔｏｎｅ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製

（実施例１３及び実施例１８乃至２１）
比較例９及び比較例１４乃至１７において使用した実験培地に、添加糖類として、キシロースを３ｇ／Ｌ添加した他は、比較例９乃至１３と同様の方法で培養を行い、化合物Ｉと化合物ＩＩを定量して、化合物ＩとＩＩの合計の変換率を算出した。なお、粉末酵母エキスを使用したものは、前記の実施例１３と同じ内容であるため、表７中も実施例１３とした。
比較例９及び比較例１４乃至１７、実施例１３及び実施例１８乃至２１の結果を表７に示す。

４日間の嫌気培養後では、キシロ－スを含む実験培地では添加したエキス類の種類によらず化合物Ｉ及び化合物ＩＩが生産されていた。一方、糖類を添加しない培地では化合物Ｉ及び化合物ＩＩは生産されなかった。

７日間の嫌気培養後においても、キシロースを添加した実験培地においてはいずれの培地でも、７日間の嫌気培養後の化合物Ｉと化合物ＩＩの合計で、変換率は１０％以上（生産量０．１ｍＭ以上）であった。一方、キシロースを添加しない実験培地においてはいずれの培地でもほとんど生産されなかった。
エキス類としては、粉末酵母エキスを用いたものが、最も高い変換率を示した。

（実施例２２）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ ＪＣＭ９９７９）株およびフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ ＡＴＣＣ４９５３１）株をそれぞれ６０ｍＬのＧＡＭブイヨンで７２時間嫌気培養し、２菌株の前培養液を得た。
式（ＩＩＩ）で示されたエピガロカテキン（純度９５％、Ｈｕｎａｎ Ｓｕｎｆｕｌｌ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈ社製）６ｇを３Ｌの下記代謝物生産培地Ｄに加え、さらに上記２菌株の前培養液６０ｍＬを加え、嫌気性培養装置ＢＭＥ－０５ＮＣＳ－Ｍ（エイブル社製）にて３７℃でｐＨ７．１に保持しながら４８時間嫌気培養した。この間のｐＨは、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ジャーファーメンター槽内のｐＨを保持した。
なお、代謝物生産培地Ｄは組成及び製造方法は下記に示す。添加糖類として五炭糖であるキシロースを添加している。

上記の成分を純水に溶解し、ｐＨを７．１に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌をし、代謝物生産培地Ｄとした。
この際、窒素ガス：９０ｍＬ／ｍｉｎ， 二酸化炭素ガス：１２ｍＬ／ｍｉｎを通気し、１００ｒｐｍの回転数で撹拌した。嫌気培養開始直後および開始から２４時間後と４８時間後に培養液を１ｍＬ採取し、高速液体クロマトグラフィーにより化合物Ｉと化合物ＩＩを定量して、化合物Ｉと化合物ＩＩの合計の変換率を算出した。
結果を表９に示す。

培養開始から２４時間後と４８時間後の、エピガロカテキンから化合物Ｉと化合物ＩＩへの変換率（化合物Ｉと化合物ＩＩの合計）は、それぞれ１２．５０％と９０．５０％となった。

以上の結果より、嫌気性培養装置を使用した場合、水素を添加しなくても５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンが効率よく生成できることがわかった。

Claims (8)

1. 嫌気性条件下で、嫌気性微生物によるカテキン類から５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの少なくとも一種を製造する製造方法において、五炭糖の単糖及び五炭糖を構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を含む培地を使用することを特徴とする製造方法。
2. 前記嫌気性微生物がエガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及びフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株の少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記カテキン類がエピガロカテキンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記糖類において、単糖である五炭糖又は多糖の構成糖である五炭糖が、キシロース、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース及びリボースからなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記培地中の前記糖類の濃度が、１～２０ｇ／Ｌである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 嫌気性条件下で、嫌気性微生物によるカテキン類から５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸及び５－（３’，５’－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの少なくとも一種を製造する製造方法において、キシロース及びキシロースを構成糖として含む多糖の少なくとも一種からなる糖類を含む培地を用いることを特徴とし、前記嫌気性微生物が、エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及びフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株である、製造方法。
7. 前記キシロース及びキシロースを構成糖として含む多糖が、キシロース、キシロビオース、キシロオリゴ糖及びキシランからなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
8. カテキン類がエピガロカテキンである請求項６又は７に記載の製造方法。

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