CN103429613A - 源自卵翅锯角萤的荧光素酶 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种新型的有用的荧光素酶。本发明实施方式的荧光素酶源自卵翅锯角萤。

Description

源自卵翅锯角萤的荧光素酶

技术领域

本发明涉及源自卵翅锯角萤(Lucidina accensa)的荧光素酶。

背景技术

为了确定诸如细胞内信号转导和基因表达等细胞功能，已经使用诸如荧光染料和荧光蛋白等荧光探针和利用荧光素-荧光素酶反应的发光探针。特别而言，为了分析基因表达的调节，使用发光测量，这不会引起由激发光照射造成的细胞损伤或自发光问题，并且在定量确定方面非常优异。例如，在观察已导入了荧光素酶基因的细胞时，可以通过测量所述细胞的发光来确定荧光素酶基因的表达强度(更具体而言，表达量)。通过下述步骤进行发光程度的测量：将荧光素和三磷酸腺苷(ATP)等添加至通过裂解细胞而制备的裂解物中，使用包含光电倍增器的光度计对所述裂解物进行定量确定。即，在裂解细胞后测量发光，因此将在特定时间点时荧光素酶基因的表达量确定为多个细胞的总和。用于导入作为报道基因的发光基因(例如荧光素酶基因)的方法的实例是磷酸钙法、脂转染法和电穿孔法，这些方法中的每一种都根据目的和细胞类型来使用。当使用连接至待导入细胞中的荧光素酶基因上游或下游的目的DNA片段来分析荧光素酶的表达量时，能够研究该DNA片段对荧光素酶基因的转录的影响。此外，待导入细胞中的荧光素酶基因和目的基因的共表达使得能够研究基因产物对荧光素酶基因表达的影响。

为了对发光基因的表达量进行时程分析，需要测量活细胞随时间的发光程度。此类测量通过以下方式进行：在配备有光度计的温育器中进行细胞培养，并且以固定时间间隔定量确定整个细胞群的发光程度。因此，例如，可以分析具有特定周期的表达节律，并且可以获得整个细胞中发光基因的表达量的时间变化。

近年来，在生物学和医学领域中，使用图像对活样品中的动态交替变化进行时程观察的必要性越来越高。在利用荧光观察的领域中，已采用时滞拍摄或动态图像拍摄来动态地阐明蛋白分子的功能。在常规技术中，已利用荧光样品进行时程观察，例如，观察带有添加的荧光分子的蛋白的一个分子的运动图像。

相反，当使用发光样品进行时程观察时，需要使用配备有图像增强器的CCD相机，这是因为发光样品的发光强度极低。近来，已经开发出配备有用于观察发光样品的光学系统的显微镜(Jpn.Pat.Appln.KOKAI申请号2006-301599,国际公开号2006/088109)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的有用的荧光素酶。

本发明实施方式的荧光素酶源自卵翅锯角萤。

本发明提供了新型的有用的荧光素酶。

附图说明

图1是发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的荧光素酶。

图2是绘出了多种荧光素酶的Km的图。

图3是比较获自发光反应的发光强度的图，其中，所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或其突变荧光素酶，或者是源自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶。

图4是比较本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的荧光素酶和源自北方锯角萤(L.biplagiata)的荧光素酶的抗蛋白降解稳定性的图。

图5是比较获自发光反应的发光强度的图，其中，所使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或其突变(M249K)荧光素酶，或者是源自北方锯角萤的荧光素酶。

图6是获自发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)。

图7是获自发光反应的光发射谱图，其中，在各pH环境下使用的酶是本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶(E322W)。

图8是显示出保持在55℃环境下的大肠杆菌(E.coli)的光发射的黑白图像，其中大肠杆菌表达源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)；和

图9是显示出保持在55℃环境下的大肠杆菌的光发射的黑白图像，其中大肠杆菌表达源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或突变荧光素酶(E322W)。

具体实施方式

本发明的一个实施方式涉及源自卵翅锯角萤的荧光素酶。

“荧光素酶”通常是指催化发光化学反应的酶。该酶的底物称为荧光素。在ATP的存在下，在荧光素因荧光素酶的催化活性而发生化学反应时出现光发射。目前，已经获得源自萤火虫和细菌的荧光素酶。本发明实施方式的荧光素酶不仅指以上定义的那些荧光素酶，还是首次获自下述萤火虫的新型荧光素酶。

卵翅锯角萤(L.accensa)是属于节肢动物门、昆虫纲、鞘翅目、萤科、锯角萤属的萤火虫，并且发现该萤火虫主要栖息于日本的本州、四国和九州的山区。此外，作为卵翅锯角萤的姊妹种，存在一种称为北方锯角萤的(Lucidina biplagiata)的萤火虫，并发现该萤火虫主要栖息于日本的北海道、本州、四国和九州的田野区域。还发现这两种萤火虫共同栖息于特定区域。本文所用的词语“源自”不仅是指源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶，还指其突变酶。

当对发光强度较小的发光样品进行图像拍摄时，应该曝光更长时间以获得清晰图像。此类发光样品仅用于有限的研究。例如，当因发光强度低而需要30分钟的曝光时，可以每30分钟拍摄时程图像，但是不能以更短的时间间隔进行，并且实时图像拍摄也是不可能的。在获得图像后，应该获得多幅图像并将其进行比较，以重点关注发光的细胞，因此，在因发光强度低而需要更长的曝光时间时，这非常耗时。

使用本发明实施方式的荧光素酶，与已知荧光素酶相比可以获得显着高的发光强度。因此，本发明实施方式的荧光素酶在用作使蛋白成像的报告物(reporter)时展示出特别优异的效果。更具体而言，本发明实施方式的荧光素酶能够对表达量小的蛋白进行良好的检测，这是因为即使在量小时其也能提供高度的发光。由于发光强度高，本发明实施方式的荧光素酶能够缩短检测所需的曝光时间。因此，通过在时程观察中使用本发明实施方式的荧光素酶作为报告物，能够缩短图像拍摄的间隔，由此实现与实时观察更接近的观察。

本发明实施方式的荧光素酶提供的发光强度是例如源自北方锯角萤的荧光素酶(SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31)的发光强度的至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或至少5.5倍。此外，本发明实施方式的荧光素酶提供的发光强度是例如源自北美萤火虫(一种主要栖息于北美的萤火虫)的荧光素酶(SEQ ID NO:33)的发光强度的至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍或至少4倍。

从本发明实施方式的荧光素酶所引起的发光反应，可以获得在500nm～700nm的波长范围内显示出高发光强度的光发射谱图。特别在550nm～650nm的波长范围内可以获得高发光强度。此外，本发明实施方式的荧光素酶所引起的发光反应的最大发光波长可以随周围环境的pH而改变。例如，在pH8.0～pH7.5的环境下，最大发光波长显示在564nm附近。在pH7.0的环境下，最大发光波长显示在605nm附近。在pH6.5～pH5.5的环境下，最大发光波长显示在614nm附近。本文所用的术语“最大发光波长”是指在测量波长范围内从荧光素酶参与的发光反应获得最高发光强度时所在的波长。本文所用的术语“测量波长范围”是指例如450nm～750nm的波长范围。

与现有的荧光素酶相比，本发明实施方式的荧光素酶可以显示出相对高的抗降解稳定性。术语“抗降解稳定性”意味着在使用荧光素酶的环境下所述荧光素酶几乎不降解。此外，术语“抗降解稳定性”不仅包括抗蛋白水解酶降解的稳定性，还包括抗不涉及蛋白水解酶的降解的稳定性，例如，抗热降解或物理刺激降解等的稳定性。术语“使用荧光素酶的环境”是指溶液、培养物、细胞外液和细胞内环境等。特别而言，许多蛋白水解酶通常存在于培养物、细胞外液或细胞内环境中，本发明实施方式的荧光素酶对此类环境下的降解具有抗性。也就是说，本发明实施方式的荧光素酶在此类环境下不降解，并且能够维持高发光强度。因此，与例如源自北方锯角萤的荧光素酶相比，本发明实施方式的荧光素酶具有更高的抗蛋白降解稳定性。

本发明实施方式的荧光素酶的一个实例是含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的那些荧光素酶。该荧光素酶获自卵翅锯角萤，并且没有受到诱变。除非另外特别说明，本文所用的术语“野生型荧光素酶”是指源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶。

