KR20190001954A

KR20190001954A - 아르기닌이 풍부한 도메인(Arginine-Rich domain)으로부터 유도된 변형된 항균성 펩타이드

Info

Publication number: KR20190001954A
Application number: KR1020187035660A
Authority: KR
Inventors: 치아호 시; 흥-리 첸; 페이-이 수
Original assignee: 치아호 시; 아카데미아 시니카
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2019-01-07
Also published as: BR112018074478A2; TW201808985A; ZA201807763B; EP3464329A4; TWI635095B; SG11201809928VA; WO2017205631A1; JP7161263B2; JP2019523220A; US20210101939A1; MX2018014490A; US20190144510A1; KR102530478B1; JP7161263B6; AU2017270201A1; IL263086A; EP3464329A1; CA3024873A1; CN109641938A

Abstract

2 내지 20개의 가변성 도메인을 포함하고, 각각의 가변성 도메인은 2 내지 20개의 연속적인 염기성 아미노산의 서열인 항균성 펩타이드로서, 여기서 (a) 상기 가변성 도메인은 가변성 링커에 의해 서로 분리되고, (b) 상기 가변성 링커는 2개 이상의 연속적인 염기성 아미노산 이외의 1 내지 20개의 임의의 아미노산을 가질 수 있으며, (c) 상기 펩타이드는 100개 이하의 아미노산을 갖는 항균성 펩타이드.

Description

아르기닌이 풍부한 도메인(Arginine-Rich domain)으로부터 유도된 변형된 항균성 펩타이드

항생제는 60년 이상 동안 세균 감염의 치료를 위해 사용되어 왔다. 최근 들어, 항생제-내성 세균(antibiotics-resistant bacteria)의 증가하는 수가 공중 보건의 주요한 위협이 되고 있다. 임상적인 치료를 위한 신규한 항생제의 개발이 매우 시급하게 필요하다. 다양한 종으로부터의 항균성 펩타이드(Antimicrobial peptide; AMP)는 병원성 미생물에 대한 숙주의 방어 무기로서 적합할 수 있다. 그들은 상이한 작용 방식을 통해 세균과 진균을 사멸할 수 있기 때문에, 이들은 항생제-내성의 문제를 극복하기 위한 잠재적인 후보물질로서 고려되어 왔다.

일 측면에서, 본 명세서에 기재된 것은 항균성 펩타이드이다. 상기 펩타이드는 2 내지 20개의 가변성 도메인(variable domain)을 포함하고, 각각의 가변성 도메인은 2 내지 20개의 연속적인 염기성 아미노산의 서열이고, 여기서 (a) 상기 가변성 도메인은 가변성 링커(linker)에 의해 서로 분리되고, (b) 상기 가변성 링커는 2개 이상의 연속적인 염기성 아미노산 이외의 1 내지 20개의 임의의 아미노산을 가질 수 있으며, (c) 상기 펩타이드는 100개 이하의 아미노산을 갖는다. 일 구현예에서, 펩타이드는 적어도 3 또는 4개의 가변성 도메인을 갖는다. 상기 펩타이드는 C-말단 시스테인을 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 가변성 도메인 내의 염기성 아미노산의 적어도 하나는 아르기닌이다. 예를 들어, 펩타이드 내 각각의 가변성 도메인 내의 모든 염기성 아미노산은 아르기닌 잔기(residue)일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 상기 항균성 펩타이드 내의 가변성 도메인은 적어도 하나의 라이신을 갖는다. 일 구현예에서, 가변성 도메인은 적어도 하나의 히스티딘을 갖는다. 상기 펩타이드는 고리 구조를 가질 수 있다.

상기 펩타이드 내의 염기성 아미노산 중의 적어도 하나는 화학적으로 변형된(chemically-modified) 아미노산일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 화학적으로-변형된 아미노산은 D-아미노산, 예컨대, D-아르기닌이다. 상기 가변성 도메인 및 가변성 링커는 헤파드나바이러스 핵심 단백질(hepadnavirus core protein; HBcARD)의 아르기닌이 풍부한(arginine-rich) 도메인으로부터 유도될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 HBcARD는 헤파드나바이러스 핵심 단백질의 147번 잔기로부터 C-말단 잔기까지의 서열을 포함한다. 상기 펩타이드 내의 각각의 가변성 도메인은 3 또는 4개의 아르기닌 잔기를 가질 수 있고 상기 펩타이드 내의 각각의 가변성 링커는 2 내지 4개의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 그람-양성 세균, 그람-음성 세균, 진균, 기생충, 또는 바이러스에 대하여 광범위 항균 활성을 나타낼 수 있다.

일 구현예에서, 상기 항균성 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 공통 서열(consensus sequence)을 포함한다:

(i) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉) (서열번호 1), 여기서 각각의 X₁, X₃, X₆, 및 X₉는, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, X₅, X₇, 및 X₈은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고,

(ii) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆) (서열번호 2), 여기서 각각의 X₁, X₃, 및 X₆은, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, 및 X₅는, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고,

(iii) (X₁)X₂PX₃P(X₄)X₅QX₆P(X₇) (서열번호 3), 여기서 각각의 X₁, X₄, 및 X₇은, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₃, X₅, 및 X₆은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하다. 각각의 가변성 도메인은 2 내지 20개의 연속적인 염기성 아미노산의 서열이다.

상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 공통 서열을 가질 수 있다:

(i) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀C (서열번호 4), 및

(ii) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀Q (서열번호 5),

여기서 각각의 X₁, X₃, X₆, 및 X₉는, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, X₅, X₇, X₈, 및 X₁₀은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하다.

일 구현예에서, 상기 항균성 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함한다:

(i) TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC (서열번호 6), 여기서, 상기 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나가 D-아르기닌이다,

(ii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC (서열번호 7),

(iii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ (서열번호 8),

(iv) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC (서열번호 9),

(v) RRRGRSPRRRTPSPRRRRC (서열번호 10),

(vi) RRRGRPRRRPPRRRRC (서열번호 11),

(vii) RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC (서열번호 12), 및

(viii) RRRPPRRRRQPRRRRC (서열번호 13).

예를 들어, 상기 항균성 펩타이드는 RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC (서열번호 7)의 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 서열 내 각각의 아르기닌 잔기는 L-아르기닌이다. 대안적으로, 상기 펩타이드가 RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC (서열번호 7)의 서열을 가질 수 있고, 여기서 상기 서열 내 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나는 D-아르기닌이다.

일 구현예에서, 상기 항균성 펩타이드는 rRrGRSPrRrTPSPrRrRSQSPrRrRSC (서열번호 7)의 서열을 포함하고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌이다. 대안적으로, 상기 펩타이드는 RrRGRSPRrRTPSPRrRrSQSPRrRrSC (서열번호 7)의 서열을 포함할 수 있고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌이다.

상기 항균성 펩타이드는 RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC (서열번호 9)의 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 서열 내 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나(예컨대, 아르기닌 잔기의 20%, 30%, 40%, 또는 50%)는 D-아르기닌이다. 예를 들어, 상기 서열은 rRrGRPrRrPPrRrRQPrRrRC (서열번호 9)일 수 있고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌이다.

일 구현예에서, 상기 항균성 펩타이드는 비-HBcARD 펩타이드(예컨대, 친화성 태그(affinity tag), 신호 서열(signal sequence), 리간드, 또는 또다른 항균성 펩타이드 또는 이의 단편)을 추가로 포함한다. 상기 비-HBcARD 펩타이드는 폴리-히스티딘(poly-histidine) 또는 이의 유사체(analog)일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 갖는다:

(i) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH (서열번호 14),

(ii) HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS (서열번호 15),

(iii) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH (서열번호 16), 및

(iv) HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR (서열번호 17).

