JP7002565B2

JP7002565B2 - 光学分析装置

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Publication number: JP7002565B2
Application number: JP2019561393A
Authority: JP
Inventors: 隆之小原; 洋平花崎; 一成今井; 智高橋; 茂樹松原
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2022-01-20
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: WO2019130372A1; JPWO2019130372A1

Description

光学分析装置に関する。特に走査型顕微鏡に関する。

光学顕微鏡の一種として、走査型顕微鏡がある。これは、照明光を試料の一部に照射して、この時に発生する信号光を検出することで試料の情報を得る観察手段である。照明光の照射位置を走査することで、試料のより広い範囲を観察し、画像や映像の形で情報を得ることができる。信号光としては、散乱光や蛍光など種々の光を含む。また、照射位置を試料の深さ方向に走査することで、試料の各種断層像を取得したり、試料内部の３次元的な像を取得したりすることが可能である。

このような走査型顕微鏡の例は、例えば特許文献１や非特許文献１に開示されている。

特許文献１に開示されている多光子励起レーザ顕微鏡は、対物レンズ（励起用レンズ）側から透過照明を行い、コンデンサレンズ（受光用レンズ）側で透過検出を行うことが可能となっている。また、この多光子励起レーザ顕微鏡は、対物レンズを光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットとコンデンサレンズを光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットを含んでいる。以上のように構成された多光子励起レーザ顕微鏡では、対物レンズ及びコンデンサレンズの各々の焦点位置調整ユニットにより、各々の焦点位置の調整が行われる。特に、透過照明を行う場合には、対物レンズとコンデンサレンズの焦点位置が一致するように調整される。非特許文献１には、走査型顕微鏡の一例として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡が開示されている。ＣＡＲＳ顕微鏡では、振動数ω_ｐのポンプ光と、振動数ω_ｓ（ω_ｐ＞ω_ｓ）のストークス光を同軸で重ね合わせて（合波）、試料上の一点に焦点を結ばせる。これにより、アンチストークス振動数（ω_ａｓ＝２ω_ｐ－ω_ｓ）を持つ信号光（ＣＡＲＳ光）を生じる。ω_ｐ－ω_ｓがラマン活性な振動の振動数に一致するときＣＡＲＳ光は増強される。これを利用して、化学種特異的な信号コントラストを得ることができる。２光子励起蛍光顕微鏡と同じく、ＣＡＲＳ光は焦点の占める空間の中でのみ発生するので、おのずと３次元的な空間分解能を持つ。よって、深さ方向の分解能を持つ画像を得るために、特段の画像処理等を設ける必要は無い。

非特許文献１のＣＡＲＳ顕微鏡の構成においては、前記の２つのレーザビームは同軸上に合波され、励起光として共焦点レーザ走査顕微鏡に導入される。励起光は水浸対物レンズ（倍率６０倍、ＮＡ＝１．２）を透過して試料中に焦点を結ぶ。前方ＣＡＲＳ光は空気を介したコンデンサレンズ（ＮＡ＝０．５５）で集光され、光電子増倍管で検出される。

非特許文献１では、上記のような構成によって、厚さ約１７μｍのポリマーフィルムの深さ方向の断層像（励起光の光軸と平行な面での断層像）を取得した例を示している。また、フィルム表面から０、６、１２、１６μｍの深さにある断層像（光軸に垂直な面での断層像）を取得した例を示している。

特許文献２では、多色ＣＡＲＳにおいて、ポンプ光の発散収束状態調整機構、ストークス光の発散収束状態調整機構を備え、所望の波長帯域の強調調整を可能とした例が開示されている。

特開２０１５－１０８７１８ＷＯ２０１６／１４３０８４

Ｋａｎｇ，Ｅｕｎａｈｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，８０３６－４３

走査型顕微鏡では、励起光の照射位置を深さ方向に走査することで、試料の深さ方向の断層像を取得できる。しかし、励起光の照射位置を試料の深さ方向に移動すると、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置がずれてしまう場合がある。しかし、励起光の照射位置を移動するたびに、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整を行うと画像の取得に要する時間が長くなってしまう。

上記課題を解決するために、代表的な本発明の光学分析装置の一つは、励起光源と、試料に向けて励起光を集光する励起用レンズと、前記試料の位置を調整する試料ステージと、
前記励起光により前記試料から発生する前記励起光とは波長の異なる信号光を集光する受光用レンズと、受光用レンズを通過した前記信号光を集光する集光レンズと、前記信号光を検出する検出器と、を備え、
前記励起用レンズの光軸方向の移動、前記試料ステージの光軸方向の移動、前記受光用レンズの光軸方向の移動、前記集光レンズの光軸方向の移動のうち、少なくとも前記移動の２種類の移動を指定する補正係数に連動して動作するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。

前記の構成によれば、例えば、励起光の照射位置を試料の深さ方向に移動しても、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置がずれないため、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整を行う必要がなく、より高速な画像取得が可能になる。そのため、例えば、スキャンをしながらＣＡＲＳスペクトルの検出が可能となる。

実施例１の走査型顕微鏡の基本構成模式図実施例１の動作手順のフローチャート実施例１のイメージング動作の模式図測定点とレンズ焦点の関係を示した模式図測定点とレンズ焦点の関係を示した模式図実施例１のＧＵＩの模式図単色ＣＡＲＳ顕微鏡の実施例の模式図２光子励起蛍光顕微鏡の実施例の模式図透過型共焦点顕微鏡の実施例の模式図

以下、本発明の実施例を、図面を用いて説明する。

以下本発明の一実施例を、図１、図２、図３、図４、図５、図６に沿って説明する。

図１は、本実施例の走査型顕微鏡１００の基本的な構成例を示す模式図である。本装置は、励起光源１３９と励起用レンズ１１３、受光用レンズ１１５、分光検出器１１９、制御部１３４を備えている。以下、その他の各構成要素を含め、詳細に説明する。
（顕微鏡の基本構成）
制御部１３４は、調整機構を含む装置全体の制御を行うとともに、ユーザからの測定指示の受け付けや測定結果の表示を行うインターフェースを備える。このインターフェースの一部は表示部１３７上に表示されるＧＵＩとして実装される。制御部１３４は記憶装置１３３、表示部１３７と論理的に接続されている。記憶装置１３３は制御部１３４の内部に備えつけられるか、制御部１３４と外部接続されるか、またはその両方の形態で備え付けられている。

短パルスレーザ光源１０１は、制御部１３４の指示に基づいて短パルスレーザ光を出射する。短パルスレーザ光源１０１はチタンサファイアレーザやファイバレーザ、マイクロチップレーザなどであり、パルス幅はナノ秒オーダー以下である。また、ピークパワーは非線形光学効果を誘起可能なキロワットオーダ以上が望ましい。波長については測定対象の吸収帯域や用いる光学部品の対応波長から選定すればよい。細胞資料などを対象とする場合には、生体組織、水の吸収帯による影響を避けるために、波長１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザや、８００ｎｍ付近で発振できるＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザを用いるのが好適である。

（１０６４ｎｍであれば、小型のＮｄ：ＹＡＧマイクロチップレーザを利用することができる。８００ｎｍではＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザを用いるのに好適である。また、８００ｎｍも１０６４ｎｍも、水の吸収帯域による影響が小さい。）
レーザ光はパワー分岐比調整機構である１／２波長板１０２及び偏光ビームスプリッタ１０３に入射する。１／２波長板１０２は制御部１３４の指示に基づいてレーザ光の偏光方向を変化させ、偏光ビームスプリッタ１０３は偏光方向に基づいたパワー分岐比でレーザ光を透過成分と反射成分とに分岐する。偏光ビームスプリッタ１０３を透過したレーザ光は、コリメータ１０４によってフォトニック結晶ファイバ１０５の端面に集光される。フォトニック結晶ファイバはコアの周囲に蜂の巣状の中空のクラッドが形成された光ファイバであり、入射光をコアに強く閉じ込める。短パルスレーザ光を入射することによって自己位相変調や四光波混合等の非線形光学現象が誘起され、入射光より幅広い帯域を有するスーパーコンティニューム光が生成される。スーパーコンティニューム光は広帯域ストークス光として利用することが可能である。ストークス光として広帯域な光を用い、発生するＣＡＲＳ光を分光検出するものは多色ＣＡＲＳ顕微鏡（もしくはマルチプレックスＣＡＲＳ顕微鏡）と呼ばれる。多色ＣＡＲＳ顕微鏡は、ＣＡＲＳ光の分光スペクトルからラマンスペクトルを推定できるため、取得できる情報が多く、測定対象のより詳細な解析に適している。これに対して、ストークス光として狭帯域な光を用いるものを本明細書では単色ＣＡＲＳと呼ぶ。単色ＣＡＲＳを採用する場合、検出器に分光性能が必要でないので、比較的簡素な構成で実現することができる。

生成されたスーパーコンティニューム光は、コリメータ１０６によって平行光となり、ロングパスフィルタ１０７によって短波長成分がカットされたのち、ポンプ光波長を反射しそれ以外の波長の光を透過するダイクロイックミラー１０８を透過して、ダイクロイックミラー１１２によって反射され、ストークス光として励起用レンズ１１３に入射する。一方、偏光ビームスプリッタ１０３を反射したレーザ光は、コリメータ１０９によって光ファイバ１１０の入射端に集光される。光ファイバ１１０中を伝搬して出射されたレーザ光は、コリメータ１１１によって平行光となり、ダイクロイックミラー１０８、およびダイクロイックミラー１１２によって反射され、ポンプ光として励起用レンズ１１３に入射する。

