JP7101982B2

JP7101982B2 - 脳梗塞の処置用の医薬組成物

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Publication number: JP7101982B2
Application number: JP2018143437A
Authority: JP
Inventors: 彰垣塚; 久徳木下; 崇州眞木; 良輔高橋
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: WO2020027137A1; EP3848029A1; EP3848029A4; KR20210038587A; CN112702999A; US20210137950A1; JP2020019734A

Description

本願は、脳梗塞の処置用の医薬組成物に関する。

脳梗塞は、一般に、脳動脈の閉塞または狭窄により脳虚血が生じ、脳組織が酸素または栄養の不足のため壊死または壊死に近い状態になることを特徴とする疾患である。脳梗塞には、脳内小動脈病変が原因の「ラクナ梗塞」、頸部ないし頭蓋内の比較的大きな動脈のアテローム硬化が原因の「アテローム血栓性脳梗塞」、心疾患による「心原性脳塞栓症」等の病型が含まれる。脳梗塞は、死亡率の高い疾患であり、また、一旦発症すると後遺症を残す可能性が高く、患者のＱＯＬ、福祉および医療経済面でも大きな課題となっている。

急性期の脳梗塞に対しては、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue plasminogen activator：ｔＰＡまたはｔ－ＰＡ）による血栓溶解治療が第一選択である。プラスミノーゲンは、血管内に出来た血栓を強力に溶解する酵素である。脳の動脈に生じた血栓により脳梗塞が起こった後にｔＰＡを投与することにより、血栓を溶解し、血液の流れを回復させる治療が行われている（血栓溶解療法）。ｔＰＡ治療により自立して生活できるまで回復する患者は４０－５０％と報告されている。しかしながら、発症からｔＰＡ投与までの時間が長く経過した場合には、脳出血を引き起こすことがあり、発症後４.５時間以内の患者にしか使用できない。また、最近、発症から８時間以内の治療可能な患者に機械的血栓回収療法により血栓を除去する血管内治療を行うことも実施されつつある。いずれにしても更なる治療改善率が臨床現場から強く望まれており、新たな治療法を開発することは極めて重要である。

ある種の４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体は、ＶＣＰ（valosin-containing protein）ＡＴＰａｓｅ阻害活性を有し、様々な疾患に対する治療効果が期待されている（特許文献１）。特に、眼疾患およびレプチン抵抗性の処置または予防に有効であることが知られている（特許文献２～５）。

国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット国際公開第２０１２／０４３８９１号パンフレット国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット国際公開第２０１５／０３３９８１号パンフレット

本願の目的は、脳梗塞の処置用の医薬組成物を提供することである。

本発明者らは、ＶＣＰ調節剤が大脳皮質ニューロンの保護効果を有し、脳梗塞の処置に有効であることを見出した。

従って、ある態様では、本願は、式（Ｉ）：

〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、脳梗塞の処置用の医薬組成物を提供する。

本開示により、脳梗塞の処置用の医薬組成物が提供される。

初代大脳皮質ニューロンを用いるインビトロ実験の手順を示す。酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）処理後のニューロンのＫＵＳ１２１存在下および非存在下での生存能を示す。ＯＧＤ処理後のニューロンにおける、ＫＵＳ１２１存在下および非存在下でのＭＡＰ２陽性面積を示す。ＯＧＤ処理後のニューロンにおける、ＫＵＳ１２１存在下および非存在下でのＡＴＰレベルを示す。ツニカマイシン処理後のニューロンにおける、ＫＵＳ１２１存在下および非存在下でのＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）発現量を示す。マウスを用いるインビボ実験の手順を示す。一過性限局的脳虚血を誘導した後、ＫＵＳ１２１または媒体を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの、ロータロッド上の滞在時間を示す。一過性限局的脳虚血を誘導した後、ＫＵＳ１２１または媒体を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳における、梗塞体積を示す。ＫＵＳ１２１または媒体を投与した後、一過性限局的脳虚血を誘導したＣＢ－１７マウスの脳における、梗塞体積を示す。ＫＵＳ１２１または媒体を投与した後、一過性限局的脳虚血を誘導したＣＢ－１７マウスの大脳皮質におけるＮｅｕＮの発現量を示すウェスタンブロットの結果である。

