JP7290295B2

JP7290295B2 - 蛍光強度が向上したシロイヌナズナ由来フラビンモノヌクレオチド結合タンパク質変異体

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Publication number: JP7290295B2
Application number: JP2021568584A
Authority: JP
Inventors: テクジョン，サン; コ，サンファン; ファン，ボラ; ナ，ジョン－ヒョン
Original assignee: Korea University Research and Business Foundation; Kookmin University
Current assignee: Korea University Research and Business Foundation; Kookmin University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: JP2022532778A; EP3988562A4; EP3988562A1; US20220267387A1; WO2021066528A1; KR102210877B1

Description

本発明は、蛍光強度が向上したフラビンモノヌクレオチド結合蛍光タンパク質変異体に関し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来の蛍光タンパク質変異体の発掘に関する。

蛍光タンパク質は、生命科学、医学、薬学研究のための遺伝子にコードされ得る標識子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）であって、様々な研究分野に広く応用されており、特に、細胞や動物、植物においてタンパク質の発現、活性、分泌などを実時間で分析するのに有用に用いられている。蛍光タンパク質は、特定波長の光によって活性化されてから低いエネルギーレベルに変化する過程で別の波長の光を放出するタンパク質であり、代表例としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）は、海に住むクラゲから発見されたものであって、生命科学研究に必須道具として用いられており、当該技術研究に対して２００８年にノーベル賞が授与されている。

タンパク質遺伝子にＧＦＰを生成する遺伝子を結合させると、細胞や組織における遺伝子発現を、ＧＦＰ蛍光を用いて追跡観察することができ、癌を引き起こす特定タンパク質の遺伝子に緑色蛍光タンパク質の遺伝子を挿入して実験用生物体の細胞に注入すると、時間が経つにつれて癌の大きさや位置が追跡でき、生物体を解剖することなく青色光を照らして肉眼で確認することもできる。

また、医薬タンパク質研究において目的タンパク質遺伝子に緑色蛍光タンパク質遺伝子を融合させた後、動物に挿入すると、緑色蛍光タンパク質により、目的タンパク質の挿入されたか否かが容易に確認できる。

その他にも、ＧＦＰ遺伝子結合を用いて神経回路の分析、細胞膜研究、ウイルス感染メカニズムなどの生命科学的研究が非常に活発に行われており、生きている動物にＧＦＰを導入した蛍光性動物開発も報告されている。

現在用いられているＧＦＰを含む大部分の蛍光タンパク質は、蛍光を放出できる蛍光発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）の形成のためには酸素の存在が必須であるという限界がある。このため、酸素の欠乏した細胞内環境、酸素のない条件で生存を維持する嫌気性微生物（ａｎａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）、細胞の過度な成長によって周囲の酸素が欠乏した環境などでは使用し難い。

一方、酸素の存在や酸素の欠乏の有無に関係なく、生命科学、医学、薬学分野に適用して蛍光標識子として利用可能なフラビンベースの蛍光タンパク質（Ｆｌａｖｉｎ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＦｂＦＰｓ））が発見されているが、該フラビンベースの蛍光タンパク質（ＦｂＦＰｓ））は蛍光の強度が高く、使用し難いという欠点がある。

上述した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知らされた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならないだろう。

本発明者らは、酸素の存在や酸素欠乏の有無に関係なく生命科学、医学、薬学などの分野で広く活用可能なフラビンベースの蛍光タンパク質（Ｆｌａｖｉｎ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＦｂＦＰｓ））を発掘しようと鋭意努力した。その結果、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）から由来したＬＯＶタンパク質の変異体であるｉＬＯＶタンパク質に基づき、一部のアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換して最適化することにより、ＬＯＶ又はｉＬＯＶタンパク質に比べて蛍光強度が大きく向上した変異体を確認し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、ｉＬＯＶ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄＬＯＶ）に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ｉＬＯＶ変異体をコードする核酸分子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ｉＬＯＶ変異体、核酸分子又はベクターを含む蛍光発色用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを発現させる段階を含む目的タンパク質の発現を分析する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを発現させて目的タンパク質を生成させる段階；及び、前記生成された目的タンパク質を分離する段階；を含む、目的タンパク質の分離精製方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、ｉｌＯＶ変異体の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、ｉＬＯＶ変異体のスクリーニング方法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によって、より明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、ｉＬＯＶ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄＬＯＶ）に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体を提供する。