图1是使用野生型荧光素酶作为酶的发光反应的光发射谱图。如该图所示，最大发光波长随pH而改变。具体而言，在pH8的环境下展示出最高的发光强度，最大发光波长在564nm附近。图2显示了野生型荧光素酶的针对ATP和D-荧光素的Km值。图3和5是比较了使用已知荧光素酶作为酶的发光反应的发光强度的图。比较图3中的左条柱和中间条柱后发现，使用野生型荧光素酶时的发光强度是使用源自北美萤火虫的荧光素酶时的发光强度的至少1.1倍。比较图5左侧的三个条柱后还发现，使用野生型荧光素酶时的发光强度是使用源自北方锯角萤的荧光素酶时的发光强度的至少5.5倍。图4显示了野生型荧光素酶和已知的荧光素酶的抗降解稳定性的比较结果。具体而言，该结果通过下述过程获得：使各荧光素酶在大肠杆菌中表达，对由此获得的裂解物进行SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳。野生型荧光素酶(即，中间泳道)显示出一条70kDa区附近的条带。同时，源自北方锯角萤的荧光素酶(左泳道和右泳道)显示出的最强条带同样在70kDa区附近，同时还具有数个次级条带。该结果表明，野生型荧光素酶没有出现降解，而源自北方锯角萤的荧光素酶发生了降解。

野生型荧光素酶(SEQ ID NO:1)具有与已知荧光素酶的序列不同的新序列。具体而言，如以下表1所示，野生型荧光素酶与文献(Oba Y,Furuhashi M,Inouye S.(2010)Identification of a functional luciferase gene in the non-luminous diurnal firefly,Lucidinabiplagiata.Molecular Insect Biology19(6):737～743)中报道的北方锯角萤的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)和由本发明的发明人克隆的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)相比具有氨基酸残基差异。该文献中报道的北方锯角萤的序列和由本发明人克隆出的北方锯角萤的序列的差异在于第249位的氨基酸分别是赖氨酸和甲硫氨酸。

表1：各种荧光素酶的氨基酸残基差异

可以如下解释表1中所示的序列差异。具体而言，在对源自北方锯角萤的荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)进行序列同源性搜索时，本发明实施方式的荧光素酶的氨基酸序列满足下述条件中的至少一条：与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第13位丙氨酸对应的氨基酸残基是脯氨酸，与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第211位苏氨酸对应的氨基酸残基是天冬酰胺，与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第227位苯丙氨酸对应的氨基酸残基是酪氨酸，与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第249位赖氨酸对应的氨基酸残基是甲硫氨酸，与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第530位亮氨酸对应的氨基酸残基是异亮氨酸，和与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第542位丙氨酸对应的氨基酸残基是缬氨酸。在实施方式的荧光素酶中，除了与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第13位、第211位、第227位、第249位、第530位和第542位对应的氨基酸残基之外，其他氨基酸残基不受特别限定，这些氨基酸残基可以不同于SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列的对应氨基酸残基。

本发明实施方式的荧光素酶不仅包括源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶，还包括使野生型荧光素酶的部分氨基酸序列突变而得到的突变荧光素酶。除非另外特别说明，本文所用的术语“突变荧光素酶”是指源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶。

用于获得突变荧光素酶的突变是不引起荧光素酶性质的任何改变的突变。例如，其可以是以下突变：通过该突变，在对发光反应几乎没有贡献的序列或结构域中引入改变，同时在对发光反应的贡献较高的序列或结构域中不引入任何改变。具体而言，其可以是使与发光反应不太相关的区域缺失的突变，在此类区域中插入特定序列的突变，或在末端添加特定序列的突变。

用于获得突变荧光素酶的突变可以是改变除荧光素酶的发光活性之外的性质的突变。例如，其可以是用于改进实验可操作性的突变。具体而言，例如，当野生型荧光素酶在哺乳动物细胞中具有低溶解度时，突变可以是用于增加其溶解度的突变。

此外，用于获得突变荧光素酶的突变可以是用于改进与发光反应相关的性质的突变。其实例包括用于增加发光强度的突变、用于改变最适pH的突变、用于改变最适温度的突变和用于增强抗降解稳定性的突变。

具有带来比野生型荧光素酶更高的发光强度的突变的荧光素酶的一个实例是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变荧光素酶。如图3中所示，该突变荧光素酶所展现的发光强度是源自北美萤火虫的荧光素酶的发光强度的至少4倍，是源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的发光强度的至少3.6倍。

突变的另一实例是使光发射谱图的最大发光波长发生移位的突变。当使用具有此类突变的突变荧光素酶作为发光反应的酶时，与使用野生型的情况相比，会获得最大发光波长发生了移位的光发射谱图。当在pH7.0的环境下使用野生型荧光素酶时，所出现的发光的最大发光波长在605nm附近。但是，由于突变，最大发光波长会向长波长侧或短波长侧移位。可允许的是，仅在将发光反应pH条件控制为具有特定pH时出现由突变荧光素酶导致的最大发光波长的此类移位。例如，可允许的是，在小于pH6.5的pH范围或大于pH7.0的pH范围内不出现移位，但其出现在6.5～7.0的pH范围内。当此类突变荧光素酶与野生型荧光素酶或其他突变荧光素酶一起在细胞内表达时，可以根据最大发光波长差异将它们彼此区分开。因此，在使用荧光素酶作为标记的研究中，通过使用展示出最大发光波长移位的突变荧光素酶，可以拓宽标记的选择范围。

突变的另一实例是使发光强度的温度依赖性发生改变的突变。换言之，这是下述突变：通过该突变，发光反应的催化活性在特定温度下相对于野生型有所增加，因此，在该温度下的发光强度变得更高。此类突变可以仅在特定温度范围内增加发光强度。例如，其可以在一定温度下展现与野生型相同或比野生型低的发光强度，但是在其他温度下展现出比野生型高的发光强度。该突变酶的实例包括在常用温度下展现出与野生型相同的活性、而在使野生型活性减少的更高或更低的温度下仍保持相同活性的荧光素酶。由于此类突变荧光素酶可用于野生型荧光素酶所不能使用的温度范围，因此可以拓宽荧光素酶的使用范围。

增加发光强度的突变、产生最大发光波长移位的突变和改变发光强度的温度依赖性的突变可以以其任意组合同时引入。

本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶的一个实例是具有SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列的荧光素酶。SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列是通过将野生型荧光素酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1中的第294位苯丙氨酸(F)残基替换为酪氨酸(Y)残基(F294Y)、将第323位缬氨酸(V)残基替换为亮氨酸(L)残基(V323L)、并将第354位谷氨酸(E)残基替换为缬氨酸(V)残基(E354V)而得到的。编码该突变荧光素酶的核酸是具有SEQ ID NO:35或38所示的碱基序列的核酸。为了在相应的氨基酸序列上具有上述3个替换，SEQ ID NO:38所示的碱基序列包含被引入编码野生型荧光素酶的碱基序列SEQ ID NO:3中的突变。同时，SEQ ID NO:35所示的碱基序列以下述方式获得：针对在哺乳动物细胞中的表达对编码野生型荧光素酶的碱基序列SEQ IDNO:3进行下文所述的密码子优化，并使其具有在相应氨基酸序列上引起上述3个替换的突变。

当使用具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的突变荧光素酶时，与使用野生型荧光素酶的情况相比，特定pH下的最大发光波长发生移位。具体而言，突变荧光素酶催化的发光反应在pH7.0～pH8.0之间的任何pH条件下都显示出最大发光波长为611nm～615nm的光发射。另一方面，如下所述，从野生型荧光素酶获得的最大发光波长在pH7.0条件下接近605nm，在pH7.5条件下接近567nm，或在pH8.0条件下接近564nm。因此，在与野生型相比，从突变荧光素酶获得的光发射的最大发光波长至少在pH7.0～pH8.0的pH范围内移向更长的波长侧。具有长波长的光在活体中具有更好的透射。因此，通过使用此类突变荧光素酶，即使在荧光素和发光探测单元之间存在许多阻挡物质的情况下，例如在测试组织、胚胎或个体作为受试对象的情况下，也能够在抑制发光强度减少的同时检测光发射。

此外，具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的突变荧光素酶显示出的发光强度的温度依赖性与野生型荧光素酶的不同。具体而言，在高于室温的温度下，其催化活性强于野生型。例如，当在表达突变荧光素酶的大肠杆菌中使发光反应在55℃下发生时，获得了比表达野生型荧光素酶的情况下更高的发光强度。

本发明实施方式的源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶的一个实例是具有SEQ IDNO:36所示的氨基酸序列的荧光素酶。SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列是通过将野生型荧光素酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1中的第322位谷氨酸(E)残基替换为色氨酸(W)残基(E322W)而得到的。编码该突变荧光素酶的核酸是具有SEQ ID NO:37或39所示的碱基序列的核酸。为了在相应的氨基酸序列上具有上述1个替换，SEQ ID NO:39所示的碱基序列包含被引入到编码野生型荧光素酶的碱基序列SEQ ID NO:3中的突变。同时，SEQ ID NO:37所示的碱基序列以下述方式获得：针对在哺乳动物细胞中的表达对编码野生型荧光素酶的碱基序列SEQ ID NO:3进行下文所述的密码子优化，并使其具有在相应氨基酸序列上引起上述1个替换的突变。

