WO2019130372A1 - 光学分析装置 - Google Patents

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WO2019130372A1
WO2019130372A1 PCT/JP2017/046289 JP2017046289W WO2019130372A1 WO 2019130372 A1 WO2019130372 A1 WO 2019130372A1 JP 2017046289 W JP2017046289 W JP 2017046289W WO 2019130372 A1 WO2019130372 A1 WO 2019130372A1
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WO
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lens
light
excitation
sample
light receiving
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Application number
PCT/JP2017/046289
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English (en)
French (fr)
Inventor
隆之 小原
洋平 花崎
今井　一成
高橋　智
松原　茂樹
Original Assignee
株式会社 日立ハイテクノロジーズ
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Filing date
Publication date
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Priority to PCT/JP2017/046289 priority patent/WO2019130372A1/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an optical analyzer. In particular it relates to scanning microscopes.
  • One type of optical microscope is a scanning microscope. This is an observation means for irradiating illumination light to a part of the sample and detecting signal light generated at this time to obtain information of the sample.
  • the signal light includes various lights such as scattered light and fluorescence.
  • scanning the irradiation position in the depth direction of the sample it is possible to obtain various tomographic images of the sample or obtain a three-dimensional image of the inside of the sample.
  • Patent Document 1 Examples of such scanning microscopes are disclosed, for example, in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1.
  • the multiphoton excitation laser microscope disclosed in Patent Document 1 can perform transmission illumination from the objective lens (excitation lens) side, and perform transmission detection on the condenser lens (light reception lens) side. Further, this multiphoton excitation laser microscope includes a focal position adjusting unit for moving the objective lens in the optical axis direction and a focal position adjusting unit for moving the condenser lens in the optical axis direction. In the multiphoton excitation laser microscope configured as described above, adjustment of each focal position is performed by the focal position adjusting unit of each of the objective lens and the condenser lens. In particular, in the case of transmissive illumination, the focal positions of the objective lens and the condenser lens are adjusted to coincide with each other.
  • Non Patent Literature 1 discloses a coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope as an example of a scanning microscope.
  • the CARS microscope the pump light of frequency [omega p, the Stokes light are overlapped coaxially (multiplexing) of angular frequency ⁇ s ( ⁇ p> ⁇ s ), which focuses to a point on the sample.
  • signal light CARS light
  • ⁇ as 2 ⁇ p ⁇ s
  • the CARS light is enhanced when ⁇ p ⁇ s matches the frequency of the Raman active vibration. This can be used to obtain chemical species specific signal contrast.
  • CARS light is generated only in the space occupied by the focal point, and naturally has three-dimensional spatial resolution. Therefore, there is no need to provide special image processing or the like in order to obtain an image having resolution in the depth direction.
  • the two laser beams are coaxially combined and introduced into a confocal laser scanning microscope as excitation light.
  • Non-Patent Document 1 shows an example in which a tomographic image (a tomographic image in a plane parallel to the optical axis of excitation light) of a polymer film with a thickness of about 17 ⁇ m in the depth direction is obtained by the above configuration. . Moreover, the example which acquired the tomogram (tomographic image in the surface perpendicular
  • Patent Document 2 discloses an example in which, in multicolor CARS, a divergent / concentrated state adjustment mechanism of pump light and a divergent / concentrated state adjustment mechanism of Stokes light are provided to enable emphasis adjustment of a desired wavelength band.
  • a tomographic image in the depth direction of the sample can be acquired by scanning the irradiation position of the excitation light in the depth direction.
  • the focal position of the excitation lens and the focal position of the light receiving lens may be shifted.
  • the adjustment of the focal position of the excitation lens and the focal position of the light reception lens will take a long time to obtain an image.
  • one of the representative optical analysis devices of the present invention comprises an excitation light source, an excitation lens for condensing excitation light toward a sample, and a sample stage for adjusting the position of the sample
  • a light receiving lens for collecting signal light having a wavelength different from that of the excitation light generated from the sample by the excitation light a collecting lens for collecting the signal light passing through the light receiving lens, and the signal light
  • a detector for detecting At least the movement of the movement of the excitation light lens in the optical axis direction, the movement of the sample stage in the optical axis direction, the movement of the light receiving lens in the optical axis direction, and the movement of the focusing lens in the optical axis direction
  • An optical analyzer comprising: a control unit that controls to operate in conjunction with a correction coefficient that designates two types of movement.
  • the focal position of the excitation lens and the focal position of the light reception lens do not shift, so the focal position of the excitation lens It is not necessary to perform adjustment for matching the focal position of the light receiving lens with that of the light receiving lens, and higher speed image acquisition becomes possible. Therefore, for example, it is possible to detect a CARS spectrum while scanning.
  • FIG. 1 An embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7.
  • FIG. 1
  • FIG. 1 is a schematic view showing a basic configuration example of a scanning microscope 100 of the present embodiment.