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 것은 항균성 펩타이드 접합체(conjugate)이며, 이는 본원에 개시된 항균성 펩타이드 및 비-펩타이드 모이어티(moiety)를 포함한다.

또 다른 측면에서, 약학적 조성물이 본원에 기재된다. 상기 조성물은 상기 항균성 펩타이드 또는 상기 항균성 접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

또한, 본원에서 고려되는 것은 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 감염(infection)을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 상기 대상체에게 본원에 기재된 항균성 펩타이드, 항균성 펩타이드 접합체, 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

하나 이상의 구현예의 세부사항들은 하기에 첨부되는 도면, 및 설명에 제시된다. 구현예들의 다른 특징, 목적, 및 이점들은 상세한 설명과 도면으로부터, 및 청구범위로부터 분명해질 것이다.

도 1은 HBcARD 도메인의 두 세트의 서열 정렬을 포함한다. (A) HBcARD 서열은 인간(서열번호 6), 양털 원숭이(서열번호 18), 들다람쥐(서열번호 19), 우드척(서열번호 20), 및 박쥐(서열번호 21) 사이에서 고도로 보존되어 있다. (B) 오리(서열번호 22), 왜가리(서열번호 23), 앵무새(서열번호 24), 로스구스(서열번호 25) 및 흰기러기 간염 B형 바이러스(서열번호 26)의 HBc C-말단에는 분리된 네 개의 양전하 집락(positive charge clusters)이 있었다.
도 2는 L-HBcARD 펩타이드와 D-HBcARD 펩타이드 사이의 혈청 내성의 비교를 보여주는 그래프의 세트이다. 펩타이드들(L-HBcARD 및 D-HBcARD)은 5% 태아 소 혈청(A), 5% 마우스 혈청(B), 또는 인간 혈청(남성 또는 여성)(C)을 포함하는 MBC 버퍼(10 mM 인산 나트륨 및 50 mM 염화 나트륨, pH 7.2)와 함께 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 펩타이드의 양은 SDS PAGE 전기영동 및 그린 앤젤(green angel) 염색을 사용하여 결정되었다. (D) MBC 분석에서 펩타이드 D-HBcARD는 L-HBcARD의 것에 비해 10,000-배 높은 효능을 나타내었다. 펩타이드들(L-HBcARD 및 D-HBcARD)은 5% 마우스 혈청의 존재 또는 부재 하에서 황색포도알균(S. aureus) ATCC19636과 함께 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 항균 활성은 콜로니 형성 분석에 의해 결정되었다. ^***P<0.0001.
도 3은 L-HBcARD 펩타이드와 D-HBcARD 펩타이드 사이의 용혈 효과의 비교를 보여주는 그래프이다. 인간 적혈구 세포는 상이한 농도의 펩타이드와 함께 배양되었다. 용혈은 트리톤 X-100-유도 용혈의 백분율로서 제공된다. ^***P<0.0001.
도 4는 황색포도알균(S. aureus)으로 감염된 마우스 패혈증 모델에서 L-HBcARD 펩타이드와 D-형 HBcARD 펩타이드 사이의 생체 내 보호 활성의 비교를 보여주는 그래프의 세트이다. (A) 3주령 ICR 마우스는 황색포도알균(4x10⁶ CFU/마우스)을 접종하였고 접종 후(post-inoculation) 2시간 째에 PBS, L-HBcARD, 또는 D-HBcARD가 복강내로 주사되었다. 각각의 그룹은 10마리의 마우스를 포함하였다. (B) 및 (C) 3주령 ICR 마우스가 0, 3, 및 6일째에 L- 및 D-HBcARD 펩타이드(5 mg/kg)로 각각 면역화되었다. 14일 째에, 마우스는 황색포도알균(4x10⁶ CFU/마우스)으로 접종하였고, 접종 후 1시간 째에 각각 PBS, L-HBcARD 또는 D-HBcARD(10 mg/kg)로 복강내 주사하였다. 마우스의 또다른 그룹은 대조군으로서 PBS로 동시에 처리되었다. 각각의 동물의 그룹은 다섯 마리의 마우스를 포함하였다. ^*P<0.05; ^***P<0.0001; ns, 유의성 없음.
도 5는 ICR 마우스 패혈증 모델에서 상이한 용량의 다양한 변형된 HBcARD 펩타이드들의 생체 내 보호 효능을 보여주는 그래프이다.
도 6은 BALB/c 마우스 폐 감염 모델에서 150-177C 및 150-177Q 펩타이드의 생체 내 보호 효능을 보여주는 그래프이다. 콜리스틴-내성 아시네토박테르 바우만니(A. baumannii)가 기관 내 경로를 통해 접종되었다.
도 7은 폴리믹신 B와의 비교에서, HBcARD 펩타이드 D-150-177C의 더 낮은 생체 내 독성을 보여주는 그래프의 세트이다. 0일째에, 수컷 ICR 마우스(5마리 마우스/그룹)에 상이한 용량의 D-150-177C 펩타이드(20-80 mg/kg) 및 폴리믹신 B(50 mg/kg)를 각각 복강내로 주사하였다. (A) 모든 그룹의 생존율을 7일 동안 모니터링하였다. (B) D-150-177C 및 폴리믹신 B로 처리된 마우스로부터 수집한 혈청 샘플은 1일 째에 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성(ALT)에 대하여 측정하였다. 점선(dash line)은 ICR 마우스의 ALT 값(45 U/L)의 평균을 나타낸다(Charles River Laboratories).
도 8은 마우스 패혈증 모델에서 전체-D-아르기닌 치환된 150-177C 펩타이드 및 부분적-D-아르기닌 치환된 150-177C 펩타이드의 생체 내 보호 효능을 보여주는 그래프이다. 접종 후 2시간 째에, 마우스(n=10/그룹)들은 5 mg/kg의 다양한 펩타이드 D-, DL-, LD-150-177C, 및 PBS로 각각 처리되었다. 펩타이드 D- 및 DL-150-177C 는 모든 황색포도알균-감염 마우스를 죽음으로부터 보호하였지만, 펩타이드 LD-150-177C는 단지 80%의 마우스만을 보호하였다.
도 9는 펩타이드 DL-150-177C로부터의 세린 및 트레오닌 잔기의 결실이 마우스 패혈증 모델에서 상이한 용량으로 생체 내 보호 효능을 향상시킴을 보여주는 그래프이다.

HBV 핵심 단백질의 아르기닌이 풍부한 도메인(arginine-rich domain)으로부터 유도된 특정한 변형된 펩타이드가 광범위 항균 활성을 나타냈다는 것이 예기치 않게 발견되었다.

본원에 기재된 것은 항균성 펩타이드이다. 이것은 적어도 두 개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)의 가변성 도메인을 포함한다. 상기 가변성 도메인은 일렬로(in tandem) 존재하며 각각은 가변성 링커에 의해 다른 것과 분리된다. 상기 항균성 펩타이드는 100개 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있다(예컨대, 10개 미만, 10, 14, 15, 20, 21, 22, 25, 28, 30, 35, 37, 40, 45, 47, 50, 55, 57, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 아미노산). 일 구현예에서, 상기 펩타이드는 C-말단 시스테인을 갖는다.

