TW201808985A

TW201808985A - 衍生自精胺酸密集區之經修飾抗菌胜肽

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Publication number: TW201808985A
Application number: TW106117731A
Authority: TW
Inventors: 施嘉和; 陳恒立; 蘇倍儀
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2018-03-16
Also published as: JP7161263B2; EP3464329A4; US20210101939A1; TWI635095B; MX2018014490A; WO2017205631A1; AU2017270201A1; SG11201809928VA; KR20190001954A; BR112018074478A2; EP3464329A1; CA3024873A1; IL263086A; CN109641938A; KR102530478B1; US20190144510A1; ZA201807763B; JP2019523220A; JP7161263B6

Abstract

一種抗菌胜肽，該胜肽包含2至20個可變區，每個可變區係為2至20個連續鹼性胺基酸序列，其中(a)該可變區經由一可變連接子而彼此分開，(b)該可變連接子除具有兩個或多個連續鹼性胺基酸外可具有1至20個任何的胺基酸，以及(c)該序列具有不超過100個胺基酸。

Description

衍生自精胺酸密集區之經修飾抗菌胜肽

本發明提供一種抗菌胜肽，特別係一種衍生自精胺酸密集區之經修飾抗菌胜肽。

抗生素已被用於治療細菌感染超過60年。近期，具抗生素抗性的細菌的數量增加已造成公共衛生的主要威脅。用於臨床治療的新抗生素的開發有急迫的需求。來自各種物種的抗菌胜肽(Antimicrobial peptides，AMPs)可作為宿主對抗病原微生物的防禦武器。因為它們可經由不同的作用方式殺死細菌，抗菌胜肽被認為是克服抗生素抗性的潛在候選方式。

本發明之一態樣，在於提供一種抗菌胜肽。該胜肽包含2至20個可變區，每個可變區係為2至20個連續鹼性胺基酸序列，其中(a)該可變區經由可變連接子而彼此分開，(b)該可變連接子除具有兩個或多個連續鹼性胺基酸外具有1至20個任何的胺基酸，以及(c)該序列具有不超過100個胺基酸。在一實施例中，該胜肽具有至少3個或4個可變區。該胜肽具有一C-端半胱胺酸(C-terminal cysteine)。在一些實施例中，在可變區中至少一個鹼性胺基酸係為一精胺酸(arginine)。例如：在該胜肽的每個可變區中所有鹼性胺基酸可為精胺酸殘基。或者或另外，在該抗菌胜肽中至少一個可變區具有一賴胺酸(lysine)。在一實施例中，至少一個可變區具有一組胺酸(histidine)。該胜肽具有一環狀結構。

在該胜肽中至少一個鹼性胺基酸可為一經化學修飾的胺基酸。在一實施例中，該經化學修飾的胺基酸係為一D-胺基酸，例如：D-精胺酸。該可變區以及該可變連接子可衍生自一肝炎病毒核心蛋白的精胺酸密集區(the arginine-rich domain of a hepadnavirus core protein，HBcARD)。在一實施例中，該HBcARD包含一肝炎病毒核心蛋白的147殘基至C-端殘基的序列。在該胜肽中每個可變區可具有3個或4個精胺酸殘基以及在該胜肽中每個可變連接子具有2至4個胺基酸。該胜肽可對一革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、寄生蟲、或病毒表現出廣效(broad spectrum)抗菌活性。

在一實施例中，該抗菌胜肽包含一選自於由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組的共同序列(consensus sequence)：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)(SEQ ID NO：1)，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、以及X₈個別係為任何的胺基酸或不存在，(ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)(SEQ ID NO：2)，其中每個X₁、X₃、以及X₆個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、以及X₅個別係為任何的胺基酸或不存在，以及(iii)(X₁)X₂PX₃P(X₄)X₅QX₆P(X₇)(SEQ ID NO：3)，其中每個X₁、X₄、以及X₇個別係為一可變區，以及每個X₂、X₃、X₅、以及X₆個別係為任何的胺基酸或不存在。每個可變區係為2至20個連續鹼性胺基酸序列。

該胜肽具有一選自於由下列(i)及(ii)所組成之群組的共同序列：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀C(SEQ ID NO：4)，以及(ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀Q(SEQ ID NO：5)，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、X₈以及X₁₀個別係為任何的胺基酸或不存在。

在一實施例中，該抗菌胜肽包含一選自於由下列(i)至(viii)所組成之群組的序列：(i)TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQ ID NO：6)，其中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸，(ii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(SEQ ID NO：7)，(iii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ(SEQ ID NO：8)，(iv)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(SEQ ID NO：9)，(v)RRRGRSPRRRTPSPRRRRC(SEQ ID NO：10)，(vi)RRRGRPRRRPPRRRRC(SEQ ID NO：11)，(vii)RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC(SEQ ID NO：12)，以及 (viii)RRRPPRRRRQPRRRRC(SEQ ID NO：13)。

例如：該抗菌胜肽可包含該RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(SEQ ID NO：7)序列，其中在該序列中每個精胺酸殘基係為L-精胺酸。或，該胜肽可具有該RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(SEQ ID NO：7)序列，其中在該序列中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸。

在一實施例中，該抗菌胜肽包含rRrGRSPrRrTPSPrRrRSQSPrRrRSC(SEQ ID NO：7)序列，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。或，該胜肽可包含RrRGRSPRrRTPSPRrRrSQSPRrRrSC(SEQ ID NO：7)序列，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。

該抗菌胜肽可包含RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(SEQ ID NO：9)序列，其中在該序列中至少一個該精胺酸殘基(如：20%、30%、40%、或50%的該精胺酸殘基)係為D-精胺酸。例如：該序列可為rRrGRPrRrPPrRrRQPrRrRC(SEQ ID NO：9)，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。

