JP7787203B2 - 改善された特性を有する新規ルシフェラーゼ - Google Patents

改善された特性を有する新規ルシフェラーゼ

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Description

本発明は、天然に存在する海洋カイアシ類メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子に由来するルシフェラーゼ遺伝子、および前記ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として組み込んだレポーター遺伝子細胞株、ならびに試験試料中の遺伝子発現を検出および最適に定量するためにそれらを使用する方法に関する。本発明はさらに、本発明のレポーター細胞株を使用して、試験試料中に存在する薬理活性分子の活性、ならびに前記分子に対する中和抗体応答を検出および最適に定量するための方法に関する。本発明はさらに、最適な感度、シグナル強度、および生物学的忠実度で生物学的過程を検出し、最適にモニタリングするための多重サンプリングを可能にする、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための非毒性方法に関する。細菌と哺乳動物の両方の選択マーカー、多重クローニング部位、トランスポゾン特異的逆方向末端反復、効率的な最小プロモーターを含有し、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質、またはこれらに限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼを含むルシフェラーゼ、または本発明に開示されるメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）由来の新規ルシフェラーゼなどの酵素を含む広範囲の天然に存在するまたは操作されたレポーター遺伝子の発現に理想的に適している新規ベクターも開示される。
生物発光および蛍光レポーター遺伝子は、遺伝子発現の研究に広く使用されており、創薬におけるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）（Ｉｎｇｌｅｓｅら、２００７）および薬物活性の定量（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、２０１０、２０１１、２０１７）に広く応用されている。発光の主な利点の１つは、蛍光とは対照的に外部光源による励起を必要とせず、結果としてシグナル対バックグラウンド比が高くなることである。生物発光アッセイは、ルミノメーターを使用して定量することができる発光を伴う、ルシフェリン基質のオキシルシフェリンへの酸化を触媒するルシフェラーゼ酵素を使用する。天然に存在するルシフェラーゼは、基質としてのＤ－ルシフェリン／ＡＴＰまたはセレンテラジンの使用に基づいて２つの主要な群に分けることができる（Ｔｈｏｒｎｅら、２０１０）。天然に存在するルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）の場合のように細胞内で発現され得るか、またはメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼのように分泌され得る（Ｍａｒｋｏｖａら、２００４）。ＦＬまたはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質と比較して半減期が比較的短く（ＣｏｒｉｓｈおよびＴｙｌｅｒ－Ｓｍｉｔｈ １９９９）、レポーター遺伝子転写レベルの動的変化を定量するために使用することができ、本発明者らなどが示したように、定量されるべき細胞内遺伝子発現または多様な細胞外シグナルの活性の定量を可能にする（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、２００８、２０１０、２０１１、２０１７）。ルシフェラーゼは、二重レポーター遺伝子アッセイで組み合わせることができ、それにより細胞外シグナルの活性、例えば薬物と細胞表面受容体との相互作用後の活性を、例えば薬物応答性プロモーターの制御下のＦＬを使用して定量することができ、結果は、一過性トランスフェクション実験中または両レポーター遺伝子構築物による細胞の安定なトランスフェクション後のいずれかで、構成的プロモーターの制御下のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＲＬ）などの第２のルシフェラーゼの発現に対して正規化することができる（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、２０１０、２０１１、２０１７）。これにより、例えばＦＬを使用して薬物活性を定量することができ、結果を、市販の基質（Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、２０１０、２０１１、２０１７）を使用したマイクロタイタープレートの同じウェルにおけるＦＬ発現のクエンチおよびＲＬレベルの定量後の細胞傷害性または細胞数の差などの効果について正規化することができる。
天然に存在するルシフェラーゼは、遺伝子発現の研究のための、および創薬におけるハイスループットスクリーニングでのレポーター遺伝子として広く応用されているが、理想的にはシングルコピー遺伝子の産物が容易に検出可能であるように非常に明るくあるべきであり、大きなダイナミックレンジを示し、分泌されて低いバックグラウンドレベルを与え、連続サンプリングを可能にし、インジェクタを備えたルミノメーターの使用を必要としない「ｇｌｏ」基質を使用し、サイズが小さく、トランスフェクト細胞における発現を促進し、高レベルで発現された場合に細胞に対して非毒性である改善されたルシフェラーゼが必要とされている。
上記から、薬理活性分子の活性の定量のためのレポーター遺伝子として使用するための、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのための最適な特徴を示す操作されたルシフェラーゼが必要とされていることが分かる。
従来の多重クローニング部位とトランスポゾン特異的組み込み部位の両方を伴う汎用的な二重細菌－哺乳動物発現、および改善された最小プロモーターも必要とされている。
本発明は、上記先行技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子としての使用、および創薬におけるハイスループットスクリーニングへの使用に最適化された新規ルシフェラーゼ遺伝子を提供することである。
特に、本発明の目的は、これらに限定されないが、以下の１つまたは複数を含む、天然の遺伝子によってコードされるものと比較して優れた特性を示すルシフェラーゼタンパク質をコードする最適化されたルシフェラーゼ遺伝子を提供することである；
（ｉ）：増加した光出力（輝度）、
（ｉｉ）：高い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される増強されたシグナル安定性および／またはシグナル持続時間、
（ｉｉｉ）：薬理活性物質の非存在下で対照試料と比較して大きなダイナミックレンジを示す、
（ｉｖ）：分泌されて低いバックグラウンドレベルを与え、連続サンプリングを可能にする、
（ｖ）：インジェクタを備えたルミノメーターの使用を不要にするのに十分に長い半減期を有する、
（ｖｉ）：異種トランスフェクト細胞での発現を促進するために分子サイズが小さく、コドン最適化されている、
（ｖｉｉ）：以下の特徴；細胞における発現の改善、および高レベルで発現された場合の毒性の低減の少なくとも１つを含む増強された生体適合性を示す。
（ｖｉｉｉ）：２つのサブユニット、ＳＬ１－Ｎ－ＴｅｒおよびＳＬ－１－Ｃ－Ｔｅｒとしての再構成を可能にし、プロテアーゼ切断部位によって分離され、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、ＳＬ１の再構成および発光をもたらし、したがって細胞死滅を検出するために使用される。
（ｉｘ）２つのサブユニット、ＳＬ１－Ｎ－ＴｅｒおよびＳＬ－１－Ｃ－Ｔｅｒへの分割を可能にし、２つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン－トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってＣａ２＋フラックスの変化を検出するために使用される。
本発明の要素は、上述の効果の１つまたは複数を提供する。
様々な実施形態では、本発明は、可溶性活性モノマーとして、またはルシフェラーゼを含む他のタンパク質、もしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの蛍光タンパク質、および異なる励起／発光スペクトルを示すそれらのバリアント、または様々なリンカータンパク質との融合タンパク質として溶液中に存在するか、または粒子、アッセイプレートもしくはチューブなどの固体表面に結合している新規ルシフェラーゼを含む。
課題を解決するために、本発明は、本発明の一実施形態において、（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つを含む新規ルシフェラーゼ遺伝子を提供する：
（ｉ）前記細胞における発現のためにコドン最適化されているルシフェラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
特定の実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号１に示され、かつ配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
さらなる実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号２に示され、かつ配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
（ｉｉ）同種由来または異種由来を問わず、細胞からの効率的な分泌を確実にするためのシグナルペプチド。
一態様では、オープンリーディングフレームは、細胞からの効率的な分泌を可能にし得る、配列番号３に示される配列を含むかまたはそれからなる。
（ｉｉｉ）ヒトインターフェロンベータ遺伝子の５’ＵＴＲ由来の最小プロモーター、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコドン最適化シグナルペプチド、ならびに配列番号１および配列番号２に示される配列を含み得る、導入遺伝子またはレポーター遺伝子の挿入のためのトランスポザーゼによって認識される５’および３’転位反復、ならびにノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子、または例えば、ＥＭ７最小プロモーターもしくは細菌細胞および哺乳動物細胞の両方において機能性である複合ＣＭＶ Ｔ７プロモーターの制御下のアンピシリンまたはカナマイシンなどの他の抗生物質耐性遺伝子、ならびに配列番号４に示される配列を含むかまたはそれらからなるコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンもしくはブラストサイジンなどの他の哺乳動物抗生物質耐性遺伝子を含有する新規細菌発現ベクター。
一態様では、細菌発現ベクターは、その全体が配列番号５に示される配列を含み得るかまたはそれからなり得るプラスミドであり得る。
したがって、一態様では、配列番号５は、配列番号１、配列番号３および配列番号４を含むかまたはそれらからなる。
本発明の別の態様は、試験試料中の薬理活性分子の活性を検出し、場合により定量するための方法であって、以下のステップを含む、方法を提供する
（ｉ）試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号ＡＡ１および配列番号ＡＡ２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。
（ｉｉｉ）好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第２のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