각각의 가변성 도메인은, 개별적으로, 적어도 두 개(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 연속적인 염기성 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘 및 라이신의 서열이다. 각각의 가변성 도메인은 동일한 염기성 아미노산 또는 상이한 염기성 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항균성 펩타이드는 2 내지 20개의 동일하거나 상이한 가변성 도메인을 포함할 수 있고, 이때 각각은 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀이고(서열번호 27), 여기서 각각의 X₁-X₂₀은, 개별적으로, 아르기닌, 히스티딘, 또는 라이신(천연의 또는 화학적으로 변형된)이고, X₃-X₂₀중의 어느 것은 존재하거나 부재할 수 있다. 예를 들어, 각각의 가변성 도메인은 2 내지 10개의 염기성 아미노산을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 펩타이드 내 적어도 하나의 가변성 도메인은 오로지 아르기닌 잔기로 이루어진다. 다른 구현예에서, 상기 펩타이드 내 모든 가변성 도메인은 오직 아르기닌 잔기만을 포함한다. 대안적으로, 상기 펩타이드는 하나 이상의 히스티딘 또는 라이신 잔기를 갖는, 적어도 하나의 가변성 도메인을 포함할 수 있다.

각각의 가변성 링커는 적어도 하나의 아미노산(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)를 가지고, 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 이것은 두 개 이상의 연속적인 염기성 아미노산을 가질 수 없다.

용어 "아미노산"은 임의의 표준 아미노산 20개(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 및 발린) 중 어느 하나를 지칭한다. 상기 용어는 또한 비-표준, 비-단백질원성(non-proteinogenic), 또는 화학적으로-변형된 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 지칭할 수도 있다. 아미노산은 L- 또는 D-형 입체이성체(stereoisomer)로 존재할 수 있다.

용어 "염기성 아미노산"은 아르기닌, 라이신, 또는 히스티딘, 이들의 L- 또는 D-형, 또는 이들의 유사체를 지칭한다.

비-표준 아미노산은 셀레노시스테인(selenocysteine), 피롤라이신(pyrrolysine), N-포밀메티오닌(N-formylmethionine), 비-단백질원성 아미노산, 아미노산 유사체, 및 화학적으로-변형된 아미노산을 포함한다. 화학적으로-변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체는 일반적으로 그것의 자연적으로 발생하는 대응물(counterpart)과 상이한 측쇄(side chain)를 갖는다. 아미노산 유사체 및 이들을 폴리펩타이드에 포함시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Nguyen et al., Biochemica et Biophysica Acta 1808 (2011), 2297-2303; Knappe, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(9) 2010, 4003-4005; US7879979; US5972940; US8835162; 및 US20080199964] 참조). 아미노산 유사체는 또한 상업적으로 이용 가능하다. 아미노산 유사체는 상기 항균성 펩타이드에, 이의 안정성, 생체이용률, 약동학, 조직 분포, 안전성, 내약성(tolerability), 및/또는 효능을 향상시키기 위해 통합될 수 있다.

본원에 기재된 항균성 펩타이드 중의 어느 것도 표준 아미노산 20개 중의 하나가 아닌, 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 특히, 가변성 도메인 내 또는 전체 항균성 펩타이드 내의 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)의 염기성 아미노산은 천연 아르기닌, 라이신, 또는 히스티닌의 D-형, 또는 천연 아르기닌, 라이신, 또는 히스티딘의 유사체일 수 있다.

상기 항균성 펩타이드는 헤파드나바이러스 핵심 단백질(hepadnavirus core protein; HBcARD)의 아르기닌이 풍부한 도메인으로부터 유도될 수 있다. HBcARD는 핵심 단백질(HBc)의, 고도로 보존된 아르기닌이 풍부한 C-말단 영역(region)을 지칭한다(도 1 참조). 상기 HBc는 포유류의 HBc 또는 조류의 HBc일 수 있다. 포유류의 HBc는 인간 HBc, 양털 원숭이 HBc, 들다람쥐 HBc, 우드척 HBc, 및 박쥐 HBc일 수 있다. 조류 HBc는 오리, 왜가리, 앵무새, 로스구스, 및 흰기러기 HBc일 수 있다. 상기 HBc는 임의의 유전형의 헤파드나바이러스로부터 온 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 항균성 펩타이드는 HBcARD의 단편 또는 이의 변이체(variant; 예컨대, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는)를 포함할 수 있다. 상기 가변성 도메인 및 상기 링커는 HBcARD로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, HBcARD 또는 이의 변이체 내 임의의 두 아르기닌 반복(repeat) 사이의 서열이 링커로서 사용될 수 있다.

상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 공통 서열을 포함할 수 있다:

상기 항균성 펩타이드는 비-HBcARD 펩타이드를 추가로 포함하는 융합(fusion) 또는 키메릭 펩타이드일 수 있다. 비-HBcARD 펩타이드는 임의의 HBcARD로부터 유도된 것이 아니며, 상기에 기재된 바와 같이 링커에 의해 연결된, 적어도 두 개의 가변성 도메인을 포함하지 않는다. 비-HBcARD 펩타이드는 또다른 근원(source; 예컨대, HBcARD 이외의 단백질로부터), 제작된 펩타이드(예컨대, 또다른 항균성 펩타이드), 친화성 태그(affinity tag; 예컨대, 플래그(FLAG), 폴리-히스티딘(poly-His), Myc, HA, CBP, HBH, 또는 V5 태그), 신호 서열(예컨대, 선도 서열(leader sequence), 또는 국소화 신호(localization signal), 또는 리간드(예컨대, 수용체 리간드)로부터 유도된 펩타이드일 수 있다.

예를 들어, 상기 항균성 펩타이드는 100개까지의 아미노산을 가질 수 있고, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다:

(i) TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC (서열번호 6), 여기서 상기 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나가 D-아르기닌임,

(ii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC (서열번호 7),

(iii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ (서열번호 8),

(iv) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC (서열번호 9),

(v) RRRGRSPRRRTPSPRRRRC (서열번호 10),

(vi) RRRGRPRRRPPRRRRC (서열번호 11),

(vii) RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC (서열번호 12),

(viii) RRRPPRRRRQPRRRRC (서열번호 13).

(ix) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH (서열번호 14),

(x) HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS (서열번호 15),

(xi) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH (서열번호 16), 및

(xii) HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR (서열번호 17).

본원에 기재된 바와 같이, 상기 항균성 펩타이드는 하나 이상의 변형된 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기한 서열 또는 공통 서열 중 어느 것에서, 상기 가변성 도메인 또는 전체 항균성 펩타이드 내 염기성 아미노산 중의 하나 이상은 천연 아르기닌, 라이신, 또는 히스티딘의 D-형, 또는 천연 아르기닌, 라이신, 또는 히스티딘의 유사체일 수 있다.

상기한 서열 또는 공통 서열 중 어느 것도 상기 항균성 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 존재할 수 있다.

본원에 기재된 상기 항균성 펩타이드는 또한 펩타이드 접합체(conjugate)를 형성하기 위해, N- 또는 C-말단에서 비-펩타이드 모이어티와 접합될(conjugated) 수 있다. 비-펩타이드 모이어티는 중합체(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 중합체), 올리고당, 지질, 당지질, 고형 지지체(solid support; 예컨대, 비드 또는 나노입자), 작은 분자 약물, 비오틴(biotin), 핵산 분자, 항체, 비타민, 담체 단백질(예컨대, KLH, BSA, 또는 OVA), 또는 검출가능한 표지(예컨대, 형광성, 방사성, 효소 표지)일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 접합체는 항균 활성을 나타낸다. 펩타이드 접합체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 기재된 항균성 펩타이드 또는 펩타이드 접합체는 약학적 조성물을 형성하기 위해 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 수 있다.

상기 조성물은 인산염완충 식염수, 중탄산염 용액, 및/또는 보강제(adjuvant)와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 적절한 약학적 담체 및 희석제 뿐만 아니라 그들의 사용을 위한 약학적인 필요성이 당업계에 공지되어 있다. 상기 조성물은 주사 가능한, 액상용액, 에멀전, 또는 또다른 적절한 제형으로서 제조될 수 있다.