在一實施例中，該抗菌胜肽進一步包含一非-HBcARD胜肽(如：一親和力標識(affinity tag)、一訊號序列(signal sequence)、一配位體(ligand)、或另一抗菌胜肽或其中的片段)。該非-HBcARD胜肽可為一多-組胺酸(poly-histidine)或其類似物。在一實施例中，該胜肽具有一選自於由下列(i)至(iv)所組成之群組的序列：(i)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH(SEQ ID NO：14)，(ii)HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS(SEQ ID NO：15)，(iii)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH(SEQ ID NO：16)，以及(iv)HHHHHHRRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR(SEQ ID NO：17)。

本發明之另一態樣，在於提供一種抗菌胜肽複合物，其包含本發明所述之抗菌胜肽以及非-胜肽部位。

本發明之再另一態樣，在於提供一種醫藥組合物。該醫藥組合物包含該抗菌胜肽或該抗菌胜肽複合物、以及一醫藥上可接受之載體。

本發明亦提供一種治療一所需個體感染的方法。該方法包含給該個體本發明所述之一抗菌胜肽、一抗微生物胜肽複合物、或一醫藥組合物。

後附圖式以及以下說明書說明本發明一或多個實施方式，本發明實施例的其他特徵、目的和優點將由說明書及圖式、以及申請專利範圍中理解。

圖1包含兩組HBcARD區的序列比較。(A)HBcARD序列是人類(SEQ ID NO：6)、絨毛猴(SEQ ID NO：18)、地松鼠(SEQ ID NO：19)、土撥鼠(SEQ ID NO：20)以及蝙蝠(SEQ ID NO：21)中高度保留的序列。(B)四個分離自鴨(SEQ ID NO：22)、蒼鷺(SEQ ID NO：23)、鸚鵡(SEQ ID NO：24)、羅斯雁(SEQ ID NO：25)以及雪雁(SEQ ID NO：26)B型肝炎HBc中的C-端四個正電荷密集區。

圖2係為L-以及D-HBcARD胜肽之間的血清抗性的比較圖。胜肽(L-HBcARD以及D-HBcARD)與含有(A)5%胎牛血清、(B)5%小鼠血清或(C)人類血清(雄性或雌性)的MBC緩衝液(10mM磷酸鈉以及50mM氯化鈉，pH 7.2)一起在37℃下培養3小時。使用SDS-PAGE電泳以及Green Angel快速蛋白膠片染色確認胜肽的量。(D)在MBC分析中胜肽D-HBcARD表現出比L-HBcARD胜肽高10,000倍的能力。胜肽(L-HBcARD以及D-HBcARD)與金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC19636以及5%小鼠血清或未加入5%小鼠血清在37℃下培養3小時。經由菌落形成分析確認抗菌能力，***P<0.0001。

圖3係為L-以及D-HBcARD胜肽之間的溶血影響的比較圖。人類紅血球與不同濃度的胜肽一起培養。溶血以相對於Triton X-100誘導溶血的百分比表示。 ***P<0.0001。

圖4係為活體內感染金黃色葡萄球菌的小鼠敗血症模組中L-以及D-式HBcARD胜肽之間保護能力之比較圖。(A)三周大ICR小鼠接種金黃色葡萄球菌(4×10⁶CFU/小鼠)並在接種兩小時後以腹腔注射(i.p.)PBS、L-HBcARD、或D-HBcARD。每個群組有十隻小鼠。(B)以及(C)三周大ICR小鼠分別在第0、3及6天以L-以及D-HBcARD胜肽(5mg/kg)進行接種注射。在第14天時，該小鼠接種金黃色葡萄球菌(4×10⁶CFU/小鼠)並在接種1小時後分別以腹腔注射(i.p.)PBS、L-HBcARD或D-HBcARD(10mg/kg)。小鼠的另一群組同時以PBS治療作為控制組。每個群組的動物有五隻小鼠。*P<0.05；***P<0.0001；ns，無顯著性。

圖5係為活體內ICR小鼠敗血症模組中給予不同劑量經修飾的各種HBcARD胜肽的保護能力圖形。

圖6係為活體內BALB/c小鼠肺部感染模組中150-177C以及150-177Q胜肽的的保護能力圖形。抗克痢黴素鮑曼不動桿菌(colistin-resistant A.baumannii)係經由氣管內接種之途徑接種。

圖7係為活體內D-150-177C之HBcARD胜肽比以多黏菌素(polymyxin)B的毒性低之圖形。在第0天，雄性ICR小鼠(5隻小鼠/群組)分別以不同劑量的D-150-177C胜肽(20-80mg/kg)以及多黏菌素B(50mg/kg)腹腔(ip.)注射。(A)監控所有群組的存活率7天。(B)在第1天確認以D-150-177C及多黏菌素B治療的小鼠收集血清樣本中的丙胺酸胺基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性。實線表示ICR小鼠(查爾斯河實驗室)的ALT值(45U/L)的平均值。

圖8係為活體內小鼠敗血症模組中以所有D-精胺酸或部分D-精胺酸取代的150-177C胜肽的保護能力之圖形。在接種兩小時後，該小鼠(n=10/群組)分別以5mg/kg的各種胜肽D-、DL-、LD-150-177C、以及PBS治療。胜肽D-以及DL-150-177C保護所有感染金黃色葡萄球菌的小鼠免於死亡，而胜肽LD-150-177C僅保護80%小鼠。

圖9係為活體內小鼠敗血症模組中在不同劑量下胜肽L-150-177C的絲胺酸以及蘇胺酸殘基缺失可改善保護能力之圖形。

本發明意外發現衍生自HBV核心蛋白的精胺酸密集區的某些經修飾的胜肽表現出廣效(broad spectrum)抗菌活性。

本發明所述之抗菌胜肽。其包含至少兩個(如：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)可變區。該可變區是前後排列以及經由一可變連接子而彼此分開。該抗菌胜肽可具有100個胺基酸的最大長度(如：小於10、10、14、15、20、21、22、25、28、30、35、37、40、45、47、50、55、57、60、65、70、75、80、85、90、95、或100個胺基酸)。在一實施例中，該胜肽具有一C-端半胱胺酸(C-terminal cysteine)。