当使用具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的突变荧光素酶时，与使用野生型荧光素酶的情况相比，特定pH下的最大发光波长发生移位。具体而言，突变荧光素酶催化的发光反应在pH6.8～pH7.0之间的任何pH条件下都显示出最大发光波长为568nm～572nm的光发射。另一方面，如下所述，从野生型荧光素酶获得的最大发光波长在pH6.5条件下接近612nm，或在pH7.0条件下接近605nm。因此，在与野生型相比，从突变荧光素酶获得的光发射的最大发光波长至少在pH6.8～pH7.0的pH范围内移向更短的波长侧。

此外，具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的突变荧光素酶显示出的发光强度的温度依赖性与野生型荧光素酶的不同。具体而言，其高于室温的温度下，其催化活性强于野生型。例如，当在表达突变荧光素酶的大肠杆菌中使发光反应在55℃下发生时，获得了比表达野生型荧光素酶的情况下更高的发光强度。

比较野生型荧光素酶(SEQ ID NO:1)、三种突变荧光素酶(SEQ ID NO:2、34和36)和已知的源自北方锯角萤的荧光素酶(SEQ ID NO:30和31)的氨基酸序列而获得的结果总结于表2中。

表2：各种荧光素酶的氨基酸残基差异

如表2所示，与野生型荧光素酶的氨基酸序列相比，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变荧光素酶的氨基酸序列在第50位和第530位具有不同的氨基酸。与野生型荧光素酶的氨基酸序列相比，具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的突变荧光素酶的氨基酸序列在第294位、第323位、第354位和第530位具有不同的氨基酸。与野生型荧光素酶的氨基酸序列相比，具有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的突变荧光素酶的氨基酸序列在第322位和第530位具有不同的氨基酸。

此处，本发明实施方式的荧光素酶包括在源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶或上述突变荧光素酶的氨基酸序列中含有突变(例如氨基酸的替换、缺失和/或添加等)的荧光素酶。通过突变获得的这种荧光素酶是在野生型荧光素酶或上述突变荧光素酶的氨基酸序列中具有至少一个突变的荧光素酶，优选的是在野生型荧光素酶或上述突变荧光素酶的1～20个、1～15个、1～10个或1～5个氨基酸上具有突变的荧光素酶。优选的是，通过突变获得的这种荧光素酶与野生型荧光素酶的氨基酸序列或与上述突变荧光素酶的氨基酸序列的氨基酸序列同源性为75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上。特别而言，优选的是通过突变获得的这种荧光素酶与野生型荧光素酶和上述卵翅锯角萤突变荧光素酶具有相同的发光反应性质。

本发明的一个实施方式涉及含有编码本发明实施方式的荧光素酶的碱基序列的核酸。即，该核酸是含有源自卵翅锯角萤的荧光素酶基因的核酸。本发明中，核酸是指例如DNA或RNA。本发明中，荧光素酶的“基因”主要是指由mRNA转录的区域，即，结构基因。由本发明实施方式的核酸所编码的荧光素酶包括野生型荧光素酶和突变荧光素酶。

本发明实施方式的核酸的实例是含有由SEQ ID NO:3表示的碱基序列的核酸。具有该序列的基因克隆自卵翅锯角萤，并且编码野生型荧光素酶。本发明实施方式的核酸的另一实例是含有由SEQ ID NO:32表示的碱基序列的核酸。具有该序列的基因在编码克隆自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的碱基序列上含有突变，并且编码突变荧光素酶(SEQ ID NO:2)。另一实例是含有由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38表示的碱基序列的核酸。具有该序列的基因在编码克隆自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的碱基序列上含有突变，并且编码突变荧光素酶(SEQ ID NO:34)。另一实例是含有由SEQID NO:37和SEQ ID NO:39表示的碱基序列的核酸。每个具有这些序列的基因在编码克隆自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的碱基序列上含有突变，并且编码突变荧光素酶(SEQ ID NO:36)。

本发明实施方式的核酸可以是在上述碱基序列上进一步含有突变的核酸。所述碱基序列上的突变包括不会使所编码的氨基酸序列变异的突变。从引入此类突变的核酸表达出的是与引入该突变之前具有相同氨基酸序列的荧光素酶。不会使氨基酸序列变异的突变的实例是消除了存在于基因中的特异性限制性酶识别序列的那些突变。由于该突变，含有该基因的核酸不会被限制性酶消化，但是该基因能够编码与突变前的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白。此类突变可以通过将构成限制性酶识别序列的密码子转化成具有不同碱基序列的同义密码子来实现。当该基因中已经包含用于基因修饰的限制性酶识别序列时，此类突变是有用的。在该情况下，通过事先消除该基因的识别序列，可以防止核酸在用限制性酶处理时发生片段化，由此便于进行基因修饰。消除了限制性酶识别序列的此类碱基序列的实例是由SEQ ID NO:4表示的序列。在该序列中，消除了碱基序列1所示的EcoRI识别序列。

不会使所编码的氨基酸发生变异的突变的另一实例是针对在特定有机体物种中的表达而对基因的密码子进行了优化的突变。此处，术语“优化”是指将包含在核酸中的基因密码子替换成在特定有机体物种中密码子频率高的密码子。如果进行优化，基因在特定有机体物种中的表达与不优化的情况相比得到增强。本发明实施方式的荧光素酶基因源自萤火虫，因此，在导入了该基因的有机体物种在分类学上与萤火虫距离较远时，可以通过优化来获得较高的效果。本发明中，特定的有机体物种例如为细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞例如为小鼠细胞、猴细胞和人类细胞。密码子经过优化的核酸的实例是含有由SEQ ID NO:5表示的碱基序列的核酸。在所述核酸中，消除了BamHI和EcoRI的识别序列，并且针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了密码子。

本发明实施方式的核酸包括包含带有Kozak序列的荧光素酶基因的核酸。Kozak序列是具有起始密码子和位于起始密码子前后的多个碱基序列的序列。已经证明Kozak序列的存在会使基因的表达量增加。关于Kozak序列，在各有机体物种或生物群系中已经发现共有序列。本发明实施方式的含有Kozak序列的核酸具有与其要被导入的有机体物种相应的Kozak序列。例如，在将核酸引入哺乳动物细胞中时，该核酸含有作为Kozak序列的序列gccrccatgg，其中r表示鸟嘌呤或腺嘌呤。带有Kozak序列的荧光素酶基因可以是野生型基因或以上述方式优化了密码子的突变基因。

本发明的一个实施方式包括具有这些核酸的载体。除编码荧光素酶的核酸之外，所述载体可以包含含有表达调控序列或标志基因序列的核酸等。

本发明的一个实施方式涉及利用实施方式的荧光素酶来分析细胞中的功能的方法。所述方法包括将本发明实施方式的荧光素酶导入细胞中并用成像设备检测荧光素酶的发光。例如，可以将本发明实施方式的荧光素酶基因引入DNA中的特定表达调控区的下游，并且基于是否存在发光来检测荧光素酶的表达，由此能够确定表达调控区的功能。

本发的一个实施方式明涉及利用本发明实施方式的荧光素酶来分析细胞内蛋白的方法。所述方法包括：导入具有本发明实施方式的荧光素酶和待分析蛋白的融合蛋白，并且使用成像设备检测所述荧光素酶的发光。

所述方法包括：观察待分析蛋白在细胞中的定位，并对定位进行时程观察(时滞)。所述方法不仅包括确认蛋白定位还包括仅确认该蛋白是否得到表达。待使用的细胞不受具体限制，并且可以是细胞成像领域中能够常规使用的那些。此外，待分析蛋白也不受具体限制，可以根据研究目来选择。所述蛋白可以是基本上存在于待使用的细胞中的蛋白，或者可以是基本上不存在于细胞中的异源蛋白或经修饰的蛋白。

为了将融合蛋白导入细胞中，可以应用已知的导入方法。其中之一是将体外纯化的融合蛋白直接导入细胞中的方法。例如，可以用显微注射法将融合蛋白直接注射到细胞中。或者，将细胞在含有融合蛋白的培养基中温育，由此通过胞吞作用将融合蛋白摄入细胞中。另一方法是将含有编码所述融合蛋白的碱基序列的核酸导入，随后在细胞中表达所述融合蛋白。例如，用磷酸钙方法、脂转染和电穿孔法等将含有所述核酸的表达载体导入细胞，由此能够从表达载体表达融合蛋白。此处，融合蛋白的基因含有本发明实施方式的荧光素酶基因和待分析的蛋白的基因，其中，所述荧光素酶基因和所述蛋白的基因以使得它们各自都能够正常翻译的方式连接。