（ｉｖ）セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｖ）セレンテラジンの非存在下で、配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するＤｕａｌ－Ｇｌｏシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
（ｖｉ）第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第１のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されている。
（ｖｉｉ）さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する二重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、または配列番号６に示される自己切断２ＡペプチドＦ２Ａのコード配列によって分離された、基質としてルシフェリンを使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物をさらに有する。
（ｖｉｉｉ）セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｉｘ）レポーター遺伝子ルシフェラーゼが、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）または別の市販のルシフェリン系基質を使用して同じ試料中で測定された後、前記細胞株における第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｘ）さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼまたはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはセレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第３のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結された３つの構築物をさらに有する。あるいは、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼは、２つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されている構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にするために、構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。
（ｘｉ）前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第１のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第１のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ、
（ｘｉｉ）ＤｕａｌＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第２のレポータータンパク質の活性を決定し、その後、ＤｕａｌＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するか、またはその第１の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第２の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、同じ試料中でセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼなどの第３のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
（ｘｉｉｉ）さらに好ましい実施形態では、細胞に入るプロテアーゼによって媒介される細胞死滅を検出するための改善された方法を提供するために、Ｓｖａｒルシフェラーゼは、２つのサブユニット、ＳＬ１－Ｎ－ＴｅｒおよびＳＬ－１－Ｃ－Ｔｅｒとして再構成され、プロテアーゼ切断部位によって分離され、配列番号ＡＡ５をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、ＳＬ１の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
（ｘｉｖ）さらに好ましい実施形態では、細胞内のセカンドメッセンジャーの活性化および結果として生じるイオンフラックスの変化、例えば、カルモジュリン依存性セリン－トレオニンホスファターゼカルシニューリンおよびＣａ２＋フラックスの変化を検出するための改善された方法を提供するために、Ｓｖａｒルシフェラーゼは、２つのサブユニット、ＳＬ１－Ｎ－ＴｅｒおよびＳＬ－１－Ｃ－Ｔｅｒとして再構成され、配列番号ＡＡ：５をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、ＳＬ１の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
（ｘｖ）２つのサブユニット、ＳＬ１－Ｎ－ＴｅｒおよびＳＬ－１－Ｃ－Ｔｅｒに分割することができ、配列番号ＡＡ：５をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、２つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン－トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってＣａ２＋フラックスの変化を検出するために使用することができる。
本発明のさらなる態様は、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
（ｉ）スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）の前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、ステップ好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、ウェルプレートまたはアッセイプレートに播種される。
（ｉｉｉ）ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤での本発明による細胞株の処理。
（ｉｖ）好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第２のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
（ｖ）セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｖｉ）Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはセレンテラジンの非存在下で、配列番号ＡＡ１および配列番号ＡＡ２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
（ｖｉｉ）第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第１のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されている。
本発明のさらなる態様は、試験試料中に存在する薬理活性分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量する方法であって、
（ｉ）薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）第１および第２の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
（ｉｉｉ）第１の細胞試料を試験試料と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
（ｉｖ）第２の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞中の第１のレポータータンパク質の活性を決定し、第２の細胞試料の細胞中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｖ）第１および第２の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、１より低い比（第１／第２）が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ
を含む方法に関する。
結果として、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子および前記遺伝子でトランスフェクトされた細胞株、本発明に従ってトランスフェクトされた細胞のＥＣ５０が、対応する１つまたは複数の天然の遺伝子でトランスフェクトされた細胞と比較して少なくとも減少するように、より高い感度で薬理活性分子の活性の検出を可能にする本発明の様々な状況におけるその使用を提供する。遺伝子は、例えば、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子であり得るが、そうでなければ他のおよび／またはさらなる遺伝子を含み得る。減少は、約２倍、例えば約３倍など、例えば約４倍など、例えば約５倍など、例えば６倍など、例えば７倍など、例えば約８倍など、例えば９倍など、例えば１０倍など、例えば５０倍など、例えば約１００倍など、または例えば約１０００倍などであり得る。
野生型メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子および遺伝子の５’翻訳領域の欠失変異体（ｎｔ．５１～ｎｔ．２２８）のヌクレオチド配列アラインメントを示す図である。 シグナルペプチドならびに推定触媒ドメイン１および２の位置を示す天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。 それぞれが構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある、示されたルシフェラーゼ遺伝子をコードする新規Ｓｖａｒベクターによる細胞の一過性トランスフェクション、および構成的チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼによる細胞の同時トランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞の応答を示す図である。市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質（ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、細胞を３７℃で１８時間インキュベートした後の細胞上清のルシフェラーゼ活性を定量した。次いで、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量した。結果は、セレンテラジン依存性ルシフェラーゼと交差反応しないホタルルシフェラーゼの発現に対して正規化される。 野生型メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子、またはそれぞれＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下にあるＳｖａｒルシフェラーゼ１もしくはＳｖａｒルシフェラーゼ２遺伝子のいずれかをコードする新規Ｓｖａｒベクターによって細胞を一過性トランスフェクトし、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで３７℃で６時間処理し、その後市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質（ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してルシフェラーゼシグナルを定量した後のＨＥＫ２９３細胞の応答を示す図である。 