每個該可變區個別係為至少兩個(如：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)連續鹼性胺基酸，如：精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)、以及賴胺酸(lysine)。每個可變區可包含一相同的鹼性胺基酸或不同的鹼性胺基酸序列。例如：該抗菌胜肽可包含2至20個相同或不同的可變區，每個係為X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀(SEQ ID NO：27)，其中每個X₁-X₂₀個別係為精胺酸、組胺酸或賴胺酸(天然的或經化學修飾的)以及X₃-X₂₀可為任何存在胺基酸或不存在。例如：每個可變區可具有2至10個鹼性胺基酸。

在一實施例中，在該胜肽中至少一可變區僅包含精胺酸殘基。在另一實施例中，在該胜肽中所有該可變區只包含精胺酸殘基。或，該胜肽可包含至少一具有一個或多個組胺酸或賴胺酸殘基的可變區。

每個可變連接子具有至少一胺基酸(如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)以及可包含任何胺基酸。其不能具有兩個或多個連續鹼性胺基酸。

「胺基酸」用語為任何20個標準胺基酸(如：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、穀胺醯胺、谷胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸)。該用語亦可為非標準、非蛋白質原(non-proteinogenic)、或經化學修飾的胺基酸、或胺基酸類似物。胺基酸可在L-或D-式的立體異構體(stereoisomer)。

「鹼性胺基酸」用語為精胺酸、賴胺酸、或組胺酸、其L-或D-式、或其類似物。

非標準胺基酸包含硒代半胱胺酸(selenocysteine)、吡咯賴胺酸(pyrrolysine)、N-甲醯甲硫胺酸(N-formylmethionine)、非蛋白質原胺基酸、胺基酸類似物和經化學修飾的胺基酸。經化學修飾的胺基酸或胺基酸類似物通常具有與其天然存在的對應物不同的側鏈。胺基酸類似物和將其併入至多肽的方法是本領域已知的。參閱如：Nguyen et al.、Biochemica et Biophysica Acta 1808(2011),2297-2303、Knappe,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 54(9)2010,4003-4005、US7879979、US5972940、US8835162、以及US20080199964。胺基酸類似物亦為商業上可購買的。胺基酸類似物可併入至該抗菌胜肽以改善其穩定性、生物上可利用性、藥物動力學、組織分佈、安全性、耐受性、及/或功效。

本發明所述之任何該抗菌胜肽可包含一個或多個非為二十個標準胺基酸之一個的殘基。特別是，在該可變區的鹼性胺基酸的一個或多個(如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2%、3%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%)或在整個該抗菌胜肽可為D-式天然的精胺酸、賴胺酸、或組胺酸、或天然精胺酸、賴胺酸、或組胺酸的類似物。

該抗菌胜肽可為衍生自一肝炎病毒核心蛋白的精胺酸密集區(the arginine-rich domain of a hepadnavirus core protein，HBcARD)。HBcARD係為核心蛋白的高度保留精胺酸密集C-端區(HBc)。參閱，圖1。HBc可為哺乳類HBc或禽類HBc。哺乳類HBc可為人類HBc、絨毛猴(woolly monkey)HBc、地松鼠(ground squirrel)HBc、土撥鼠HBc、以及蝙蝠HBc。禽類HBc可為鴨、蒼鷺、鸚鵡、羅斯雁(Ross’s goose)、或雪雁(snow goose)的HBc。HBc可以來自任何基因型的肝炎病毒。

例如：該抗菌病毒可包含HBcARD的片段或其變體(如：包含一個或多個胺基酸取代、缺失、或插入)。該可變區以及該連接子可衍生自HBcARD。例如：在HBcARD或其變體的任兩個精胺酸重複之間的序列可作為連接子。

在一實施例中，該抗菌胜肽包含一選自於由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組的共同序列：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)(SEQ ID NO：1)，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、以及X₈個別係為任何的胺基酸或不存在，(ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)(SEQ ID NO：2)，其中每個X₁、X₃、以及X₆個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、以及X₅個別係為任何的胺基酸或不存在，以及(iii)(X₁)X₂PX₃P(X₄)X₅QX₆P(X₇)(SEQ ID NO：3)，其中每個X₁、X₄、以及X₇個別係為一可變區，以及每個X₂、X₃、X₅、以及X₆個別係為任何的胺基酸或不存在。每個可變區係為2至20個連續鹼性胺基酸序列。

該胜肽具有一選自於由下列(i)及(ii)所組成之群組的共同序列：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀C(SEQ ID NO：4)，以及 (ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀Q(SEQ ID NO：5)，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、X₈以及X₁₀個別係為任何的胺基酸或不存在。

該抗菌胜肽可為進一步包含非-HBcARD胜肽的融合(fusion)或嵌合(chimeric)的胜肽。非-HBcARD胜肽非衍生自任何HBcARD以及非包含至少兩個經由連接本發明所述之連接子的可變區。非-HBcARD胜肽可為衍生自另一來源的胜肽(如：來自蛋白質而非HBcARD)、工程的胜肽(如：另一抗菌胜肽)、親和力標識(affinity tag)(如：FLAG、多-His、Myc、HA、CBP、HBH、或V5標識)、訊號序列(signal sequence)(如：前導序列(leader sequence)或定位訊號(localization signal))、或配位體(ligand)(如：受器配位體(receptor ligand))。

例如：該抗菌胜肽可具有高達100個胺基酸並包含一選自於由下列(i)至(xii)所組成之群組的序列：

(i)TVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQ ID NO：6)，其中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸，

(ii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC(SEQ ID NO：7)，

(iii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ(SEQ ID NO：8)，

(iv)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC(SEQ ID NO：9)，

(v)RRRGRSPRRRTPSPRRRRC(SEQ ID NO：10)，

(vi)RRRGRPRRRPPRRRRC(SEQ ID NO：11)，

(vii)RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC(SEQ ID NO：12)，

(viii)RRRPPRRRRQPRRRRC(SEQ ID NO：13)。

(ix)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH(SEQ ID NO：14)，

(x)HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS(SEQ ID NO：15)，

(xi)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH(SEQ ID NO：16)，以及

(xii)HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR(SEQ ID NO：17)。

如本發明所述，該抗菌胜肽可具有一個或多個經修飾胺基酸。例如：在任何上述序列或共同序列中，在該可變區或在整個該抗菌胜肽中一個或多個鹼性胺基酸可為D-式天然的精胺酸、賴胺酸、或組胺酸、或自然的精胺酸、賴胺酸、或組胺酸類似物。