本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。

特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。

「アルキル」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチルおよびネオペンチルを意味するが、これらに限定されない。

基の接頭語「置換」は、当該基の１個以上の水素原子が、同一または異なる指定する置換基によって置換されていることを意味する。

「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、２価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキレン基は、分枝鎖および直鎖ヒドロカルビル基を含む。

「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本開示に定義されている）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシおよびｎ－ペントキシを意味するが、これらに限定されない。

「アリール」は１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６～１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリール基は典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリール（ここで、アリールは本開示に定義されている）の基を意味し、例えばフェノキシおよびナフトキシを含む。

「シアノ」は、－ＣＮの基を意味する。
「カルボキシル」または「カルボキシ」は－ＣＯＯＨまたはその塩を意味する。
「カルボキシエステル」は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本開示に定義されている）の基を意味する。
「ハロ」は、ハロゲン、特に、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
「ヒドロキシ」は－ＯＨの基を意味する。

特に定めのない限り、本開示において明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能基の末端部分を命名し、次いで結合点に向かって隣接する官能基を命名して行う。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、（アリール）－（アルキル）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－を意味する。

式（Ｉ）の化合物には、置換パターンによっては、エナンチオマーまたはジアステレオマーが存在し得る。式（Ｉ）の化合物は、ラセミ体であってもよく、既知方法で立体異性的に純粋な成分に分離したものであってもよい。ある種の化合物は、互変異性体であり得る。

「エステル」は、インビボで加水分解され得るエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
「オキシド」は、ヘテロアリール基の窒素環原子が酸化され、Ｎ－オキシドを形成しているものを意味する。

「薬学的に許容し得る塩」は、式（Ｉ）の化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。

また、薬学的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン、メチルピペリジン、Ｌ－アルギニン、クレアチン、コリン、Ｌ－リジン、エチレンジアミン、ベンザチン、エタノールアミン、メグルミンまたはトロメタミン）から誘導されるアンモニウム塩、特にナトリウム塩であり得る。

「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している式（Ｉ）の化合物を意味する。好適な溶媒和物は水和物である。

本開示において「式（Ｉ）の化合物」に言及する場合、文脈中で不適切でない限り、そのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩および溶媒和物も包含することを意図する。

ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである。

ある実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、下記の表１の化合物から選択される：

ある実施態様では、医薬組成物の有効成分は、下記式

で表される４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸、または、そのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であり、特にナトリウム塩が好ましい。

式（Ｉ）の化合物、特に、上記の化合物の特性および合成方法は、国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット（特許文献１）に詳細に記載されている。

本開示において、「脳梗塞」は、脳虚血に起因する脳の損傷を意味し、ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞および心原性脳塞栓症を含むが、これらに限定されない。脳虚血の原因としては、脳血栓、脳栓塞、血管攣縮、低血圧、低酸素血症などが挙げられるが、これらに限定されない。本開示において、神経障害、高次機能障害、感情障害等の脳梗塞に関連する症状または脳梗塞の後遺症も、脳梗塞の用語に含まれるものとする。

本開示において、「処置」は、疾患または症状の治癒、寛解、緩和、改善および／または一時的寛解を目的とするいかなる医学的介入も包含する。例えば、「処置」は、疾患の進行の遅延もしくは停止、病変の退縮もしくは消失、または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的介入を包含する。

疾患の処置の対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトが挙げられる。

医薬組成物の投与方法は特に限定されないが、経口投与、非経腸投与、注射、輸液等の一般的な投与経路を経ることができ、組成物は、各投与経路に適する剤形であり得る。髄腔内投与および硬膜外投与、または脳室への投与も可能である。ある実施態様では、医薬組成物は静脈内に投与される。