为了使用成像设备检测荧光素酶的发光，可以应用公知的检测方法。例如，通过将荧光素、ATP和Mg²⁺离子等适当地添加到表达含荧光素酶的融合蛋白的细胞中来引起荧光素酶的发光反应，并且通过成像设备可以检测发出的光。所述成像设备是配备有用于捕获发光的滤光器的显微镜。基于通过鉴定细胞中的发光位置而获得的信息，可以使用显微镜来具体确定蛋白的定位。作为成像设备，可以使用具有能够进行时程图像拍摄功能的显微镜，并且可以用所述显微镜实现时程观察。

实施例

[实施例1：克隆源自卵翅锯角萤的荧光素酶基因]

1.材料

使用在东京都收集的卵翅锯角萤的萤火虫幼虫作为材料。

2.总RNA的提取和cDNA的合成

使用剪刀从萤火虫中剪下发光器官。向Lysing Matrix D试管(由MP-Biomedicals,LLP制造，其是含有用于使组织和细胞匀质化的珠的试管)中添加所收集的发光器官和1mL总RNA提取试剂TRIzol试剂(由Invitrogen制造)。将该试管安装在匀质化系统FastPrep24(由MP-Biomedicals,LLP制造)或FastPrep FP100A(由MP-Biomedicals Co.,Ltd.制造)中，将萤火虫的发光器官以6.5m/s的振动速度和45秒的振动时间在所述试剂中匀质化。均质化完成后，将所述试管从所述系统取出，并放置在冰上30分钟。随后，在相同条件下再重复一次上述匀质化过程。

在下一步骤中，根据总RNA提取试剂TRIzol试剂的说明书，从匀质化的溶液中分离出并纯化总RNA。用乙醇沉淀法对100μL所获得mRNA溶液进行沉淀和浓缩。使用全长cDNA合成试剂GeneRacer(由Invitrogen制造)根据手册从经沉淀浓缩的总RNA合成全长cDNA。如下所述对20μL所获得的cDNA溶液进行基因实验，作为萤火虫全长cDNA文库。

3.荧光素酶基因的5’末端侧的鉴定

3-1.制备用于cDNA末端快速扩增(RACE)法的引物

通过聚合酶链式反应(PCR)法进行荧光素酶基因的克隆。如下所述，基于源自已知的亲缘关系接近的物种的荧光素酶基因的氨基酸序列，制备PCR引物。

为了确认在源自萤火虫的荧光素酶中高度保守的氨基酸区域，使用序列信息分析软件DNASIS Pro(由Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.制造)对10种已经公开的源自萤火虫的荧光素酶的氨基酸序列进行相互比较。用于比较的亲缘关系接近的物种是大萤火虫(Lampyris noctiluca)(登记号CAA61668)、源氏萤(Luciola cruciata)(登记号P13129)、平家萤(Luciola lateralis)(登记号Q00158)、东欧萤火虫(Luciola mingrelica)(登记号Q26304)、姬萤(Hotaria parvula)(登记号AAC37253)、北美萤火虫(登记号BAF48390)、宾夕法尼亚萤火虫(Photuris pennsylvanica)(登记号Q27757)、都子窗萤(Pyrocoelia miyako)(登记号AAC37254)、亚洲窗萤(Pyrocoelia rufa)(登记号AAG45439)和大场雌光萤(Rhagophthalmus ohbai)(登记号BAF34360)。

随后，经证明位于荧光素酶的C末端侧的第440位残基近端处的氨基酸序列L-I-K-Y-K-G-Y-Q-V(SEQ ID NO:6)是高度保守的。基于编码这9个氨基酸的密码子，预测了碱基序列，设计了12种对荧光素酶具有特异性的混合引物，以用于5’末端RACE PCR。这些引物的名称和序列如下(引物序列中的Y、R和N是指混合碱基)：flexLuc5-ATA(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT-3’：SEQ ID NO:7)，flexLuc5-ATG(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT-3’：SEQ ID NO:8)，flexLuc5-ATT(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT-3’：SEQ ID NO:9)，flexLuc5-ACA(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT-3’：SEQ ID NO:10)，flexLuc5-ACG(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT-3’：SEQ ID NO:11)，flexLuc5-ACT(5’-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT-3’：SEQ ID NO:12)，flexLuc5-GTA(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT-3’：SEQ ID NO:13)，flexLuc5-GTG(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT-3’：SEQ ID NO:14)，flexLuc5-GTT(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT-3’：SEQ ID NO:15)，flexLuc5-GCA(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT-3’：SEQ ID NO:16)，flexLuc5-GCG(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT-3’：SEQ ID NO:17)，flexLuc5-GCT(5’-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT-3’：SEQ ID NO:18)。这些引物的合成外包给Life Technologies,Japan,Co.,Ltd.。

3-2.通过5’-RACE PCR克隆荧光素酶基因的5’末端侧

使用以前述方式制备的萤火虫全长cDNA文库作为模板，使用以上述方式制备的12种具有特异性的混合引物和5’末端特异性引物GeneRacer5’引物(5’-CGA CTGGAG CAC GAG GAC ACT GA-3’:SEQ ID NO:19)及GeneRacer5’巢式引物(5’-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3’:SEQ ID NO:20)，进行5’-RACERCP。GeneRacer5’引物和GeneRacer5’巢式引物是包含在全长cDNA合成试剂GeneRacer试剂盒(由Invitrogen制造)中的引物。为了通过5’-RACE PCR高效地扩增荧光素酶基因，使用经PCR扩增一次的基因作为模板，并用内侧引物对来进行巢式PCR以进一步特异性地扩增基因。使用聚合酶Ex-Taq(由Takara Bio Inc.制造)根据手册进行PCR。

作为第一次PCR，使用由上述12种特异性混合引物中的任一种与GeneRacer5’引物组成的12种引物对来扩增荧光素酶基因。制备包含终浓度为相同比率的10x ExTag缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)、终浓度为1.0μΜ的12种引物之一和终浓度为0.3μΜ的GeneRacer3’引物的10μL PCR反应液，向其中添加0.2μL萤火虫全长cDNA文库溶液。此处，萤火虫全长cDNA文库溶液的浓度未确定。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在45℃下30秒和在72℃下90秒组成的循环30次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，使用1%tris乙酸缓冲液(TAE)琼脂糖凝胶对1μL的PCR反应液进行电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。在所有12种反应液中，确认了轻微的基因扩增，因此使用每种PCR反应液作为模板以下述方式进行巢式PCR反应。

作为巢式PCR，使用4种引物对来进行荧光素酶基因的扩增，所述引物对分别具有第一次PCR中所用的12种引物中的4种和GeneRacer3’巢式引物。制备包含终浓度为相同比率的10x Ex Tag缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.005U/μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)、终浓度为1.0μΜ的12种引物之一和终浓度为0.3μΜ的GeneRacer3’引物的10μL PCR反应液，向其中添加1.0μL的用无菌水稀释了10倍的第一次PCR反应溶液作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在45℃下30秒和在72℃下90秒组成的循环30次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。确认了高效地扩增了在约1.4kbp附近的基因的引物组合条件。

3-3.确定通过5’-RACE扩增得到的基因的碱基序列

为了确定通过5’-RACE扩增得到的基因的碱基序列，对PCR产物进行凝胶抽提纯化、亚克隆和直接测序。详细内容如下给出。

使用能够高效扩增约1.4kbp附近的基因的组合来进行PCR(终体积20μL)，然后使用凝胶抽提来收集目标基因片段。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System(由Promega KK制造)根据其手册进行凝胶抽提。通过TA克隆法对抽提自凝胶的PCR产物进行亚克隆。使用pGEM-T Easy Vector System(由Promega KK制造)根据其手册来进行TA克隆。随后，将载体DNA转化至大肠杆菌(TOP10菌株或DH5α菌株)中，并且用蓝-白筛选法选择插入物阳性菌落。对所选择的菌落进行直接菌落PCR，并且确认插入了目标基因。在直接菌落PCR中，使用包括M13-F(-29)引物(5’-CAC GACGTT GTA AAA CGA C-3’:SEQ ID NO:21)和M13反向引物(5’-GGA TAA CAA TTTCAC AGG-3’:SEQ ID NO:22)的引物对。制备包含终浓度为相同比率的10x Ex Tag缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)和终浓度为0.2μΜ的引物对的10μL PCR反应液，向其中添加少量大肠杆菌的菌落作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性1分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环25次，接着在72℃下进行延伸反应2分钟。PCR反应后，取2μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。

对于已确认发生了扩增的PCR反应液，通过直接测序方法来确定基因的碱基序列。使用PCR产物纯化试剂盒EXoSAP-IT(GE Healthcare Bioscience制造)，除去包含在PCR反应液中的额外dNTP和引物，制得用于PCR直接测序的模板。使用BigDyeTerminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，制备含有所述模板的测序反应液，并且使用热循环仪进行测序反应。PCR产物的纯化和测序分别根据其手册进行。测序反应后，如下所述对反应产物进行纯化。向反应液中添加2.5倍重量的100%乙醇，然后离心沉淀核酸。除去上清液后，添加70%乙醇来清洗沉淀物，然后用离心机进行沉淀。最后，在除去上清液后，使沉淀物干燥。向经纯化的沉淀物中添加15μL的Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems制造)并使其溶解。在94℃下使溶液热变性2分钟，然后在冰上快速冷却，由此提供用于确定碱基序列的样品。对于该样品，使用Applied Biosystems3130x1基因分析仪(Applied Biosystems制造)确定碱基序列。根据手册来执行分析方法。