本発明者らは、酸素の存在や酸素欠乏の有無に関係なく生命科学、医学、薬学などの分野で広く活用可能なフラビンベースの蛍光タンパク質（Ｆｌａｖｉｎ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＦｂＦＰｓ））を発掘しようと鋭意努力した結果、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）から由来したＬＯＶタンパク質の変異体であるｉＬＯＶタンパク質に基づき、一部のアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換して最適化することにより、ＬＯＶ又はｉＬＯＶタンパク質に比べて蛍光強度が大きく向上した変異体を確認した。

本明細書において用語“ＬＯＶタンパク質”又は“ＬＯＶｐｒｏｔｅｉｎ”は、高等植物、微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）、かび及びバクテリアなどにおいて環境条件を感知するセンサードメインを意味し、Ｌｉｇｈｔ－ｏｘｙｇｅｎ－ｖｏｌｔａｇｅの略字である。本発明では、前記ＬＯＶタンパク質は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のフラビンベースの蛍光タンパク質（Ｆｌａｖｉｎ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＦｂＦＰｓ））であり、より好ましくは、配列目録第１配列を含む。

本明細書において用語“ｉＬＯＶタンパク質”、“ｉＬＯＶｐｒｏｔｅｉｎ”又は“ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄＬＯＶ”は、前記ＬＯＶタンパク質の変異体を意味し、好ましくは、配列目録第１配列のアミノ酸配列において８番目、２３番目、４０番目、６６番目、８４番目及び８９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、より好ましくは、配列目録第２配列を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列の一部を含み、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列のうち５番目のアミノ酸であるＦ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）が、Ｙ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）に置換されたものを含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列のうち５番目アミノ酸であるＦ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）がＹ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）に置換され、且つ、さらに、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列のうち７９番目のアミノ酸であるＫ（Ｌｙｓｉｎｅ）がＥ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）に；８４番目のアミノ酸であるＬ（Ｌｅｕｃｉｎｅ）がＦ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に；９１番目のアミノ酸であるＤ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）がＮ（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）に；及び、１０４番目のアミノ酸であるＬ（Ｌｅｕｃｉｎｅ）がＱ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に置換されたものを含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列のうち５番目のアミノ酸であるＦ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）がＹ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）に置換され、且つ、さらに、配列目録第２配列のｉＬＯＶのアミノ酸配列のうち２９番目のアミノ酸であるＥ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）がＧ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）に、７８番目のアミノ酸であるＫ（Ｌｙｓｉｎｅ）がＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）に；及び、１０９番目のアミノ酸であるＨ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）がＲ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）に置換されたものを含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、配列目録第３配列又は第４配列のアミノ酸配列を含む。

本発明のｉＬＯＶ変異体は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のＬＯＶタンパク質の変異体であるｉＬＯＶタンパク質と比較して、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上蛍光強度が増加したことを特徴とする。

本発明の一実施例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、ｉＬＯＶタンパク質と比較して、９３％～２７７％増加した蛍光強度を示した（図４）。

本発明のｉＬＯＶ変異体は、また、前記ＬＯＶタンパク質又はｉＬＯＶタンパク質と比較して増加した量子収率を示す。

量子収率（ｑｕａｎｔｕｍｙｉｅｌｄ）は、光の吸収に続いて起こる発光又は光電子放出などにおいて、吸収した光子の数に対して放出した光子の数又は光電子の数の比率を示す値である。すなわち、量子収率が高いほど、吸収した光の光子が再び放出される光子への転換率が高いことを意味する。このため、量子収率が高いタンパク質は、結局、明るい蛍光タンパク質であることを示す。量子収率の高い蛍光タンパク質は少量あっても、蛍光が相対的に高く測定され得、これは敏感度の増加につながる。

本発明のｉＬＯＶ変異体は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のＬＯＶタンパク質又はその変異体であるｉＬＯＶタンパク質と比較して、４％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、最も好ましくは８％以上量子収率が増加したことを特徴とする。

本発明の一実施例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、ｉＬＯＶタンパク質と比較して８％～２２％増加した量子収率を示した（図７）。

また、本発明のｉＬＯＶ変異体は、前記ＬＯＶタンパク質又はｉＬＯＶタンパク質と比較して増加した熱的安定性を示す。

本発明の一実施例によれば、本発明のｉＬＯＶ変異体は、温度が大きく増加（４５℃）したにもかかわらず、高い熱的安定性を示し（図８）、高い温度条件でも利用可能であるという利点がある。