遺伝子の５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列、および４つの変異ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列の多重配列アラインメントを示す図である。 遺伝子の５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列、および４つの変異ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列の多重配列アラインメントを示す図である。５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子と、４つの変異ルシフェラーゼ遺伝子の両方におけるヌクレオチド１～５１は、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼのシグナルペプチドのヌクレオチド配列を表す。 １．５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列 ２．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列。 ３．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－２ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列。 ４．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－３ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列。 ５．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－４ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列 遺伝子の５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列、および４つの変異ルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す図である。５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子と、４つの変異ルシフェラーゼタンパク質の両方におけるアミノ酸１～１７は、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼのシグナルペプチドのアミノ酸配列を表す。 １．５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列 ２．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列。 ３．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－２ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列 ４．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－３ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列。 ５．ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－４ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列 それぞれ構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある、示されるルシフェラーゼ遺伝子によって細胞を一過性トランスフェクトし、市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質（ＱｕａｎｔｉＬｕｃ、Ｇｏｌｄ Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、室温で漸増時間でルシフェラーゼ活性を定量した後のＨＥＫ２９３細胞の上清中のルシフェラーゼ活性の喪失率を示す図である。 図６Ａに示される同じ試料の１５分での相対ルシフェラーゼ活性を示す図である。 漸増濃度のＴＮＦαで処理した、ＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下の、配列番号１に示される配列を含むレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のクローン細胞株の応答を示す図である。 パネルＡ．ＲＬＵ値 パネルＢ．ＴＮＦαで処理していない対照と比較した誘導倍率 ＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下の、配列番号１に示される配列を含むいずれかのルシフェラーゼ遺伝子で安定にトランスフェクトされたＫ５６２細胞と、同じＮＦｋＢ応答性プロモーターの制御下の、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むホタルルシフェラーゼ遺伝子で安定にトランスフェクトされたＫ５６２細胞の応答の比較、および３７℃で６時間の漸増濃度のＴＮＦαによる細胞の処理を示す図である。 ＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下でＳｖａｒルシフェラーゼ１を発現するプラスミド、または同じキメラプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するｐＧＬ４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のいずれかによって細胞を一過性トランスフェクトし、２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで３７℃で４時間処理し、その後市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質（ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してＳｖａｒルシフェラーゼ活性を定量するか、またはＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してホタルルシフェラーゼ活性を定量した後のＨＥＫ２９３細胞の応答を示す図である。 ＥＭ７プロモーターｎｔ．５０７２～５１３７、コドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子ｎｔ．２５３２～３５５７（Ｈｙｇｒｏ ＯＰＴＩ）の制御下、ＳＶ４０最小プロモーターｎｔ．２１３８～２４９５、および多重クローニング部位ｎｔ．１１１０～１１３４（ＭＣＳ）、および細菌複製起点ｎｔ．５９５４～２１７の制御下のＳｖａｒルシフェラーゼ－１（ＳＶＬ１）ｎｔ．１３３０～１７７９、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼシグナルペプチドｎｔ．１２７６～１３２９（ＧＬｕｃ ＳＰ）、ヒトインターフェロンベータ遺伝子の５’－ＵＴＲ由来の最小プロモーターｎｔ．１１４１～１２６３、トランスポゾン特異的５’逆方向末端反復ｎｔ．６５２～６８２、トランスポゾン特異的３’逆方向末端反復ｎｔ．４５６７～４６０１、コドン最適化ノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子ｎｔ．５１３８～５７１０（ｎａｔＭｘ６＿ＯＰＴＩ）のコドン最適化コード配列を含む新規ベクター（６３２５ｂｐ）の主要な特徴を示す図である。主要な制限部位は；コンセンサス応答配列の挿入のためのＫｐｎＩ、ＮｈｅＩおよびＸｈｏｌ、哺乳動物選択マーカーの置換のためのＢｃｕｌ／ＳａｌＩ、レポーター遺伝子の置換のためのＢｇｌＩＩ／Ｘｂａｌ、および最小プロモーター配列の置換のためのＸｈｏｌ／ＢｇｌＩＩを含む。 一般的なセレンテラジン系ルシフェラーゼ基質の組成を示す表１を示す。 文献に報告される他の天然または操作されたルシフェラーゼの特性に対する、配列番号１および配列番号２に示される配列によってコードされ、かつＡＡ１およびＡＡ２に示される配列によってコードされるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼの特性の比較を示す表２を示す。 ＡＰ１応答性プロモーターの６倍縦列反復の制御下にあるコドン最適化ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、および配列番号６に示される自己切断２ＡペプチドＦ２Ａのコード配列によって分離されたコドン最適化ホタルルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物でトランスフェクトされた、本発明によるＨＥＫ２９３細胞のクローン細胞株の応答を示す図である。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで３７℃で６時間処理した後、二重ルシフェラーゼ活性を定量した。 環状化ＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃのＮ末端およびＣ末端断片を示す図である。 再構成された場合の機能性環状化ルシフェラーゼＬｕｃ－１を示す図である。
ヌクレオチド配列の簡単な説明
配列番号１．コドン最適化されたＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－１
配列番号２．コドン最適化されたＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－２
配列番号３．コドン最適化され、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）シグナルペプチドをコードするガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）シグナルペプチド。
配列番号４．コドン最適化されたノーセオトリシン耐性遺伝子
配列番号５．ＳＶＡＲプラスミドの全ヌクレオチド配列
配列番号６．Ｆ２Ａ自己切断ペプチドのヌクレオチド配列およびホタルルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の上流のコドン最適化されたＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－１。
ヌクレオチド１～５４ ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼシグナルペプチド
ヌクレオチド５５～５０１ コドン最適化されたＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃ－１
Ｆ２Ａ自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド５１７～５８２
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド５８２～２２３５
配列番号７は、配列番号ＡＡ５、したがって環状化ルシフェラーゼＬｕｃ－１のＮ末端およびＣ末端断片をコードする。
アミノ酸配列の簡単な説明
配列番号ＡＡ１；配列番号１によってコードされるＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－１。
配列番号ＡＡ２；配列番号２によってコードされるＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－２。