在任何上述序列或共同序列可為在該抗菌胜肽的N-或C-端。

本發明所述之抗菌胜肽亦可連接至N-或C-端的非-胜肽部位(moiety)以形成一胜肽複合物。非-胜肽部位可為聚合物(如：聚乙二醇聚合物(polyethylene glycol polymer))、寡糖、脂質、醣脂、固體支持物(例如：珠粒或奈米顆粒)、小分子藥物、生物素、核酸分子、抗體、維生素、載體蛋白質(例如：KLH、BSA、或OVA)或可檢測標記(例如：螢光、放射性、或酶標記)。該胜肽複合物亦表現抗菌活性。產生胜肽複合物的方法為本發明技術領域中已知的方法。

本發明所述之抗菌胜肽或胜肽複合物可與一醫藥上可接受之載體混合以形成一醫藥組合物。

該組合物可與例如是磷酸鹽緩衝鹽水、碳酸氫鹽溶液、以及/或佐劑的醫藥上可接受之載體一起配製。其所使用的合適的藥物載體以及稀釋液、以及醫藥必需品是本發明技術領域中已知的方法。該組合物可配製為可注射的、液體溶液、乳狀液、或另一合適的製劑。

本發明所述之該組合物的有效劑量可經由鼻內吸入、局部給予、或非腸道途徑給予，例如：靜脈內注射、皮下注射或肌內注射。或，使用所需其他包含栓劑以及口服製劑的其他給予方式。就栓劑而言，可包含黏合劑以及載體，例如：聚亞烷基二醇(polyalkalene glycols)或甘油三酸酯(triglycerides)。口服製劑可包含通常使用的例如是醫藥級的糖精、纖維素、碳酸鎂或其類似物之賦形劑。這些組合物以溶液、懸浮液、錠劑、片劑、膠囊、緩釋製劑或粉劑的形式。

上述組合物可給予至一個體(例如：人類、另一哺乳類、或實驗動物)以治療該個體微生物感染或以抑制該個體的微生物生長。該組合物可使用以治療由革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌、真菌、寄生蟲或病毒引起的感染，如：綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium Difficile)、假絲酵母(Candida)、曲黴菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、新隱球菌(Cryptococcus neoformans)、新型隱球菌(Cryptococcus gattii)、球孢子菌(Coccidioides)、組織胞漿菌(Histoplasma)、肺囊蟲(Pneumocystis jirovecii)、癬菌(ringworm)、孢子絲菌(Sporothrix)、突臍孢菌(Exserohilum)或枝孢菌屬(Cladosporium)。

以下具體內容將被解釋為僅是說明性質，而非以任何方式限制本文的其餘部分。未進一步的闡述，相信本領域技術中熟悉技藝人士可以基於本文的描述，利用本文至最大範圍。本文引述的所有出版物經由引用整體併入本文中。

衍生自人類HBcARD的修飾的抗菌胜肽

先前定義的來自人類B型肝炎病毒(HBV)核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)之精胺酸密集區(ARD)的新穎的抗菌胜肽。參閱Chen et al.(2013),PLoS Pathog 9：e1003425 doi：10.1371/journal.ppat.1003425、以及Chen et al.,(2016),Appl Microbiol Biotechnol.100(21)：9125-9132。該HBcARD胜肽表現出對革蘭氏陽性細菌以及革蘭氏陰性細菌表現出廣效(broad spectrum)抗菌活性。在本發明之敗血症模組中，接種後2小時注射HBcARD胜肽可保護40%感染金黃色葡萄球菌的小鼠免於死亡。參閱See Chen et al.(2013)。

該HBcARD胜肽在不同物種的肝炎病毒中是高度保留的。為改善該HBcARD的抗菌功效，本發明比較哺乳類、囓齒類和禽類肝炎病毒的各種HBcARD胜肽的序列及抗菌活性。人類肝炎病毒的HBcARD胜肽表現出最強的抗菌活性。

為進一步改善先導化合物的效力，本發明測試幾種HBcARD衍生物的各自抗菌活性，包含經由截斷修飾的胜肽以及以D-精胺酸取代L-精胺酸。參閱表一。

比較人類及非人類HBcARD胜肽的序列及抗菌活性

經由多重序列比對，本發明比較各種肝炎病毒的HBcARD胜肽的序列，包含：人類(AAP31571.1)、絨毛猴(AAO74859.1)、地松鼠(AAB08031.1)、土撥鼠(AAA46761.1)、蝙蝠(AGT17576.1)、鴨(AAO49490.1)、蒼鷺(AAA45737.1)、鸚鵡(AFY97786.1)、羅斯雁(AAR89928.1)以及雪雁(AAD22001.1)。參閱圖1。與人類肝炎病毒的HBcARD胜肽類似，其他哺乳類肝炎病毒的HBcARD胜肽(絨毛猴、地松鼠、土撥鼠以及蝙蝠)包含四個聚集的精胺酸密集區。雖然禽類及哺乳類肝炎病毒的HBcARD同源序列較少，但它們都包含四個高度正電荷的結構區。為比較其各自的抗菌活性，本發明確定衍生自蝙蝠、絨毛猴、鴨及蒼鷺肝炎病毒的四個HBcARD的最小殺菌濃度。結果顯示衍生自蝙蝠以及絨毛猴肝炎病毒的胜肽表現出與人類B型肝炎病毒相當的抗菌活性。參閱表二。相反地，衍生自禽類肝炎病毒的胜肽表現出較低的抗菌活性。因為來自人類HBV的HBcARD胜肽在長度上較短(147-183；37個胺基酸)，本發明在之後的修飾及優化的實驗中著眼於該胜肽。