利用序列信息分析软件DNASIS Pro的“序列连接(sequence linking)”功能对测序获得的基因序列(SEQ ID NO:23)进行分析。对于所述序列，使用由美国国家生物技术信息中心(下文简称为NCBI)提供的blastx检索进行同源性研究，由此确认：所述序列与已知荧光素酶的碱基序列具有高同源性。确定了通过上述实验和分析而获得的碱基序列位于新型荧光素酶基因的5’末端侧。

4.荧光素酶基因的3’Race RCR和全长cDNA的获得

4-1.设计用于3’Race PCR的引物

基于在5’Race PCR实验获得的荧光素酶基因的5’末端侧上的非翻译区中的序列，制备了用于3’RACE的引物和用于巢氏PCR的引物。引物的合成外包给日本的Life Technologies。

4-2.用于获得荧光素酶基因的全长cDNA的3’Race RCR

使用如以上所述制备的萤火虫全长cDNA文库作为模板，使用基于目标萤火虫荧光素酶的5’末端侧上的非翻译区的碱基序列制备的引物(即：JP-Ohoba-Full-F1，5’-GAT TCG AGA TAG TGC TAG TC-3’:SEQ ID NO:24)、GeneRacer3’引物(5’-GCTGTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3’;SEQ ID NO:25)和GeneRacer3’巢氏引物(5’-CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG-3’:SEQ ID NO:26)，进行3’-RACE PCR。所用的GeneRacer3’引物和GeneRacer3’巢式引物包含在全长cDNA合成试剂GeneRacer试剂盒(由Invitrogen制造)中。为了通过3’-RACE PCR高效地扩增荧光素酶基因，使用PCR扩增一次的基因作为模板，并用内侧引物对来进行巢氏PCR以进一步特异性地扩增基因。使用聚合酶Ex-Taq(由Takara Bio Inc.制造)根据手册进行PCR。

作为第一次PCR，使用由从位于5’末端侧上的非翻译区的碱基序列制备的引物和GeneRacer3’引物组成的引物对来扩增荧光素酶基因。制备包含终浓度为相同比率的10x Ex Tag缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)、终浓度为0.3μΜ的引物的20μL PCR反应液，向其中添加0.4μL萤火虫全长cDNA文库溶液。此处，萤火虫全长cDNA文库溶液的浓度未确定。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环30次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。确认了轻微的基因扩增，因此使用该PCR反应液作为模板进行巢氏PCR反应。

作为巢氏PCR，使用包括巢氏PCR引物(即：JP-Ohoba-Full-F2,5’-GAT TCG AGATAG TGC TAG TCA AAA GC-3’;SEQ ID NO:27)和GeneRacer3’巢氏引物的引物对来扩增荧光素酶基因。制备包含终浓度为相同比率的10x Ex Tag Buffer(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μL的TaKaRaEx Taq(5U/μL)、终浓度为0.3μΜ的引物的20μL巢氏PCR反应液，向其中添加1.0μL的用无菌水稀释了10倍的第一次PCR反应溶液作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环30次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。经确认基因在约2kbp处得到高效扩增。

4-3.确定通过3’-Race扩增得到的基因的碱基序列

为了鉴定通过3’-RACE扩增得到的碱基序列，对PCR产物进行凝胶抽提纯化、亚克隆和直接测序。详细内容如下给出。

使用能够高效扩增约2kbp处的基因的引物的组合来进行PCR(终体积20μL)，借助于凝胶抽提来收集目标基因片段。使用Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System(由Promega KK制造)根据手册进行凝胶抽提。借助于RA克隆对抽提自凝胶的PCR产物进行亚克隆。使用pGEM-T Easy Vector System(由Promega KK制造)根据手册来进行TA克隆。随后，将载体DNA转化至大肠杆菌(TOP10菌株或DH5α菌株)中，并且用蓝-白筛选法选择插入物阳性菌落。对所选择的菌落进行直接菌落PCR，并且确认引入了所述基因。在直接菌落PCR中，使用包括M13-F(-29)引物和M13反向引物的引物对。制备包含终浓度为相同比率的10x Ex Tag缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μL的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)和终浓度为0.2μΜ的引物的10μL PCR反应液，向其中添加少量大肠杆菌的菌落作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性1分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环25次，接着在72℃下进行延伸反应2分钟。PCR反应后，取2μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增的基因的条带。

对于已确认发生了扩增的PCR反应液，通过直接测序方法来确定基因的碱基序列。使用PCR产物纯化试剂盒EXoSAP-IT(GE Healthcare Bioscience制造)，除去包含在PCR反应液中的额外dNTP和引物，制得用于PCR直接测序的模板。使用BigDyeTerminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)，制备含有所述模板的测序反应液，并且使用热循环仪进行测序反应。测序用引物是载体引物或基因特异性引物。PCR产物的纯化和测序分别根据其手册进行。测序反应后，如下所述对反应产物进行纯化。向反应液中添加2.5倍重量的100%乙醇，然后离心沉淀核酸。除去上清液后，添加70%乙醇来清洗沉淀物，然后用离心机沉淀出核酸。最后，在除去上清液后，使沉淀物干燥。向经纯化的沉淀物中添加15μL的Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems制造)并使其溶解。在94℃下使溶液热变性2分钟，然后在冰上快速冷却，将其用做确定碱基序列的样品。对于该样品，使用Applied Biosystems3130x1基因分析仪(Applied Biosystems制造)确定碱基序列。根据手册来执行对碱基序列的分析方法。

通过测序来获得全长萤火虫荧光素酶基因。对于碱基序列(SEQ ID NO:3)或翻译成氨基酸的序列(SEQ ID NO:1)，利用由NCBI提供的blastx或blastp检索进行同源性检索。在各次检索中，经确认所述碱基序列与已知荧光素酶的碱基序列具有高同源性。将在上述实验和分析中获得的碱基序列确定为新型荧光素酶的全长cDNA序列。下文中，所述碱基序列和氨基酸序列描述如下。

碱基序列：

ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTTCTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGAGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGAATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA(SEQ ID NO:3).

氨基酸序列:

MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL＊(SEQ ID NO:1).

下文中，将新型荧光素酶称为源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶。

[实施例2：野生型荧光素酶的酶学参数的确定]

1.野生型荧光素酶基因的蛋白表达

为了在大肠杆菌中表达野生型荧光素酶基因，将其引入pRSET-B载体(由Invitrogen制造)。根据标准方法，通过下述实验来构建该基因表达载体。

1-1.对野生型荧光素酶基因的限制性酶识别位点的修饰

根据如以上所述确定的碱基序列，野生型荧光素酶基因含有限制性酶EcoRI的识别序列。进行基因修饰从而保持荧光素酶的氨基酸序列并除去这些碱基序列中的识别序列。进行该处理是为了便于将荧光素酶基因引入下述表达载体中。通过以下文献中描述的方法来引入基因突变：由Kazunari Taira编写的"An experimental method ofgene functional inhibition-from simple and secure gene function analysis to application togene therapy"(Yodosha，出版于2001，第17～25页)。引入突变后的碱基序列由SEQID NO:4表示。

1-2.将野生型荧光素酶基因引入基因表达载体中

为了将野生型荧光素酶基因引入位于pRSET-B载体的BamHI位点和EcoRI位点之间的限制性酶区域，制备了包含起始密码子及其前方的限制性酶BamHI的识别序列GGATCC的引物，和包含终止密码子及其后方的限制性酶EcoRI的识别序列GAATTC的引物。使用该引物对，对在荧光素酶基因的两端含有前述限制性酶识别位点的片段进行扩增。使用聚合酶KOD-Plus(Toyobo Co.,Ltd.)根据其手册进行PCR。