配列番号ＡＡ３；ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号ＡＡ４；ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）シグナルペプチド（アミノ酸１～１８）、ＳＶＡＲルシフェラーゼＬｕｃ－１（アミノ酸１９～１６７）、Ｆ２Ａ自己切断ペプチド（アミノ酸１６８～１９４）、ホタルルシフェラーゼ（アミノ酸１９５～７４５）のアミノ酸配列。
配列番号ＡＡ５；アミノ酸配列は、図１４に示されるように、再構成された場合に機能性である環状化ルシフェラーゼＬｕｃ－１のＮ末端およびＣ末端断片に対応する
本発明の実施形態を説明する際に、明確にするために特定の用語が使用される。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様のまたは同等の目的を達成するために同様の方法で動作するすべての技術的等価物を含むことが理解される。
本発明者らは、とりわけ、天然のタンパク質と比較して改善された特性を有し、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されており、薬理活性分子の活性の定量のためのレポーター遺伝子として使用するために最適な特徴を示すルシフェラーゼタンパク質をコードする、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）のルシフェラーゼ遺伝子に由来するオープンリーディングフレーム、ならびに薬理活性分子に対する抗体を検出／定量するために、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのためにそれを使用する方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ１と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ１に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号ＡＡ１に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
一態様では、配列番号ＡＡ１は
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
一態様では、本発明は、配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ２と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ２に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームに関する。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号ＡＡ２に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
一態様では、配列番号ＡＡ２は
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFVAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
一態様では、本発明は、配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２に示されるヌクレオチド配列、または配列番号２と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号２に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列に関する。
別の態様において、本発明は、配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列をさらに含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。
特定の態様において、本発明は、配列番号１に示され、かつ配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関し、オープンリーディングフレームは、配列番号２に示され、かつ配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列をさらに含み得るかまたはそれからなり得る。
本発明のさらなる態様では、配列番号ＡＡ３は、
MGVKVLFALICIAVAEAK、または配列番号ＡＡ３と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ３に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有する配列であり得る。
本発明のなおさらなる態様では、配列番号ＡＡ４は、
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDRKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV*
、または配列番号ＡＡ４と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号ＡＡ４に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有する配列であり得る。
一態様では、本発明は、アミノ酸配列
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKV YIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDR CASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
、または配列番号ＡＡ５と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ５に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有する配列を含み得るかまたはそれからなり得る配列番号ＡＡ５に関する。
別の態様では、本発明は、細胞または細胞株に関する。前記細胞が、本発明による少なくとも１つのアミノ酸をコードする下流のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み得る、本発明による細胞または細胞株。
細胞または細胞株は、配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ１と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ１に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームを含み得る。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号ＡＡ１に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
別の態様では、本発明による細胞または細胞株は、配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ２と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号ＡＡ２に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームを含み得る。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号ＡＡ２に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
別の態様では、細胞または細胞株は、配列番号ＡＡ１に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ１と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレーム、および配列番号ＡＡ２に示されるアミノ酸配列、または配列番号ＡＡ２と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームを含み得る。１つの非限定的な例では、細胞または細胞株は、配列番号ＡＡ１をコードする配列番号１、および配列番号ＡＡ２をコードする配列番号２を含み得る。
本発明はまた、配列番号３～７、または配列番号３～７と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号３～７に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有する任意のそのような配列の１つまたは複数に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列、または配列番号６と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号６に示される配列と少なくとも８０％の配列同一性など、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性など、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性など、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば少なくとも９９％の配列同一性など、または例えば１００％の配列同一性などを有する任意のそのような配列を含み得る、またはそれからなり得るオープンリーディングフレームをさらに含み得る、またはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。したがって、本発明による細胞または細胞株は、配列番号１または２の１つを含み得るか、または配列番号１または２の両方を含み得、配列番号６をさらに含み得る。
さらなる態様では、本発明は、配列番号１～４に示されるヌクレオチド配列の少なくとも１つまたは複数を含み得るまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームを含み得るまたはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。
一態様では、本発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号３～４の１つまたは複数をさらに含み得るオープンリーディングフレームを含み得るかまたはそれからなり得、収集された配列全体が配列番号５で示され得る細胞または細胞株に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号３～４の１つまたは複数をさらに含み得るオープンリーディングフレームを含み得るかまたはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。
一態様では、本発明は、任意の診断方法におけるアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか１つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用に関する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中の中和抗体の存在を決定するためのアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか１つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用に関する。
別の態様では、本発明は、創薬におけるアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか１つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用、例えば、薬物または薬物候補のスクリーニングにおける使用などに関する。特定の態様では、スクリーニングは、ハイスループットスクリーニングに関してもよい。
