JP7161263B6 - アルギニンリッチドメインに由来する改変抗微生物ペプチド - Google Patents
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Description
(i)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)(配列番号1)
(ここで、X1、X3、X6及びX9の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X4、X5、X7及びX8の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)、
(ii)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)(配列番号2)
(ここで、X1、X3及びX6の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X4及びX5の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)、及び、
(iii)(X1)X2PX3P(X4)X5QX6P(X7)(配列番号3)
(ここで、X1、X4及びX7の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X3、X5及びX6の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)からなる群から選択されるコンセンサス配列を含む。各可変ドメインが2個~20個の連続する塩基性アミノ酸の配列である。
(i)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)X10C(配列番号4)、及び、
(ii)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)X10Q(配列番号5)
(ここで、X1、X3、X6、及びX9の各々は、個別に可変ドメインであり、X2、X4、X5、X7、X8、及びX10の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)からなる群から選択されるコンセンサス配列を有することができる。
(i)TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(配列番号6)(ここで、上記アルギニン残基の少なくとも1個はD-アルギニンである)、
(ii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(配列番号7)、
(iii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ(配列番号8)、
(iv)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(配列番号9)、
(v)RRRGRSPRRRTPSPRRRRC(配列番号10)、
(vi)RRRGRPRRRPPRRRRC(配列番号11)、
(vii)RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC(配列番号12)、及び、
(viii)RRRPPRRRRQPRRRRC(配列番号13)、
からなる群から選択される配列を含む。
(i)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH(配列番号14)、
(ii)HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS(配列番号15)、
(iii)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH(配列番号16)、及び、
(iv)HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR(配列番号17)、
からなる群から選択される配列を有する。
(i)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)(配列番号1)
(ここで、X1、X3、X6及びX9の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X4、X5、X7及びX8の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)、
(ii)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)(配列番号2)
(ここで、X1、X3及びX6の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X4及びX5の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)、及び、
(iii)(X1)X2PX3P(X4)X5QX6P(X7)(配列番号3)
(ここで、X1、X4及びX7の各々は、個別に可変ドメインであり、