比較L-以及D-HBcARD胜肽的抗菌活性

本發明使用PeptideCutter分析軟體預測在HBcARD 147-183(37-mer)胜肽上的潛在蛋白酶切割位點。該結果顯示超過70%的蛋白酶切割位點反應至HBcARD胜肽的精胺酸殘基(結果未顯示)。未改善該胜肽在血清中的穩定性，本發明合成經修飾胺基酸，經由D-胺基酸取代的D-HBcARD 147-183胜肽，其所有精胺酸殘基被D-異構體取代。

為了研究D-精胺酸取代是否會改善抗菌活性，L-以及D-HBcARD胜肽(37-mer)與多種細菌一起測試，包含：綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)、肺炎克雷伯桿菌(K.pneumoniae)、鮑曼不動桿菌(A.baumannii)、大腸桿菌(E.coli)、痢疾桿菌(S.dysenteriae)以及金黃色葡萄球菌(S.aureus)。比較L-HBcARD以及D-HBcARD對鮑曼不動桿菌(A.baumannii)(MBC=2.3-4.6mg/L)相似的抗菌活性、以及對綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)(MBC=4.6mg/L)、肺炎克雷伯桿菌(K.pneumoniae)(MBC=4.6mg/L)以及金黃色葡萄球菌(S.aureus)(MBC=4.6-9.2mg/L)較佳的抗菌活性。然而，仍不清楚原因為何，D-HBcARD胜肽對大腸桿菌以及痢疾桿菌的抗菌活性是從18.4下降至73.6mg/L。參閱表三。

^aATCC：美國典型培養物保藏中心^b抗克痢黴素A.baumannii(實驗室誘導以及從慈濟總醫院分離Chen et al.PLoS Pathog.2013；9(6)：e1003425)c Caliper Life Sciences公司

L-HBcARD以及D-HBcARD血清抗性的比較。

為比較37-mer的L-以及D-HBcARD對抗血清蛋白酶分解的穩定性，本發明進行蛋白酶抗性分析。以5%胎牛血清在37℃下培養3小時之後，經由SDS-PAGE的Green Angel快速蛋白膠片染色超過80%的L-HBcARD胜肽不能再被檢測到。相反地，D-HBcARD胜肽的訊號強度在相同的條件下不會減少。參閱圖2的A，當L-HBcARD與5%小鼠或人類(雄性或雌性)的血清培養，會獲得類似的結果。參閱圖2的B及C。該結果建議D-HBcARD比L-HBcARD更能抵抗胎牛、小鼠及人類血清的蛋白酶分解。

更進一步地，本發明確認L-以及D-HBcARD胜肽在血清存在時活體外(in vitro)的抗菌活性。該結果顯示在MBC分析中L-HBcARD以及D-HBcARD胜肽兩者在18.4mg/L濃度下能殺死金黃色葡萄球菌(S.aureus)。參閱圖2的D，加入5%小鼠血清後，L-以及D-HBcARD胜肽之間的抗菌活性明顯不同(P<0.0001)。雖然在5%小鼠血清存在時以L-HBcARD胜肽處理會產生10⁷個細菌菌落，以D-HBcARD胜肽處理會產生約10³個細菌菌落。因此，在5%小鼠血清存在時本發明之D-HBcARD胜肽比L-HBcARD胜肽表現出較高的抗菌活性。該發結果顯示D-HBcARD較為穩定且對抗蛋白水解分解。

D-HBcARD胜肽的溶血活性(hemolytic acitvity)

在溶血分析中，人類RBCs與連續稀釋劑量(0至460mg/L)的D-HBcARD、L-HBcARD、或蜂毒素在37℃下培養1小時。如圖3所示，蜂毒素在8.9mg/L的濃度下會引起100%溶血。相反地，在高達460mg/L的D-HBcARD以及L-HBcARD胜肽下，兩者且檢測不到溶血活性(P<0.0001)。

感染金黃色葡萄球菌的小鼠敗血症模組中L-以及D-式HBcARD胜肽之間活體內(in vivo)的保護功效之比較

為研究在活體內(in vivo)37-mer的L-以及D-HBcARD胜肽的保護功效，本發明進行感染金黃色葡萄球菌(S.aureus)的小鼠敗血症模組。ICR小鼠首先腹腔注射(i.p.)接種(4×10⁶CFU/小鼠)金黃色葡萄球菌，接著在接種兩小時後個別單一注射L-HBcARD、D-HBcARD以及PBS。所有給予PBS的小鼠(n=10)在第一天死亡。參閱圖4的A。在接種7天後，40%的小鼠以L-HBcARD(10mg/kg)治療後存活。參閱圖4的A。相反地，D-HBcARD胜肽能達到較高的存活率(5mg/kg劑量達60%，以及10mg/kg劑量達100%HBcARD)。參閱圖4的A。結果顯示在活體內以D-精胺酸替代的策略可改善HBcARD的效果。

感染金黃色葡萄球菌的小鼠敗血症模組中L-以及D-式HBcARD胜肽之間的免疫原性之比較

為研究在動物活體內重複治療是否會誘導出中和HBcARD胜肽的抗體，本發明在細菌感染前分別給予3周大的小鼠注射了三次L-以及D-HBcARD胜肽。第一次注射後兩周，接種金黃色葡萄球菌(S.aureus)至小鼠，在細菌接種後1小時，以L-或D-HBcARD胜肽經由腹腔注射(i.p.)。與本發明先前的結果一致(Chen et al.,2013)，無論小鼠先前是否曾經注射過L-HBcARD，L-HBcARD仍然能保護所有小鼠免於死亡。參閱圖4的B。以PBS注射以及以PBS治療的控制組小鼠在給予細菌攻擊後24小時內的死亡率接近80%(P<0.05)。同樣的，在細菌接種後7天，所有以D-HBcARD(10mg/kg)治療的小鼠均在細菌攻擊後存活，無論先前是否曾注射過D-HBcARD。參閱圖4的C。因此，無論先前是否曾使用D-式或L-式的胜肽注射過，對於HBcARD胜肽治療效果沒有影響。