経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。また注射による投与の剤形としては、静脈注射用、点滴投与用、活性物質の放出を延長する製剤等などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。静脈注射用または点滴投与用の剤形としては、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤、増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。注射用の投与形は、密閉したアンプルやバイアル中に提供されてもよく、凍結乾燥物として提供され、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えて調製してもよい。注射溶液または懸濁液を、粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。

これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。

医薬組成物の投与量および投与回数は、有効量の式（Ｉ）の化合物が対象に投与されるように、投与対象の動物種、健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、約０.００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０.０１～約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日、あるいは約０.１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の式（Ｉ）の化合物を投与し得る。例えば、医薬組成物は単回投与してもよく、複数回投与してもよく、持続投与してもよい。

ある実施態様では、医薬組成物は、脳梗塞の急性期に投与される。「急性期」とは、脳梗塞の発症から１４日以内の期間を意味する。本開示の医薬組成物は、対象が脳梗塞を発症した後、例えば、対象が脳梗塞を発症した後に速やかに、例えば、発症から約３時間以内、約４.５時間以内、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内または約２４時間以内に投与され得る。本開示では、脳虚血の原因（例えば、脳動脈の閉塞または狭窄）が発生した時点を、脳梗塞の発症の時点とみなすことを意図する。ある実施態様では、医薬組成物は、脳梗塞の急性期に単回または複数回投与される。ある実施態様では、医薬組成物は、脳梗塞の急性期の全体または一部にわたって持続的に投与される。ある実施態様では、医薬組成物は、脳梗塞による炎症が生じる前に投与される。炎症の有無は、例えば、血中ＣＲＰまたはＩＬ－１βなどの炎症性マーカーにより判定することができる。

ある実施態様では、医薬組成物は、閉塞した血管の再灌流処置（例えば、血栓溶解剤の投与または外科手術による）の直前または直後に投与され得る。「再灌流処置の直前」は、再灌流処置の数分ないし数十分前、例えば、約６０分前、約３０分前、約２０分前、約１５分前、約１０分前、約５分前または約３分前から再灌流処置までの時点を意味する。「再灌流処置の直後」は、再灌流処置から、再灌流処置の数分ないし数十分後、例えば、約６０分後、約３０分後、約２０分後、約１５分後、約１０分後、約５分後または約３分後までの時点を意味する。ある実施態様では、医薬組成物は、再灌流処置と同時に投与される。あるいは、医薬組成物を持続投与している間に再灌流処置を行ってもよい。

ある実施態様では、急性期に１回、約１～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、約５～約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０～約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５～約２００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約１００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を静脈内投与し得る。

式（Ｉ）の化合物は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、脳梗塞の処置用の有効成分と併用できる。併用に適する有効成分には、例えば、血栓溶解剤（例えば、ｔＰＡ、ｒｔＰＡ（例えば、アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ、デスモテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、ウロキナーゼ）、抗血小板薬（例えば、オザグレルナトリウム、アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾール）、選択的トロンビン阻害薬（例えば、アルガトロバン）、ヘパリン、低分子ヘパリン、ヘパリノイド、脳保護薬（例えば、エダラボン）、高張グリセロール、高張マンニトール、血管拡張薬、抗炎症薬、スタチン系薬剤等、特にｒｔＰＡ、特にアルテプラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが脳梗塞の処置のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することもできる。

式（Ｉ）の化合物の投与に加えて、薬物療法以外の治療法を実施することもできる。適する治療法には、例えば、機械的血栓回収療法、開頭外減圧療法、緊急頸動脈内膜剥離術、急性期再開通療法、急性期頸部頸動脈血行再建術（血管形成術／ステント留置術）等の外科手術、遺伝子治療、再生医療等が含まれる。

ある態様では、脳梗塞の処置を必要としている対象に式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、脳梗塞の処置方法が提供される。
ある態様では、脳梗塞の処置に使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
ある態様では、脳梗塞を処置するための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
ある態様では、脳梗塞の処置用の医薬組成物の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。