したがって、本発明はまた、試験試料中の薬理活性分子の活性を検出し、場合により定量するための方法に関する。一態様では、前記方法は、以下のステップを含んでもよい；
（ｉ）試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであって、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、第１のレポータータンパク質をコードする配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ、
（ｉｉｉ）場合により、（ｉｉ）において薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物に使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する本発明による細胞株を使用して、アッセイの正規化を提供するステップ。一態様では、構成的産生は、（ｉｉ）のレポータータンパク質とは異なる第２のルシフェラーゼのものであり得、原則として任意の適切なレポータータンパク質であり得、例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼであり得る。
（ｉｖ）その組成が表１に示されているものなどのセレンテラジン系基質、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第１のレポータータンパク質（（ｉｉ）における）の活性を決定するステップ。
（ｖ）Ｄｕａｌ－Ｇｌｏシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬、またはホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、その後のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有し、セレンテラジンの非存在下で、配列番号１および配列番号２に示される配列の１つによってコードされる第１のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する二重ルシフェラーゼ緩衝液の第２の成分を含む検出システムを使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株中の第２のレポータータンパク質（（ｉｉｉ）における）の活性を決定するステップ。
（ｖｉ）第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第１のルシフェラーゼの活性は、米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する二重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、または配列番号６に示される自己切断２ＡペプチドＦ２Ａのコード配列によって分離された、基質としてルシフェリンを使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物をさらに有し得る。
本発明による方法はまた、代替的に、以下のステップを含んでもよい：
（ｖｉｉ）その組成が表１に示されているものなどのセレンテラジン系基質、またはＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）などの市販の基質、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
（ｖｉｉｉ）ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）または別の市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株における第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、またはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、またはセレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第３のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された異なるリガンド応答性プロモーターにそれぞれ作動可能に連結された３つの構築物をさらに有する。あるいは、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼは、２つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載される構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にするために、構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。
本発明による方法は、代替的に以下のステップを含んでもよい；
（ｉｘ）前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第１のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第１のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ。
（ｘ）ＤｕａｌＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第２のレポータータンパク質の活性を決定し、その第１の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第２の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、その後、ＤｕａｌＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）または別の市販の同等物を使用して、同じ試料中でセレンテラジン系基質を必要とするウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼなどの第３のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
上述のように、本発明はまた、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって、以下のステップを含む方法に関する
（ｉ）スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。一態様では、本発明による細胞株は、９６、３８４または１５３６ウェルプレートアッセイプレートに播種され得る。
（ｉｉｉ）ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤または薬物候補による本発明による細胞株の処理。
（ｉｖ）場合により、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なり、したがって配列番号１または配列番号２によってコードされるレポータータンパク質とは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第２のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
（ｖ）セレンテラジン系基質、例えばその組成が表１に示されるもの、または市販の基質、例えばＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
（ｖｉ）Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはセレンテラジンの非存在下で配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
（ｖｉｉ）第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第１のルシフェラーゼの活性を決定するステップは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されている。
本発明のさらなる態様は、試験試料中に存在する薬理活性分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量する方法に関する。
本発明による方法は、以下のステップを含んでもよい；
（ｉ）薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）第１および第２の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）における第１の細胞試料を試験試料（（ｉ）における）と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
（ｉｖ）第２の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
（ｉｖ）第１の細胞試料の細胞中の第１のレポータータンパク質の活性を決定し、第２の細胞試料の細胞中の第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｖ）第１および第２の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、１より低い比（第１／第２）が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ。
定義
ベクター
「ベクター」または「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子を指す。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、バクテリオファージおよび他のウイルス、コスミド、および人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート（異種核酸配列、導入遺伝子）、およびベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を宿主に伝達するベクターの目的は、典型的に、インサートを標的細胞において単離、増殖または発現することである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現に特異的に適合され、一般に、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本発明の実施形態に用いられるベクターの選択は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするベクターの特定の用途に依存する。
作動可能に連結される
「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームなどの機能単位の一部である要素の接続を指す。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）にプロモーターを作動可能に連結することにより、２つの要素は機能単位、すなわち遺伝子の一部になる。核酸配列への発現制御配列（プロモーター）の連結は、プロモーターによって指示される核酸配列の転写を可能にする。ポリペプチドをコードする２つの異種核酸配列を作動可能に連結することによって、配列は機能単位、すなわち異種核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの一部になる。２つのアミノ酸配列を作動可能に連結することにより、配列は同じ機能単位、すなわちポリペプチドの一部になる。２つの異種アミノ酸配列を作動可能に連結することにより、ハイブリッド（融合）ポリペプチドが生成される。
最小構成的プロモーター