X2、X3、X5及びX6の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)からなる群から選択されるコンセンサス配列を含む。各可変ドメインが2個~20個の連続する塩基性アミノ酸の配列である。
(i)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)X10C(配列番号4)、及び、
(ii)(X1)GRX2P(X3)X4PX5P(X6)X7QX8P(X9)X10Q(配列番号5)
(ここで、X1、X3、X6、及びX9の各々は、個別に可変ドメインであり、X2、X4、X5、X7、X8、及びX10の各々は、個別に任意のアミノ酸であるか又は不在である)からなる群から選択されるコンセンサス配列を有することができる。
(i)TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(配列番号6)(ここで、アルギニン残基の少なくとも1個はD-アルギニンである)、
(ii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(配列番号7)、
(iii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ(配列番号8)、
(iv)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(配列番号9)、
(v)RRRGRSPRRRTPSPRRRRC(配列番号10)、
(vi)RRRGRPRRRPPRRRRC(配列番号11)、
(vii)RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC(配列番号12)、
(viii)RRRPPRRRRQPRRRRC(配列番号13)、
(ix)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH(配列番号14)、
(x)HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS(配列番号15)、
(xi)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH(配列番号16)、及び、
(xii)HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR(配列番号17)。
以前にヒトB型肝炎ウイルス(HBV)コアタンパク質(HBc)のアルギニンリッチドメイン(ARD)に由来する新規な抗微生物ペプチドが同定された。Chen et al. (2013), PLoS Pathog 9:e1003425 doi:10.1371/journal.ppat.1003425、及びChen et al., (2016), Appl Microbiol Biotechnol. 100(21): 9125-9132を参照されたい。このHBcARDペプチドは、グラム陰性及びグラム陽性の細菌に対する広域スペクトルの抗微生物活性を示した。本発明者らのマウス敗血症モデルでは、接種から2時間後のHBcARDペプチドの注射は、S.アウレウスに感染したマウスの40%を死亡させずに保護することができる。Chen et al. (2013)を参照されたい。
多重配列アラインメントによって、本発明者らは、ヒト(AAP31571.1)、ウーリーモンキー(AAO74859.1)、ジリス(AAB08031.1)、ウッドチャック(AAA46761.1)、コウモリ(AGT17576.1)、アヒル(AAO49490.1)、サギ(AAA45737.1)、オウム(AFY97786.1)、ヒメハクガン(AAR89928.1)及びハクガン(AAD22001.1)を含む、様々なヘパドナウイルスのHBcARDペプチドの配列を比較した。図1を参照されたい。ヒトB型肝炎ウイルスのHBcARDペプチドと同様に、他の哺乳動物(ウーリーモンキー、ジリス、ウッドチャック及びコウモリ)のヘパドナウイルスのHBcARDペプチドは、4個のクラスター化するアルギニンリッチドメインを含んでいた。鳥類ヘパドナウイルスと哺乳動物ヘパドナウイルスとの間のHBcARDペプチドの配列相同性は低かったが、それらはいずれも4個の高度に正に帯電したドメインを含んでいた。上記ペプチドの各抗微生物活性を比較するため、本発明者らは、コウモリ、ウッドチャック、アヒル及びサギのヘパドナウイルスに由来する4つのHBcARDペプチドの最小殺菌濃度を決定した。結果は、コウモリ及びウッドチャックのヘパドナウイルスに由来するペプチドは、ヒトB型肝炎ウイルスに由来するペプチドに匹敵する強力な抗微生物活性を表したことを示した。表2を参照されたい。対照的に、鳥類のヘパドナウイルスに由来するペプチドは、より低い抗微生物活性を示した。ヒトHBV由来のHBcARDペプチドの長さはより短い(147-183;37個のアミノ酸)ことから、本発明者らは、後の改変及び最適化の実験でこのペプチドに注目した。
本発明者らは、HBcARD147-183ペプチド(37-mer)上の可能性のあるプロテアーゼ切断部位を予測するために、PeptideCutterを使用した。結果は、HBcARDペプチドのアルギニン残基にプロテアーゼ切断部位の70%超がマッピングされたことを示した(データは示されていない)。血清中でのペプチド安定性を改善するため、本発明者らは、全てのアルギニン残基をそのD異性体で置換するD-アミノ酸置換によって、改変ペプチドであるD-HBcARD147-183ペプチドを合成した。