励起用レンズ１１３は、ダイクロイックミラー１０８によって同軸上に合波されたストークス光とポンプ光とを試料１１４に集光する、励起用レンズとして作用する。合波されたストークス光とポンプ光は励起光としてＣＡＲＳ光生成に寄与する。試料１１４では前記の励起光１４４により、試料１１４の分子種に対応する波長のＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光は受光用レンズ１１５によって開口部１２２へ導かれて分光検出器１１９にて検出される。すなわち、ＣＡＲＳ光は受光用レンズ１１５を透過して平行光となり、ダイクロイックミラー１２４で反射して、ノッチフィルタ１１７及びショートパスフィルタ１１８によってポンプ光及びストークス光の透過成分がカットされ、集光レンズ１２０で集光されたのち、スリット１２１の開口部１２２を通して分光検出器１１９に入射する。分光検出器１１９はＣＡＲＳスペクトルを検出する。ここで、受光用レンズ１１５を透過したＣＡＲＳ光が平行光になるよう配置することで、ＣＡＲＳ光はノッチフィルタ１１７及びショートパスフィルタ１１８の表面に対して直交して入射するので、フィルタ表面での屈折の影響などを排除できる。

試料ステージ１３０は、試料１１４を保持して移動する機能を備える。これにより、試料１１４上の観察する部位（測定点）を変更できる。受光用レンズステージ１３２は受光用レンズ１１５をＣＡＲＳ光の光軸方向に移動できるように、励起用レンズステージ１３１は励起用レンズ１１３を励起光１４４の光軸方向に移動できるように、それぞれ配置されている。これら３つのステージの全てまたは一部を動かすことで、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整に使うことができる。制御部１３４には、試料ステージ１３０の移動量と受光用レンズステージ１３２の移動量を一定の比率で連動して移動する機能を備えている。この機能は以下の構成により実現される。試料ステージ１３０は３軸ピエゾアクチュエータで駆動され、ピエゾコントローラ１３５を介して、制御部１３４に接続されている。受光用レンズステージ１３２はステッピングモータとボールねじ、またはラックピニオン機構で駆動され、モータコントローラ１３６を介して、制御部１３４に接続されている。例えば、比率Ａで受光用レンズステージ１３２を連動する場合、制御部１３４上のソフトウェアが試料ステージ１３０をＺ軸の正の向きに１０μｍ移動させる際、まず制御部１３４はピエゾコントローラ１３５に対し、Ｚ軸アクチュエータを現在位置から正方向に１０μｍ移動するよう指示を送る。続いて制御部１３４はモータコントローラ１３６に対し、現在位置からＺ軸の正の方向にＡ×１０μｍ移動するよう指示を送る。制御部１３４は、ピエゾコントローラ１３５とモータコントローラ１３６の位置決め完了の信号を、両方とも受けとった時点で、一連のステージ制御が完了したと判断する。これによって、制御部１３４によって試料ステージ１３０の移動量と受光用レンズステージ１３２の移動量を一定の比率Ａで連動して移動させることができる。

この比率を０以外の定数に設定可能で、この比率に従って連動して移動することが可能である。この比率は、あらかじめ記憶装置１３３内に保持された値を設定することもできる。また、この比率として、表示部１３７の操作画面上からユーザが入力した値を設定することもできる。また、この比率として、表示部１３７の操作画面上からユーザが入力した値に応じて、記憶装置１３３内に保持された複数の値を選択して設定することもできる。

明視野用光源１２９から出射した光の少なくとも一部はダイクロイックミラー１２４を透過して、受光用レンズ１１５を介して試料１１４を照明する。試料１１４を透過した光は励起用レンズ１１３、ダイクロイックミラー１１２、ミラー１２５、結像レンズ１２６を経て、２次元センサ１２７のセンサ面に、試料１１４の明視野像を結ぶ。制御部１３４で２次元センサ１２７の出力を読み取ることで、明視野像情報を得ることができる。取得した明視野像情報は表示部１３７の操作画面上に画像として出力される。そのほか、明視野像情報は、各種媒体（電子データや印刷物）に出力してもよい。試料ステージ１３０や受光用レンズステージ１３２、励起用レンズステージ１３１を動かしながら明視野像を取得することで、試料１１４の中のＣＡＲＳ顕微鏡で観察したい部位を探すことができる。

（レンズの選択）
本実施例の走査型顕微鏡１００は、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５を備える。

励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５として、顕微鏡用の各種対物レンズを含む各種光学レンズを用いることができる。また、同様の働きをもつ凹面鏡やその組合せなどを用いても良い。

対物レンズには各種のカップリング媒質を想定して設計されたレンズ、すなわち各種カップリング媒質用のレンズが存在する。ここでカップリング媒質とは、レンズの試料側表面を覆う媒質のことを指す。例えば、カップリング媒質として水を想定した水浸レンズ、同じくオイルを想定した油浸レンズ、空気を想定した空気用レンズ（非液浸レンズ）などがある。

このような各種レンズの中から、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せとして、異なるカップリング媒質を想定して設計したレンズを組み合わせてよい。異なるカップリング媒質に対して設計したレンズ同士の組み合わせを用いることで、レンズ選択の自由度を高めることができる。例えば、水浸の励起用レンズ１１３と空気用（非液浸）の受光用レンズ１１５の組み合わせを用いることができる。この場合、励起光１４４を大きな開口数の励起用レンズ１１３で集光することで励起効率を高め、生成するＣＡＲＳ光強度を高めつつ、空気用の受光用レンズ１１５による使い勝手の良さを両立することができる。他にも例えば、油浸の励起用レンズ１１３と空気用（非液浸）の受光用レンズ１１５の組み合わせであれば、励起用レンズ１１３の開口数をより大きくすることも可能なため、より大きなＣＡＲＳ光強度を得ることが可能になる。

励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せの１つは、励起用レンズ１１３のカップリング媒質の屈折率Ｒ１と受光用レンズ１１５のカップリング媒質の屈折率Ｒ２について、Ｒ１≠Ｒ２である。このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の組合せの１つではＲ１＞Ｒ２であり、この場合は励起用レンズ１１３のカップリング媒質の屈折率がより大きいために、励起用レンズ１１３の開口数をより大きく取ることが可能で、ＣＡＲＳ光生成効率を高めることができる。また、このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の別の組合せの１つではＲ１＜Ｒ２であり、この場合は受光用レンズ１１５のカップリング媒質の屈折率がより大きいために、ＣＡＲＳ光の受光効率（生成したＣＡＲＳ光の光量のうち、受光用レンズ１１５に入射する光量の割合）、および検出効率（生成したＣＡＲＳ光の光量のうち、開口部１２２を通過して分光検出器１１９に入射するに入射する光量の割合）を高め、ひいては検出感度を高めることができる。

励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せの１つでは、励起用レンズ１１３のカップリング媒質の開口数Ｍ１と受光用レンズ１１５のカップリング媒質の開口数Ｍ２について、Ｍ１≠Ｍ２である。このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の組合せの１つではＭ１＞Ｍ２であり、励起用レンズ１１３の開口数がより大きいために、ＣＡＲＳ光生成効率を高めることができる。このとき、一般的に同じレンズ口径であれば開口数と作動距離（ＷＤ）は逆相関の関係にあるため、より長い作動距離を持つ受光用レンズ１１５を用いることで作業性を高めることができる。

また、このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の別の組合せの１つではＭ１＜Ｍ２であり、この場合は受光用レンズ１１５の開口数がより大きいために、ＣＡＲＳ光の受光効率および検出感度を高めることができる。このとき、より長い作動距離を持つ励起用レンズ１１３を用いることで作業性を高めることができる。

励起用レンズ１１３について、好ましい開口数は例えば０．８以上で、さらに好ましくは開口数０．９５以上である。試料１１４内でのストークス光とポンプ光のエネルギー密度を増加させ、ＣＡＲＳ光生成効率を向上させるためである。好ましい開口数を持つ励起用レンズ１１３としては液浸レンズを使ってよい。

また、励起用レンズ１１３として、色収差を補正したレンズを用いてよい。色収差を補正したレンズを用いることで、励起光１４４の強度やビームスポット形状への色収差の影響を低減し、偏りの少ないＣＡＲＳ信号およびＣＡＲＳスペクトルを検出することができる。

励起用レンズ１１３について、好ましい作動距離（ＷＤ）は大きければ大きいほど作業性が高まるので、また、深部観察を可能にするので好ましい。励起用レンズ１１３の作動距離は好ましくは０．１ｍｍ以上である。より好ましくは０．２ｍｍ以上であれば、一般的な厚み０．１７－０．１９ｍｍのカバーガラス越しに試料を観察できる。さらに好ましくは０．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１００μｍ以上、を観察しうる。さらに好ましくは１．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１０００μｍ以上、を観察しうる。

励起用レンズ１１３として水浸レンズを用いてよい。試料として、水溶液や細胞、組織、または細胞や組織を含む培養液やゲルやハイドロゲルを想定する場合、これらの試料の屈折率は水の屈折率に近いため、励起用レンズ１１３として水浸レンズを採用することで、球面収差の影響を押えることができる。特に試料の深部を観察する際に信号光強度と空間分解能の点で有利となる。

また、励起用レンズ１１３として油浸レンズや、その他の浸液を用いるよう設計されたレンズを用いてもよい。この場合、試料の成分として、ガラスやポリマーフィルムなど水より大きな屈折率をもつ材料を含むものを観察する際に、球面収差の影響を押さえることができる。また、水浸レンズよりさらに大きな開口数を得ることも可能になるため、試料中の励起光１４４の集光点においてより大きな励起光パワー密度を得ることができる。

励起用レンズ１１３として非液浸レンズ（空気用レンズ）を用いてもよく、この場合、液浸レンズよりも開口数の面では不利であるものの、カップリング媒質としての液体（浸液）が試料や試料を覆うカバーガラス等に触れることがないため、取り扱いを容易にすることができる。

色収差を補正した励起用レンズ１１３として、好ましくはアクロマートレンズを用いることで色収差の影響を低減することができる。さらに好ましくはアポクロマートレンズを用いることで、色収差の影響をさらに低減できる。また、ポンプ光とストークス光を含む領域で色収差を補正したレンズを用いることで、励起光１４４に近赤外光を含むＣＡＲＳにおいて色収差の影響を低減できる。近赤外領域を含む領域で色収差補正したレンズを用いることで、本実施例のように中心波長１０６４ｎｍのポンプ光を用いたＣＡＲＳにおいて、測定精度を向上することができる。なお、励起用レンズ１１３として、色収差を補正しないレンズを用いることで、コスト低減を図ることもできる。