レポーター遺伝子の発現を指示するプロモーターは、典型的に、本発明のレポーター細胞株を樹立するために使用される哺乳動物宿主細胞において最小構成的に活性であり、単独では、薬理学的活性分子による細胞の処理に応答しない。有用な構成的に活性なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトβ－アクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ－１α）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態を説明するとき、すべての可能な実施形態の組合せおよび順列は明示的に説明されていない。それにもかかわらず、特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているか、または異なる実施形態に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを有利に使用することができないことを示すものではない。本発明は、記載された実施形態のすべての可能な組合せおよび順列を想定している。
本明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、あらゆる場合において、それぞれ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という用語で場合により置換可能であることを意図している。本発明は、本発明の詳細な説明を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかし、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての文献の引用は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「配列番号Ｘ」という用語は、ＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列番号Ｘを意味することを意図する。本発明によれば、定義は、例えば配列番号１～７のいずれか１つを指し得る。
「配列番号ＡＡＸ」という用語は、ペプチドまたはアミノ酸配列番号Ｘを意味することを意図する。本発明によれば、定義は、例えば配列番号ＡＡ１～５のいずれか１つを指し得る。
例
以下では、本発明を非限定的な例によってさらに説明する。
薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子として、また、創薬におけるハイスループットスクリーニングに使用するために最適な特徴を示すルシフェラーゼタンパク質を開発するために、特にルシフェラーゼが他のタンパク質または他の分子との融合タンパク質として発現される場合、哺乳動物細胞における発現を促進するために遺伝子が可能な限り小さいことが望ましい。天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子の５’コード領域の一連の欠失変異体をインシリコで設計し、インビトロで合成し、一過性トランスフェクション実験で試験した。天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）遺伝子ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１に、アミノ酸配列を図２に示す。天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子の５’翻訳領域において開始コドン（ＡＵＧ）のアミノ酸１からアミノ酸７６までを含む欠失変異体（図１）は、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）タンパク質の２３．８ｋＤａの分子量と比較して、ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１タンパク質の分子量が１７．３ｋＤａであることを考慮すると、６．５ｋＤａの分子量の減少に相当する７６アミノ酸だけルシフェラーゼタンパク質のサイズを減少させながら、天然のタンパク質のものに匹敵する活性を示すことが見出された（図３）。分泌の効率を高め、したがって生物発光のバックグラウンドレベルを低下させ、連続サンプリングを可能にするために、これまで記載された最も効率的なシグナルペプチドであることが示されているカラヌス目カイアシ類ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）由来のルシフェラーゼ遺伝子のシグナルペプチド（Ｓｔｅｒｎ，Ｂら、２００７）を、シグナルペプチドの１７アミノ酸をコードするメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子（図１）の天然のシグナルペプチド（図１～図５１）に置き換えた（図２）。薬理活性分子による細胞の処理に応答する、レポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞における分泌効率を高め、バックグラウンドレベルを低下させ、したがって薬理活性分子で処理されていない対照細胞と比較してシグナルを増加させるために、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子の天然のシグナルペプチドを欠失させ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子からのコドン最適化シグナルペプチドで置き換えた。
単一または複数の変異を有するオリゴヌクレオチドを使用して、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列に一連のランダム変異を導入した（図４）。オリゴヌクレオチドをインビトロで合成し、組織培養で成長させたヒト胎児腎臓細胞に元来由来するヒトＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣカタログＣＲＬ－１５７３）における一過性トランスフェクション実験で試験した。天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列に導入された特定の変異は、以下の特徴；増大した光出力（輝度）を含む増強された発光、高い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される増強されたシグナル安定性および／またはシグナル持続時間、ならびに薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較して増大したダイナミックレンジの少なくとも１つにおいて、天然の遺伝子によってコードされるものよりも優れたルシフェラーゼタンパク質をコードすることが個々におよび一緒に見出された。図５に示すように、第１の推定触媒ドメイン（Ｍａｒｋｏｖａ，ＳＶ．ら、２００４）において、位置６６および１０５のメチオニンをコードするヌクレオチドをそれぞれセリン（Ｓ）およびイソロイシン（Ｉ）に変異させると、発光が安定化し、「ｇｌｏ」基質の使用が可能になり、インジェクタを備えたルミノメーターの必要がなくなることが見出された。
天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の第２の推定触媒ドメイン（Ｍａｒｋｏｖａ，ＳＶ．ら、２００４）中の位置１００におけるアラニン（Ａ）のグルタミン酸（Ｅ）への変異は、天然の遺伝子、またはアミノ酸配列においてのみ位置２２および３５における変異をコードする遺伝子によって示されるよりも増大した光出力（輝度）を含む増大した発光、高い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される増加したシグナル安定性および／またはシグナル持続時間（図５）、ならびに天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子によって示されるよりも高い薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較したダイナミックレンジ（図３Ｂ）を示すルシフェラーゼタンパク質（配列番号ＡＡ１によるＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１および配列番号ＡＡ２によるＳＶＡＲ Ｌｕｃ－２）をコードすることが見出された。
アミノ酸配列中の位置１０６のイソロイシン（Ｉ）を第１の推定触媒ドメイン中のバリン（Ｖ）に変異させると、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼまたは５’翻訳領域に１７７ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるルシフェラーゼと比較して改善された活性、およびＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼ（ヌクレオチド配列番号１およびアミノ酸配列配列番号ＡＡ１）と比較して同等またはわずかに低下した活性を示すルシフェラーゼタンパク質ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－２（ヌクレオチド配列番号２およびアミノ酸配列配列番号ＡＡ２）が得られることが見出された。
位置１４１および１４２のアミノ酸アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）をコードする天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列における配列ｎｔ４２３～ｎｔ４３５のアミノ酸チロシン（Ｔ）およびグリシン（Ｇ）への変異は、それぞれ、減少した光出力（輝度）を含む減少した発光、天然の遺伝子によって示されるよりも低下した相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される減少したシグナル安定性および／またはシグナル持続時間、ならびに天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子、Ｓｖａｒルシフェラーゼ１またはＳｖａｒルシフェラーゼ２によって示されるものよりも低い薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較したダイナミックレンジを示すルシフェラーゼタンパク質（ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－３）をコードすることが見出された（図３）。同様に、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列中の位置１４４におけるアラニン（Ａ）および位置１４５におけるメチオニンをそれぞれコードするｎｔ４３２およびｎｔ４３３の変異は、減少した光出力（輝度）を含む減少した発光、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子、ＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃ－１またはＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃ－２によって示されるものよりも低い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される減少したシグナル安定性および／またはシグナル持続時間を示すルシフェラーゼタンパク質（ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－４）をコードすることが見出された（図３Ｂ）。３７℃で１８時間のヒトＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクション実験で試験し、その後市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してルシフェラーゼ活性を定量した強力な構成的ＣＭＶプロモーターの制御下のＳｖａｒルシフェラーゼ１およびＳｖａｒルシフェラーゼ２の両方は、野生型メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼによって示されるものよりも増大したシグナル安定性および／またはシグナル持続時間を示した（図６）。