例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］式（Ｉ）：

〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、脳梗塞の処置用の医薬組成物。
［２］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、第１項に記載の医薬組成物。
［３］Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、第１項または第２項に記載の医薬組成物。
［４］Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、第１項～第３項のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］式（Ｉ）の化合物が表１に記載の化合物から選択される、第１項～第４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、第１項～第５項のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩を含む、第１項～第６項のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］脳梗塞が、ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞または心原性脳塞栓症である、第１項～第７項のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］脳梗塞がラクナ梗塞である、第１項～第８項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］脳梗塞の急性期に投与される、第１項～第９項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］脳梗塞後の再灌流処置の直前または直後に投与される、第１項～第１０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１２］脳梗塞後の再灌流処置と同時に投与される、第１項～第１０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］再灌流処置が血栓溶解剤の投与である、第１１項または第１２項に記載の医薬組成物。
［１４］再灌流処置が外科手術である、第１１項または第１２項に記載の医薬組成物。
［１５］単回投与される、第１項～第１４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１６］複数回投与される、第１項～第１４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１７］持続投与される、第１項～第１４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］脳梗塞の発症から約２４時間以内に投与される、第１項～第１７項のいずれかに記載の医薬組成物。
［１９］脳梗塞の発症から約１２時間以内に投与される、第１項～第１８項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２０］脳梗塞の発症から約８時間以内に投与される、第１項～第１９項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２１］脳梗塞の発症から約６時間以内に投与される、第１項～第２０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２２］脳梗塞の発症から約４.５時間以内に投与される、第１項～第２１項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２３］脳梗塞の発症から約３時間以内に投与される、第１項～第２２項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２４］約１～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１項～第２３項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２５］約５～約５００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１項～第２４項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２６］約１０～約３００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１項～第２５項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２７］約２５～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の式（Ｉ）の化合物を投与するための、第１項～第２６項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２８］血栓溶解剤と併用される、第１項～第２７項のいずれかに記載の医薬組成物。
［２９］血栓溶解剤がｔＰＡである、第２８項に記載の医薬組成物。
［３０］血栓溶解剤がアルテプラーゼである、第２８項または第２９項に記載の医薬組成物。
［３１］静脈内投与される、第１項～第３０項のいずれかに記載の医薬組成物。

本開示で引用するすべての文献は、出典明示により本開示の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。

材料と方法
初代ニューロン培養
大脳ニューロン培養を、１７日齢のスプラーグドーリーラット胚（清水実験材料）から、以前に記載された方法を使用して調製した（Maki T, et al, Annals of Clinical and Translational Neurology, 2014 Aug;1(8):519-33）。これを簡潔に説明する。皮質を取り出し、分離させた。細胞を、５％熱不動化ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、ポリ－Ｄ－リジンで被覆されたディッシュ上に、細胞２００，０００～２５０，０００個／ｃｍ^２の密度で播種した。播種の２４時間後、培地を０.５ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２％Ｂ２７サプリメントを含む神経基礎（Neurobasal）（ＮＢ）培地に替えた。培養したニューロンを、播種の１４日後に実験に使用した。

酸素グルコース欠乏
培地を、グルコースを含まないＤＭＥＭに替えた。次いで、細胞を、Anaero Pack を備えた密封 Anaero コンテナ（三菱ガス化学）に１.５～２時間置いた。酸素グルコース欠乏の後、細胞を通常の培地に移し、正常酸素圧の５％ＣＯ_２インキュベーターに戻した。

細胞生存試験
細胞生存能をCell Counting Kit-8 (CCK-8) アッセイ（同仁化学研究所）により評価した。ＣＣＫ－８アッセイは、水溶性テトラゾリウム塩である２－（２－メトキシ－４－ニトロフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム一ナトリウム塩（ＷＳＴ－８）が、電子伝達体の存在下でデヒドロゲナーゼにより還元されると、水溶性ホルマザン染料に変換されることに基づく。細胞を１０％ＣＣＫ－８溶液と１～２時間３７℃でインキュベートした。次いで、培養培地の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した（測定波長４５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍ）。

免疫細胞化学
細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間処理した。さらにＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ／０.１％Tweenとインキュベートし（１０分間）、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした（室温で１時間）。細胞をＭＡＰ２に対する一次抗体（１：１０００、Sigma Aldrich、M1406）と、４℃で終夜インキュベートした。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。最後に、核をＤＡＰＩで対比染色した。