受光用レンズ１１５には、各種レンズを用いてよく、各種の顕微鏡用対物レンズやコンデンサレンズを用いてもよい。

受光用レンズ１１５として、開口数の大きなレンズを用いることで、より多くのＣＡＲＳ光を受光し、開口部１２２を通して分光検出器１１９へと導くことができ、受光効率および検出感度を上げることができる。このような受光用レンズ１１５の開口数は好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、さらに好ましくは０．９以上、最も好ましくは１．２以上である。

受光用レンズ１１５について、好ましい作動距離（ＷＤ）は大きければ大きいほど作業性が高まるので、また、深部観察を可能にするので好ましい。受光用レンズ１１５の作動距離は好ましくは０．１ｍｍ以上である。より好ましくは０．２ｍｍ以上であれば、一般的な厚み０．１７－０．１９ｍｍのカバーガラス越しに試料中で生成したＣＡＲＳ光を検出できる。さらに好ましくは０．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１００μｍ以上、を観察しうる。さらに好ましくは１．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１０００μｍ以上、を観察しうる。

このような受光用レンズ１１５として水浸レンズを用いることで、より大きな開口数を得ることができる。また、受光用レンズ１１５として油浸レンズを用いることで、さらに大きな開口数を得ることができる。また、受光用レンズ１１５として、その他の浸液を用いるよう設計されたレンズを用いることもできる。

また、受光用レンズ１１５として非液浸レンズ（空気用レンズ）を用いてもよく、この場合、液浸レンズよりも開口数の面では不利であるものの、カップリング媒質としての液体（浸液）が試料や試料を覆うカバーガラス等に触れることがないため、取り扱いを容易にすることができる。

（イメージング用の機構）
本実施例の走査型顕微鏡１００は、図１中のＸＹＺ軸方向に移動可能な３つの移動軸を持つ試料ステージ１３０、Ｚ軸方向に移動可能な軸を持つ受光用レンズステージ１３２、Ｚ軸方向に移動可能な軸を持つ励起用レンズステージ１３１を備える。制御部１３４は、短パルスレーザ光源１０１、分光検出器１１９、試料ステージ１３０、受光用レンズステージ１３２、励起用レンズステージ１３１の各部の動作を同期して制御する機能を備える。制御部１３４は、これらを連動することで、以下のようにＣＡＲＳイメージを取得することができる。

制御部１３４は、試料ステージ１３０を移動させて「測定対象領域」を走査しながら、短パルスレーザ光源１０１および分光検出器１１９によるＣＡＲＳスペクトルを検出させるよう制御する。制御部１３４は試料ステージ１３０の現在位置から、試料１１４中の測定点の座標を算出する。ＣＡＲＳイメージ中の画素の座標と、試料１１４中の測定点の相対座標を対応付け、検出したＣＡＲＳスペクトルをＣＡＲＳイメージ中の画素に対応づける。各画素に対応付けたＣＡＲＳスペクトルから代表値を算出し、代表値を色や輝度に変換して画素に割り当てることで、ＣＡＲＳイメージを生成する。生成したＣＡＲＳイメージは表示部１３７にて画像として出力する。

制御部１３４は、明視野用光源１２９、明視野用カメラ１２７で取得した明視野画像を合せて表示部１３７や紙面やその他の媒体へ出力することができる。出力の様式としては、明視野画像とＣＡＲＳイメージを並べても、明視野画像とＣＡＲＳイメージを重畳してもよい。

本実施例では、制御部１３４は記憶装置と入出力ポートを備えた電子回路を備え、表示部１３７は制御部１３４に接続された液晶モニタである。制御部１３４の内部または外部に接続された記憶装置には、制御に必要なソフトウェアと制御パラメータが電子データとして保持されている。

図６は、本実施例のＧＵＩ１６０の概要を示した模式図である。ＧＵＩ１６０は表示部１３７上に表示される。ＧＵＩ１６０上には、明視野画像表示領域１６１、ＣＡＲＳイメージ表示領域１６４、自動焦点合わせボタン１６５、補正用パラメータ設定用ＧＵＩ１６６、受光用レンズ位置ボックス１７１、試料ステージ座標ボックス１７２、試料走査範囲ボックス１７３、ターゲット波数ボックス１７５が配置されている。

明視野画像表示領域１６１には、明視野用カメラ１２７で取得した明視野画像をリアルタイムに表示できる。ＣＡＲＳイメージ表示領域１６４には、明視野画像１６３にＣＡＲＳイメージ１６２を重ね合わせて表示できる。試料ステージ座標ボックス１７２には試料ステージ１３０の現在位置座標を表示したり、座標を入力することで指定位置に試料ステージ１３０を移動するようユーザから指示したりすることができる。試料走査範囲ボックス１７３は、測定対象領域を指定するための情報を表示、入力することができる。例えば、試料ステージ座標ボックス１７２の座標を始点、試料走査範囲ボックス１７３の座標を終点とし、始点と終点を対角の２点とする直方体を測定対象領域として指定できる。または、試料走査範囲ボックス１７３には、試料ステージ座標ボックス１７２の座標を始点とした差異の終点までのオフセット値を入力しても良い。自動焦点合わせボタン１６５をユーザが押下すると、後述する図２中ステップ２０５の焦点合わせ動作を自動実行する。補正用パラメータ設定用ＧＵＩ１６６上には、励起側カップリング媒質選択ボックス１６７、受光側カップリング媒質選択ボックス１６８、励起側カップリング媒質屈折率ボックス１６９、受光側カップリング媒質屈折率ボックス１７０、補正係数ボックス１７４がある。励起側カップリング媒質選択ボックス１６７、受光側カップリング媒質選択ボックス１６８は、それぞれ励起側カップリング媒質１４０、受光側カップリング媒質１４１の物質名を表示と入力できる。励起側カップリング媒質屈折率ボックス１６９、受光側カップリング媒質屈折率ボックス１７０には、それぞれ励起側カップリング媒質１４０、受光側カップリング媒質１４１の屈折率の設定値を表示、入力できる。これらの屈折率の設定値は、後述する図２中ステップ２０９で、焦点合わせ状態を維持する動作のための制御パラメータとして利用される。補正係数ボックス１７４は、後述する補正係数αの値を表示したり、ユーザから入力したりすることができる。受光用レンズ位置ボックス１７１には、受光用レンズ１１５または受光用レンズステージ１３２の少なくともＺ座標を含む現在位置座標を表示することができ、また、この座標を変更することで受光用レンズ１１５および受光用レンズステージ１３２の移動をユーザから指示することができる。１７６焦点合わせモード切換ボタンは、現在の焦点合わせモードを表示し、ユーザがクリックすることで焦点合わせモードを切換可能である。同モードがＯＮのときには、焦点合わせ状態を維持するように各種ステージを連動して制御する。ＯＦＦの時には、この連動制御を無効にする。

ターゲット波数ボックス１７５には、焦点合わせや，補正係数αの算出，ＣＡＲＳイメージの表示などの目的に用いるＣＡＲＳ光のターゲット波数を表示と入力することができる。ターゲット波数ボックス１７５は前記の複数目的に応じて，ＧＵＩ１６０上に複数個備えてもよい。

（測定点の位置調整と焦点合わせ）
図２と図３はそれぞれ、本実施例の走査型顕微鏡１００で試料をイメージングする際の動作を説明したフローチャートと模式図である。

図２のフローチャートに基づきでイメージング動作の手順を説明する。フローチャートは２０１のＳＴＡＲＴから手順を開始する。まずステップ２０２で装置の電源を投入する。短パルスレーザ光源１０１や各種ステージ、分光検出器１１９、制御部１３４、明視野用光源１２９を含む各部を起動し、動作を安定させる。次のステップ２０３で、試料を試料ステージ１３０に載せて固定する。ステップ２０４では試料の観察したい部位が顕微鏡の視野付近に来るように、試料位置の粗調整を行う。位置の確認は目視やＧＵＩ１６０上の明視野画像表示領域１６１に表示される顕微鏡の明視野像を参考に行う。位置の調整は、手動またはＧＵＩ１６０を介した各種ステージの移動、主に試料ステージ１３０の移動によって行う。

次のステップ２０５では焦点合わせを行う。その目的は、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率を上げることである。本実施例での焦点合わせの方法は、受光用レンズ１１５を受光用レンズステージ１３２によって図３中のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向）に移動しながらＣＡＲＳ光の強度を分光検出器１１９で測定し、その強度が最大となるよう受光用レンズ１１５の位置を定めることによる。焦点合わせ後の配置では、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系によって、測定点１５０の像は開口部１２２の位置に投影される。

図３（ａ）は焦点合わせ前の光路を示した模式図である。図中の矢印１４６と矢印１４７はそれぞれ、励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５の進行方向を表す。励起用レンズ１１３を透過した励起光１４４は、励起側カップリング媒質１４０中を進み、試料１１４の表面で屈折して一点に集光する。この点においてＣＡＲＳ光１４５が生成するため、この励起光１４４の集光点を測定点１５０と呼ぶ。なお本実施例では、励起光１４４は平行光となるよう配置しているので、測定点１５０は励起用レンズ１１３の焦点と一致する。図３（ａ）は焦点合わせ実施前の状態なので、測定点１５０と受光用レンズ１１５の焦点１５１とは一致していない。このとき、生成したＣＡＲＳ光は試料１１４と受光側カップリング媒質１４１中を進んで受光用レンズ１１５に入射して屈折するが、屈折した後のＣＡＲＳ光１４５は平行光にはならない。この時、分光検出器１１９で検出されるＣＡＲＳ光１４５の光量は最大ではない。