  • the present apparatus includes an excitation light source 139, an excitation lens 113, a light reception lens 115, a spectral detector 119, and a control unit 134.
  • the other components will be described in detail below.
  • the control unit 134 controls the entire apparatus including the adjustment mechanism, and includes an interface that receives a measurement instruction from the user and displays a measurement result. A part of this interface is implemented as a GUI displayed on the display unit 137.
  • the control unit 134 is logically connected to the storage device 133 and the display unit 137.
  • the storage device 133 is provided inside the control unit 134, is externally connected to the control unit 134, or both.
  • the short pulse laser light source 101 emits short pulse laser light based on an instruction of the control unit 134.
  • the short pulse laser light source 101 is a titanium sapphire laser, a fiber laser, a microchip laser, or the like, and the pulse width is on the order of nanoseconds or less.
  • the peak power is preferably on the order of kilowatts or more capable of inducing a non-linear optical effect.
  • the wavelength may be selected from the absorption band of the measurement target and the corresponding wavelength of the optical component to be used.
  • Nd: YAG laser with a wavelength of 1064 nm or a Ti: Sapphire laser that can oscillate around 800 nm in order to avoid the influence of absorption bands of living tissue and water.
  • a small Nd: YAG microchip laser can be used. At 800 nm, it is suitable to use a Ti: Sapphire laser. Moreover, the influence of the absorption band of water is small at 800 nm and 1064 nm. .
  • the laser light is incident on a half wave plate 102 and a polarization beam splitter 103 which are power branching ratio adjustment mechanisms.
  • the half-wave plate 102 changes the polarization direction of the laser light based on an instruction from the control unit 134, and the polarization beam splitter 103 divides the laser light into a transmission component and a reflection component at a power branching ratio based on the polarization direction. .
  • a photonic crystal fiber is an optical fiber in which a honeycomb-like hollow clad is formed around the core, and strongly confines incident light in the core.
  • the incidence of short pulse laser light induces nonlinear optical phenomena such as self phase modulation and four-wave mixing, and supercontinuum light having a wider band than incident light is generated.
  • Supercontinuum light can be used as broadband Stokes light.
  • a device that uses broadband light as Stokes light and spectrally detects the generated CARS light is called a multicolor CARS microscope (or multiplex CARS microscope).
  • the multicolor CARS microscope can estimate a Raman spectrum from the spectrum of CARS light, there is much information that can be acquired, and it is suitable for more detailed analysis of an object to be measured.
  • one using narrow band light as Stokes light is referred to as single color CARS in the present specification.
  • the detector does not require spectral performance, it can be realized with a relatively simple configuration.
  • the generated super continuum light is collimated by the collimator 106, short wavelength components are cut by the long pass filter 107, and then transmitted through the dichroic mirror 108 which reflects the pump light wavelength and transmits light of other wavelengths.
  • the light beam is reflected by the dichroic mirror 112 and enters the excitation lens 113 as Stokes light.
  • the laser beam reflected by the polarization beam splitter 103 is focused by the collimator 109 on the incident end of the optical fiber 110.
  • Laser light propagated and emitted in the optical fiber 110 becomes parallel light by the collimator lens 111, is reflected by the dichroic mirror 108 and the dichroic mirror 112, and enters the excitation lens 113 as pump light.
  • the excitation lens 113 acts as an excitation lens that condenses the Stokes light and pump light coaxially combined by the dichroic mirror 108 onto the sample 114.
  • the combined Stokes light and pump light contribute to the generation of CARS light as excitation light.
  • the excitation light 144 generates CARS light of a wavelength corresponding to the molecular species of the sample 114.
  • the CARS light is guided to the opening 122 by the light receiving lens 115 and detected by the spectral detector 119. That is, the CARS light passes through the light receiving lens 115 to become parallel light, is reflected by the dichroic mirror 124, and the transmission components of the pump light and the Stokes light are cut by the notch filter 117 and the short pass filter 118.
  • the light is condensed by the laser light, and enters the spectral detector 119 through the opening 122 of the slit 121.
  • the spectral detector 119 detects the CARS spectrum.
  • the CARS light transmitted through the light receiving lens 115 to be parallel light, the CARS light is orthogonally incident on the surfaces of the notch filter 117 and the short pass filter 118, so The effects of refraction can be eliminated.
  • the sample stage 130 has a function of holding and moving the sample 114. Thereby, the site (measurement point) to be observed on the sample 114 can be changed.
  • the light receiving lens stage 132 is disposed to move the light receiving lens 115 in the optical axis direction of the CARS light
  • the excitation lens stage 131 is disposed to move the excitation lens 113 in the optical axis direction of the excitation light 144. ing. By moving all or part of these three stages, it can be used for adjustment to match the focal position of the excitation lens and the focal position of the light receiving lens.
  • the control unit 134 has a function of interlockingly moving the movement amount of the sample stage 130 and the movement amount of the light receiving lens stage 132 at a constant ratio.