Ｓｖａｒルシフェラーゼ１とＳｖａｒルシフェラーゼ２の両方はまた、天然のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）遺伝子、または遺伝子の５’翻訳領域のアミノ酸１～７６が欠失したメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）遺伝子、またはＳＶＡＲルシフェラーゼ３、またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、Ｎａｎｏルシフェラーゼ、またはガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼによって示されるものよりも高い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映される増大した光出力（輝度）を示した（図３Ａ）。野生型メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）ルシフェラーゼ遺伝子、それぞれＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下にあるＳｖａｒルシフェラーゼ１またはＳｖａｒルシフェラーゼ２でトランスフェクトし、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで３７℃で６時間処理したまたは処理していないＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクション実験の結果は、市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してより高い相対発光量（ＲＬＵ）によって反映されるように、両方のＳＶＡＲルシフェラーゼ遺伝子が野生型遺伝子と比較して増強されたルシフェラーゼ活性を示したことを示した（図３Ｂ）。
ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下のＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃ－１遺伝子でトランスフェクトし、安定なクローンを単離し、特徴づけた。そのようなクローン細胞株の１つを、増加するＴＮＦαで３７℃で６時間処理したまたは処理しなかった場合、市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、ＴＮＦαで処理しなかった対照試料と比較して相対発光量（ＲＬＵ）と誘導倍率の両方のレベルが高くなった（図７）。
慢性骨髄性白血病に元来由来するＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－２４３）を、それぞれＳＶ４０最小プロモーターおよびカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下のＳｖａｒルシフェラーゼＬｕｃ－１遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子のいずれかでトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、特徴づけた。クローン細胞株を漸増濃度のＴＮＦαで３７℃で６時間処理した（図８）。ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１遺伝子で安定にトランスフェクトした細胞は、市販のセレンテラジン系「ｇｌｏ」基質ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用したルシフェラーゼ活性の定量後に、同じＮＦｋＢ応答性プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子で安定にトランスフェクトした細胞よりも著しく高い相対発光量（ＲＬＵ）値を示した（図８）。
ＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼは、小さいサイズ、輝度、およびトランスフェクトされた哺乳動物細胞に対する毒性の非存在を含む、文献に報告されている他の天然または操作されたルシフェラーゼと比較して、いくつかの改善された特性を示す（表２）。
配列番号１および配列番号２に示されるヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない、レポーター遺伝子としてのＳｖａｒ Ｌｕｃ－１およびＳｖａｒ Ｌｕｃ－２ルシフェラーゼの発現のためのベクターとして、薬理活性分子の活性の定量のため、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのために使用するのに最適な特徴を示すプラスミドを開発するために、プラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の実験室株において染色体外で容易に複製することができ、この目的に必要とされる必要なＤＮＡ配列を含有し、宿主因子との干渉の確率が少なく、細菌における収率が増加するように、３，０００～６，０００塩基対程度の比較的小さいサイズであることが望ましい。したがって、以下を含有するプラスミド（ｐＳＶＡＲ００１）をインシリコで設計し、インビトロで合成した：細菌複製起点（ｎｔ．５９５４～２１７）、ヒトインターフェロンベータ遺伝子の５’ＵＴＲ由来の最小プロモーター（ｎｔ．１１４１～１２６３）、コドン最適化されたガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ遺伝子（ｎｔ．１２７６～１３２９）由来のシグナルペプチド（配列番号３）、これらに限定されないが配列番号１および配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子のコード配列（ｎｔ．１３３０～１７７９）、ならびにトランスポゾン特異的５’（ｎｔ．６５２～６８２）および３’（ｎｔ．４５６７～４６０１）逆方向末端反復、導入遺伝子のトランスポザーゼ組み込みのための認識配列、ＥＭ７プロモーター（ｎｔ．５０７２～５１３７）の制御下のノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子（ｎｔ．５１３８～５７１０）、および配列番号４に示される配列を含むかまたはそれからなるＳＶ４０最小プロモーター（ｎｔ．２１３８～２４９５）の制御下のコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｎｔ．２５３２～３５５７）。プラスミドは、いくつかの重要な制限部位をさらに含有する：コンセンサス応答配列の挿入のためのＫｐｎＩ、ＮｈｅＩおよびＸｈｏｌ、哺乳動物選択マーカーの置換のためのＢｃｕＩ－ＳａｌＩ、これらに限定されないが配列番号１および配列番号２に示される配列を含むレポーター遺伝子の置換のためのＢｇｌＩ－Ｘｂａｌ、および最小プロモーター配列の置換のためのＸｈｏｌ－ＢｇｌＩＩ。ｐＳＶＡＲ００１プラスミドの性能を試験するために、カノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復をＫｐｎ－ＸｈｏＩ制限部位に挿入し、得られたプラスミドを、２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで３７℃で４時間処理したまたは処理していないヒトＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクション実験で試験し、その後市販のセレンテラジン系基質（ＱｕａｎｔｉＬｕｃ Ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用してＳＶＡＲ１ルシフェラーゼ活性を定量した。カノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復を含有するｐＳＶＡＲ００１プラスミドの性能を、Ｋｐｎ－ＸｈｏＩ制限部位に挿入されたカノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復の制御下の、ＢｇＩＩＩ－Ｘｂａｌ制限部位に挿入されたＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＧＬ４プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）の性能と比較すると、ｐＳＶＡＲ００１プラスミドで得られた最大ＲＬＵレベルは、カノニカルＮＦｋＢ認識配列の６倍縦列反復の制御下のＳＶＡＲ Ｌｕｃ－１ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＧＬ４プラスミドで得られたものと同等であるが、ｐＳＶＡＲ００１プラスミドを使用すると、誘導倍率は有意に大きかったことが示された（図９）。
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特定の実施形態では、本発明はまた、以下の項目に関する：
１．
（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドであり、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、第１の異種ポリヌクレオチド。
（ｉｉ）好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第２のルシフェラーゼ、例えば構成的プロモーターの制御下のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
（ｘｉ）さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれ異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結され、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、またはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、または第３のリガンド応答性プロモーターの制御下にあるか、もしくは２つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載される構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にする構成的プロモーターの制御下にある、セレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第３のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重構築物をさらに有する。
（ｉｉｉ）前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清中の第１のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下にある、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第１のレポータータンパク質の活性を、その組成が表１に示されるものなどのセレンテラジン系基質、またはＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）などの市販の基質を使用して決定するステップ。
（ｉｖ）Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞の溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップであり、第２のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するＤｕａｌＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞溶解後に同じ試料においてセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼなどの第３のレポーター遺伝子の活性を測定し、その後第３のレポーター遺伝子の活性を定量するステップ