상기에 기재된 조성물의 유효량(effective amount)은 비강내 흡입, 국소 적용, 또는 비경구적 경로, 예컨대, 정맥내 주사, 피하 주사, 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수도 있다. 대안적으로, 좌제 및 경구 제형을 포함하는 다른 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌제를 위해, 결합체(binder) 및 담체는, 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜(plolyalkalene glycol) 또는 트리글리세라이드(triglyceride)를 포함할 수 있다. 경구 제형은 약학적 등급의 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은, 통상적으로 사용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지효성 제형(sustained release formulation) 또는 분말의 형태를 취한다.

상기한 조성물은 세균 감염을 치료하거나 대상체(subject; 예컨대, 인간, 또다른 포유류, 또는 실험실 동물) 내의 미생물의 성장을 억제하기 위해, 대상체에 투여될 수 있다. 상기 조성물은 그람-양성 또는 그람-음성 세균, 진균, 기생충, 또는 바이러스, 예컨대, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae), 세균성 이질균(Shigella dysenteriae, S. dysenteriae), 대장균(Escherichia coli, E. coli), 황색포도알균(Staphylococcus aureus, S. aureus), 아시네토박테르 바우만니(Acinetobacter baumannii, A. baumannii), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium Difficile), 칸디다(Candida), 아스페르길루스(Aspergillus), 분아균(Blastomyces), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 가티(Cryptococcus gattii), 콕시디오이데스(Coccidioides), 히스토플라스마(Histoplasma), 사람폐포자충(Pneumocystis jirovecii), 링웜(ringworm), 스포로트릭스(Sporothrix), 엑세로힐룸(Exserohilum), 또는 클라도스포륨(Cladosporium)에 의해 야기된 감염을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

하기의 구체적인 개시내용은 단지 예시하기 위한 것이며, 어떤 식으로든지 본 개시내용의 나머지가 한정적이지 않는 것으로 해석되어야 한다. 추가의 상세한 설명 없이도, 당업계의 숙련가들은, 본원의 설명을 기반으로 하여 본 개시내용을 가장 완전한 정도로 이용할 수 있는 것으로 고려된다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들은 그들의 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다.

인간 HBcARD로부터 유도된 변형된 항균성 펩타이드

인간 B형 간염 바이러스(human hepatitis B virus; HBV) 핵심 단백질(HBc)의 아르기닌이 풍부한 도메인(arginine-rich domain ; ARD)으로부터의 신규한 항균성 펩타이드가 이전에 확인되었다(문헌[Chen et al. (2013), PLoS Pathog 9:e1003425 doi:10.1371/journal.ppat.1003425], 및 [Chen et al., (2016), Appl Microbiol Biotechnol. 100(21): 9125-9132] 참조). 이 HBcARD 펩타이드는 그람-음성 및 그람 -양성 세균에 대하여 광범위 항균 활성을 나타내었다. 본 발명자들의 마우스 패혈증 모델에서, 2시간 후접종(postinoculation)에서의 HBcARD 펩타이드의 주사는 40%의 황색포도알균-감염 마우스를 죽음으로부터 보호할 수 있다(문헌 [Chen et al. (2013)] 참조).

HBcARD 펩타이드는 상이한 종들의 헤파드나바이러스에서 고도로 보존되어 있다. HBcARD의 항균 효능을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 포유류, 설치류, 및 조류 헤파드나바이러스의 다양한 HBcARD 펩타이드들의 서열과 항균 활성을 비교하였다. 인간 헤파드나바이러스의 HBcARD 펩타이드가 가장 강한 항균 활성을 나타내었다.

본 발명의 선도 화합물(lead compound)인 HBcARD의 효능(potency)을 더 향상시키기 위해, 본 발명자들은, 절단(truncation) 및 L-아르기닌에 대한 D-아르기닌 치환에 의해 변형된 펩타이드를 포함하여, 여러가지 HBcARD 유도체들 각각의 항균 활성을 시험하였다(하기 표 1 참조).

[표 1]

그들의 살균(bactericidal) 활성에 대해 시험된 다양한 HBcARD 펩타이드들의 서열

(R : L-아르기닌; r : D-아르기닌)

인간 및 비-인간 HBcARD 펩타이드의 서열 및 항균 활성의 비교

다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)에 의해, 본 발명자들은 인간(AAP31571.1), 양털 원숭이(wooly monkey ; AAO74859.1), 들다람쥐(ground squirrel; AAB08031.1), 우드척(AAA46761.1), 박쥐(AGT17576.1), 오리(AAO49490.1), 왜가리(heron; AAA45737.1), 앵무새(AFY97786.1), 로스 구스(AAR89928.1) 및 흰기러기(AAD22001.1)를 포함하는, 다양한 헤파드나바이러스의 HBcARD 펩타이드 서열을 비교하였다(도 1 참조). 인간 B형 간염 바이러스의 HBcARD 펩타이드와 유사하게, 다른 포유류의 헤파드나바이러스(양털 원숭이, 들다람쥐, 우드척 및 박쥐)의 HBcARD 펩타이드는 네 개의 집락(clustering)화된, 아르기닌이 풍부한 도메인을 포함하였다. 조류 헤파드나바이러스와 포유류 헤파드나바이러스 사이의 HBcARD 펩타이드의 서열 상동성은 낮았던 반면에, 그들은 둘 다 네 개의 고도로 양성-하전된(positive-charged) 도메인을 포함하였다. 이들 각각의 항균 활성을 비교하기 위해, 본 발명자들은 박쥐, 우드척, 오리 및 왜가리 헤파드나바이러스로부터 유도된 네 개의 HBcARD 펩타이드들의 최소 살균 농도(minimal bactericidal concentration)를 결정하였다. 그 결과는 박쥐와 우드척 헤파드나바이러스로부터 유도된 펩타이드가 인간 B형 간염 바이러스로부터 유도된 것과 비교할 만한 잠재적인 항균 활성을 보였음을 나타냈다(표 2 참조). 대조적으로, 조류 헤파드나바이러스로부터 유도된 펩타이드들은 더 낮은 항균 활성을 보였다. 인간 HBV로부터의 HBcARD는 길이가 더 짧기 때문에(147-183; 37개 아미노산), 본 발명자들은 본 발명의 이후의 변형(modification) 및 최적화 실험에서 이 펩타이드에 초점을 맞추었다.

[표 2]

인간, 박쥐, 우드척, 오리 및 왜가리 HBcARD 펩타이드들의 그람-양성 및 그람-음성 세균에 대한 항균 활성

^a ATCC: 미국미생물자원센터(American Type Culture Collection) ; ND: 검출되지 않음

L- 및 D-HBcARD 펩타이드들의 항균 활성의 비교

본 발명자들은 HBcARD 147-183 펩타이드(37-머(mer)) 상의 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 예측하기 위해 펩타이드커터(PeptideCutter)를 사용하였다. 그 결과, 70% 이상의 프로테아제 절단 부위가 HBcARD 펩타이드의 아르기닌 잔기들에 매핑(mapping)되었음을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음). 혈청에서의 펩타이드 안정성을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 D-아미노산 대체(replacement)에 의해, 변형된 펩타이드, D-HBcARD 147-183 펩타이드를 합성하였는데, 이때 모든 아르기닌 잔기가 그것의 D-이성체로 대체되었다.