ＡＴＰアッセイ
ルシフェラーゼ化学発光をベースとする細胞のＡＴＰ測定試薬（東洋インキ製造）により、製造業者のプロトコールに従って、細胞溶解物中のＡＴＰレベルを測定した。これを簡潔に説明する。製造業者により提供された溶解溶液１００μＬを、９６ウェルプレートの各ウェル中の細胞に添加した。室温で５分間インキュベートした後、溶液のアリコートの発光をルミノメーターで測定した。

ウェスタンブロット
細胞を回収し、１０％２－メルカプトエタノール（ナカライテスク）および１％プロテアーゼ阻害剤（ナカライテスク）を含むＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨｐＨ７.４、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１％Nonidet-P40、１％デオキシコール酸ナトリウム）中で溶解した。切り出された脳のサンプルを、２－メルカプトメタノールおよびプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファー中でホモジナイズした。サンプルを超音波処理し、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質（１５～２０μｇ／レーン）をロードし、５～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、フッ化ポリビニリデン膜（Millipore）に移した。一次抗体は、以下の通りである：β－アクチン（１：５０００、Sigma Aldrich、A5441）、ＣＨＯＰ（１：１０００、Cell Signaling Technology、L63F7）、ＮｅｕＮ（１：２０００、Merck Millipore、ABN78）、ＶＣＰ（１：５００、ABGENT、AP6920b）。増強された化学発光（ナカライテスク）による可視化のために、ＨＲＰ標識二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）を使用した。

マウス
成体のオスのＣ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ）およびＣＢ－１７（ＣＢ－１７／ｌｃｒ－＋／＋Ｊｃｌ）マウス（６～７週齢）を、清水実験材料および日本クレアからそれぞれ購入した。食物と水を自由に摂取させた。

脳卒中手術
以前に記載された方法（Kasahara Y, Ihara M, Nakagomi T, et al. A highly reproducible model of cerebral ischemia/reperfusion with extended survival in CB-17 mice. Neuroscience Research, 2013 Jul;76(3):163-8）をわずかに改変して、ＣＢ－１７マウスにおいて、遠位中大脳動脈閉塞（遠位ＭＣＡＯ）を実施した。これを簡潔に説明する。４％イソフルラン（Pfizer）の吸入により全身麻酔を誘導し、１.５％イソフルランの吸入により維持した。マウスを側臥位に置き、左眼球と左外耳道の間で皮膚を切開した。左唾液腺および側頭筋の一部を切除し、頭蓋骨を通して中大脳動脈（ＭＣＡ）が見えるようにした。頭蓋骨に穿頭孔を作った。次いで、ＭＣＡを分離し、モノフィラメントナイロン糸で一過性に閉塞させた。２２分間の閉塞の後、ナイロン糸の除去によりＭＣＡ血流を回復させた。手術の間、直腸温をモニターし、フィードバック制御された加熱パッドで３６.０～３７.２℃に維持した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、以前に記載された方法（Doyle KP, Fathali N, Siddiqui MR, et al. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods, 2012 May 30;207(1):31-40）をいくらか改変して、低酸素による遠位ＭＣＡＯを実施した。ナイロン糸による遠位ＭＣＡの閉塞の後に、１０％酸素および９０％窒素を含む大型チャンバーにマウスを入れた。３０分間の低酸素条件の後、ナイロン糸を除去し、正常酸素圧条件に戻した。偽手術は、遠位ＭＣＡの閉塞以外は、脳卒中手術と同じであった。