制备包含终浓度为相同比率的10×PCR缓冲液、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为1.0mM的MgSO₄、终浓度为0.02U/μl的Toyobo KOD-Plus(1U/μl)和终浓度为0.3μM的引物对的PCR反应液，向20μl的该PCR反应液中添加0.4μl的作为模板的不含BamHI和EcoRI识别序列的荧光素酶基因。在PCR反应中，将反应液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在55℃下30秒和在68℃下2分钟组成的循环30次，接着在68℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增基因的条带。确认了基因扩增，因此通过乙醇沉淀法对该PCR反应液进行沉淀浓缩，通过添加4μL用于进行限制性酶处理的10x Η Buffer、限制性酶BamHI(Toyobo Co.,Ltd.制造)和限制性酶EcoRI(Toyobo Co.,Ltd.制造)各2μL、以及32μL无菌去离子水使沉淀溶解，并用限制性酶进行处理，同时保持37℃的温度2小时。随后，通过乙醇沉淀法对反应液进行沉淀浓缩，并将其溶解于无菌去离子水中。取该溶液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色。在紫外照射下确认含有DNA条带的凝胶，用刀切下该凝胶。使用Wizard(R)SV Gel and PCRClean-UP System(Promega KK制造)从切下的凝胶中提取DNA。根据手册进行这些操作。随后，使用Ligation Pack(Nippon Gene制造)根据手册将所提取的DNA引入pRSET-B载体中，所述pRSET-B载体事先已经用BamHI和EcoRI用相似的方法处理过。将该载体DNA转化至大肠杆菌JM109(DE3)菌株中，并使菌落形成。

使用所获得的菌落作为模板进行直接菌落PCR，并且对引入pRSET-B中的荧光素酶基因进行扩增。使用T7启动子引物(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3':SEQID NO:28)和T7反向引物(5'-CTA GTT ATT GCT CAG CGG TGG-3':SEQ ID NO:29)的引物对来进行直接菌落PCR。制备包含终浓度为相同比率的10×Ex Taq缓冲液(20mM Mg²⁺plus)、终浓度为0.2mM的dNTP混合物(每种2.5mM)、终浓度为0.05U/μl的TaKaRa Ex Taq(5U/μL)和终浓度为0.2μM的引物的PCR反应液，向10μl该PCR反应液中添加少量大肠杆菌菌落作为模板。在PCR反应中，将溶液在94℃下热变性2分钟，然后重复进行由在94℃下30秒、在50℃下30秒和在72℃下2分钟组成的循环25次，接着在72℃下进行延伸反应5分钟。PCR反应后，取1μL的PCR反应液进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳，并且在用溴化乙锭染色后于紫外线照射下观察所扩增基因的条带。

对于已确认发生了扩增的PCR反应液，通过直接测序方法来确定基因的碱基序列。使用PCR产物纯化试剂盒ExoSAP-IT，除去包含在PCR反应液中的额外的dNTP和引物，由此制得用于PCR直接测序的模板。使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒，制备含有所述模板的测序反应液，并且使用热循环仪进行测序反应。将载体引物或基因特异性引物用于测序。PCR产物的纯化和测序根据手册来进行。测序反应后，如下所述对反应产物进行纯化。向反应液中添加2.5倍重量的100%乙醇，然后离心沉淀核酸。除去上清液后，添加70%乙醇来清洗沉淀物，并用离心机使核酸沉淀。除去上清液后，最后使沉淀物干燥。通过添加15μL的Hi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems制造)使经纯化的沉淀物溶解。在94℃下使溶液热变性2分钟，在冰上冷却，并使用其作为用于确定碱基序列的样品。对于该样品，使用Applied Biosystems3130xl基因分析仪确定碱基序列，并且确认了所述基因已被引入基因表达载体pRSET-B中。

2.发光蛋白的纯化

将0.5μL荧光素酶载体添加至50μL含有JM109(DE3)的大肠杆菌溶液中，将该溶液在冰上温育10分钟，然后在42℃温育1分钟，最后在冰上温育2分钟。随后，将50μL该大肠杆菌溶液添加至200μL SOC培养基中，在37℃下将该大肠杆菌与SOC培养基的混合溶液振荡温育20分钟。用100μL经温育的样品在LB培养基平板(含有100μg/mL的氨苄青霉素)上进行划线接种，并在37℃下温育过夜。第二天，挑选所获得的菌落并在500mL规模的LB培养基中于37℃温育24小时，并于18℃温育24小时。在48小时的温育之后，用离心机收集菌块，将其再悬浮于0.1M Tris-HCl溶液(pH8.0)中，并进行超声波破碎。对破碎处理后的菌块溶液进行离心分离(15,000rpm,10分钟)，除去沉淀物，并收集上清液。向床体积为2mL的柱中添加500μL Ni-Agar悬浮液和2mL0.1M Tris-HCl以使柱平衡。将收集的上清液添加至柱上并使其过柱。在使全部上清液过柱的同时，操作都在4℃下进行。用2mL的25mM咪唑/0.1MTris-HCl溶液洗柱。向洗过的柱上添加2mL的500mM咪唑/0.1M Tris-HCl溶液以洗脱荧光素酶。用凝胶过滤柱PD-10(GE Healthcare制造)过滤经洗脱的样品，并除去矿物质。使用Vivaspin6(Sartorius K.K.制造)对除去了矿物质的样品进行超滤，并向浓缩样品中添加甘油以制备50%的甘油溶液。将该溶液保存在-20℃下。

3.光发射谱图的测量

使用LumiFlSpectroCapture(由ATTO Corporation制造)作为测量设备，向含有1mM的D-荧光素、2mM ATP和4mM MgCl₂的0.1M柠檬酸/0.1M Na₂HPO₄缓冲液(pH5.5～8.0)溶液中添加终浓度为1μg/mL的经纯化的酶，添加所述酶15秒后测量发光谱图。测量结果示于图1。

图1说明，由所获得的荧光素酶引起的发光反应在pH8.0时的最大发光波长在约564nm处。示出的最大发光波长在pH7.5时为约567nm，在pH7.0时为约605nm，在pH6.5时为约612nm，在pH6.0时为约614nm，在pH5.5时为约616nm。

4.动力学分析

4-1.D-荧光素和ATP浓度的确定

如下所述来确定D-荧光素在D-荧光素溶液中的浓度和ATP在ATP溶液中的浓度。

使用紫外光-可见光分光光度计(Hitachi制造)测量了D-荧光素溶液和ATP溶液的紫外线-可见光吸收光谱。基于测量结果和以下所示的ε值来计算各浓度。

D-荧光素：λ_最大328nm,ε18200,pH5.0

ATP:λ_最大259nm,ε15400,pH7.0

对每个样品进行10次测量，并且使用吸光度的平均值进行计算。如下文所述，使用以上述方式确定了浓度的D-荧光素溶液和ATP溶液来计算Km值。

4-2.测量针对D-荧光素的Km值

在多种D-荧光素浓度下测量所获得的荧光素酶的发光强度。基于测量结果，计算针对D-荧光素的Km值。

通过向0.1M Tris-HCl(pH8.0)中添加D-荧光素来制备8种不同浓度的D-荧光素溶液。这些溶液中D-荧光素的终浓度为0.625μΜ、1.25μΜ、2.5μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ和80μΜ。将这些D-荧光素溶液各自以50μL的量等分加入96孔微孔板中。将含有每种经纯化的荧光素酶、4mM ATP和8mM MgSO₄的0.1M Tris-HCl(pH8.0)溶液连接至光度计的标准泵，在向孔中添加50μL所述溶液的同时进行测量。使用Luminescensor(ATTO)进行测量。对于每种荧光素浓度重复测量3次。

将所获得的光子计数值的峰值强度对荧光素浓度S作图，将初始速率定义为V。对这些图进行Michaelis-Menten型曲线拟合，由此得出Km值。通过非线性最小二乘法进行曲线拟合，通过Newton法进行参数的检索。

4-3.测量针对ATP的Km值

在多种ATP浓度下测量所获得的荧光素酶的发光强度。基于所述结果，确定了针对ATP的Km值。

通过向0.1M Tris-HCl(pH8.0)中添加ATP来制备8种不同浓度的ATP溶液。这些溶液中的ATP的终浓度为10μΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ、160μΜ、320μΜ、480μΜ和640μΜ。将这些ATP溶液各自以50μL的量等分加入96孔微孔板中。将含有每种经纯化的荧光素酶、1mM D-荧光素和8mM MgSO₄的0.1M Tris-HCl(pH8.0)溶液连接至光度计的标准泵，在向孔中添加50μL所述溶液的同时进行测量。对于每种荧光素浓度重复测量3次。

将所获得的光子计数值的峰值强度对ATP浓度S作图，将初始速率定义为V。对这些图进行Michaelis-Menten型曲线拟合，由此得出Km值。通过非线性最小二乘法进行曲线拟合，通过Newton法进行参数的检索。

表3中，示出了上文确定的针对D-荧光素的Km值和针对ATP的Km值。表3还示出了以类似方式测量的已知的荧光素酶的Km值。GL3是源自北美萤火虫的荧光素酶。此外，ELuc、CBG和CBR是源自已知的叩头虫(click beetle)的荧光素酶。这些已知的荧光素酶是能够商购获得的。

表3：Km值的比较

此外，图2示出了作为对D-荧光素浓度(横轴)和ATP浓度(纵轴)作图的这些Km值。

[实施例3：与源自北美萤火虫的荧光素酶的发光强度的比较]