図３（ｂ）は焦点合わせ完了後の光路の模式図である。分光検出器１１９で検出されるＣＡＲＳ光１４５の光量が最大となるように、受光用レンズ１１５の位置が調整されている。このとき、測定点１５０と受光用レンズ１１５の焦点位置は一致しており、受光用レンズ１１５を透過した後のＣＡＲＳ光１４５は平行光となる。本実施例の走査型顕微鏡１００では、集光レンズ１２０の焦点がスリット１２１の開口部１２２の中央に一致するように配置している。このため、図３（ｂ）のように受光用レンズ１１５を透過したＣＡＲＳ光が平行光として集光レンズ１２０に入射するときに、スリット１２１の開口部１２２を通過して分光検出器１１９に入射するＣＡＲＳ光の量が最大になる。

なお、他の好ましい実施例においては、焦点合わせ完了後の励起用レンズ１１３の焦点位置と受光用レンズ１１５の焦点１５１の位置は必ずしも一致しなくてもよい。たとえば、あえて平行光でない励起光１４４を励起用レンズ１１３に入射する場合は、励起光１４４の集光点である測定点１５０は励起用レンズ１１３の焦点と一致しないが、測定点１５０と受光用レンズの焦点１５１の位置が一致すればよい。このような例は、特に励起光１４４を構成するポンプ光またはストークス光のいずれかまたは両方に、広帯域光などの非単色光を用いた多色ＣＡＲＳ顕微鏡において有用である。この際、各集光点の位置調整は、例えば励起用レンズ１１３やコリメータ１０６、コリメータ１１１などの調整によって、励起光１４４の発散収束状態を変更することにより実現できる。したがって、この場合の励起光１４４は必ずしも平行光ではなく、測定点１５０はポンプ光の集光点とストークス光の集光点の重なりの領域である。

また、集光レンズ１２０の焦点とスリット１２１の開口部１２２が一致していない配置の場合、焦点合わせ後の受光用レンズ１１５の焦点１５１の位置は、測定点１５０と一致しなくてよい。

上記の焦点合わせにおいてＣＡＲＳ光１４５を検出する際，特定波長の光のみを検出しても良い。このために，制御部１３４の指示により，受光用レンズ１１５と分光検出器１１９の間にバンドパスフィルタを挿入してもよい。または，制御部１３４の指示によって分光検出器１１９の設定を変更したり，分光検出器１１９で得られたスペクトルから制御部１３４での計算処理によって特定帯域のデータのみを抽出したりしてもよい。この場合，特定物質のＣＡＲＳ光のみに注目することで，焦点合わせ状態をＳＮ比よくモニタし，より精度の高い焦点合わせを実現できる。特に，測定対象の物質があらかじめ決められている場合，たとえば水溶液中の有機物を測定したい場合などには，それ以外の物質の影響によって誤った位置に焦点合わせしてしまうリスクを低減できるのでよい。この場合，測定対象の物質の指定は，物質名や，物質のＣＡＲＳスペクトル中のピーク位置を指定してよく，ピーク位置は，絶対波長やラマンシフトを波長または波数として指定してよい。これらの指定は，表示部１３７上のＧＵＩを用いてユーザに直接入力させても，選択肢から選択させてもよく，記憶装置１３３にあらかじめ保持された情報によってもよい。

上記の焦点合わせにおいてＣＡＲＳ光１４５を検出する際，スペクトルの全部または部分の帯域を分光検出器１１９で検出してよい。または，複数の帯域を検出しても良い。光量の最大値を求める際に用いる光量としては，検出したスペクトル中の最大値や各種平均値を用いてよい。これらの場合，測定点１５０に存在する物質組成の影響を平均化できるため，より安定的に焦点合わせを実施することができる。

次のステップ２０６では、試料位置の微調整と測定対象領域の設定を行う。図３の測定対象領域１４８は、以降のステップでＣＡＲＳイメージを取得する対象となる、試料中の領域であり、ユーザの意志により決定される。本ステップ２０６では、この測定対象領域１４８を測定対象として指定する。具体的には、主に明視野像を確認しながら試料ステージ１３０を移動し、励起光１４４の散乱光などを頼りに測定点１５０の位置が、測定対象領域１４８の端に位置するようにする。その上で、表示部１３７上のＧＵＩを用いて測定対象領域１４８の各軸方向の幅を指定することで、現在の測定点１５０の位置を起点とした測定対象領域１４８の範囲を設定する。制御部１３４は、設定された測定対象領域１４８の範囲情報から、測定時の走査範囲パラメータを決定し、記憶装置１３３に記憶する。

ステップ２０７では測定条件を設定する。例えば、測定時の１点あたりの露光時間や走査時の移動速度などのパラメータを設定する。設定方法としては、表示部１３７上のＧＵＩからユーザに入力させてもよく、記憶装置１３３中の情報や、外部記憶上の電子ファイル中の情報を用いてもよい。なお、ステップ２０７を実施するタイミングは、装置電源ＯＮ２０２から、測定開始指示２０８の間のいつでもよい。

ステップ２０８では、ユーザから測定開始の指示を出す。

ステップ２０９では、試料１１４上を測定点１５０が走査しながら、ＣＡＲＳ光１４５およびＣＡＲＳスペクトルを検出する。図３（ｃ）は、ステップ２０９の途中の状態を示している。測定対象領域１４８の中を、図中に示した測定予定点１５３の各点をラスタースキャンしながら、ＣＡＲＳスペクトルを測定する。ここでラスタースキャン（Ｒａｓｔｅｒｓｃａｎ）とは、２次元の画像を、まず測定点を１次元的にスキャン（走査）して線上の測定データを得て、次いでその直角方向にその線でスキャンして、２次元の面の点で測定データを得る方法である。図３（ｃ）は、測定済みの点の集合１４９として示した各点を測定点として、ＣＡＲＳスペクトルを測定し終えた状態であり、この後測定点１５０の位置のＣＡＲＳスペクトルを測定する。ステップ２０６で設定された走査範囲パラメータで規定される走査と測定の動作を終えると、全ての測定予定点１５３での測定は完了するので、次のステップに進む。

ステップ２１０では、測定が終了した旨をユーザに報告する。これには、例えば表示部１３７上のＧＵＩを用いてよい。

ステップ２１１では、ユーザが前ステップの測定終了の報告を確認した上で、試料１１４を試料ステージ１３０から撤去する。

ステップ２１２では、装置電源をＯＦＦする。

最後に２１３のＥＮＤでイメージング動作の手順のフローチャートは終了となる。

（焦点の調整）
図２のフローチャート中のステップ２０９中の動作について、図４、図５を用いてより詳細に説明する。

図４，図５は、ステップ２０９中の、測定点１５０と受光用レンズの焦点１５１の位置関係を示した模式図である。ここで説明する例では、試料１１４はガラス１４３とガラス１４２に挟まれている。ただし、ガラス１４３とガラス１４２が無くとも、以下で説明する現象に本質的な違いは無いため、このような試料１１４を測定する場合にも適用できる。励起用レンズ１１３を透過した励起光１４４は、励起側カップリング媒質１４０、ガラス１４２、試料１１４、ガラス１４３、受光側カップリング媒質１４１、の５層の中を進んで受光用レンズ１１５に到達する。前記５層の図中Ｚ軸方向（励起光１４４の光軸方向）の厚みはそれぞれｄ_１、ｄ_２、ｄ_３、ｄ_４、ｄ_５であり、屈折率はそれぞれ、ｎ_１、ｎ_２、ｎ_３、ｎ_４、ｎ_５である。

試料１１４とガラス１４３とガラス１４２は共に、試料ステージ１３０によって光軸方向に移動することができる。ここで、試料ステージ１３０によって光軸方向に移動される物体を試料ステージによる移動体１５９と総称する。試料ステージによる移動体１５９には、たとえば前述のように試料１１４とガラス１４３とガラス１４２からなっていてもよく、試料１１４だけの場合もありうる。また、より多くの屈折率の異なる材料からなっていてもよく、いずれの場合でも以下の操作を用いることができる。

励起用レンズ１１３は、励起用レンズステージ１３１によって光軸方向に移動することができる。受光用レンズ１１５は、受光用レンズステージ１３２によって光軸方向に移動することができる。

図４（ａ）は、焦点合わせがなされた状態を示した模式図である。励起光１４４の集光点である測定点１５０は、受光用レンズ１１５の焦点１５１と一致しており、ＣＡＲＳ光１４５の分光検出器１１９による検出効率は最大となっている。

図４（ａ）では、励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５をともに平行光に保つという条件で焦点合わせを行ってある。この条件下で、励起用レンズ１１３、試料ステージ１３０、受光用レンズ１１５を光軸方向に移動することで焦点合わせを行った場合、ｆ_１、ｆ_２はそれぞれ、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の焦点距離であるとき、次の関係を満たす。

ｆ_１＋ｆ_２＝ｄ_１／ｎ_１＋ｄ_２／ｎ_２＋ｄ_３／ｎ_３＋ｄ_４／ｎ_４＋ｄ_５／ｎ_５・・・式１
したがって、より一般的には図５（ｇ）において、試料ステージ１３０、励起用レンズステージ１３１、受光用レンズステージ１３２を動かす際に、
Ｄ_１／Ｎ_１＋Ｄ_５／Ｎ_５＝一定・・・式２
という関係式を満たすように制御することで、焦点合わせされた状態を維持することができる。ここで、Ｄ_１は励起光１４４が励起側カップリング媒質１４０の中を通る距離であり、ここでは励起用レンズ１１３と試料ステージによる移動体１５９の距離を用いてよい。Ｄ_５はＣＡＲＳ光１４５が受光側カップリング媒質１４１の中を通る距離であり、ここでは受光用レンズ１１５と試料ステージによる移動体１５９の距離を用いてよい。Ｎ_１は励起側カップリング媒質１４０の屈折率、Ｎ_５は受光側カップリング媒質１４１の屈折率である。