末端半胱胺酸的重要性

本發明測試其他HBcARD衍生物的抗菌活性。參閱表一。該些胜肽的抗菌活性經由最小殺菌濃度(MBC)確認。與原來親代(parental)胜肽HBcARD 147-183(37-mer)不同(參閱Chen et al.,2013)，該衍生的胜肽HBcARD 150-177Q(28-mer)顯示未檢測出抗金黃色葡萄球菌(S.aureus)。參閱表四。為模擬在羧基末端具有半胱胺酸的親代胜肽HBcARD 147-183，本發明經由HBcARD 150-177Q末端Q(穀胺醯胺)殘基以C(半胱胺酸)代替而設計出另一個28-mer衍生自 HBcARD 150-177C。參閱表一。有趣的是，該Q以C取代的胜肽對金黃色葡萄球菌是有殺菌活性的。參閱表四。

長度或精胺酸含量的重要性

基於末端半胱胺酸顯示對殺菌活性的重要性的事實，本發明尋求是否可進一步減少HBcARD 105-177C胜肽(28-mer)的總長度。本發明比較在150-177C(20-mer)、157-177C(21-mer)以及164-177C(14-mer)胜肽中對抗金黃色葡萄球菌的能力。如表四所示，沒有胜肽顯示可檢測出活性。結果表示具有減少精胺酸數目的短胜肽顯示對金黃色葡萄球菌不具有抗菌能力，參閱表四。另一方面，本發明已顯示出含有3個可變區的較短胜肽足以殺死其他細菌(數據未顯示)。

在敗血症小鼠中28-mer的胜肽D-150-177C會改善保護功效

本發明比較活體內含有D-式或L-式的精胺酸的HBcARD 150-177C胜肽(28-mer)的保護能力。參閱表一以及圖5。ICR小鼠(n=10/群組)腹腔注射(i.p.)接種金黃色葡萄球菌ATCC19636(4×10⁶/小鼠)，接著在接種兩小時後注射經修飾的胜肽。所有給予PBS的小鼠在第一天死亡，且只有20%以控制組胜肽(150-177Q)治療的小鼠存活。給予5以及10mg/kg劑量的L-150-177C胜肽分別保護30%以及70%的老鼠免於死亡。參閱圖5。當以5mg/kg劑量的D-150-177C治療時，所有小鼠(100%)存活。

28-mer的胜肽D-150-177C保護小鼠不受抗克痢黴素鮑曼不動桿菌(colistin-resistant A.baumannii)感染肺部

BALB/c小鼠(n=8/群組)以抗克痢黴素鮑曼不動桿菌TCGH 43709(3.4×10⁸CFU/小鼠)進行氣管接種。該肺部感染的小鼠分別以腹腔注射(i.p.)克痢黴素(5mg/kg/day)或D-150-177C(5以及10mg/kg/day)。所有以克痢黴素治療的小鼠在接種抗藥物克痢黴素60小時後死亡。參閱圖6。相反地，D-150-177C具有劑量依賴性的保護作用。當10mg/kg/day的D-150-177C胜肽治療該小鼠時可觀察到顯著不同(p<0.05)。參閱圖6。

活體內胜肽D-150-177C以及多黏菌素(polymyxin)B毒素的比較

使用小鼠敗血症模組，本發明檢測以28-mer D-150-177C胜肽(20至80mg/kg體重)以及多黏菌素B(與克痢黴素有關之化合物)(50mg/kg體重)腹膜內(i.p.)注射ICR小鼠的存活率。參閱圖7的A。所有以多黏菌素B(50mg/kg)治療的小鼠在第一天死亡，如所預期的克痢黴素和多黏菌素B對腎臟具有眾所皆知的腎毒性。參閱圖7的A。相反地，以20以及40mg/kg D-150-177C治療的小鼠沒有觀察到急性毒性。參閱圖7的A。當增加劑量至60以及80mg/kg時，小鼠的存活率分別降低至80%以及40%。參閱圖7的A。經由血清ALT含量檢測肝損傷，以D-150-177C治療比以多黏菌素B治療的小鼠在20至40mg/kg的劑量範圍時顯示較高的ALT含量，但p值不顯著。參閱圖7的B。以60mg/kg治療的小鼠ALT含量明顯高於以20mg/kg多黏菌素B治療的小鼠(p<0.01)。參閱圖7的B。

活體內各種經修飾150-177C胜肽之保護能力的比較

28-mer D-150-177C胜肽含有所有14個L-精胺酸被14個D-精胺酸取代。參閱表一以及圖6。D-精胺酸的成本遠高於L-精胺酸。為減少胜肽合成的成本，本發明比較活體內含有全部的或部分的D-精胺酸取代的胜肽之間的保護能力。參閱表一以及圖8。胜肽DL-150-177C僅為部分D-精胺酸取代，且對全部D-精胺酸取代的D-150-177C(100%取代)表現出非常類似的保護能力。參閱圖8。相反地，胜肽LD-150-177C(亦為部分取代)的保護能力似乎小於DL-150-177C。參閱圖8。

絲胺酸(serine)以及蘇胺酸(threonine)是非必要的

本發明設計一個新的22-mer胜肽，DL-dST-150-177C(參閱表一)，其具有兩個主要修飾部分：(1)部分的D-精胺酸取代的胜肽DL-150-177C主鏈；以及(2)從親代28-mer胜肽DL-150-177C的5個絲胺酸及1個蘇胺酸殘基缺失。22-mer胜肽DL-dST-150-177C相較於28-mer DL-150-177C以及L-150-177C顯示出改善的保護能力。參閱圖9。

菌株分離

利用多種菌出測試HBcARD胜肽的抗菌活性，包含：綠膿假單胞菌假單胞菌屬(Pseudomonas aeruginosa Migula)菌株(ATCC 27853、抗胺芣青黴素以及ATCC 9027、抗胺芣青黴素)、肺炎克雷伯桿菌菌株(ATCC 13884)、痢疾桿菌Xen27(Caliper Co.)、大腸桿菌菌株(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌亞種菌株(ATCC 25923、抗耐甲氧西林，ATCC 29213、抗耐甲氧西林以及ATCC 19636、抗耐甲氧西林)以及鮑曼不動桿菌菌株(ATCC 17978、ATCC 17978 CR、ATCC19606、ATCC 19606 CR、TCGH 45530以及TCGH 46709)。從台灣佛教慈濟綜合醫院(TCGH)分離TCGH 45530以及TCGH 46709，以及使用Vitek系統(Biomerieux Vitek公司，美國)鑑定。參閱Chang et al.(2012),J Microbiol Immunol Infect 45：37-42 doi：10.1016/j.jmii.2011.09.019。