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ｉＬＯＶ変異体をコードする核酸分子、これを含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の核酸分子は、単離したもの、又は組み替えられたものでよく、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他に、対応する相補性配列も含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が、単離した核酸分子として理解されてよい。単離した核酸分子は、別個の断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合に、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるときに、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同一リーディングフレーム内に存在することを意味する。ただし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲイションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、通常の方法によって使用する。

本明細書において用語“ベクター”は、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入し得る伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、ＡＡＶなど）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及び、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。

本明細書において用語“発現ベクター”は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列に加え、ベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能も提供する核酸配列も含まれてよい。

本発明の好ましい具現例によれば、前記ベクターは、前記核酸分子をレポーター遺伝子として含み、発現しようとする目的タンパク質をさらに含む。

本明細書において用語“目的タンパク質”又は“ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ”は、適当な宿主細胞を用いて確認又は生産しようとするタンパク質を意味する。

本発明の核酸分子をレポーター遺伝子として用いる場合に、前記目的タンパク質の発現の有無を蛍光で分析することにより、前記目的タンパク質の発現を分析するか、目的タンパク質を生産し、それを容易に分離精製するのに用いることができる。

本明細書において用語“宿主細胞”は、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、ベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてよく、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。

本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、イースト（ｙｅａｓｔ）、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＷＩ３８細胞など）を挙げることができるが、これに制限されるものではない。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ｉＬＯＶ変異体、前記核酸分子又は前記ベクターを含む蛍光発色用組成物を提供する。

前記蛍光発生用組成物は、目的タンパク質の発現の有無を確認するか、発現した目的タンパク質を分離精製するか、特定組織、細胞又は分子をイメージングするためのキットに含まれて作製されてもよい。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ベクターを発現させる段階を含む目的タンパク質の発現を分析する方法を提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ベクターを発現させて目的タンパク質を生成させる段階；及び、前記生成された目的タンパク質を分離する段階；を含む、目的タンパク質の分離精製方法を提供する。

上述したように、本発明の核酸分子をレポーター遺伝子として用いる場合、目的タンパク質の発現の有無を確認するか、発現した目的タンパク質を分離精製するのに用いることができ、本発明のｉＬＯＶ変異体を他のタンパク質や分子に結合又は融合し、蛍光を用いてそれらの位置を確認又は定量するのに用いることができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含むｉｌＯＶ変異体の製造方法を提供する：ａ）前記ｉＬＯＶ変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び、ｂ）前記宿主細胞によって発現したｉＬＯＶ変異体を回収する段階。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含むｉＬＯＶ変異体のスクリーニング方法を提供する：ａ）前記ｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子にさらに、無作為的な点突然変異を加えたｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子のライブラリーを構築する段階；及び、ｂ）前記ライブラリーから、配列目録第２配列のｉＬＯＶタンパク質に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子を選別する段階。

本発明のスクリーニング方法は、蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）スクリーニング、又は流細胞分析技術を用いることができる。流細胞分析を行うための機器は、当業者には公知である。かかる機器の例には、ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＦＡＣＳＳｔａｒＰｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、ＥｐｉｃｓＣ（ＣｏｕｌｔｅｒＥｐｉｃｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、ＭＯＦＬＯ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，ＣｏｌｏｒａｄｏＳｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏ．）、ＭＯＦＬＯ－ＸＤＰ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を挙げることができる。一般に、流細胞分析技術には、液体試料中の細胞又は他の粒子の分離が含まれる。典型的には、流細胞分析機の目的は、分離された粒子を、それらの一つ以上の特性（例えば、標識されたリガンド又は他の分子の存在）に対して分析することである。粒子は、センサーによって一つずつ通過し、サイズ、屈折、光散乱、不透明度、照度、形状、蛍光などに基づいて分類される。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、ｉＬＯＶ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄＬＯＶ）に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体を提供する。

（ｉｉ）また、本発明は、ｉＬＯＶ変異体のスクリーニング方法を提供する。

（ｉｉｉ）本発明のｉＬＯＶ変異体は、既存のＬＯＶタンパク質又はｉＬＯＶタンパク質に比べて蛍光強度及び量子収率が増加し、酸素の存在するか否かに関係なく目的タンパク質の発現の有無を確認するか、発現した目的タンパク質を分離精製するのに有用に用いることができる。