脳卒中体積の評価
虚血の２４時間後にマウスを深く麻酔し、ＰＢＳおよび４％ＰＦＡで経心的に灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中で４８時間の後固定を行った。脳がバイアルの底に沈むまで、２０％スクロース中でさらに凍結保護した。ニッスル染色のために、クライオスタットで脳を連続的に切断し、スライド上で６００μｍ毎に厚さ２０μｍの切片にした（十字縫合に対して、前後に＋２.０、＋１.４、＋０.８、＋０.２、－０.４、－１.０および－１.６ｍｍ）。切片をクレシルバイオレット液中で１５分間インキュベートし、７０％メタノール中で５秒間脱水した。その後、スライドをマウント媒体で被覆した。各切片の同側半球の面積と梗塞の面積を、NIH imageJ ソフトウエアを用いて測定した。測定値に切片間の距離（６００μｍ）を乗じ、脳全体で合計し、体積の測定値を得た。

加速ロータロッド試験
虚血の２４時間後、マウスを加速ロータロッド装置（４分間かけて０ｒｐｍから４０ｒｐｍに加速する）に乗せた。マウスが回転する円柱の上に居られる時間を測定した。３回試行し、落下までの最大の潜時を使用した。

ＫＵＳ１２１の投与
国際公開第２０１２／０１４９９４号（特許文献１）に記載の方法により製造した４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩（ＫＵＳ１２１またはＫＵＳと称する）を、５％Cremophor EL（Sigma）を含むＰＢＳに溶解し、２０μｇ／μＬの溶液を作製した。限局的虚血脳卒中マウスモデルに、ＫＵＳ１２１溶液を静脈内および腹腔内で投与した（各々、ＫＵＳ１２１１００ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ）。

統計分析
断りの無い限り、すべての値を平均±ＳＥで表した。ダネットの検定（細胞生存試験）およびスチューデントのｔ検定（細胞生存試験以外の試験）を使用して統計分析を行った。ｐ＜０.０５の差異を統計的有意差とみなした。

結果
ＫＵＳ１２１はＡＴＰ枯渇を防止することにより酸素グルコース欠乏条件下で初代大脳皮質ニューロンを保護する
初代大脳皮質ニューロンを用いるインビトロ実験の手順を図１に示す。ＫＵＳ１２１の虚血条件下でのニューロン保護効果を評価するために、ＫＵＳ１２１の存在下および非存在下で、酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）処理後に細胞生存試験を実施した（図１上）。ＯＧＤをラットの大脳皮質初代ニューロン培養で２時間実施し、続いて２１％Ｏ_２およびグルコース含有培地で２２時間回復させた。対照ニューロンは、２１％Ｏ_２、グルコース含有培地で２４時間維持した。ＯＧＤへの暴露は初代大脳皮質ニューロンの細胞死を引き起こした。しかしながら、１００μＭおよび２００μＭのＫＵＳ１２１が実験中に存在すると、ＯＧＤ処理後のニューロンの生存能は有意に改善された（媒体（ＤＭＳＯ）で１８.１±１.９％、１００μＭＫＵＳで４３.５±３.１％、２００μＭＫＵＳで４２.４±３.７％；ｐ＜０.００１）（図２）。さらに、１００μＭのＫＵＳ１２１は、ＭＡＰ２陽性面積を媒体（ＤＭＳＯ）と比較して有意に増加させた（媒体（ＤＭＳＯ）で０.８７±０.１３％、１００μＭＫＵＳで２.６４±０.４１％；ｐ＜０.０５）（図３）。ＤＭＳＯ、または、ＯＧＤ処理をしない場合のＫＵＳ１２１は、ニューロンの生存能に影響を与えなかった。

ＫＵＳ１２１は病的状況においてＡＴＰ枯渇を防止できると報告されているので、ＫＵＳ１２１がＯＧＤ処理された初代大脳皮質ニューロンでも同様の効果を示すか否かを調べた。１.５時間のＯＧＤ処理後に、ルシフェラーゼをベースとするアッセイにより細胞のＡＴＰレベルを測定した。ＫＵＳによる処理は、ＡＴＰレベルを高めた（媒体（ＤＭＳＯ）で１４.３±１.１％、１００μＭＫＵＳで２８.０±２.３％；ｐ＜０.００１）（図４）。ＤＭＳＯ、または、ＯＧＤ処理をしない場合のＫＵＳ１２１は、ＡＴＰレベルに対して効果がなかった。これらのデータは、ＫＵＳ１２１がＡＴＰ枯渇を防止することにより酸素グルコース欠乏条件下で初代大脳皮質ニューロンを保護することを示唆する。