D-아르기닌 치환(substitution)이 항균 활성을 향상시킬지 여부를 조사하기 위해, L- 및 D-HBcARD 펩타이드들(37-머)이, 녹농균, 폐렴막대균, 아시네토박테르 바우만니, 대장균, 세균성 이질균, 및 황색포도알균을 포함하는, 매우 다양한 세균에 대하여 나란히(side-by-side) 시험되었다. L-HBcARD에 상대적으로, D-HBcARD 펩타이드는 아시네토박테르 바우만니에 대하여 유사한 항균활성을 나타내었고(MBC=2.3-4.6 mg/L), 녹농균(MBC=4.6 mg/L), 폐렴막대균(MBC=4.6 mg/L), 및 황색포도알균(MBC=4.6-9.2 mg/L)에 대하여 더 좋은 항균 활성을 나타내었다. 그러나, 불명확하게 남아있는 이유 때문에, 대장균 및 세균성 이질균에 대한 D-HBcARD 펩타이드의 항균 활성은 18.4에서 73.6 mg/L로 감소하였다(표 3 참조).

[표 3]

야생형 HBcARD 147-183 펩타이드 L-HBcARD와 D-HBcARD 사이의 최소 살균 농도(MBC)의 비교

^aATCC: 미국미생물자원센터

^b콜리스틴-내성 아시네토박테르 바우만니(Tzu Chi General Hospital로부터의 실험실 및 임상적 분리주[Chen et al. PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003425.])

^c캘리퍼 라이프 사이언시즈, 잉크.(Caliper Life Sciences, Inc.)

L-HBcARD와 D-HBcARD 사이의 혈청 내성(serum resistance)의 비교

37-머 L- 및 D-HBcARD 펩타이드의 혈청 프로테아제 분해에 대한 안정성을 비교하기 위해, 본 발명자들은 프로테아제 내성 분석(protease resistance assay)을 수행하였다. 37℃에서 3시간 동안 5%의 소 혈청과 함께 배양한 후, 80% 이상의 L-HBcARD 펩타이드는 SDS-PAGE 상에서 그린 앤젤(Green Angel)로 염색함으로써 더 이상 검출되지 않았다. 대조적으로, D-HBcARD 펩타이드의 신호 강도는 동일한 조건 하에서도 감소되지 않았다(도 2A 참조). L-HBcARD가 5% 마우스 또는 인간(남성 및 여성) 혈청과 함께 배양되었을 때, 유사한 결과가 얻어졌다(도 2B 및 2C 참조). 이러한 결과는 L-HBcARD에 비해 D-HBcARD가 태아 소, 마우스 및 인간 혈청의 프로테아제 소화에 대하여 더 저항적이라는 것을 시사한다.

더욱이, 본 발명자들은 L- 및 D-HBcARD 펩타이드들의 시험관내(in vitro) 항균 활성을 혈청의 존재 하에서 결정하였다. 그 결과는 18.4 mg/L 농도에서의 L-HBcARD 및 D-HBcARD 펩타이드 둘 다 MBC 분석에서 황색포도알균을 사멸시킬 수 있었음을 보여주었다(도 2D 참조). 5% 마우스 혈청의 첨가 시에, L-HBcARD 펩타이드와 D-HBcARD 펩타이드 사이의 항균 활성에 있어서 유의한 차이점이 있었다(P<0.0001). 5% 마우스 혈청의 존재 하에 L-HBcARD 펩타이드의 처리는 10⁷개 세균 콜로니를 생산한 반면, D-HBcARD 펩타이드를 사용한 처리는 약 10³개 콜로니를 생산하였다. 그러므로, 본 발명의 D-HBcARD 펩타이드는 5% 마우스 혈청의 존재 하에서 L-HBcARD 펩타이드의 것보다 더 높은 항균 활성을 나타냈다. 이러한 관찰은 D-HBcARD가 단백분해성 분해(proteolytic degradation)에 더 안정적이며 내성적이라는 것을 시사한다.

D-HBcARD 펩타이드의 용혈능(Hemolytic activity)

용혈 분석(Hemolytic assay)에서, 인간 RBC들은, 37℃에서 1시간 동안, 순차적으로-희석된 용량(0 내지 460 mg/L)의 D-HBcARD, L-HBcARD, 또는 멜리틴(melittin)과 함께 배양되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 멜리틴은 8.9 mg/L의 농도에서, 100%의 용혈을 야기하였다. 대조적으로, D- 및 L-HBcARD 펩타이드 둘 다의 용혈 활성은 460 mg/L까지 검출되지 않았다(P<0.0001).

황색포도알균으로 감염된 마우스 패혈증 모델에서 L-HBcARD 펩타이드와 D-형 HBcARD 펩타이드 사이의 생체 내(in vivo) 보호 효능의 비교

37-머 L- 및 D-HBcARD 펩타이드의 생체 내 보호 효능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 황색포도알균으로 감염된 마우스 패혈증 모델을 수행하였다. ICR 마우스는 먼저 황색포도알균(4x10⁶ CFU/마우스)이 복강내(i.p.)로 접종되었고, 다음으로 접종 후 2시간 째에 L-HBcARD, D-HBcARD 및 PBS가 각각 1 회 단일 복강내로 주사되었다. PBS가 투여된 모든 마우스(n=10)들은 1일 째에 죽었다(도 4A 참조). 접종 후 7일째에, L-HBcARD(10 mg/kg)로 치료된 마우스의 40%가 생존하였다(도 4A 참조). 대조적으로, D-HBcARD 펩타이드는 훨씬 더 높은 생존율(5 mg/kg 용량의 경우 60%, 및 10 mg/kg 용량의 경우 100%)을 달성할 수 있었다(도 4A 참조). 이러한 결과는 HBcARD의 생체 내 효능이 D-아르기닌 대체 전략에 의해 향상될 수 있음을 나타내었다(P<0.0001).

황색포도알균으로 감염된 마우스 패혈증 모델에서 L-HBcARD 펩타이드와 D-형 HBcARD 펩타이드 사이의 면역원성의 비교

생체 내에서 중화 항체를 유도함으로써 37-머 HBcARD 펩타이드의 반복된 처리가 효능을 손상시키는지(compromise) 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 세균 감염에 앞서 3-주령의 마우스를 L- 및 D-HBcARD 펩타이드로 3번 각각 면역화시켰다. 1차 면역화 후 2주 뒤에, 면역화된 마우스들은 황색포도알균이 접종되었고, 뒤이어 L- 또는 D-HBcARD 펩타이드 중 하나를 접종 후 1시간 뒤에 복강내(i.p.)로 주사하였다. 본 발명자들의 이전 보고서[Chen et al., 2013]와 일치하게, L-HBcARD는 사전의 L-HBcARD 펩타이드 존재 또는 부재 하의 면역화와 관계 없이, 여전히 모든 마우스를 죽음으로부터 보호하였다(도 4B 참조). PBS로 면역화된 및 PBS로 처리된 대조군 마우스는 세균 시험감염(challenge) 후 24시간 이내에 거의 80% 사망률을 보였다(P<0.05). 접종 후 7일 째에, L- 및 D-HBcARD(10 mg/kg)가 처리된 모든 마우스들은, 사전의 D-HBcARD 존재 또는 부재 하의 면역화와 관계 없이 세균 시험감염에서 생존하였다(도 4C 참조). 그러므로, D-형 또는 L-형 펩타이드 중 어느 하나의 사전의 면역화는, HBcARD 펩타이드의 연속적 처리의 생체 내 항균 활성에 대하여 중화 활성을 유도하지 않았다.