ｉＬＯＶ１次及び２次ライブラリーを用いてソート（ｓｏｒｔｉｎｇ）した過程を示す。ｉＬＯＶ１次スクリーニング結果として得たライブラリーの増菌試験（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｔｅｓｔ）を示す。ｉＬＯＶ２次スクリーニング結果として得たライブラリーの増菌試験を示す。ｉＬＯＶ１次及び２次ライブラリーから選別されたＳＨ３及びＢＲ１のＦＡＣＳ蛍光強度を示す。ｉＬＯＶ変異体の突然変異が導入された位置を示す。ＳＨ３及びＢＲ１の発光蛍光パターン分析を示す。ＳＨ３及びＢＲ１の量子収得率を示す。ＳＨ３及びＢＲ１の熱的安定性分析を示す。ＳＨ３及びＢＲ１の熱的安定性分析において実際蛍光強度を示す。ｉＬＯＶ変異体とｉＬＯＶ及び野生型ＬＯＶの配列を比較した結果である。ホモロジーモデリング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙｍｏｄｅｌｉｎｇ）分析を用いたＳＨ３及びＢＲ１の向上したスペクトル特性に対する構造解析結果を示す。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

［実施例］
＜実施例１：ｉＬＯＶ変異体ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）作製＞
シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来のＦＭＮベースの蛍光タンパク質（ＦＭＮ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ｉＬＯＶ）を合成し、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ）制限酵素サイトを用いてＰＥＱ－８０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に移してｉＬＯＶ発現用プラスミドを完成した。このプラスミドを鋳型とし、エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒｐｒｏｎｅＰＣＲ）法を用いて、それぞれに変異を導入した。エラープローンＰＣＲのためのプライマーは、５’－ＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＧＡＴＣＣ－３’、５’－ＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＣＣＴＧ－３’を使用し、エラー率（Ｅｒｒｏｒｒａｔｅ）は、０．５％エラーが入り得るように調整してライブラリーインサートを製造した。製造されたライブラリーインサートを発現用ベクターに入れるために、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ）制限酵素処理をし、同じ制限酵素で処理されたＰＥＱ－８０Ｌベクターとライゲイションさせた。その後、大腸菌Ｊｕｄｅ１（（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）ｆ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ）に転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、巨大ｉＬＯＶ変異体ライブラリーを構築した。また、１次発掘した変異体を用いて２次ライブラリーを構築した。

＜実施例２：バクテリア培養及び流細胞分離器（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いたｉＬＯＶ変異体ライブラリー探索＞
構築されたｉＬＯＶ変異体ライブラリー探索のために、大腸菌Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換されている変異体ライブラリー細胞１ｍｌを３７℃、２５０ｒｐｍ振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）条件で２％（ｗ／ｖ）グルコースに、抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）はアンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）含有のＴＢ（ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ）培地にそれぞれ入れ、４時間培養した。振盪培養されたライブラリー細胞をＴＢ培地に１：１００に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍ振盪でＯＤ６００が０．５に到達するまで培養した。その後、冷却のために２０分間２５℃で培養した後、１ｍＭＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を入れて発現誘導した。培養が終わると細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した後、流細胞分離器（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｓ３ｓｏｒｔｏｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ））を用いて、高い蛍光を示す上位２％細胞を回収するためにソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）を行い、蛍光の高い細胞の純度を上げるために、ソートされた細胞をさらにリソート（ｒｅｓｏｒｔｉｎｇ）した。リソートされたサンプルを直ちに、アンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）含有ＴＢ＋２％（ｗ／ｖ）グルコースに接種して一晩培養し、翌日、アンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）含有ＴＢ培地に１：１００に接種し、次のラウンドの蛍光の高い細胞の分類作業を行った。このような方法で各ライブラリーを４回にわたってソーティング及びリソーティングを行った（図１）。ラウンドが進むにつれてディテクター（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）の敏感度を下げて測定した（流細胞分離器のディテクターの敏感度を下げ、より蛍光強度の高いものを探すことができる）。また、上のような方法で１次ライブラリーから発掘されたＳＨ３に基づいて２次ライブラリーを構築し、４回にわたってソーティング及びリソーティングを行った（図１）。

＜実施例３：蛍光の向上したｉＬＯＶ変異体選別＞
ｉＬＯＶの１次、２次ライブラリーから、４ラウンドのソーティング及びリソーティング過程により、蛍光強度の向上したグループが得られたか確認し（図２及び図３）、確認されたグループにおいて個別クローンを分析し、高い蛍光を示すｉＬＯＶ変異体を、流細胞分離器を用いた蛍光信号により確認した。そのうち、ｉＬＯＶの蛍光強度よりも高い２個のｉＬＯＶ変異体（ＳＨ３、ＢＲ１）が確保できた（図４及び図５）。