また、焦点合わせの考え方として、受光用レンズ１１５の焦点１５１の代わりに、測定点１５０について、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点を、分光検出器１１９の前のスリット１２１の開口部１２２と一致させてもよい。ここで像点とは、測定点１５０から出たＣＡＲＳ光１４５を構成する複数本の光線が、光学系によって再び収束する点である。測定点１５０の像点が開口部１２２に一致するとき、ＣＡＲＳ光１４５のうち分光検出器１１９で検出される成分の割合が極大になる。この考え方によれば、励起光１４４やＣＡＲＳ光１４５は必ずしも平行光でなくともよくなり、光学系の自由度が増す。

図４（ｂ）は、ステップ２０９での走査において試料１１４を図中のＺ軸方向（励起光の光軸方向）に移動した直後の状態を示した模式図である。なお、Ｚ軸の向きは、図４中の右上に示したように、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とし、移動量の向きもこれに従う。図４（ｂ）は、図４（ａ）の状態から試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量ΔΔｄ_１だけ移動しており、これに伴い試料１１４とガラス１４２、ガラス１４３が移動量ΔΔｄ_１だけ移動している。その結果、受光レンズの焦点１５１の位置は測定点１５０と一致していない。測定点１５０で生成したＣＡＲＳ光１４５は平行光になっていないので、測定点１５０の像点が開口部１２２に一致せず、分光検出器１１９による検出効率が落ちてしまう。そこで、ステップ２０９の間にステップ２０５と同様の焦点合わせの動作を繰り返すことで、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率をより高め、より大きな信号強度を得ることが可能になる。しかし、焦点合わせ動作の分だけ測定時間はのびることになる。さらに試料１１４のＺ軸方向（励起光の光軸方向）への走査回数が増えれば、その分だけ焦点合わせ動作の回数が増え、全体の測定時間はさらに長くなってしまう。なお、図４の例ではｎ_１とｎ_３がおよそ等しい例をしているため、図４（ａ）と図４（ｂ）で測定点１５０のＺ軸方向の位置はほぼ一致しているように描かれているが、一般的には試料１１４の移動に伴い測定点１５０は移動する。

図４（ｃ）では、試料ステージ１３０が移動量ΔΔｄ_１だけ移動したのに合せて、受光用レンズステージ１３２によって受光用レンズ１１５の位置を移動量ΔΔｄ_５だけ移動することにより、焦点合わせした状態を回復している。
このとき、ΔΔｄ_５の値は以下のように求めてよい。図４（ｃ）に示された焦点合わせされた受光用レンズ１１５のＺ軸方向の位置Ｚは、励起用レンズ１１３の位置を基準（Ｚ＝０）として、式３で表される。

Ｚ＝ｄ_１＋ｄ_２＋ｄ_３＋ｄ_４＋ｄ_５
＝ｄ_１＋ｄ_２＋ｄ_３＋ｄ_４＋ｎ_５（ｆ_１＋ｆ_２）－ｎ_５（ｄ_１／ｎ_１）－ｎ_５（ｄ_２／ｎ_２）－ｎ_５（ｄ_３／ｎ_３）－ｎ_５（ｄ_４／ｎ_４）・・・式３
ただしｆ_１、ｆ_２はそれぞれ、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の焦点距離である。このとき、試料ステージ１３０をＺ軸方向に微小量動かした時のＺの変化はＺのｄ_１についての偏微分で得られる。ｄ_２、ｄ_３、ｄ_４は定数でありｄ_１とは独立であることに注意して、
∂Ｚ／∂ｄ_１＝１－ｎ_５／ｎ_１＝（一定）・・・式４
よって、ΔΔｄ_１とΔΔｄ_５の関係は比例関係である。その比例定数を用いて、補正係数を、
α＝ΔΔｄ_５／ΔΔｄ_１・・・式５
と定義する。補正係数αは励起側カップリング媒質１４０の屈折率と受光側カップリング媒質１４１の屈折率のみによって決まる定数となる。すなわち、式５によってαの値を定めてよい。

α＝１－ｎ_５／ｎ_１・・・式６
これを用いて、試料ステージ１３０を移動量ΔΔｄ_１移動したときに、受光用レンズ１１５を
ΔΔｄ_５＝ΔΔｄ_１×α＝ΔΔｄ_１×（１－ｎ_５／ｎ_１）・・・式７
の移動をすれば、焦点合わせされた状態を維持することができる。これによって、ステップ２０５と同様の焦点合わせ動作をステップ２０９の中で実施する必要は無くなり、ステップ２０９の所要時間を短縮し、全体の測定時間も短縮できる。

補正係数αの値を０に設定した場合は、受光用レンズ１１５の位置補正を行わない従来と同じ動作が可能である。この補正係数αの値を正の値（α＞０）に設定してもよい。この場合ｎ_５＜ｎ_１となるレンズの組合せが使用できる。この補正係数αの値を負の値（α＜０）に設定してもよい。この場合ｎ_５＞ｎ_１となるレンズの組合せが使用できる。なお、補正係数αの値を１に設定した場合は、試料１１４と受光用レンズ１１５との距離を一定に保つことができる。

前述のように、好ましい実施形態の一つでは、励起用レンズ１１３は水浸レンズで、受光用レンズ１１５は空気用レンズ（非液浸レンズ）である。このとき、励起側カップリング媒質１４０が水、受光側カップリング媒質１４１が空気であるので、試料ステージ１３０の移動量に対する受光用レンズ１１５の好ましい移動量の比率は、水と空気の屈折率のみで定まる。水の屈折率を１．３３３、空気の屈折率を１．０００とすると、前記の比率は０．２４９８となる。よって、試料ステージ１３０の移動量から受光用レンズ１１５の移動量を定める係数を０．２４９８に定めてもよい。または、温度変化や夾雑物による水や空気の屈折率の変動を４％程度考慮して、前記の係数を０．２４から０．２６の間の任意の定数に定めても良い。また、前記の変動を２０％程度考慮して、前記の係数を０．２から０．３の間の任意の定数に定めても良い。

好ましい実施形態の一つでは、前記の例とは逆に、励起用レンズ１１３は空気用レンズ（非液浸レンズ）で、受光用レンズ１１５は水浸レンズである。このとき、励起側カップリング媒質１４０が空気、受光側カップリング媒質１４１が水であるので、試料ステージ１３０の移動量に対する受光用レンズ１１５の好ましい移動量の比率は、水と空気の屈折率のみで定まる。水の屈折率を１．３３３、空気の屈折率を１．０００とすると、前記の比率は、－０．３３３となる。よって、試料ステージ１３０の移動量から受光用レンズ１１５の移動量を定める係数を－０．３３３３に定めてもよい。または、温度変化や夾雑物による水や空気の屈折率の変動を４％程度考慮して、前記の係数を－０．３２から－０．３４６の間の任意の定数に定めても良い。また、前記の変動を２０％程度考慮して、前記の係数を－０．２７８から－０．４の間の任意の定数に定めても良い。

また、ほかの好ましい実施形態では、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１は水、空気、オイル、グリセロール、シリコーンオイルなどである。表１は、あらかじめこれらの媒質の屈折率から計算した、媒質の組合せと補正係数αの補正係数αの値の表の例である。

表中のＡとＢはそれぞれ、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１に対応する。表１のような対応表を記憶装置１３３に保持しておいてよく、顕微鏡の使用時に適宜これらの値を取り出して補正係数αとして設定してよい。これによって、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１のいずれか、または両方について、複数のレンズに対応する製品を提供できる。また、ユーザが測定目的や試料の種類に応じてレンズを切り替えて使用することも可能になる。

また、表２に示すように、媒質名と屈折率の対応表を記憶装置１３３に保持してもよい。なお、表中のＲ．Ｉ．は屈折率を表す。制御部１３４で、この対応表の屈折率を用いて、補正係数αを算出して用いても良く、その場合は表１のような対応表よりも行数が少なくてよいため、記憶装置１３３中に占める容量を節約できる。

また、記憶装置１３３中に保持した補正係数α、屈折率、または媒質名の複数の選択肢のうち、どれを用いるかを選択する手段としては、ユーザに選択を促して選択情報の入力を受け付ける表示部１３７上のＧＵＩを用いてよい。このときユーザが入力する情報としては、αの値そのもの、１つの屈折率、２つの屈折率、１つの媒質名、２つの媒質名、でよい。これらの入力値と表１の対応表や表２の対応表を用いて補正係数αを算出してよい。αの算出法として、２つの屈折率を数５のｎ_５とｎ_１に代入してαを求めてよい。なお、１つの媒質名、または１つの屈折率だけを入力する場合は、他方の媒質名または屈折率はデフォルト値を用いればよい。ユーザが入力する形態としては、数値のテキスト入力、数値のスライドバーでの指定、プルダウンメニューによる数値または物質名の選択、ラジオボタンによる数値または物質名の選択、などを用いてよい。

また、記憶装置１３３に保持した複数の値のうちどれを用いるかを選択する手段として、装置に備え付けられたセンサまたは電子回路が励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５のいずれかまたは両方の、レンズの種類や媒質の屈折率を認識し、認識結果を入力として制御部１３４が適切な値を選択してもよい。

物質の屈折率は一般に，考慮する光の波長によって変わるが，ＣＡＲＳでは以下のように複数の波長を含む光を扱う必要がある。まず、ＣＡＲＳの励起光１４４はポンプ光とストークス光という波長の異なる光からなる。多色ＣＡＲＳにおいては、励起光１４４中のストークス光成分もまた複数波長を含む広帯域光を用いる必要がある。さらには、多色ＣＡＲＳにおけるＣＡＲＳ光１４５も複数波長を含む広帯域光である。したがって、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１の物質がそれぞれ同じであっても、複数波長のどの波長に着目するかで、前記のα算出時に用いるために式５に代入する２つの屈折率ｎ_５とｎ_１の値は異なってくる。

例えば、多色ＣＡＲＳでは、励起光１４４は狭帯域光であるポンプ光と広帯域光であるストークス光が励起側カップリング媒質１４０中を透過し、広帯域光であるＣＡＲＳ光１４５が受光側カップリング媒質１４１中を透過する。

そこで、好ましくは、励起側カップリング媒質１４０のポンプ光の中心波長に対する屈折率をｎ_１として用いる。また、受光側カップリング媒質１４１のターゲット波長に対する屈折率をｎ_５として、それぞれ指定する。