血清プロテアーゼ分解に対する37-merのL-HBcARD及びD-HBcARDのペプチドの安定性を比較するため、本発明者らは、プロテアーゼ耐性アッセイを行った。37℃で3時間の5%ウシ血清とのインキュベーションの後、L-HBcARDペプチドの80%超は、SDS-PAGE上でのグリーンエンジェルによる染色でもはや検出できなかった。対照的に、D-HBcARDペプチドのシグナル強度は、同じ条件下で減少しなかった。図2Aを参照されたい。L-HBcARDを5%のマウス又はヒト(男性及び女性)の血清と共にインキュベートした場合に同様の結果が得られた。図2のB及びCを参照されたい。これらの結果は、D-HBcARDが、ウシ胎児、マウス及びヒトの血清のプロテアーゼ消化に対して、L-HBcARDよりも耐性であったことを示唆した。
溶血アッセイにおいて、連続希釈用量(0mg/L~460mg/L)のD-HBcARD、L-HBcARD又はメリチンと共に、ヒトRBCを37℃で1時間インキュベートした。図3に示されるように、メリチンは8.9mg/Lの濃度で100%の溶血を引き起こした。対照的に、D-HBcARD及びL-HBcARDの両方のペプチドの溶血活性は、460mg/Lまで検出されなかった(P<0.0001)。
37-merのL-HBcARD及びD-HBcARDのペプチドのin vivo保護効能を調べるため、本発明者らは、S.アウレウスに感染したマウス敗血症モデルを行った。初めに、ICRマウスにS.アウレウス(4×106CFU/マウス)を腹腔内で接種し、続いて、接種から2時間後にL-HBcARD、D-HBcARD及びPBSの単回の腹腔内注射をそれぞれ行った。PBSが投与されたマウス(n=10)は全て1日目に死亡した。図4Aを参照されたい。接種から7日後、L-HBcARD(10mg/kg)で処置したマウスの40%が生存した。図4Aを参照されたい。対照的に、D-HBcARDペプチドは、はるかに高い生存率(5mg/kg用量で60%、及び10mg/kg用量で100%)を達成することができた。図4Aを参照されたい。これらの結果は、HBcARDのin vivo効能がD-アルギニン置換の戦略によって改善され得ることを示した(P<0.0001)。
in vivoで中和抗体を誘導することによって、37-merのHBcARDペプチドによる反復処置が上記効能を損なう可能性があるかどうかを調べるため、本発明者らは、細菌感染に先立って、L-HBcARD及びD-HBcARDのペプチドのそれぞれを用いて3週齢のマウスを3回免疫した。その後、最初の免疫から2週間後に免疫したマウスにS.アウレウスを接種し、続いて、接種から1時間後にL-HBcARDペプチド又はD-HBcARDペプチドのいずれかを腹腔内注射した。本発明者らの先の報告(Chen et al., 2013)と一致して、L-HBcARDは、L-HBcARDペプチドによる事前の免疫の有無にかかわらず、ここでも全てのマウスを死亡させずに保護した。図4Bを参照されたい。PBSで免疫してPBSで処置した対照マウスは、細菌チャレンジ後24時間以内に80%近くの死亡率を示した(P<0.05)。接種から7日後、D-HBcARDによる事前の免疫の有無にかかわらず、L-HBcARD及びD-HBcARD(10mg/kg)で処置した全てのマウスが細菌チャレンジを生き延びた。図4Cを参照されたい。したがって、D型又はL型のいずれかのペプチドによる事前の免疫は、後のHBcARDペプチドによる処置のin vivo抗微生物活性に対する中和活性を誘導しなかった。
本発明者らは、更なるHBcARD誘導体の抗微生物活性を試験した。表1を参照されたい。これらのペプチドの抗微生物活性を、最小殺菌濃度(MBC)によって判定した。親ペプチドHBcARD 147-183(37-mer)(Chen et al., 2013を参照されたい)とは異なり、誘導体ペプチドHBcARD 150-177Q(28-mer)は、S.アウレウスに対して検出可能な殺菌活性を示さなかった。表4を参照されたい。カルボキシル末端にシステインを有する親ペプチドHBcARD 147-183を模倣するため、本発明者らは、HBcARD 150-177Qの末端のQ(グルタミン)残基をC(システイン)残基に置換することによって別の28-merの誘導体であるHBcARD 150-177Cを設計した。表1を参照されたい。興味深いことに、このQからCへの置換は、S.アウレウスに対する殺菌活性を効果的に回復した(rescued)。表4を参照されたい。
末端システインが殺菌活性にとって重要なようであるという事実を考慮して、本発明者らは、HBcARD 150-177Cペプチド(28-mer)の全長を更に減らせるかを求めた。本発明者らは、150-168C(19-mer)、157-176C(20-mer)及び164-177C(14-mer)のペプチド間のS.アウレウスに対する効力を比較した。表4に示されるように、これらのペプチドのいずれも検出可能な活性を示さなかった。ここでの結果は、アルギニン数が減じられたより短いペプチドは、S.アウレウスに対して抗微生物活性を表さないことを示した。表4を参照されたい。一方、本発明者らは、3個の可変ドメインを含むより短いペプチドが他の細菌を死滅させるのに十分であることを示した(データは示されていない)。