말단 시스테인의 유의성

본 발명자들은 추가적인 HBcARD 유도체들의 항균 활성을 시험하였다(표 1 참조). 이 펩타이드들의 항균 활성은 최소 살균 농도(MBC)에 의해 결정되었다. 모 펩타이드(parental peptide) 147-183(37-머)과 달리[Chen et al., 2013 참조], 유도체 펩타이드 HBcARD 150-177Q(28-머)는 황색포도알균에 대하여 검출 가능한 살균 활성을 나타내지 않았다(표 4 참조). 카복실기 말단에 시스테인이 있는 모 펩타이드 HBcARD 147-183를 모방하기 위해, 본 발명자들은 HBcARD 150-177Q의 말단 Q(글루타민) 잔기를 C(시스테인) 잔기로 대체함으로써 또다른 28-머 유도체 HBcARD 150-177C를 설계하였다(표 1 참조). 흥미롭게도, 이 Q-에서-C로의 치환은 황색포도알균에 대한 살균 활성을 효과적으로 안정화시켰다(표 4 참조).

[표 4]

변형된 HBcARD 펩타이드들의 다양한 그람-음성 및 그람-양성 세균에 대한 최소 살균 농도(MBC)

-, 측정되지 않음; ND, 항균 활성이 검출되지 않음

길이 또는 아르기닌 함량의 유의성

말단 시스테인이 살균 활성에 중요해보인다는 사실이 주어졌으므로, 본 발명자들은 HBcARD의 150-177C 펩타이드(28-머)의 총 길이가 추가로 감소될 수 있는지에 대한 의문을 가졌다. 본 발명자들은 황색포도알균에 대하여 펩타이드 150-171C(20-머), 157-177C(21-머), 및 164-177C(14-머)들의 효능을 비교하였다. <표 4>에 나타낸 바와 같이, 이 펩타이드 중 어느 것도 검출 가능한 활성을 나타내지 않았다. 여기서 이러한 결과는 감소된 수의 아르기닌을 갖는 단축된 펩타이드가 황색포도알균에 대하여 항균 활성을 나타내지 않음을 나타낸다(표 4 참조). 다른 한편으로, 본 발명자들은 3개의 가변성 도메인을 포함하는 더 짧은 펩타이드가 다른 세균을 사멸하기에 충분함을 나타내었다(결과는 나타내지 않음).

28-머 펩타이드 D-150-177C는 패혈증 마우스 모델에서 보호 효능을 향상시켰음

본 발명자들은 D-형 또는 L-형 아르기닌 중 하나를 포함하는 HBcARD 150-177C 펩타이드(28-머)의 생체 내 보호 효능을 비교하였다(표 1 및 도 5 참조). ICR 마우스(n=10/그룹)는 황색포도알균 ATCC19636 (4x10⁶/마우스)이 복강내(ip.)로 접종되었고, 이어서 접종 후 2시간 째에 변형된 펩타이드로 처리하였다. PBS 대조군 마우스는 모두 1일 째에 죽었고, 대조군 펩타이드(150-177Q)로 처리된 마우스의 단지 20%가 생존하였다. 5 및 10 mg/kg의 용량에서 L-150-177C 펩타이드의 투여는 각각 30% 및 70%의 마우스를 사망으로부터 보호하였다(도 5 참조). 5 mg/kg의 D-150-177C 처리 시에는 모든 마우스(100%)가 생존하였다.

28-머 펩타이드 D-150-177C는 콜리스틴-내성 아시네토박테르 바우만니에 의한 폐 감염으로부터 마우스를 보호했음

BALB/c 마우스(n=8/그룹)는 콜리스틴-내성 아시네토박테르 바우만니 TCGH 46709(3.4x10⁸ cfu/마우스)가 기관-내(intra-tracheally) 접종되었다. 이 폐-감염 마우스들은 콜리스틴(5 mg/kg/일) 또는 D-150-177C(5 및 10 mg/kg/일)가 각각 복강내주사로 처리되었다. 콜리스틴으로 처리된 모든 마우스는 약물-내성 아시네토박테르 바우만니의 접종 후 60시간 째에 죽었다(도 6 참조). 대조적으로, D-150-177C로부터는 용량-의존적인 보호 효과가 있었다. 마우스가 10 mg/kg/일의 D-150-177C 펩타이드로 처리되었을 때 유의한 차이점이 관찰되었다(p<0.05)(도 6 참조).

펩타이드 D-150-177C와 폴리믹신 B(polymyxin B) 사이의 생체 내 독성의 비교

패혈증 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들은 28-머 D-150-177C 펩타이드(20-80mg/kg 체중) 및 폴리믹신 B(콜리스틴-관련 화합물)(50 mg/kg 체중)가 복강내(i.p.)로 주사된 ICR 마우스의 생존율을 검사하였다(도 7a 참조). 콜리스틴 및 폴리믹신 B의 신장에 대한 유명한 신독성으로부터 기대된 바와 같이, 폴리믹신 B(50 mg/kg)로 처리된 모든 마우스가 1일 째에 죽었다(도 7a 참조). 대조적으로, 20 및 40 mg/kg D-150-177C가 처리된 마우스에서는 급성 독성이 관찰되지 않았다(도 7a 참조). 용량이 60 에서 80 mg/kg으로 증가되었을 때, 마우스의 생존율은 각각 80% 및 40%로 감소하였다(도 7a 참조). 혈청 ALT 수준에 의해 간 손상이 검출될 수 있었다. 20 내지 40 mg/kg의 D-150-177C로 처리된 마우스는 폴리믹신 B에 비해 더 높은 ALT 수준을 보였지만, p 값은 유의적이지 않았다(도 7b 참조). 60 mg/kg으로 처리된 마우스의 ALT 수준은 20 mg/kg의 폴리믹신 B로 처리된 것보다 유의적으로 높았다(p<0.01)(도 7b 참조).

다양한 변형된 150-177C 펩타이드들간의 생체 내 보호 효능의 비교

28-머 펩타이드 D-150-177C는 총 14개의 D-아르기닌으로 치환된 14개의 L-아르기닌을 포함한다(표 1 및 도 6 참조). D-아르기닌은 L-아르기닌보다 훨씬 더 비싸다. 펩타이드 합성의 비용을 감소시키기 위해, 본 발명자들은 완전한 D-아르기닌 치환 또는 부분적인 D-아르기닌 치환을 포함하는 펩타이드들 사이의 생체 내 보호 효능을 비교하였다(표 1 및 도 8 참조). 펩타이드 DL-150-177C는 단지 부분적으로 D-아르기닌 치환되었고, 전체-D-아르기닌 치환된 펩타이드 D-150-177C(100% 치환)에 대한 유사한 보호 효능을 나타냈다(도 8 참조). 대조적으로, 펩타이드 LD-150-177C(또한 부분적으로 치환됨)의 보호 효능은 DL-150-177C보다 적은 것으로 나타났다(도 8 참조).

세린과 트레오닌은 비필수적임

본 발명자들은 다음과 같은 2개의 주요한 변형: (1) 펩타이드 DL-150-177C의 주쇄(backbone)를 사용한 부분적-D-아르기닌 치환; 및 (2) 모 28-머 펩타이드 DL-150-177C로부터의 5개의 세린과 1개의 트레오닌 잔기의 결실(deletion)을 갖는 새로운 22-머 펩타이드, DL-dST-150-177C(표 1 참조)를 가공하였다. 이러한 22-머 펩타이드 DL-dST-150-177C는 28-머 DL-150-177C 및 L-150-177C에 비해 현저하게 향상된 보호 효능을 보였다(도 9 참조).