ｎ_１を考慮する際の波長としてポンプ光の中心波長を選ぶ理由は、ＣＡＲＳ光発生に対してポンプ光はストークス光より大きな寄与をもつためである。

なお、ターゲット波長はユーザが最も興味を持つ分子のＣＡＲＳ光波長に対応するように選ぶ。具体的には、ポンプ光の波長からターゲット波数ボックス１７５に指定されたターゲット波数分だけ高波数（短波長）側にシフトした波長とする。

αを求める際に用いる波長を以上のように選ぶことによって、ユーザの最も興味を持っている分子に対応するＣＡＲＳ光の検出効率を極大にできる。

屈折率を考慮する波長は，任意の適切な波長に対する屈折率を用いてよく，例えば，波長５８９ｎｍに対する屈折率でもよい。短パルスレーザ光源１０１の波長や，ポンプ光の波長，励起光１４４波長や，ＣＡＲＳ光１４５の波長に対する屈折率を用いれば，より精度の高い焦点合わせが実現できるので良い。ＣＡＲＳ光１４５の波長の指定は，励起光１４４波長からの差分を波長や波数で指定してもよい。多色ＣＡＲＳの場合の励起光１４４の波長，ポンプ光の波長やＣＡＲＳ光１４５の波長の指定は，各光のスペクトルの帯域の中央値や，光強度のピーク位置を参考に設定してよい。たとえば，ＣＡＲＳ光１４５の波長として，励起光１４４の波長からのアンチストークスラマンシフトで表現して，１００ｃｍ－１～２０００ｃｍ－１を用いれば指紋領域のＣＡＲＳスペクトルをより感度よく測定可能であり，２０００ｃｍ－１～４０００ｃｍ－１を用いればＯ－Ｈ結合やＣ－Ｈ結合を多く含む，水や有機物をより感度高く測定できる。
また，例えば，前記のｎ１は励起光１４４の波長で，ｎ５は励起光１４４の波長から指定波数分だけずれた波長で，それぞれ屈折率を考慮してもよく，この場合，励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５の波長の違いを考慮したより高精度の焦点合わせを実現できる。

屈折率を考慮するための１つまたは複数の波長は，表示部１３７上のＧＵＩを用いてユーザに直接入力させても，選択肢から選択させてもよく，記憶装置１３３にあらかじめ保持された情報によってもよい。前記の屈折率の選択肢からの選択は，制御部１３４が励起光源１３９や分光検出器１１９の種類や設定を認識し，その結果に基づいて選択してもよい。

さらには，表２の対応表中に，波長ごとの屈折率の値も含めて，記憶装置１３３に保持しておき，選択された媒質名と波長の組合せから，屈折率を選択し，補完して算出して，用いても良い。

ステップ２０９で、測定点１５０の試料１１４中での走査は、試料ステージ１３０を固定したままで、励起用レンズ１１３を励起用レンズステージ１２３で移動することによってもよい。このとき、式２の関係を満たすように励起用レンズステージ１２３と受光用レンズステージ１３２を制御すればよい。たとえば、図５（ｆ）のように、励起用レンズ１１３のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とする）の移動量をΔΔｄ_ｅ、受光用レンズ１１５の移動量をΔｄ_ｒとすれば、一度焦点を合わせた状態を維持するためには、式５によって定まるαを用いてΔｄ_ｒ／Δｄ_ｅ＝－ｎ_５／ｎ_１となるように各ステージを制御すればよい。

また、ステップ２０９で、測定点１５０の試料１１４中での走査は、受光用レンズステージ１３２を固定したまま、試料１１４を試料ステージ１３０で、励起用レンズ１１３を励起用レンズステージ１２３で、それぞれ移動することによってもよい。このとき、式２の関係を満たすように励起用レンズステージ１２３と試料ステージ１３０を制御すればよい。たとえば、図５（ｅ）のように、励起用レンズ１１３のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とする）の移動量をΔｄ_ｅ、試料１１４の移動量を－Δｄ_ｓとすれば、一度焦点を合わせた状態を維持するためには、式５によって定まるαを用いて
Δｄ_ｅ／Δｄ_ｓ＝１＋ｎ_１／ｎ_５・・・式８
となるように各ステージを制御すればよい。

また、前記の例も含めて一般には、図５（ｇ）において励起用レンズ１１３とガラス１４２の間の距離Ｄ_１の変化をΔＤ_１（距離が増える方を正として）、受光用レンズ１１５とガラス１４３の間の距離Ｄ_５の変化をΔＤ_５とすれば（距離が増える方を正として）、いずの場合も、
ΔＤ_５／ΔＤ_１＝－Ｎ_５／Ｎ_１・・・式９
となるように各ステージを制御すればよい。

このような各ステージを特定の比例係数に従って連動させる制御は、ステップ２０１装置電源ＯＮからステップ２１２装置電源ＯＦＦまでの間で、有効な時期と無効な時期があるように設定される。少なくともステップ２０９では前記の制御は有効である。未だ焦点合わせが行われていないステップ２０５では、前記制御は無効に設定する。このような前記制御の有効、無効の切換は、装置が自動で行ってよいし、ＧＵＩ１６０上のボタンやラジオボタンなどを備えることで、ユーザに切換を指示する手段を提供してもよい。
ステップ２０９で焦点を合わせた状態を維持するために、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点を、分光検出器１１９の開口部１２２に一致させるよう制御してもよい。この場合、受光用レンズ１１５を透過した後のＣＡＲＳ光１４５は必ずしも平行光でなくてよい。具体的には、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を組合せレンズとして捉えて、その主点の位置、合成焦点距離、またはその両方を変化させればよい。例えば、図４（ｄ）に示したように、集光レンズ１２０の位置をＣＡＲＳ光１４５の光軸方向に移動してもよい。また例えば、受光用レンズ１１５または集光レンズ１２０に複合レンズに焦点距離調整機構を備えたものを用いて、その焦点距離が前記条件を満たすように調整してもよい。集光レンズの移動は、集光レンズステージ１３８によって移動することができる。

図４（ｄ）は、図４（ｂ）の状態から集光レンズ１２０を移動距離Δｄ_６だけ移動することで、焦点を合わせた状態を実現した状態である。測定点１５０で発生して矢印１４７の向きに進むＣＡＲＳ光１４５は、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系によって、分光検出器１１９前面のスリット１２１の開口部１２２に集められている。すなわち、測定点１５０の像点が開口部１２２の位置にあり、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率は極大となっている。ここで測定点１５０が移動したときに、測定点１５０の像点を開口部１２２の位置に保ち、焦点を合わせた状態を維持するために最適な集光レンズ１２０の移動距離Δｄ_６は以下のように求めればよい。

まず、図４（ａ）の状態から図４（ｂ）の状態まで、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量Δｄ_１だけ移動したとき、これに伴って測定点１５０と受光用レンズ１１５の空気換算距離ａは、次の式で表されるΔａだけ変化する。

Δａ＝Δｄ_１（１／ｎ_１－１／ｎ_５）・・・式１０
受光用レンズ１１５による測定点１５０の像点と受光用レンズ１１５との距離をｂ、受光用レンズ１１５による測定点１５０の像点と集光レンズ１２０との距離をｂ’、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０のレンズ２枚の光学系による測定点１５０の像点と集光レンズ１２０との距離ｃとすると、次の式が成り立つ。

１／ａ＋１／ｂ＝ｆ_１、１／ｂ‘＋１・ｃ＝ｆ_２・・・式１１
また、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０のレンズ２枚の光学系による測定点１５０の像点のＺ軸方向の位置Ｚ_１を、受光用レンズ１１５の位置を基準として表すと、
Ｚ_１＝ｂ－ｂ‘ ・・・式１２
式１１を変形して式１２に代入して次の式を得る。

Ｚ_１＝ｆ_１ａ／（ａ－ｆ_１）－ｆ_２ｃ／（ｃ－ｆ_２）＋ｃ・・・式１３
ここで、Ａ＝ａ－ｆ_１、Ｃ＝ｃ－ｆ_２とおけば、
Ｚ_１＝｛ｆ_１（Ａ＋ｆ_１）／Ａ｝－｛ｆ_２（Ｃ＋ｆ_２）／Ｃ｝＋（Ｃ＋ｆ_２）
・・・式１４
測定点１５０がＺ軸方向に微小量動いた時、その像点の位置Ｚ_１の変化はＺ_１のａについての偏微分で得られる。

∂Ｚ_１／∂ａ
＝（∂Ｚ_１／∂Ａ）・（∂Ａ／∂ａ）
＝－ｆ_１ ^２／Ａ^２＋（ｆ_２ ^２／Ｃ^２）・∂Ｃ／∂Ａ＋∂Ｃ／∂Ａ・・・式１５
Ｚ_１を一定に保つための条件は、式１５＝０なので、
｛１＋（ｆ_２ ^２／Ｃ^２）｝・∂Ｃ／∂Ａ＝ｆ_１ ^２／Ａ^２・・・式１６
∂Ｃ／∂Ａ＝（ｆ_１ ^２／Ａ^２）／｛１＋（ｆ_２ ^２／Ｃ^２）｝
＝｛ｆ_１ ^２／（ａ－ｆ_１）^２｝・｛（ｃ－ｆ_２）^２／｛（ｃ－ｆ_２）^２＋ｆ_２ ^２｝・・・式１７
ここで、集光レンズ１２０と開口部１２２の距離が焦点距離ｆ_２に近い場合は、（ｃ－ｆ_２）^２＜＜ｆ_２ ^２なので、
∂Ｃ／∂Ａ＝｛ｆ_１ ^２／（ａ－ｆ_１）^２｝・｛（ｃ－ｆ_２）^２／ｆ_２ ^２｝
＝｛ｆ_１ ^２／ｆ_２ ^２｝・｛（ｃ－ｆ_２）^２／（ａ－ｆ_１）^２｝
・・・式１８
試料ステージ１３０の移動量Δｄ_１に対して、集光レンズ１２０の望ましい移動量Δｃを算出するための補正係数を、β＝Δｄ_６／Δｄ_１と定義する。式１０と式１８から、
β＝Δｄ_６／Δｄ_１＝Δｃ／Δｄ_１
＝∂Ｃ／∂Ａ・Δａ／Δｄ_１
＝（ｆ_１ ^２／ｆ_２ ^２）｛（ｃ－ｆ_２）^２／（ａ－ｆ_１）^２｝（１／ｎ_１－１／ｎ_５）・・・式１９
さらに、測定点１５０が受光用レンズ１１５の焦点に近い場合（受光用レンズ１１５を通ったあとのＣＡＲＳ光１４５が平行光に近い場合）には、次の関係が成り立つ。