を含む後生動物細胞。
２．前記オープンリーディングフレームが、配列番号１もしくは配列番号２に示される配列、または配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と７９％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と８５％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と９０％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と９５％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と９７％の配列同一性、例えば配列番号１もしくは配列番号２と９８％の配列同一性、例えば配列番号１または配列番号２．１０と９９％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる、先行する項目に記載の哺乳動物細胞。前記オープンリーディングフレームが、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなる、先行する請求項のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
３．前記細胞が、これらに限定されないが、すべてのバリアントを含むＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｋ５６２、Ｕ９３７、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ－４、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９、ＡＲＰＥ－１９／ＨＰＶ－１６、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、鳥類細胞、例えばＤＴ－４０、ＭＳＢ１またはＬＭＨ、マウス細胞、例えばＬ９２９細胞またはＬＳバリアント、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞からなる群から選択される、先行する項目のいずれかに記載の細胞。
４．前記細胞株がＨＥＫ２９３である、先行する項目のいずれかに記載の細胞株。
５．試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出し、場合により定量するための方法であって、
（ｉ）試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）前記試験試料を先行する項目のいずれか一項に記載の細胞株と接触させるステップ、
（ｉｉｉ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ
を含む、方法。
６．前記細胞株が第２のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
（ｉｖ）前記細胞株における第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
（ｖ）第１のレポータータンパク質の活性と第２のレポータータンパク質の活性の間の比を提供するステップ
をさらに含む、項目のいずれかに記載の方法。
７．創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって：
（ｉ）スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
（ｉｉ）前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号１および配列番号２に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ
を含む、方法。好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、３８４または１５３６ウェルプレートアッセイプレートに播種される。
８．薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
９．レポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミドであって、前記レポーター遺伝子が、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、プラスミド。
１０．配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
１１．配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
配列表１ ＜２２３＞人工配列
配列表１ ＜２２３＞配列番号１
配列表２ ＜２２３＞人工配列
配列表２ ＜２２３＞配列番号２
配列表３ ＜２２３＞人工配列
配列表３ ＜２２３＞配列番号３
配列表４ ＜２２３＞人工配列
配列表４ ＜２２３＞配列番号４
配列表５ ＜２２３＞人工配列
配列表５ ＜２２３＞配列番号５
配列表６ ＜２２３＞人工配列
配列表６ ＜２２３＞配列番号６
配列表７ ＜２２３＞人工配列
配列表７ ＜２２３＞配列番号ＡＡ１
配列表８ ＜２２３＞人工配列
配列表８ ＜２２３＞配列番号ＡＡ２
配列表９ ＜２２３＞人工配列
配列表９ ＜２２３＞配列番号ＡＡ３
配列表１０ ＜２２３＞人工配列
配列表１０ ＜２２３＞配列番号ＡＡ４
配列表１１ ＜２２３＞人工
配列表１１ ＜２２３＞配列番号７
配列表１２ ＜２２３＞人工
配列表１２ ＜２２３＞配列番号ＡＡ５
配列表１４ ＜２２３＞人工
配列表１５ ＜２２３＞人工
配列表１６ ＜２２３＞人工
配列表１７ ＜２２３＞人工
配列表１８ ＜２２３＞人工
配列表１９ ＜２２３＞人工
配列表２０ ＜２２３＞人工
配列表２１ ＜２２３＞人工
配列表２２ ＜２２３＞人工
配列表２３ ＜２２３＞人工
配列表２４ ＜２２３＞人工

Claims (13)

  1. 配列番号７および／または配列番号８に示されるペプチド配列の１つまたは複数をコードする１つまたは複数のヌクレオチド。
  2. 前記ヌクレオチド配列が配列番号１および／または配列番号２に示される配列の１つまたは複数である、請求項１に記載の１つまたは複数のヌクレオチド。
  3. 配列番号１および／または配列番号２に示される配列の１つまたは複数を含むベクター。
  4. 配列番号６に示される配列を含む、請求項３に記載のベクター。
  5. 配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、および配列番号６に示される自己切断２ＡペプチドＦ２Ａのコード配列によって分離された、ルシフェリンを基質として使用する、ホタルルシフェラーゼまたは任意の他のルシフェラーゼをコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項３に記載のベクター。
  6. 請求項３～５のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞または細胞株。
  7. 前記細胞または細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、配列番号７および配列番号８とは異なる第２のレポータータンパク質の構成的産生のためのさらなる構築物を含む、請求項６に記載の細胞または細胞株。
  8. 前記ベクターが、配列番号３および配列番号４をさらに含む、請求項６～７のいずれか一項に記載の細胞または細胞株。
  9. 前記細胞または細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含むさらなる構築物を含み、前記プロモーターが、ルシフェリン系基質を必要とするホタルルシフェラーゼであるルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、下流プロモーター配列に作動可能に連結された第３の異種シス作用性調節配列を含むさらなる構築物を含み、前記プロモーターが、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼである配列番号７および配列番号８とは異なるセレンテラジン系基質を必要とするルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞または細胞株。
  10. すべてのバリアントを含む、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｋ５６２、Ｕ９３７、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ－４、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＡＲＰＥ－１９、ＡＲＰＥ－１９／ＨＰＶ－１６、Ｓｆ９細胞である昆虫細胞、ＤＴ－４０、ＭＳＢ１またはＬＭＨから選択される鳥類細胞、Ｌ９２９細胞またはＬＳバリアントから選択されるマウス細胞、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞から選択されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む群から選択される細胞または細胞株である、請求項６～９のいずれか一項に記載の細胞または細胞株。
  11. 診断方法または薬物スクリーニング方法に用いるための、請求項６～１０のいずれか一項に記載の細胞もしくは細胞株、または請求項１～２のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むキット。
  12. 診断用途が、試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出または定量するための方法を含み、前記薬物スクリーニング方法がハイスループットスクリーニング方法である、請求項１１に記載のキット。
  13. 試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出または定量するための方法であって、
    ｉ）試験試料を準備するステップ、
    ｉｉ）前記試験試料を請求項７～１０のいずれか一項に記載の細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、前記試験試料中に存在する前記薬理活性分子による前記細胞株の処理に応答する、異種シス作用性調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチドを含み、
    前記プロモーターがオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、
    前記オープンリーディングフレームが、配列番号７および配列番号８に示される配列の１つを含む第１のレポータータンパク質をコードし、
    前記オープンリーディングフレームが、配列番号７および配列番号８とは異なる第２のレポータータンパク質の構成的産生のためのさらなる構築物を含む、ステップ、
    ｉｉｉ）セレンテラジン系基質を使用して、配列番号７または配列番号８に示される前記第１のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
    ｉｖ）セレンテラジンの非存在下で、配列番号１および／または配列番号２に示される配列によりコードされる前記第１のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用することにより、配列番号７または配列番号８の前記レポータータンパク質からの蛍光を同じ試料中で測定した後に、前記細胞株中の前記第２のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
    ｖ）前記第１のレポータータンパク質の活性を前記第２のレポータータンパク質の活性に対して正規化するステップ
    を含む、方法。
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