세균 분리주(Bacterial isolates)

HBcARD 펩타이드의 항균 활성을, 녹농균 미굴라(Migula) 균주(ATCC 27853, 암피실린-내성 및 ATCC 9027, 암피실린 내성), 폐렴막대균(ATCC 13884), 세균성 이질균 Xen27(Caliper Co.), 대장균 균주(ATCC 25922), 황색포도알균 아종(subsp.) 균주(ATCC 25923, 메티실린 내성 ATCC 29213, 메티실린-내성 및 ATCC 19636, 메티실린 내성) 및 아시네토박테르 바우만니 균주(ATCC 17978, ATCC 17978 CR, ATCC19606, ATCC 19606 CR, TCGH 45530 및 TCGH 46709)를 포함하는 많은 세균 균주를 이용하여 시험하였다. 임상 분리주 TCGH 45530 및 TCGH 46709는 대만의 투 치(Tzu-Chi) 불교 일반 병원(TCGH)에서 수득하였고, 비텍 시스템(Vitek system; Biomerieux Vitek, Inc., Hazelwood, MO, USA)을 이용하여 확인하였다(문헌 [Chang et al. (2012), J Microbiol Immunol Infect 45:37-42 doi:10.1016/j.jmii.2011.09.019] 참조).

항균 분석

L- 및 D-HBcARD 펩타이드는 Yao-Hong 바이오테크놀로지 인크.(Biotechnology Inc.; 타이페이, 대만)에서 구매하였다. 항균 활성은 기재된 바와 같이 측정되었다(문헌 [Chen et al., 2013] 참조). 요약하면, 세균들은 37℃에서 중간-대수기(mid-logarithmic phase)까지 MH 액체배지(broth)(디프코)에서 생장되었고, 인산염 완충액(10 mM 인산 나트륨 및 50 mM 염화 나트륨, pH 7.2)에서 10⁶ CFU (콜로니 형성 유닛)/ml 로 희석시켰다. 펩타이드들도 동일한 완충액에서 연속적으로 희석되었다. 세균 50 마이크로리터(μl)가 다양한 농도의 펩타이드 50μl와 혼합되었고, 이어서 37℃에서 3시간 동안 진탕 없이 배양되었다. 배양의 말기에, 최소 살균 농도(MBC)를 측정하기 위해, 세균은 뮐러-힌톤 액체배지 아가 플레이트에 놓였고, 37℃에서 밤새도록 성장하도록 허용되었다. 세균 성장을 보이지 않는(0 콜로니) 가장 낮은 펩타이드 농도는 MBC로서 정의되었다. 모든 펩타이드들은 3회 시험되었다.

프로테아제에 대한 안정성

L- 및 D-HBcARD 펩타이드(0.5 nmol)들은 소, 마우스 및 인간 기원으로부터의 5% 혈청이 존재하거나 또는 부재한 MBC 완충액과 혼합하였다. 37℃에서 3시간 동안의 배양 후에, 프로테아제 소화에서 생존한 펩타이드의 양은 SDS-PAGE 전기영동 및 그린 앤젤(Green Angel)로 염색함으로써 결정되었다. 이미지는 이미지 J 소프트웨어(image J software)를 이용하여 정량화되었고, 강도(intensity)는 혈청이 없는 대조군으로 표준화되었다. HBcARD 펩타이드의 항균 활성에 대한 혈청의 효과를 조사하기 위해, 그들 각각의 MBC 농도에서의 L- 및 D-HBcARD 펩타이드가 황색포도알균 ATCC19636 균주(10⁶ CFU/ml)와 함께 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 세균은 MH 아가에 놓였고 항균 활성이 콜로니 형성을 통해 결정되었다.

용혈 활성

펩타이드의 용혈 활성은 인간 적혈구 세포(hRBCs)에 대한 용혈에 의해 측정되었다. 인간 혈액은 EDTA-함유 튜브에 수득되었고, 450 g에서 10분간 원심분리되었다. 펠렛(pellet)은 PBS 완충액으로 세 번 세척되었고, 10% hRBC 용액이 준비되었다. hRBC 용액은 PBS 완충액에서 연속적 희석된 펩타이드와 혼합되었고, 반응 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 10분 간 450 g에서 원심분리한 뒤, 용혈의 백분율(percentage)이 상층액의 405 nm의 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 측정되었다. 맹검액(blank) 및 100% 용혈은 각각 PBS 완충액 상 및 1% 트리톤 X-100의 존재 하에서 각각 측정되었다.

생체 내 동물 실험

3주령의 수컷 ICR 마우스(19 내지 21 g)가 BioLASCO(대만)에서 구입되었다. HBcARD 펩타이드의 생체 내 보호 효능을 시험하기 위해, 모든 마우스들은 황색포도알균 ATCC 19636 (4 x 10⁶CFU/마우스)가 복강내로 접종되었다. 세균 접종 후 2시간 째에, HBc147-183 (L- 또는 D-HBcARD) 또는 PBS 대조군이 각각 복강내로 투여되었다. 각 그룹은 10 마리 마우스를 포함하였다. 사망률은 세균 접종 이후 7일 동안 매일 모니터링되었다.

HBcARD 펩타이드의 잠재적인 면역원성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 펩타이드-면역화된 마우스에서 HBcARD 펩타이드의 생체 내 항균 활성을 측정하였다. 요약하면, 3주령의 수컷 마우스는 0.2 ml의 L- 및 D-HBcARD 펩타이드(5 mg/kg)로 세 번, 0일째, 3일째, 6일째에 각각 면역화되었다. 면역화된 마우스는 14일 째에 황색포도알균 ATCC 19636 (4 x 10⁶CFU/마우스)가 접종되었고, 접종 후 1시간 째에 0.2 ml의 PBS 또는 L- 및 D-HBcARD 펩타이드(10 mg/kg)가 투여되었다. 마우스의 또 다른 그룹은 대조군으로서 PBS로 동일한 과정을 수여받았다. 각각의 그룹은 5 마리의 마우스를 포함하였다. 사망률은 세균 접종 이후 7일 동안 매일 모니터링되었다.

통계학적 분석

통계학적 분석은 그래프패드 소프트웨어(Graphpad software)를 이용해 수행되었다. 결과는 평균 ± SD 로 나타내었고, 개별 그룹 사이의 차이점은 스튜던트 t 검정(student t test)을 통해 분석되었다. 생존 곡선은 카플란-마이어 방법(Kaplan-Meier method)으로 그려졌고, 로그-순위 검정(log-rank test)으로 분석되었다.

다른 구현예

본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징들은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 그러므로, 명확하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 유사한 특징의 포괄적인 시리즈의 한 가지 예시일 뿐이다.