本発明者らは、D型又はL型のアルギニンのいずれかを含むHBcARD 150-177Cペプチド(28-mer)のin vivo保護効能を比較した。表1及び図5を参照されたい。ICRマウス(n=10匹/群)にS.アウレウスATCC19636(4×106個/マウス)を腹腔内で接種し、続いて、接種から2時間後、改変ペプチドで処置した。全てのPBS対照マウスは1日目に死亡し、対照ペプチド(150-177Q)で処置したマウスのわずか20%が生存した。5mg/kg及び10mg/kgの用量のL-150-177Cペプチドの投与は、それぞれ、30%及び70%のマウスを死亡させずに保護した。図5を参照されたい。5mg/kgのD-150-177Cで処置した場合、全てのマウス(100%)が生存した。
BALB/cマウス(n=8匹/群)にコリスチン耐性A.バウマニTCGH46709(3.4×108cfu/マウス)を気管内接種した。これらの肺感染マウスをコリスチン(5mg/kg/日)又はD-150-177C(5mg/kg/日及び10mg/kg/日)でそれぞれ腹腔内処置した。コリスチンで処置したマウスは全て、薬剤耐性A.バウマニによる接種から60時間後に死亡した。図6を参照されたい。対照的に、D-150-177Cに由来する用量依存的な保護効果があった。マウスを10mg/kg/日のD-150-177Cペプチドで処置した場合に有意差が観察された(p<0.05)。図6を参照されたい。
敗血症マウスモデルを使用して、本発明者らは、28-merのD-150-177Cペプチド(20mg/体重kg~80mg/体重kg)及びポリミキシンB(コリスチン関連化合物)(50mg/体重kg)を腹腔内(i.p.)注射したICRマウスの生存率を調査した。図7Aを参照されたい。腎臓に対するコリスチン及びポリミキシンBの周知の腎毒性から予想されたように、ポリミキシンB(50mg/kg)で処置されたマウスは全て1日目に死亡した。図7Aを参照されたい。対照的に、急性毒性は、20mg/kg及び40mg/kgのD-150-177Cで処置されたマウスでは観察されなかった。図7Aを参照されたい。用量を60mg/kg及び80mg/kgに増加させた場合、マウスの生存率は、それぞれ80%及び40%まで減少した。図7Aを参照されたい。肝傷害は、血清ALTレベルによって検出され得る。20mg/kg~40mg/kgの用量範囲のD-150-177Cで処置されたマウスは、ポリミキシンBより高いALTレベルを示したが、p値は有意ではない。図7Bを参照されたい。60mg/kgで処置されたマウスのALTレベルは、20mg/kgのポリミキシンBで処置されたものより有意に高かった(p<0.01)。図7Bを参照されたい。
28-merのペプチドD-150-177Cは、14個のD-アルギニンで置換された合計14個のL-アルギニンを含む。表1及び図6を参照されたい。D-アルギニンはL-アルギニンよりはるかに高価である。ペプチド合成のコストを削減するため、本発明者らは、完全な又は部分的なD-アルギニン置換を含むペプチド間のin vivo保護効能を比較した。表1及び図8を参照されたい。ペプチドDL-150-177Cは一部のみがD-アルギニン置換されており、全てがD-アルギニンで置換されたペプチドD-150-177C(100%置換)と非常に類似する保護効能を示した。図8を参照されたい。対照的に、ペプチドLD-150-177C(これもまた部分的に置換されている)の保護効能はDL-150-177Cよりも低いようである。図8を参照されたい。
本発明者らは、2つの主な改変、すなわち、(1)ペプチドDL-150-177Cの骨格を使用することによる部分的なD-アルギニン置換、並びに(2)28-merの親ペプチドDL-150-177Cに由来する5個のセリン残基及び1個のトレオニン残基の欠失を有する新たな22-merのペプチド、DL-dST-150-177C(表1を参照されたい)を操作した。この22-merのペプチドDL-dST-150-177Cは、28-merのDL-150-177C及びL-150-177Cと比較して、著しく改善された保護効能を示した。図9を参照されたい。
シュードモナス・エルギノーサミグラ(Migula)株(ATCC27853、アンピシリン耐性、及びATCC9027、アンピシリン耐性)、クラブシエラ・ニューモニエ株(ATCC13884)、シゲラ・ディゼンテリエXen27(Caliper Co.)、エシェリキア・コリ株(ATCC25922)、スタフィロコッカス・アウレウス亜種株(ATCC25923、メチシリン耐性、ATCC29213、メチシリン耐性、及びATCC19636、メチシリン耐性)及びアシネトバクター・バウマニ株(ATCC17978、ATCC17978 CR、ATCC19606、ATCC19606 CR、TCGH45530及びTCGH46709)を含む、数多くの細菌株を使用して、HBcARDペプチドの抗微生物活性を試験した。台湾の慈済仏教徒総合病院(TCGH)から臨床分離株TCGH45530及びTCGH46709を得て、Vitekシステム(米国ミズーリ州ヘイゼルウッドのBiomerieux Vitek, Inc.)を使用して同定した。Chang et al. (2012), J Microbiol Immunol Infect 45:37-42 doi:10.1016/j.jmii.2011.09.019を参照されたい。