＜実施例４：選別されたｉＬＯＶ変異体の発光パターン分析＞
ｉＬＯＶ変異体の発光パターンを調査した。３μＭの各精製されたタンパク質に４５０ｎｍの波長を用いて電子を浮かばせ、これによって放出される波長を測定した。４７０ｎｍ～６００ｎｍの放出波長を測定した結果、４９５ｎｍと５２０ｎｍで２個のピークが観察された。ｉＬＯＶとその変異体の全体的な蛍光パターンは類似しているが、ＳＨ３及びＢＲ１の放出強度がそれぞれ２０％、７０％向上している（図６）。

＜実施例５：ｉＬＯＶ変異体の量子収率（ｑｕａｎｔｕｍｙｉｅｌｄ）分析＞
量子収率（ｑｕａｎｔｕｍｙｉｅｌｄ）は、光の吸収に続いて起こる発光又は光電子放出などにおいて、吸収した光子の数に対して放出した光子の数又は光電子の数の比率を示す値である。すなわち、量子収率が高いほど、吸収した光の光子が再び放出される光子への転換率が高いことを意味する。このため、量子収率が高いタンパク質は、結局、明るい蛍光タンパク質であることを示す。量子収率の高い蛍光タンパク質は、少量あっても蛍光が相対的に高く測定され得、これは敏感度増加につながる。フルオレセインを基準物質として用いてｉＬＯＶ変異体の量子収率を測定した。野生型ｉＬＯＶの量子収率が０．３７であるのに対し、ＳＨ３及びＢＲ１はそれぞれ０．４０及び０．４５と向上した量子収率を示した（図７）。

＜実施例６；ｉＬＯＶ変異体の熱的安定性分析＞
選別されたｉＬＯＶ変異体の熱的安定性を測定した。熱的安定性実験は、タンパク質を３μＭで３７℃又は４５℃で露出させた後。一定の時間が経つとサンプルを取り、残っている蛍光タンパク質の明るさを測定した。この時、蛍光タンパク質の明るさが温度に影響を受けるため、全ての測定において、各サンプルは２５℃の恒温槽に３０秒間インキュベーションした後、２５℃に温度が固定されたキューベットで蛍光の明るさを測定した。この時、サンプルは４５０ｎｍの波長で浮かばせ、４９５ｎｍの発光を測定した。ｉＬＯＶと比較して、ＳＨ３は、熱的安定性の向上した結果を示し、ＢＲ１は、低い熱的安定性を示した（図８）。しかし、ＢＲ１は依然として高い蛍光強度を示した（図９）。