抗菌分析

L-及D-HBcARD胜肽從曜鴻生物科技有限公司(臺北，台灣)購買。如所述的方法確認抗菌活性。參閱Chen et al.,2013。簡而言之，在MH液態培養基(Difco公司)生長的細菌在37℃下至中間對數期，以及在磷酸鹽緩衝液(10mM磷酸鈉以及50mM氯化鈉，pH7.2)中稀釋至10⁶CFU(菌落形成單位)/mL。在相同緩衝液中將胜肽連續稀釋。五十微升(μL)的細菌與五十μL不同濃度的胜肽混合，接著在37℃沒有震盪下培養3小時。在培養結束時，將細菌接種於Mueller-Hinton瓊脂培養基上，在37℃下生長隔夜以測量最小殺菌濃度(MBC)。最小胜肽濃度表示以MBC定義為沒有細菌生長(零菌落)。所有的胜肽以三重複進行測試。

蛋白酶穩定性

L-及D-HBcARD胜肽(0.5nmol)與MBC緩衝液在含有5%胎牛、小鼠以及人類的血清或不含血清混合。在37℃下培養3小時後，使用SDS-PAGE電泳以及Green Angel快速蛋白膠片染色確認蛋白酶分解下存活的胜肽的量。使用影像J軟體定量該影像以及以不含血清的控制組對強度進行標準化。每個MBC濃度下與金黃色葡萄球菌ATCC19636菌株(10⁶CFU/mL)一起在37℃下培養3小時，以研究血清對HBcARD胜肽、L-以及D-HBcARD胜肽的抗菌活性之影響。將菌株接種於MH瓊脂培養基上以菌落形成確認抗菌活性。

溶血活性

經由對人類紅血球細胞(hRBCs)抗溶血確認胜肽的溶血活性。經由含有EDTA的採血管中獲得的人類血液以450g離心10分鐘。用PBS緩衝液清洗沉澱物三次，製備10% hRBCs溶液。hRBCs溶液與PBS緩衝液連續稀釋的胜肽混合，以及反應混合物在37℃下培養1小時。以450g離心10分鐘之後，經由在405nm的波長下測量上清液的吸光值確認溶血的百分比。分別在PBS緩衝液以及含有1%的Triton X-100時確認空白組及100%的溶血。

活體內動物研究

從樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO公司，台灣)購買三周大ICR小鼠(19至21g)。為測試HBcARD胜肽在活體內的保護能力，所有小鼠腹膜內接種金黃色葡萄球菌ATCC 19636(4×10⁶CFU/小鼠)。在細菌接種2小時之後，分別腹膜內給予HBc147-183(L-或D-HBcARD)或PBS控制組。每個群組包含10隻小鼠。細菌接種7天後每天監控死亡率。

為研究HBcARD胜肽的免疫力，本發明在胜肽-免疫小鼠中確認活體內HBcARD胜肽的抗菌活性。簡而言之，三周大的雄性小鼠分別在第0、3及6天以0.2ml的L-以及D-HBcARD胜肽(5mg/kg)進行接種注射。在第14天時，該小鼠接種金黃色葡萄球菌ATCC 19636(4×10⁶CFU/小鼠)並在接種1小時後分別給予PBS、或L-HBcARD以及D-HBcARD胜肽(10mg/kg)。另一個小鼠群組以相同方式給予PBS做為控制組。每個群組包含5隻小鼠。細菌接種7天後監控死亡率。

統計分析

使用Graphpad軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。存活曲線以Kaplan-Meier方法繪製並以等級檢定(log-rank test)分析。

其他實施例

本說明書揭露之所有特徵可以任意組合方式結合。說明書中所揭露的每一特徵可取代為其他具有相同、等效或相似目的的特徵。據此，除非有其他明確闡述，在此所揭露之各個特徵僅為上位系列之等效或相似特徵之實施例。

根據上述內容，該領域熟習此技藝人士可輕易地確認本發明之必要特徵，且未脫離本發明保護範圍及精神，可對本發明作不同變化及修飾以用於不同用途及條件。據此，其它實施例亦在本發明請求保護範圍中。

<110> 中央研究院

<120> 衍生自精胺酸密集區之經修飾抗菌胜肽

<130> 106B0248-I1

<150> US 62/342,415

<151> 2016-05-27

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、以及組胺酸的2至20個胺基酸

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<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<213> 人工序列

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<223> 合成胜肽

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<213> 人工序列

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<223> 合成胜肽

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<223> Xaa可為任何胺基酸或不存在

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<212> PRT

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<400> 14

<210> 15

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<400> 15

<210> 16

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<400> 16

<210> 17

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<400> 17

<210> 18

<211> 36

<212> PRT

<213> 絨毛猴HepB病毒

<400> 18

<210> 19

<211> 41

<212> PRT

<213> 地松鼠HepB病毒

<400> 19

<210> 20

<211> 42

<212> PRT

<213> 土撥鼠HepB病毒

<400> 20

<210> 21

<211> 43

<212> PRT

<213> 蝙蝠HepB病毒

<400> 21

<210> 22

<211> 36

<212> PRT

<213> 鴨HepB病毒

<400> 22

<210> 23

<211> 36

<212> PRT

<213> 蒼鷺HepB病毒

<400> 23

<210> 24

<211> 36

<212> PRT

<213> 鸚鵡HepB病毒

<400> 24

<210> 25

<211> 36

<212> PRT

<213> 羅斯雁HepB病毒

<400> 25

<210> 26

<211> 36

<212> PRT

<213> 雪雁HepB病毒

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸或組胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸或組胺酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> Xaa可為選自於精胺酸、賴胺酸、或組胺酸或不存在