将源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶、源自卵翅锯角萤的突变荧光素酶(N50D和I530R)和源自北美萤火虫的荧光素酶(SEQ ID NO:33)各自在HeLa细胞中表达，测量发光强度并且将其相互比较。

如下构造含有野生型荧光素酶基因的表达载体。具体而言，对于野生型荧光素酶，将Kozak序列添加到包含针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了的基因的核酸中(SEQ ID NO:5)，将所得物插入pF9A CMV hRLuc neo Flexi载体(由Promega制造)的多克隆位点内的SgfI位点和PmeI位点之间。

下文中，描述碱基序列：

ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA(SEQ ID NO:5)。

如下制备含有突变荧光素酶基因的表达载体。首先，制备突变荧光素酶基因。通过使用突变用引物，在如上所述经密码子优化的野生型荧光素酶基因(SEQ ID NO:5)中的两个位置引入突变。通过以下文献中描述的方法来引入基因突变：Kazunari Taira编写的"An experimental method of gene functional inhibition-from simple and securegene function analysis to application to gene therapy"(Yodosha，出版于2001，第17～25页)。引入突变的结果是，位于所述基因编码的蛋白的氨基酸序列中的第50位的氨基酸残基，即天冬酰胺，变成了天冬氨酸(N50D)，第530位的氨基酸残基，即异亮氨酸，变成了精氨酸(I530R)。向引入突变后的卵翅锯角萤荧光素酶基因(SEQ ID NO:32)中添加Kozak序列，将所得物插入pF9A CMV hRLuc neo Flexi载体的多克隆位点内的SgfI位点和PmeI位点之间。下文中，描述碱基序列：

ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGGACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGAGAGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA(SEQ ID NO:32)。

如下制备含有源自北美萤火虫的荧光素酶基因的表达载体。具体而言，针对在哺乳动物细胞中的表达对源自北美萤火虫的现有荧光素酶基因进行优化，对其提供Kozak序列，然后插入pF9A CMV hRLuc neo Flexi载体的多克隆位点内的SgfI位点和PmeI位点之间。

此外，由于pF9A载体含有作为内部对照的源自海肾(Renilla reniformis)的荧光素酶基因，因此可以将相对于海肾荧光素酶的发光强度的比值作为插入多克隆位点的发光基因的发光强度。

通过脂转染法将以上述方式获得的三种质粒分别基因转染至HeLa细胞中(该HeLa细胞已经在24孔板中温育)，24小时后，用PBS清洗细胞。向24孔板的每个孔中添加500μL的2mM D-luciferin/CO₂非依赖性培养基(由Invitrogen制造)，并使用Luminescensor(由ATTO Corporation制造)在包括25℃和每孔1秒的条件下测量发光强度90分钟。将在开始测量90分钟后的时间点获得的发光强度作为野生型荧光素酶、突变荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度。从各个孔除去培养基，然后用PBS将其清洗三次。随后，向各个孔中添加500μL的10μM腔肠素/CO₂非依赖性培养基，并使用Luminescensor在包括25℃和每孔1秒的条件下测量发光强度30分钟。将在添加腔肠素后5分钟时获得的发光强度作为海肾荧光素酶的发光强度(内部对照)。将来自野生型荧光素酶、突变荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的发光强度各自除以海肾荧光素酶的发光强度，将结果绘在图中以说明各荧光素酶的发光强度。结果在图3中给出。

北美萤火虫荧光素酶、野生型荧光素酶和突变荧光素酶分别展示出6.6、7.3和26.5的发光强度。因此，与北美萤火虫荧光素酶的发光强度相比，野生型荧光素酶展示出1.1倍以上的发光强度。与北美萤火虫荧光素酶的发光强度相比，突变荧光素酶展示出4倍以上的发光强度。与野生型荧光素酶的发光强度相比，突变荧光素酶展示出3.6倍以上的发光强度。

[实施例4：稳定性确定]

确定了源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的与源自北方锯角萤的已知荧光素酶相比时的抗降解稳定性。

源自北方锯角萤的荧光素酶的氨基酸序列在文献(Oba Y,Furuhashi M,Inouye S.(2010)Identification of a functional luciferase gene in the non-luminous diurnal firefly,Lucidina biplagiata.Molecular Insect Biology19(6):737～743)中公开(SEQ ID NO:30，下文中，该序列也称为“文献序列”)。同时，本发明人从收集自东京都八王子市的北方锯角萤的成体昆虫中克隆出了该荧光素酶，并且鉴定了该荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:31，下文中，该序列也称为“克隆序列”)。作为氨基酸序列比较的结果，发现第249位氨基酸在文献序列中为赖氨酸，而在克隆序列中为甲硫氨酸。碱基序列如下所示：

MEEDKNILRGPAAFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELTHTSVCVRFSHCRDPVFGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILVKAKKTKSKL＊(SEQ ID NO:31)。

当将源自北方锯角萤的荧光素酶的氨基酸序列与野生型荧光素酶的氨基酸序列进行比较时，存在如下表4所示的差异。具体而言，当将源自北方锯角萤的荧光素酶的文献序列(SEQ ID NO:30)与野生型荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)进行比较时，发现6个氨基酸是不同的，且序列同源性为98.9%。

表4：各种荧光素酶的氨基酸残基差异

将以上三种基因引入表达载体中并在大肠杆菌中表达。以与实施例2相同的方式进行表达，不同之处在于：使用BL21(DE3)CodonPlus(由Stratagene Corporation制造)作为大肠杆菌菌株，并且适当地培养细胞。

从表达各基因的大肠杆菌制备裂解物，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶染色结果在图4中给出。经确认，作为尺寸最大的条带，全部三种蛋白都在70kDa附近存在一条带。在野生型荧光素酶(即中央泳道)中没有鉴定出其他条带。同时，在源自北方锯角萤的荧光素酶(即左泳道和右泳道)中，鉴定出尺寸小于70kDa的数条带。特别而言，在具有文献序列的荧光素酶(即左泳道)中，凝胶在70kDa以下的区域中的染色呈涂片状。

图4所示的结果表明，源自北方锯角萤的荧光素酶发生了显著降解，而野生型荧光素酶几乎未降解。换言之，发现野生型荧光素酶的抗蛋白降解稳定性高于源自北方锯角萤的荧光素酶。

[实施例5：与源自北方锯角萤的荧光素酶的发光强度的比较]

将使用源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶(SEQ ID NO:1)的发光反应的发光强度与使用源自北方锯角萤的具有文献序列(SEQ ID NO:30)的荧光素酶和源自北方锯角萤的具有克隆序列(SEQ ID NO:31)的荧光素酶的发光反应的发光强度进行比较。此外，基于文献序列和克隆序列之间的差异，将野生型荧光素酶的氨基酸序列的第249位氨基酸残基(即甲硫氨酸)变成赖氨酸以制备突变荧光素酶(M249K)，然后将其用于强度测量。

对于这四种荧光素酶，向含有针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了的基因的核酸添加Kozak序列，然后将其插入pF9A CMV hRLuc neo Flexi载体(由Promega制造)的多克隆位点内的SgfI位点和PmeI位点之间。此外，由于pF9A载体在载体序列中含有作为内部对照的源自海肾的荧光素酶基因，因此可以将相对于海肾荧光素酶的发光强度的比值作为插入多克隆位点的发光基因的发光强度。

通过脂转染法将以上述方式获得的四种荧光素酶质粒分别基因转染至HeLa细胞中(该HeLa细胞已经在48孔板中温育)，24小时后，用PBS清洗细胞。向48孔板的每个孔中添加500μL的2mM D-荧光素/CO₂非依赖性培养基(由Invitrogen制造)，并使用Luminescensor(由ATTO Corporation制造)在包括37℃和每孔1秒的条件下测量发光强度90分钟。将在开始测量后90分钟的时间点获得的发光强度作为各荧光素酶的发光强度。从各个孔除去培养基，然后用PBS将其清洗三次。随后，向各个孔添中加500μL的10μM腔肠素/CO₂非依赖性培养基，并使用Luminescensor在包括37℃和每孔1秒的条件下测量发光强度30分钟。将在添加腔肠素后5分钟时获得的发光强度作为海肾荧光素酶的发光强度(内部对照)。将来自荧光素酶的发光强度各自除以海肾荧光素酶的发光强度，从而得出各荧光素酶的发光强度。结果在表5和图5中给出。对于每种荧光素酶进行多次测量，并且将发光强度为平均值。

表5

与源自北方锯角萤的具有克隆序列的荧光素酶的发光反应的发光强度相比，野生型荧光素酶展示的发光反应的发光强度为5.5倍以上。此外，与源自北方锯角萤的具有文献序列的荧光素酶的发光反应的发光强度相比，野生型荧光素酶展示的发光反应的发光强度为29倍以上。基于这些结果，发现与源自北方锯角萤的荧光素酶相比，野生型荧光素酶可以引起非常高的发光强度。