L-HBcARD及びD-HBcARDのペプチドをYao-Hong Biotechnology Inc.(台湾、台北)から購入した。抗微生物活性を記載される通りに判定した。Chen et al., 2013.を参照されたい。簡潔には、細菌を37℃で対数中期までMHブロス(Difco)中で増殖させ、リン酸バッファー(10mMリン酸ナトリウム及び50mM塩化ナトリウム、pH7.2)中に106CFU(コロニー形成単位)/mlまで希釈した。ペプチドを同じバッファー中に段階希釈した。50マイクロリットル(μl)の細菌を、様々な濃度のペプチド50μlと混合し、続いて、振蕩せずに37℃で3時間インキュベートした。インキュベーションの終了時、最小殺菌濃度(MBC)の測定のため、細菌をミュラー-ヒントンブロス寒天プレートに入れ、37℃で一晩増殖させた。細菌増殖を示さなかった(0コロニー)最低ペプチド濃度をMBCとして定義した。全てのペプチドを3回繰り返して試験した。
L-HBcARD及びD-HBcARDのペプチド(0.5nmol)をウシ、マウス及びヒトの起源から収集した5%血清の存在下又は不在下でMBCバッファーと混合した。37℃で3時間のインキュベーションの後、プロテアーゼ消化から残存するペプチドの量をSDS-PAGE電気泳動及びグリーンエンジェルによる染色によって特定した。画像をimage Jソフトウェアを使用して定量し、血清を含まない対照を用いて強度を正規化した。HBcARDペプチドの抗微生物活性に対する血清の効果を調べるため、各MBC濃度のL-HBcARDペプチド及びD-HBcARDペプチドをS.アウレウスATCC19636株(106CFU/ml)と共に37℃で3時間インキュベートした。細菌をMH寒天上に蒔き、抗微生物活性をコロニー形成によって判定した。
ペプチドの溶血活性をヒト赤血球(hRBC)に対して溶血によって判定した。ヒト血液をEDTA含有チューブに得て、450gで10分間遠心分離した。ペレットをPBSバッファーで3回洗浄し、10%hRBCの溶液を調製した。hRBC溶液を、PBSバッファー中のペプチドの段階希釈物と混合し、該反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。450gで10分間の遠心分離の後、405nmの波長での上清の吸光度を測定することにより溶血のパーセンテージを決定した。ブランク及び100%溶血を、PBSバッファー及び1%Triton X-100の存在下でそれぞれ判定した。
3週齢の雄性ICRマウス(19g~21g)をBioLASCO(台湾)から購入した。HBcARDペプチドのin vivo保護効能を試験するため、全てのマウスにS.アウレウスATCC19636(4×106CFU/マウス)を腹腔内で接種した。細菌接種から2時間後、HBc147-183(L-HBcARD又はD-HBcARD)又はPBS対照をそれぞれ腹腔内投与した。各群は10匹のマウスを含んだ。細菌接種に続いて7日間に亘って毎日、死亡率をモニターした。
Graphpadソフトウェアを使用して統計学的解析を行った。結果を平均±SDで示し、個々の群間の差をスチューデントt試験によって解析した。生存曲線をカプラン-マイヤー法によってプロットし、ログランク検定によって解析した。
本明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的にかなう代替となる特徴によって置き換えられてよい。このように、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴のうちの単なる一例である。
Claims (8)
- RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(配列番号7)、又はRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(配列番号9)からなる、抗微生物ペプチド。
- 前記配列において少なくとも1個のアルギニン残基がD-アルギニンである、請求項1に記載の抗微生物ペプチド。
- 前記配列において各々のアルギニン残基がD-アルギニンである、請求項2に記載の抗微生物ペプチド。
- 前記配列がrRrGRSPrRrTPSPrRrRSQSPrRrRSC(配列番号7)、RrRGRSPRrRTPSPRrRrSQSPRrRrSC(配列番号7)、又はrRrGRPrRrPPrRrRQPrRrRC(配列番号9)であり、ここで、RがL-アルギニンであり、rがD-アルギニンである、請求項2に記載の抗微生物ペプチド。
- 前記ペプチドが、抗菌活性又は抗真菌活性を示す、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドと、非ペプチド部分とを含む、抗微生物ペプチドコンジュゲート。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド又は請求項6に記載の抗微生物ペプチドコンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
- 細菌感染又は真菌感染症を治療するための、請求項7に記載の医薬組成物。
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