＜実施例７：ホモロジーモデリング分析を用いたＳＨ３及びＢＲ１の向上したスペクトル特性に対する構造解析＞
ＳＨ３及びＢＲ１は、ｉＬＯＶの配列と比較して、それぞれ、５個の追加突然変異（Ｆ３９１Ｙ、Ｋ４６５Ｅ、Ｌ４７０Ｆ、Ｄ４７７Ｎ及びＬ４９０Ｑ）及び４個の追加突然変異（Ｆ３９１Ｙ、Ｅ４１５Ｇ、Ｋ４６４Ｒ及びＨ４９５Ｒ）を含んでいる（図１１Ａ）。このうち、ＳＨ３は、Ｐｈｅ－４７０（ｉＬＯＶのＬｅｕ－４７０）が野生型ＬＯＶと同じアミノ酸で保存されている。先行研究によれば、ｉＬＯＶのＦ４７０Ｌは、Ｌｅｕ－４７２を、ＦＭＮのイソアロキサジン環（ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅｒｉｎｇ）側にフリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）して蛍光強度を改善した。野生型ＬＯＶでは、Ｐｈｅ－４７０によってＬｅｕ－４７２がＦＭＮイソアロキサジン環から遠く離れている構造を有する。しかし、ＳＨ３変異体の蛍光強度は、Ｌ４７０Ｆ置換を含むにもかかわらず、ｉＬＯＶの蛍光強度よりも高かった。そこで、ＳＨ３のＦ４７０位置にいずれかのアミノ酸に代替されたとき、蛍光強度向上効果に対する洞察力を得るために、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを用いてインシリコモデルを生成した。ＳＨ３のモデルによれば、４７０位置に、Ｐｈｅ又はＬｅｕに関係なくＬｅｕ－４７２は依然としてＦＭＮイソアロキサジン環側に回転しており（図１１Ｂ）、ＳＨ３においてＬｅｕ－４７２をフリッピングする原因はＤ４７７Ｎであると予想された。ｉＬＯＶのＡｓｐ－４７７は、Ａｒｇ－３９７と共に塩橋（ｓａｌｔｂｒｉｄｇｅ）を形成し、ＦＭＮとの結合を増加させる。ただし、ＳＨ３においてＤ４７７Ｎ置換による塩橋の除去は、Ｌｅｕ－４７２がＦＭＮイソアロキサジン環側にひっくり返得るようにした（図１１Ｂ）。また、ＳＨ３の４７０位置に、フェニルアラニンに比べてＦＭＮ輪に対する親和性が低いより小さな疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン）への置換は、ＳＨ３の蛍光強度をむしろ減少させることから、ＳＨ３のＰｈｅ－４７０に対するモデリング解析を裏付ける（図１１Ｃ）。このため、ＳＨ３におけるＬ４７０Ｆ及びＤ４７７Ｎ置換によるＦＭＮイソアロキサジン環の増加した構造的安定性が、ＳＨ３がｉＬＯＶに比べて向上した蛍光強度を有することを裏付けるだろう。Ｙ３９１Ｆ置換を除けば、ＳＨ３と比較して、ＢＲ１のみを持っている３種の確認された突然変異（Ｅ４１５Ｇ、Ｋ４６４Ｒ及びＨ４９５Ｒ）は、ＢＲ１がｉＬＯＶに比べて大きい陽電荷を有するようにする（図１１のＤ及びＥ）。ＢＲ１に対するインシリコモデルによれば、Ｅ４１５Ｇ、Ｋ４６４Ｒ及びＨ４９５Ｒは、ＦＭＮイソアロキサジン環の親水性面と近づいている（図１１のＥ）。先行研究では、酸化条件下で、ＬＯＶタンパク質は、ＦＭＮイソアロキサジン環の親水性側面によって生成されたセミキノンラジカルがタンパク質の光安定性を阻害して蛍光減少したとの報告がある。陰電荷を帯びたアミノ酸がセミキノンラジカルを生成し、陽性子がセミキノンラジカルをヒドロキノンに転換するのに関与するという事実に基づき、３種の換突然変異による、ＢＲ１の相対的に陽電荷を帯びた環境は、セミキノンラジカルによる光還元を減少させ、ＢＲ１の蛍光強度を向上させることができた。ＳＨ３は、野生型ｉＬＯＶ又はＢＲ１に比べて向上した熱安定性を示したが、これは、ＳＨ３のモデリング結果においてＬ４９０ＱがＡｓｎ－３９０（図１１のＦ）と水媒介電荷相互作用を生成することによって熱安定性が向上したものと予想される。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単に好ましい具現例に過ぎず、それに本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその等価物によって定義されるといえよう。

Claims

ｉＬＯＶ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐｒｏｖｅｄＬＯＶ）に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体であって、該ｉＬＯＶ変異体は、配列番号３または４に記載のアミノ酸配列を含む、ｉＬＯＶ変異体。
前記ｉＬＯＶ及びｉＬＯＶ変異体は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）由来であることを特徴とする、請求項１に記載のｉＬＯＶ変異体。
請求項１のｉＬＯＶ変異体をコードする核酸分子。
請求項３の核酸分子を含むベクター。
前記ベクターは、前記核酸分子をレポーター遺伝子として含み、発現しようとする目的タンパク質をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のベクター。
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
請求項１のｉＬＯＶ変異体、請求項３の核酸分子又は請求項４のベクターを含む蛍光発色用組成物。
請求項５のベクターを発現させる段階を含む、目的タンパク質の発現を分析する方法。
請求項５のベクターを発現させて目的タンパク質を生成させる段階；及び、前記生成された目的タンパク質を分離する段階；を含む、目的タンパク質の分離精製方法。
次の段階を含むｉＬＯＶ変異体の製造方法：
ａ）請求項１のｉＬＯＶ変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び
ｂ）前記宿主細胞によって発現したｉＬＯＶ変異体を回収する段階。
次の段階を含むｉＬＯＶ変異体のスクリーニング方法：
ａ）請求項１のｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子にさらに、無作為的な点突然変異を加えたｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子のライブラリーを構築する段階；及び
ｂ）前記ライブラリーから、配列目録第２配列のｉＬＯＶタンパク質に比べて蛍光強度が増加したｉＬＯＶ変異体又はこれをコードする核酸分子を選別する段階。