상기 설명으로부터, 당업계의 숙련가들은 기재된 구현예의 필수적인 특징들을 손쉽게 확인할 수 있고, 이것의 사상과 범위로부터 벗어나지 않고 이의 다양한 용도와 조건으로 각색하기 위해 구현예들의 다양한 변화, 유도체, 및 변형들을 만들 수 있다. 따라서, 다른 구현예들 또한 청구범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> SHIH, Chiaho ACADEMIA SINICA <120> MODIFIED ANTIMICROBIAL PEPTIDE DERIVED FROM AN ARGININE -RICH DOMAIN <130> IPA181412-US <150> US 62/342,415 <151> 2016-05-27 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be 2-20 amino acids each selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be 2-20 amino acids each selected from arginine, lysine, and histidine <400> 1 Xaa Gly Arg Xaa Pro Xaa Xaa Pro Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <400> 2 Xaa Gly Arg Xaa Pro Xaa Xaa Pro Xaa Pro Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <400> 3 Xaa Xaa Pro Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid or absent <400> 4 Xaa Gly Arg Xaa Pro Xaa Xaa Pro Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa 1 5 10 15 Xaa Cys <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be 2 to 20 amino acids selected from arginine, lysine, and histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid or absent <400> 5 Xaa Gly Arg Xaa Pro Xaa Xaa Pro Xaa Pro Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa 1 5 10 15 Xaa Gln <210> 6 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 20 25 30 Arg Glu Ser Gln Cys 35 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Cys 20 25 <210> 8 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln 20 25 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Arg Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Gln 1 5 10 15 Pro Arg Arg Arg Arg Cys 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Cys <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Arg Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Cys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Cys 20 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Gln Pro Arg Arg Arg Arg Cys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser His His His His His 20 25 30 His <210> 15 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 His His His His His His Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Ser <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Arg Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Arg Arg Gln 1 5 10 15 Pro Arg Arg Arg Arg His His His His His His 20 25 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 His His His His His His Arg Arg Arg Gly Arg Pro Arg Arg Arg Pro 1 5 10 15 Pro Arg Arg Arg Arg Gln Pro Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Wooly monkey HepB virus <400> 18 Thr Val Val Arg Arg Arg Arg Pro Ser Gly Arg Arg Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 20 25 30 Ala Ser Ser Cys 35 <210> 19 <211> 41 <212> PRT <213> Ground squirrel HepB virus <400> 19 Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ala Arg Val Val Arg Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Pro Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys 35 40 <210> 20 <211> 42 <212> PRT <213> Woodchuck HepB virus <400> 20 Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Ala Asn Cys 35 40 <210> 21 <211> 43 <212> PRT <213> Bat HepB virus <400> 21 Thr Ile Val Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Thr Arg Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Ser Asn Cys 35 40 <210> 22 <211> 36 <212> PRT <213> Duck HepB virus <400> 22 Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro 20 25 30 Thr Pro Gln Arg 35 <210> 23 <211> 36 <212> PRT <213> Heron HepB virus <400> 23 Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Gly Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Gln Arg 35 <210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Parrot HepB virus <400> 24 Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Pro Gln Arg 35 <210> 25 <211> 36 <212> PRT <213> Ross' Goose HepB virus <400> 25 Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro 20 25 30 Thr Pro Gln Arg 35 <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Snow goose HepB virus <400> 26 Arg Lys Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Ser 20 25 30 Ser Pro Gln Arg 35 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa can be arginine, lysine, or histidine or absent <400> 27 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Cys 1 5 10

Claims

2 내지 20개의 가변성 도메인(variable domain)을 포함하고, 각각의 가변성 도메인은 2 내지 20개의 연속적인 염기성 아미노산의 서열인 항균성 펩타이드로서, 여기서 (a) 상기 가변성 도메인은 가변성 링커(linker)에 의해 서로 분리되고, (b) 상기 가변성 링커는 2개 이상의 연속적인 염기성 아미노산 이외의 1 내지 20개의 임의의 아미노산을 가질 수 있으며, (c) 상기 펩타이드는 100개 이하의 아미노산을 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 적어도 3개의 가변성 도메인을 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 C-말단 시스테인을 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 가변성 도메인 내의 염기성 아미노산의 적어도 하나가 아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 4 항에 있어서, 상기 각각의 가변성 도메인 내의 모든 염기성 아미노산이 아르기닌 잔기(residue)인 항균성 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산의 적어도 하나가 화학적으로-변형된(chemically-modified) 아미노산인 항균성 펩타이드.
제 6 항에 있어서, 상기 화학적으로-변형된 아미노산이 D-아미노산인 항균성 펩타이드.
제 7 항에 있어서, 상기 D-아미노산이 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가변성 도메인 및 가변성 링커가 헤파드나바이러스 핵심 단백질(hepadnavirus core protein; HBcARD)의 아르기닌이 풍부한(arginine-rich) 도메인으로부터 유도된 것인 항균성 펩타이드.
제 9 항에 있어서, 상기 HBcARD가 헤파드나바이러스 핵심 단백질의 147번 잔기부터 C-말단 잔기까지의 서열을 포함하는 항균성 펩타이드.
제 10 항에 있어서, 각각의 가변성 도메인이 3 내지 4개의 아르기닌 잔기를 갖고, 각각의 가변성 링커가 2 내지 4개의 아미노산을 갖는 항균성 펩타이드.
제 11 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 공통 서열(consensus sequence)을 포함하는 항균성 펩타이드:
(i) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉), 여기서 각각의 X₁, X₃, X₆, 및 X₉는, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, X₅, X_7,및 X₈은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고,
(ii) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆), 여기서 각각의 X₁, X₃, 및 X₆은, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, 및 X₅는, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고,
(iii) (X₁)X₂PX₃P(X₄)X₅QX₆P(X₇), 여기서 각각의 X₁, X₄, 및 X₇은, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₃, X₅, 및 X₆은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 부재함.
제 12 항에 있어서, 상기 펩타이드가 C-말단 시스테인을 갖는 항균성 펩타이드.
제 12 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 공통 서열을 갖는 항균성 펩타이드:
(i) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀C, 및
(ii) (X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀Q,
여기서 각각의 X₁, X₃, X₆, 및 X₉는, 개별적으로, 가변성 도메인이고, 각각의 X₂, X₄, X₅, X₇, X₈, 및 X₁₀은, 개별적으로, 임의의 아미노산이거나 부재함.
제 12 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 항균성 펩타이드:
(i) TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC, 여기서, 상기 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나가 D-아르기닌임,
(ii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC,
(iii) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ,
(iv) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC,
(v) RRRGRSPRRRTPSPRRRRC,
(vi) RRRGRPRRRPPRRRRC,
(vii) RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC, 또는
(viii) RRRPPRRRRQPRRRRC.
제 15 항에 있어서, 상기 펩타이드가 RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC의 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열 내 각각의 아르기닌 잔기가 L-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 15 항에 있어서, 상기 펩타이드가 RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC의 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열 내 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나가 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 17 항에 있어서, 상기 서열 내 각각의 아르기닌 잔기가 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 17 항에 있어서, 상기 서열이 rRrGRSPrRrTPSPrRrRSQSPrRrRSC이고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 17 항에 있어서, 상기 서열이 RrRGRSPRrRTPSPRrRrSQSPRrRrSC이고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 15 항에 있어서, 상기 펩타이드가 RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC의 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열 내 아르기닌 잔기 중의 적어도 하나가 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 15 항에 있어서, 상기 서열이 rRrGRPrRrPPrRrRQPrRrRC이고, 여기서 R은 L-아르기닌이고 r은 D-아르기닌인 항균성 펩타이드.
제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열이 펩타이드의 C-말단에 있는 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-HBcARD(non-HBcARD) 펩타이드를 추가로 포함하는 항균성 펩타이드.
제 24 항에 있어서, 상기 비-HBcARD 펩타이드가 친화성 태그(affinity tag), 신호 서열(signal sequence), 리간드, 또는 또다른 항균성 펩타이드 또는 이의 단편인 항균성 펩타이드.
제 25 항에 있어서, 상기 비-HBcARD 펩타이드가 폴리-히스티딘(poly-histidine) 또는 이의 유사체(analog)인 항균성 펩타이드.
제 26 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 갖는 항균성 펩타이드:
(i) RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH
(ii) HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS
(iii) RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH, 및
(iv) HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가변성 도메인이 라이신을 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가변성 도메인이 히스티딘을 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 고리 구조(cyclic structure)를 갖는 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 그람-양성 세균, 그람-음성 세균, 진균, 기생충, 또는 바이러스에 대하여 광범위 항균 활성을 나타내는 항균성 펩타이드.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 및 비-펩타이드 모이어티(moiety)를 포함하는, 항균성 펩타이드 접합체(conjugate).
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 항균성 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 32 항에 따른 항균성 펩타이드 접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
제 33 항 또는 제 34 항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 세균 감염(microbial infection)을 치료하는 방법.