<400> 27

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成胜肽

<400> 28

Claims

一種抗菌胜肽，該胜肽包含2至20個可變區，每個可變區係為2至20個連續鹼性胺基酸序列，其中(a)該可變區經由一可變連接子而彼此分開，(b)該可變連接子除具有兩個或多個連續鹼性胺基酸外具有1至20個任何的胺基酸，以及(c)該胜肽具有不超過100個胺基酸。
如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽具有至少3個可變區。
如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽具有一C-端半胱胺酸(C-terminal cysteine)。
如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，其中在該可變區中至少一個鹼性胺基酸係為一精胺酸(arginine)。
如申請專利範圍第4項所述之抗菌胜肽，其中在該每個可變區中所有鹼性胺基酸係為精胺酸殘基。
如申請專利範圍第1項所述之抗菌胜肽，其中至少一個鹼性胺基酸係為一經化學修飾的胺基酸。
如申請專利範圍第6項所述之抗菌胜肽，其中該經化學修飾的胺基酸係為一D-胺基酸。
如申請專利範圍第7項所述之抗菌胜肽，其中該D-胺基酸係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之抗菌胜肽，其中該可變區以及該可變連接子係衍生自一肝炎病毒核心蛋白的精胺酸密集區(the arginine-rich domain of a hepadnavirus core protein，HBcARD)。
如申請專利範圍第9項所述之抗菌胜肽，其中該HBcARD包含一肝炎病毒核心蛋白的一147殘基至C-端殘基的序列。
如申請專利範圍第10項所述之抗菌胜肽，其中該每個可變區具有3個或4個精胺酸殘基以及每個可變連接子具有2至4個胺基酸。
如申請專利範圍第11項所述之胜肽，其中該胜肽包含一選自於由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組的共同序列(consensus sequence)：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、以及X₈個別係為任何的胺基酸或不存在，(ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₃P(X₆)，其中每個X₁、X₃、以及X₆個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、以及X₅個別係為任何的胺基酸或不存在，以及(iii)(X₁)X₂PX₃P(X₄)X₅QX₆P(X₇)，其中每個X₁、X₄、以及X₇個別係為一可變區，以及每個X₂、X₃、X₅、以及X₆個別係為任何的胺基酸或不存在。
如申請專利範圍第12項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽具有一C-端半胱胺酸。
如申請專利範圍第12項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽具有一選自於由下列(i)及(ii)所組成之群組的共同序列：(i)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀C，以及(ii)(X₁)GRX₂P(X₃)X₄PX₅P(X₆)X₇QX₈P(X₉)X₁₀Q，其中每個X₁、X₃、X₆、以及X₉個別係為一可變區，以及每個X₂、X₄、X₅、X₇、X₈以及X₁₀個別係為任何的胺基酸或不存在。
如申請專利範圍第12項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽包含一選自於由下列(i)至(viii)所組成之群組的序列：(i)TVVRRRGRSPPRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC，其中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸，(ii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC，(iii)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ，(iv)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC，(v)RRRGRSPRRRTPSPRRRRC，(vi)RRRGRPRRRPPRRRRC，(vii)RRRTPSPRRRRSQSPRRRRC，或(viii)RRRPPRRRRQPRRRRC。
如申請專利範圍第15項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽包含該RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC序列，其中在該序列中每個精胺酸殘基係為L-精胺酸。
如申請專利範圍第15項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽包含該RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSC序列，其中在該序列中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第17項所述之抗菌胜肽，其中該序列中每個該精胺酸殘基係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第17項所述之抗菌胜肽，其中該序列係為rRrGRSPrRrTPSPrRrRSQSPrRrRSC，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第17項所述之抗菌胜肽，其中該序列係為RrRGRSPRrRTPSPRrRrSQSPRrRrSC，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第15項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽包含該RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRC序列，其中在該序列中至少一個該精胺酸殘基係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第15項所述之抗菌胜肽，其中該序列係為rRrGRPrRrPPrRrRQPrRrRC，其中R係為L-精胺酸以及r係為D-精胺酸。
如申請專利範圍第15項至第22項中之任一項所述之抗菌胜肽，其中該序列係為在該胜肽的C-端。
如申請專利範圍第1項至第23項中之任一項所述之抗菌胜肽，進一步包含一非-HBcARD胜肽。
如申請專利範圍第24項所述之抗菌胜肽，其中非-HBcARD胜肽係為一親和力標識(affinity tag)、一訊號序列(signal sequence)、一配位體(ligand)、或另一抗菌胜肽或其中的片段。
如申請專利範圍第25項所述之抗菌胜肽，其中該非-HBcARD胜肽係為一多-組胺酸(poly-histidine)或其類似物。
如申請專利範圍第26項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽具有一選自於由下列(i)至(iv)所組成之群組的序列：(i)RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSHHHHHH，(ii)HHHHHHRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS，(iii)RRRGRPRRRPPRRRRQPRRRRHHHHHH，以及(iv)HHHHHHRRRGRPRRRPPRRRRQPRRRR。
如申請專利範圍第1項至第4項中之任一項所述之抗菌胜肽，其中至少一個可變區具有一賴胺酸(lysine)，
如申請專利範圍第1項至第4項中之任一項所述之抗菌胜肽，其中至少一個可變區具有一組胺酸。
如申請專利範圍第1項至第29項中之任一項所述之胜肽，其中該胜肽具有一環狀結構。
如申請專利範圍第1項至第30項中之任一項所述之抗菌胜肽，其中該胜肽對一革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、寄生蟲或病毒表現出廣效(broad spectrum)抗菌活性。
一種抗菌胜肽複合物，該複合物包含如申請專利範圍第1項至第31項中任一項所述之胜肽以及非-胜肽部位。
一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項至第31項中任一項所述之抗菌胜肽以及一醫藥上可接受之載體。
一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第32項所述之抗菌胜肽複合物以及一醫藥上可接受之載體。
一種治療微生物感染的方法，該方法包含給予一所需個體如申請專利範圍第33項或第34項所述之組合物。