（ｃ－ｆ_２）^２／（ａ－ｆ_１）^２＝（ｆ_１／ｆ_２）^４・・・式２０
よって式１９は、
β＝（ｆ_１／ｆ_２）^６・（１／ｎ_１－１／ｎ_５）・・・式２１
したがってこのとき、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量Δｄ_１だけ移動したときに、集光レンズ１２０を移動量Δｄ_６＝β・Δｄ_１だけ移動すれば、図４（ｄ）のように、焦点を合わせた状態を実現でき、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率を極大にすることができる。またこのとき、集光レンズ１２０と開口部１２２の間の距離Ｄ_６の変化をΔＤ_６（距離が増える方を正として）、励起用レンズ１１３とガラス１４２の間の距離Ｄ_１の変化をΔＤ_１（距離が増える方を正として）とすればΔＤ_６とΔＤ_１を用いて
ΔＤ_６＝β×ΔＤ_１・・・式２２
となるように各ステージを制御してもよい。また、集光レンズ１２０と開口部１２２の間の距離と受光用レンズ１１５とガラス１４３の間の距離でも同様に類似した関係が成り立つ。

他の好ましい実施例として、ＣＡＲＳ光１４５を分光検出器１１９まで導くための光学系の一部に光ファイバを用いてもよく、この場合は分光検出器１１９の配置の自由度が高まるメリットがある。この場合、光ファイバの入射側開口を、本実施例の走査型顕微鏡１００のスリット１２１の開口部１２２と同等になるように配置すればよく、このような光学系においても焦点を合わせた状態を維持してステップ２０９の測定を行うことができる。

ステップ２０９で焦点を合わせた状態を維持するためには、前記のような、試料ステージ１３０と受光用レンズステージ１３２とを補正係数αを用いて連動する制御と、自動焦点合わせ制御を組み合わせた制御を行ってもよい。具体的には、最後に焦点合わせを実行してからのＺ軸方向の累積移動量を記憶装置１３３に保持しておいて、累積移動量が閾値に達するまでは、補正係数αに従って受光用レンズステージ１３２を移動することで焦点合わせを維持する。累積移動量が閾値に達した時点で、自動焦点合わせ制御を実行する。これによって、試料ステージ１３０のＺ軸方向への移動時に毎回焦点合わせを実行する場合に比べて測定時間を短縮することができる。

なお、ここで用いる閾値としては任意の値を設定してよいが、測定点１５０のサイズより十分大きい長さでよく、例えば測定点１５０のサイズが１μｍ前後の場合、好ましい閾値は約１０倍の１０μｍ、または約１００倍の１００μｍ、または約１０００倍の１０００μｍである。この場合、それぞれ、試料中に１０μｍオーダー、１００μｍオーダー、１０００μｍオーダーの屈折率ムラが存在する場合に生じうる、焦点あわせのズレに対応し、このような試料に対しても、手動の焦点合わせを実行することなく測定を実行できる。

また、累積移動量と閾値を比較する際に、累積移動量の絶対値と閾値を比較してもよい。こうすることで、Ｚ軸の正負両方の向きに試料ステージ１３０を移動する場合にも対応できる。また、累積移動量の確認と焦点合わせの実行タイミングは、ステップ２０９の走査時でもよいし、手動またはＧＵＩを介して試料ステージ１３０を動作している時でもよい。

さらには、累積移動量と閾値をＺ軸方向以外の移動量について設定してもよい。例えば、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向、またはその両方について設定した場合、試料１１４自体が試料ステージ１３０や励起光１４４の光軸に対して傾きを持っていた場合に、Ｘ軸方向やＹ軸方向への試料ステージ１３０移動に伴って試料１１４表面のＺ軸方向の位置が変動してしまうことによって焦点合わせのズレが生じたとしても、そのズレが過大にならないよう制御することができる。

または、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動した際に毎回、または規定回数ごとに、自動焦点合わせ制御を実行してもよい。そして、各回の自動焦点合わせ制御を開始する時点で、補正係数αを用いて受光用レンズステージ１３２の位置座標を算出し、この座標を自動焦点合わせ実行時の受光用レンズステージ１３２の初期座標として採用する。これによって、自動焦点合わせにおける受光用レンズステージ１３２の位置座標の初期座標と、ベストの座標との乖離の期待値を小さくできるため、自動焦点合わせの信頼性向上と所要時間短縮が期待できる。

ＸＹ軸方向のサイズが比較的大きな試料１１４が傾いて保持されている場合など、試料ステージ１３０をＸＹ軸方向に移動した際に、これに伴って試料１１４が意図せずＺ軸方向に移動してしまう場合がある。本実施例を応用することで、このような場合にも対応することが可能である。

ステップ２０３で試料を設置してから、ステップ２０９の開始までの間のいずれかのタイミングで、試料ステージ１３０を３点以上の異なる点に移動し、各点で焦点合わせを実施する。各点での焦点合わせの設定パラメータ、ここでは受光用レンズステージ１３２のＺ座標と試料ステージ１３０のＸＹＺ座標と共に記憶装置１３３に保持しておく。

または、実際に焦点合わせを実施する代わりに、何からの方法で焦点合わせの参考となる値、たとえば試料１１４のＺ座標の代表値を測定しても良い。試料１１４のＺ座標としては、試料１１４の励起用レンズ１１３側の表面位置、試料１１４の受光用レンズ１１５側の表面位置、Ｚ軸方向の中心位置、ガラス１４２やガラス１４３のように試料１１４の容器や基板にあたる物体の表面や中心位置、試料１１４やその容器や基板に設けられた刻印や印刷などによる位置マーカの位置、等の座標を用いてよい。これらの方法で、３点以上で取得した焦点合わせの参考値から焦点合わせの設定パラメータを算出しても良い。

制御部１３４上での計算により、前記各点での焦点合わせの設定パラメータやその参考値から、試料１１４上のほかの位置での設定パラメータを補完または推定することが可能である。例えば、前記各点での試料ステージ１３０のＸ座標、Ｙ座標、受光用レンズステージ１３２のＺ座標を、それぞれａ_１、ａ_２、ａ_３として、３つ以上の前記各点をａ_１、ａ_２、ａ_３３次元空間上の点として表現できるので、各点を含む平面、曲面や、各点の回帰平面、曲面を求めることで、各点以外の位置での受光用レンズステージ１３２の望ましいＺ座標を求めることができる。これを用いて、試料ステージ１３０をＸＹ軸に移動する際に、自動的に受光用レンズステージ１３２を望ましいＺ座標に移動することができる。これによって、傾いて保持された試料１１４を走査する際にも、焦点合わせを維持することができる。

図７は、本実施例の走査型顕微鏡６００の基本的な構成例を示す模式図である。

走査型顕微鏡６００は、励起用レンズ１１３を透過した励起光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を検出器に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡１００と同様である。走査型顕微鏡６００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡１００と同様である。

走査型顕微鏡６００は、複数の狭帯域光からなる励起光６４４を出射する励起光源６３９を備える点が走査型顕微鏡１００と異なっている。励起光源６３９は、フォトニック結晶ファイバ１０５から出射された広帯域光から狭帯域光を抽出するＡＯＴＦ（音響光学可変フィルタ）６０７を備える。ＡＯＴＦ６０７は制御部１３４の指示により抽出する光の波長を調節可能である。また、励起光６４４が狭帯域光からなるために、生成されるＣＡＲＳ光６４５も狭帯域光である点と、そのためにＣＡＲＳ光６４５を検出する光検出器６１９は分光機能をもたない点も、走査型顕微鏡１００と異なっている。このような光検出器６１９として、光電子増倍管やフォトダイオードを用いてよい。この構成によって、走査型顕微鏡６００は単色ＣＡＲＳ測定が可能である。単色ＣＡＲＳを採用する場合、検出器に分光性能が必要でないので、多色ＣＡＲＳに比べ簡素な検出系の構成で実現することができる。

（単色ＣＡＲＳ用の別の狭帯域光源構成）上記では複数の狭帯域光からなる励起光６４４を出射する励起光源６３９として、広帯域光から狭帯域光の例を示したが、この代わりに狭帯域光を入力として別の波長の狭帯域光を出力するＯＰＯ（光パラメトリックオシレータ）のような光学素子を用いてもよい。この場合は、狭帯域光の光源である短パルスレーザ光源１０１の出力光を偏光ビームスプリッタ１０３で２つの光線に分割し、片方の光線をそのまま、他方の光線をＯＰＯによって波長変換したうえで、２つの光線をダイクロイックミラー１０８で合波することで、２つの波長の異なる狭帯域光パルス光の光源を実現できる。

ＣＡＲＳ光６４５は、光検出器６１９の前の有限の大きさを持つ開口部６２２を通過して、光検出器６１９の受光面に到達する。前記の開口部６２２とは、光検出器６１９の前に特段の絞りやスリットを設ける場合は、それらの開口部の１つまたは両方を指す。また、光検出器６１９の前に特段の絞りやスリットを設けない場合は、光検出器６１９の有限の大きさを持つ受光面を開口部６２２と考えてよい。その他の点は、実施例１の走査型顕微鏡１００と同様である。

走査型顕微鏡６００の焦点合わせでは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点が開口部６２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部６２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、ＣＡＲＳ光６４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。