ＫＵＳ１２１はＥＲストレス誘導条件下で初代大脳皮質ニューロンを保護する
虚血後にはＥＲストレスが惹起されるので、初代大脳皮質ニューロンがツニカマイシンで処理されたときのＫＵＳ１２１の保護効果を試験した（図１下）。ツニカマイシン処理はＥＲストレスを引き起こすことが知られている。Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）はＥＲストレスに誘導される細胞死の中心的なメディエーターであり、ＥＲストレス下で上方調節される。大脳皮質ニューロンを０.２５μｇ／ｍＬツニカマイシンに６時間暴露した。ＫＵＳ１２１は、ツニカマイシン処理した初代大脳皮質ニューロンにおいてＣＨＯＰの発現を抑制した（図５）。

ＫＵＳ１２１による処置は運動機能を改善し、脳梗塞体積を低減する
マウスを用いるインビボ実験の手順を図６に示す。脳虚血に対するＫＵＳ１２１の効果を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで一過性限局的脳虚血を誘導した。左中大脳動脈の遠位の閉塞の直後にＫＵＳ１２１を投与した（図６上）。閉塞の２４時間後、ＫＵＳ１２１は、媒体と比較して、ロータロッド上の滞在時間を有意に延長した（媒体（５％Cremophor）で１３４.５±１８.４秒、ＫＵＳで２０１.０±２１.８秒；ｐ＜０.０５）（図７）。加えて、梗塞体積はＫＵＳ１２１処置により顕著に減少した（媒体（５％Cremophor）で８.８±０.６３％、ＫＵＳで４.７±１.７０％；ｐ＜０.０５）（図８）。

神経保護効果をＣＢ－１７マウスで確認した。虚血直前のＫＵＳ１２１の投与（図６下）は、梗塞体積を低減した（媒体（５％Cremophor）で１１.８±０.６０％、ＫＵＳで５.７４±１.６４％；ｐ＜０.０５）（図９）。さらに、大脳皮質のウェスタンブロットは、ニューロンマーカーであるＮｅｕＮの発現がＫＵＳ１２１により保存されることを明らかにした（図１０）。

本開示は、これまで利用されてこなかった作用機序による脳梗塞の処置方法を提供するものであり、医療の分野で利用され得る。

Claims

式（Ｉ）：

〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、脳梗塞の処置用の医薬組成物。
Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
式（Ｉ）の化合物が、
４－アミノ－３－（６－フェニルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｐ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｍ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｏ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ビフェニル－２－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（２－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（３－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（４－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレンスルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,４－ジクロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フェノキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,３－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－｛４－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェニル｝－４－オキソブチル酸；
４－アミノ－３－（６－ビフェニル－３－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３,５－ビストリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレンスルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－ベンゾイルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－６－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ヘキシルオキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－ブチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－｛６－［２－（６－ヒドロキシヘキシルオキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
４－｛２－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェノキシ｝ブチル酸；
４－アミノ－３－｛６－［２－（３－ヒドロキシプロポキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－イソブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－クロロ－２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４’－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４,３’,５’－トリメチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３’－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,６－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－イソプロポキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；および、
４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
式（Ｉ）の化合物が、４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸である、請求項１～３のいずれかに記載の医薬組成物。
脳梗塞が、ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞または心原性脳塞栓症である、請求項１～４のいずれかに記載の医薬組成物。
脳梗塞後の再灌流時に投与される、請求項１～５のいずれかに記載の医薬組成物。
脳梗塞の発症から約８時間以内に投与される、請求項１～６のいずれかに記載の医薬組成物。
脳梗塞の発症から約４.５時間以内に投与される、請求項１～７のいずれかに記載の医薬組成物。
血栓溶解剤と併用される、請求項１～８のいずれかに記載の医薬組成物。
血栓溶解剤がｔＰＡである、請求項９に記載の医薬組成物。
静脈内投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の医薬組成物。