此外，关于在氨基酸序列的第249位的氨基酸残基差异，与突变荧光素酶M249K(第249位为赖氨酸)的发光强度相比，使用野生型荧光素酶(第249位为甲硫氨酸)获得了34.8倍以上的发光强度。此外，与源自北方锯角萤的具有文献序列的荧光素酶(第249位为赖氨酸)的发光强度相比，使用源自北方锯角萤的具有克隆序列的荧光素酶(第249位为甲硫氨酸)获得了5.25倍以上的发光强度。基于这些结果，证明了位于氨基酸序列的第249位的甲硫氨酸残基对于荧光素酶的光发射活性而言是重要的。

[实施例6：获得具有移位的最大发光波长的突变酶]

将源自卵翅锯角萤的野生型荧光素酶的氨基酸序列的第294位苯丙氨酸(F)残基替换为酪氨酸(Y)残基(F294Y)、将第323位缬氨酸(V)残基替换为亮氨酸(L)残基(V323L)、将第354位谷氨酸(E)残基替换为缬氨酸(V)残基(E354V)，由此制得突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)。

此外，通过将野生型荧光素酶的氨基酸序列的第322位谷氨酸(E)残基替换为色氨酸(W)残基(E322W)，制备了突变荧光素酶(E322W)。

具体而言，通过适当地使用突变用引物，将突变引入野生型荧光素酶的基因中，获得两种突变荧光素酶基因。通过以下文献中描述的方法来引入基因突变：KazunariTaira编写的"An experimental method of gene functional inhibition-from simple andsecure gene function analysis to application to gene therapy"(Yodosha，出版于2001，第17～25页)。

由此制备的突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)的氨基酸序列如下：

MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSYFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKELGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPVGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL(SEQ ID NO:34)。

由此制备的突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)的基因的碱基序列如下：

ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTACTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAAGAACTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGTGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGGATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA(SEQ ID NO:38)。

此外，制备了含有针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了的基因的突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)的基因。其碱基序列如下：

ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTaCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAcTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGtGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA(SEQ ID NO:35)。

此外，由此制备的突变荧光素酶(E322W)的氨基酸序列如下：

MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKWVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL(SEQ ID NO:36)。

由此制备的突变荧光素酶(E322W)的基因的碱基序列如下：

ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTTCTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAATGGGTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGAGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGGATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA(SEQ ID NO:39)。

此外，制备了含有针对在哺乳动物细胞中的表达而优化了的基因的突变荧光素酶(E322W)的基因。其碱基序列如下：

ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAtggGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA(SEQ ID NO:37)。

其后，根据与实施例2相同的方法，将如上制备的基因(SEQ ID NO:38和39)各自引入pRSET-B载体中。将该载体转化至大肠杆菌JM109(DE3)菌株中以表达突变荧光素酶。随后，从大肠杆菌纯化突变荧光素酶。另外，在各种pH环境下，根据与实施例2相同的方法，测量由突变荧光素酶催化的发光反应的光发射谱图。

图6中，图示了在各种pH环境下从使用突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)作为酶进行的发光反应获得的光发射谱图。在pH描述的旁边的圆括号中标出了各谱图的最大发光波长。由图6可以发现，对于该特定突变荧光素酶，在pH7.4的环境下获得具有最高强度的最大发光波长，其最大发光波长在615nm附近。此外发现，其最大发光波长随pH变化的变化小于图1中示出的野生型的最大发光波长的变化。还意识到的是，与图1中示出的野生型相比，特别在pH为7.0以上时的光谱中，其最大发光波长向长波长侧的移位更显著。

图7中，图示了在各种pH环境下从使用突变荧光素酶(E322W)进行的发光反应获得的光发射谱图。在pH描述的旁边的圆括号中标出了各谱图的最大发光波长。由图7可以发现，对于该特定突变荧光素酶，在pH8.0的环境下获得具有最高强度的最大发光波长，其最大发光波长在557nm附近。此外发现，在pH6.8、pH6.6或pH6.4的环境中获得的光发射谱图具有呈现出两峰重叠的形状。此外还意识到，随着pH降低，最大发光波长向长波长侧移位。还发现，与图1中示出的野生型相比，特别在pH6.8和pH7.0的光谱中，最大发光波长向短波长侧的移位更显著。

[实施例7：确定发光强度的温度依赖性]

确定了由实施例6获得的两种突变荧光素酶的发光强度的温度依赖性。

将野生型荧光素酶基因和实施例6中获得的2种突变基因各自引入pRSET-B载体中，并转化至大肠杆菌JM109(DE3)菌株中，以形成菌落。培养由此获得的菌落，并施涂在LB琼脂培养基上，以再次形成菌落24小时。其后，在55℃进行热处理1小时，将其保持在室温下1小时。然后用含有0.5mM D-荧光素的液体对其进行喷射，并使用CCD相机(商品名：DP70，由Olympus Corporation制造)对其拍照。

图8图示了野生型荧光素酶和突变荧光素酶(F294Y、V323L和E354V)之间的摄影图像的比较。应该注意的是，图8中包括的图像是从最初拍摄的彩色图像转化成的黑白图像。图8中，标记为“红色突变荧光素酶”的图像是指突变荧光素酶的图像。从图8中发现，在55℃下，表达突变荧光素酶的大肠杆菌所引起的发光反应显示出了比野生型荧光素酶更强的光发射。该结果意味着即使在55℃下该突变荧光素酶也能保持其催化活性。此外，根据彩色摄影图像，表达突变荧光素酶的大肠杆菌显示出红色的光发射，而表达野生型荧光素酶的大肠杆菌显示出黄色略带橙色的光发射。

图9图示了野生型荧光素酶和突变荧光素酶(E322W)之间的摄影图像的比较。应该注意的是，图9中包括的图像是从最初拍摄的彩色图像转化成的黑白图像。图9中，标记为“绿色突变荧光素酶”的图像是指突变荧光素酶的图像。从图8中发现，在55℃下，表达突变荧光素酶的大肠杆菌所引起的发光反应展示了比野生型荧光素酶更强的光发射。该结果意味着即使在55℃下该突变荧光素酶也能保持其催化活性。此外，根据彩色摄影图像，表达突变荧光素酶的大肠杆菌显示出黄绿色的光发射，而表达野生型荧光素酶的大肠杆菌显示出黄色略带橙色的光发射。

Claims (13)

1.一种荧光素酶，所述荧光素酶源自卵翅锯角萤(Lucidina accensa)。

2.如权利要求1所述的荧光素酶，所述荧光素酶包含：

选自由下述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:34或SEQID NO:36的序列同源性为90%以上的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的荧光素酶，所述荧光素酶所催化的荧光素反应的发光强度是在具有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的荧光素酶催化所述反应时的荧光素发光强度的5.5倍以上。

4.如权利要求1～3中任一项所述的荧光素酶，所述荧光素酶所催化的荧光素反应的发光强度是在具有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的荧光素酶催化所述反应时的荧光素发光强度的4倍以上。

5.如权利要求1～4中任一项所述的荧光素酶，所述荧光素酶的抗蛋白降解稳定性高于具有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的荧光素酶的抗蛋白降解稳定性。

6.如权利要求1～5中任一项所述的荧光素酶，所述荧光素酶满足下述条件中的至少一条：

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第13位丙氨酸对应的氨基酸残基是脯氨酸，

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第211位苏氨酸对应的氨基酸残基是天冬酰胺，

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第227位苯丙氨酸对应的氨基酸残基是酪氨酸，

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第249位赖氨酸对应的氨基酸残基是甲硫氨酸，

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第530位亮氨酸对应的氨基酸残基是异亮氨酸或精氨酸，和

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第542位丙氨酸对应的氨基酸残基是缬氨酸。

7.如权利要求6所述的荧光素酶，所述荧光素酶同时满足下述条件：

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第50位天冬酰胺对应的氨基酸残基是天冬氨酸，和

与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的第530位亮氨酸对应的氨基酸残基是精氨酸。

8.如权利要求1所述的荧光素酶，所述荧光素酶在pH7.0～8.0范围内的任何pH条件下都显示出最大发光波长为611nm～615nm的光发射。

9.如权利要求1所述的荧光素酶，所述荧光素酶在pH6.8～7.0范围内的任何pH条件下都显示出最大发光波长为568nm～572nm的光发射。

10.如权利要求1、8或9所述的荧光素酶，所述荧光素酶在55℃以上催化荧光素反应时的发光强度高于在具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的荧光素酶在相同温度下催化所述反应时荧光素的发光强度。

11.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求1～10中任一项所述的荧光素酶的碱基序列。

12.如权利要求11所述的核酸，其中，针对在哺乳动物细胞中的表达对编码所述荧光素酶的基因的密码子进行了优化。

13.如权利要求11或12所述的核酸，所述核酸包含由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39表示的碱基序列。

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