走査型顕微鏡６００は、実施例１の走査型顕微鏡１００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。

図８は、本実施例の走査型顕微鏡７００の基本的な構成例を示す模式図である。

走査型顕微鏡７００は、励起用レンズ１１３を透過した光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を光検出器６１９に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡６００と同様である。走査型顕微鏡７００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡６００と同様である。

走査型顕微鏡７００は、単色の励起光７４４を出射する励起光源７３９を備える点が走査型顕微鏡６００と異なる。励起光源７３９は短パルスレーザ光源１０１を備える。

走査型顕微鏡７００は、以下のようにして２光子励起蛍光を検出可能である。励起光７４４は励起用レンズ１１３を透過して、試料１１４中の測定点１５０に集光される。励起光７４４により測定点１５０に存在する物質が２光子励起され、２光子励起蛍光７４５を生成する。受光用レンズ１１５を透過した２光子励起蛍光７４５は、開口部６２２を通過して光検出器６１９に到達して検出される。なお、２光子励起蛍光７４５でなく、３光子励起蛍光など、その他の多光子励起蛍光や、２次高調波、３次高調波、和周波、高次和周波を検出しても良い。この場合、ノッチフィルタ１１７、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の波長特性を適切に選択すればよく、また検出系として、実施例１で用いた分光検出器１１９とスリット１２１を用いてもよい。

走査型顕微鏡７００の焦点合わせは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点が開口部６２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部６２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、２光子励起蛍光７４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。

走査型顕微鏡７００は、実施例２の走査型顕微鏡６００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。

図９は、本実施例の走査型顕微鏡８００の基本的な構成例を示す模式図である。

走査型顕微鏡８００は、励起用レンズ１１３を透過した光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を光検出器６１９に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡７００と同様である。走査型顕微鏡８００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡７００と同様である。
走査型顕微鏡８００は、以下のようにして２光子励起蛍光を検出可能である。励起光７４４は励起用レンズ１１３を透過して、試料１１４中の測定点１５０に集光される。励起光７４４により測定点１５０に存在する物質が２光子励起され、２光子励起蛍光７４５を生成する。受光用レンズ１１５を透過した２光子励起蛍光７４５は、開口部６２２を通過して光検出器６１９に到達して検出される。

走査型顕微鏡８００では、励起光源７３９は短パルスレーザ光源１０１を備えるが、レーザ光源として連続波（ＣＷ）光源を用いても良い。

走査型顕微鏡８００では、２光子励起蛍光７４５でなく、３光子励起蛍光など、その他の多光子励起蛍光や、２次高調波、３次高調波、和周波、高次和周波を検出しても良い。この場合、ノッチフィルタ１１７、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の波長特性を適切に選択すればよく、また検出系として、実施例１で用いた分光検出器１１９とスリット１２１を用いてもよい。

走査型顕微鏡８００では、２光子励起蛍光７４５でなく、１光子で励起される蛍光を検出してもよい。この場合、蛍光の波長は励起光７４４の波長より長いので、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の仕様を適切に変更すればよい。例えば、ショートパスフィルタ１１８の代わりに励起光７４４を透過せずに前記蛍光を透過するように、励起光７４４の波長より長波長のカットオフ波長を持つロングパスフィルタや、バンドパスフィルタを用いてよい。

走査型顕微鏡８００の焦点合わせは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点がピンホール８２１の開口部８２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部８２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、２光子励起蛍光７４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。

走査型顕微鏡８００は、実施例３の走査型顕微鏡７００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１００走査型顕微鏡
１０１短パルスレーザ光源
１０２１／２波長板
１０３偏光ビームスプリッタ
１０４コリメータ
１０５フォトニック結晶ファイバ
１０６コリメータ
１０７ロングパスフィルタ
１０８ダイクロイックミラー
１０９コリメータ
１１０光ファイバ
１１１コリメータ
１１２ダイクロイックミラー
１１３励起用レンズ
１１４試料
１１５受光用レンズ
１１７ノッチフィルタ
１１８ショートパスフィルタ
１１９分光検出器
１２０集光レンズ
１２１スリット
１２２開口部
１２３励起用レンズステージ
１２４ダイクロイックミラー
１２５ミラー
１２６結像レンズ
１２７２次元センサ
１２８ミラー
１２９明視野用光源
１３０試料ステージ
１３１励起用レンズステージ
１３２受光用レンズステージ
１３３記憶装置
１３４制御部
１３５ピエゾコントローラ
１３６モータコントローラ
１３７表示部
１３８集光レンズステージ
１３９励起光源
１４０励起側カップリング媒質
１４１受光側カップリング媒質
１４２ガラス
１４３ガラス
１４４励起光
１４５ＣＡＲＳ光
１４６励起光の進行方向
１４７ＣＡＲＳ光の進行方向
１４８測定対象領域
１４９測定済みの点の集合
１５０測定点
１５１受光用レンズの焦点
１５２受光用レンズの焦点から発した光の光路
１５３測定予定点
１５４試料ステージの移動量
１５５受光用レンズの移動量
１５６集光レンズの移動量
１５７励起用レンズの移動量
１５９試料ステージによる移動体
１６０ＧＵＩ
１６１明視野画像表示領域
１６２ＣＡＲＳイメージ
１６３明視野画像
１６４ＣＡＲＳイメージ表示領域
１６５自動焦点合わせボタン
１６６補正用パラメータ設定用ＧＵＩ
１６７励起側カップリング媒質選択ボックス
１６８受光側カップリング媒質選択ボックス
１６９励起側カップリング媒質屈折率ボックス
１７０受光側カップリング媒質屈折率ボックス
１７１受光用レンズ位置ボックス
１７２試料ステージ座標ボックス
１７３試料走査範囲ボックス
１７４補正係数ボックス
１７５ターゲット波数ボックス
１７６焦点合わせモード切換ボタン
２０１イメージング動作のフローチャートの開始点
２０２装置電源ＯＮ
２０３試料を設置
２０４試料位置の粗調整
２０５焦点合わせ
２０６測定対象領域の設定
２０７測定条件の測定
２０８測定開始指示
２０９走査しながらＣＡＲＳ光を検出
２１０測定終了を報告
２１１試料を撤去
２１２装置電源ＯＦＦ
２１３イメージング動作のフローチャートの終了点
６００走査型顕微鏡
６０７ＡＯＴＦ
６１９光検出器
６２２開口部
６３９励起光源
６４４励起光
６４５ＣＡＲＳ光
７００走査型顕微鏡
７３９励起光源
７４４励起光
７４５２光子励起蛍光
８００走査型顕微鏡
８２１ピンホール
８２２開口部

Claims

励起光源と、試料に向けて励起光を集光する励起用レンズと、前記試料の位置を調整する試料ステージと、
前記励起光により前記試料から発生する前記励起光とは波長の異なる信号光を集光する受光用レンズと、受光用レンズを通過した前記信号光を集光する集光レンズと、前記信号光を検出する検出器と、を備え、
前記励起用レンズ、前記試料、前記受光用レンズ、前記集光レンズのうち、少なくとも２種類が、予め指定された補正係数を基に、光軸方向に移動するように制御する制御部を有し、
光軸方向に移動する前記２種類の距離の変化量は比例関係にあり、前記補正係数は、光軸方向に移動する前記２種類の距離の変化量の比例定数であることを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、前記試料と前記受光用レンズが、予め指定された補正係数を基に、
光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、励起用レンズと前記受光用レンズが、予め指定された補正係数を基に、
光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、前記励起用レンズと前記試料が、予め指定された補正係数を基に、
光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、前記試料と前記集光レンズが、予め指定された補正係数を基に、
光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、前記励起用レンズと前記集光レンズが、予め指定された補正係数を基に、
光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、前記受光用レンズと前記集光レンズが、
予め指定された補正係数を基に、光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
請求項１、または請求項２、または請求項３、または請求項４に記載の光学分析装置において、
励起用レンズステージあるいは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、受光用レンズステージが移動することによる受光用レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ５と、補正係数αとの間には、
ΔＤ５＝α×ΔＤ１
の関係が成り立つことを特徴とする光学分析装置。
請求項１、または請求項５、または請求項６に記載の光学分析装置において、
励起用レンズステージあるいは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、前記集光レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ６と、補正係数βとの間には、
ΔＤ６＝β×ΔＤ１
の関係が成り立つことを特徴とする光学分析装置。
請求項１、または請求項２、または請求項３、または請求項４、または請求項５、または請求項６に記載の光学分析装置において、
励起用レンズステージあるいは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、受光用レンズステージが移動することによる受光用レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ５と、補正係数αとの間には、
ΔＤ５＝α×ΔＤ１
の関係が成り立ち、
前記距離の変化量ΔＤ１と、前記集光レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ６と、補正係数βとの間には、
ΔＤ６＝β×ΔＤ１
の関係が成り立つことを特徴とする光学分析装置。
請求項１０において、
前記励起用レンズと前記試料とを結合する第１の媒質と、前記受光用レンズと前記試料とを結合する第２の媒質とを有し、
前記補正係数α、βは、第１の媒質と第２の媒質の屈折率を用いて求められる係数であることを特徴とする光学分析装置。
請求項１１において、
第１の媒質の屈折率をｎ１、第２の媒質の屈折率をｎ５とすると、前記補正係数αは、
α＝－ｎ５／ｎ１
で演算される値であることを特徴とする光学分析装置。
請求項１１において、
第１の媒質の屈折率をｎ１、第２の媒質の屈折率をｎ５とし、
受光レンズの焦点距離をｆ１、集光レンズの焦点距離をｆ２とすると、
前記補正係数βは、
β＝（ｆ１／ｆ２）^６・（１／ｎ１－１／ｎ５）
で演算される値であることを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、
前記検出器で検出される信号光がＣＡＲＳ光であって、前記試料上を測定点が走査しながら前記ＣＡＲＳ光を検出することを特徴とする光学分析装置。
請求項１において、
前記受光用レンズと前記検出器との間の光軸上に、共焦点光学系を構成するピンホールを備えることを特徴とする光学分析装置。