  • the sample stage 130 is driven by a three-axis piezo actuator, and is connected to the control unit 134 via the piezo controller 135.
  • the light receiving lens stage 132 is driven by a stepping motor and a ball screw or a rack and pinion mechanism, and is connected to the control unit 134 via a motor controller 136.
  • the control unit 134 first Send an instruction to move the axis actuator 10 ⁇ m in the positive direction from the current position.
  • control unit 134 instructs the motor controller 136 to move A ⁇ 10 ⁇ m in the positive direction of the Z axis from the current position.
  • the control unit 134 determines that a series of stage control has been completed when both positioning completion signals of the piezo controller 135 and the motor controller 136 are received.
  • the control unit 134 can move the movement amount of the sample stage 130 and the movement amount of the light receiving lens stage 132 in an interlocking manner at a constant ratio A.
  • This ratio can be set to a constant other than 0, and can be moved in conjunction with this ratio.
  • the ratio may be set to a value held in advance in the storage device 133.
  • a value input by the user on the operation screen of the display unit 137 can also be set.
  • a plurality of values held in the storage device 133 can be selected and set in accordance with the value input by the user on the operation screen of the display unit 137.
  • At least a portion of the light emitted from the bright field light source 129 is transmitted through the dichroic mirror 124 and illuminates the sample 114 through the light receiving lens 115.
  • the light transmitted through the sample 114 passes through the excitation lens 113, the dichroic mirror 112, the mirror 125, and the imaging lens 126 to form a bright field image of the sample 114 on the sensor surface of the two-dimensional sensor 127.
  • Bright-field image information can be obtained by reading the output of the two-dimensional sensor 127 by the control unit 134.
  • the acquired bright field image information is output as an image on the operation screen of the display unit 137.
  • the bright field image information may be outputted to various media (electronic data and printed matter).
  • the scanning microscope 100 of the present embodiment includes an excitation lens 113 and a light reception lens 115.
  • various optical lenses including various objective lenses for a microscope can be used. Also, a concave mirror having a similar function or a combination thereof may be used.
  • the objective lens includes lenses designed on the assumption of various coupling media, that is, lenses for various coupling media.
  • the coupling medium refers to a medium that covers the sample side surface of the lens.
  • the excitation lens 113 and the light reception lens 115 lenses designed on the assumption of different coupling media may be combined.
  • a combination of lenses designed for different coupling media it is possible to increase the freedom of lens selection.
  • a combination of a water immersion excitation lens 113 and an air (non-immersion) light reception lens 115 can be used.
  • the excitation light 144 is condensed by the excitation lens 113 with a large numerical aperture, thereby enhancing the excitation efficiency and increasing the intensity of the generated CARS light, while simultaneously achieving good usability by the light receiving lens 115 for air. it can.
  • the numerical aperture of the excitation lens 113 can be made larger, so It becomes possible to obtain CARS light intensity.
  • One preferable combination of the excitation lens 113 and the light reception lens 115 is such that R1 ⁇ R2 for the refractive index R1 of the coupling medium of the excitation lens 113 and the refractive index R2 of the coupling medium of the light reception lens 115.
  • R1 > R2
  • the refractive index of the coupling medium of the excitation lens 113 is larger, so the aperture of the excitation lens 113 It is possible to increase the number and increase the CARS light generation efficiency.
  • the CARS light Light reception efficiency (the ratio of the amount of light incident on the light receiving lens 115 to the amount of light generated from the CARS light) and the detection efficiency (the amount of light generated from the CARS light) pass through the opening 122 to the spectral detector 119
  • the ratio of the amount of incident light to the incident light can be increased, and thus the detection sensitivity can be increased.
  • the numerical aperture M1 of the coupling medium of the excitation lens 113 and the numerical aperture M2 of the coupling medium of the light reception lens 115 are M1 ⁇ M2.
  • One of the combinations of the excitation lens 113 and the light reception lens 115 satisfies M1> M2, and since the numerical aperture of the excitation lens 113 is large, the CARS light generation efficiency can be enhanced.
  • the lens aperture is generally the same, the numerical aperture and the working distance (WD) are in an inverse correlation relationship, and therefore, the workability can be enhanced by using the light receiving lens 115 having a longer working distance. .
  • the preferable numerical aperture of the excitation lens 113 is, for example, 0.8 or more, and more preferably 0.95 or more. This is to increase the energy density of Stokes light and pump light in the sample 114 and to improve the CARS light generation efficiency.
  • An immersion lens may be used as the excitation lens 113 having a preferred numerical aperture.
  • a lens whose chromatic aberration has been corrected may be used as the excitation lens 113.
  • a lens with chromatic aberration corrected By using a lens with chromatic aberration corrected, the influence of the chromatic aberration on the intensity of the excitation light 144 and the beam spot shape can be reduced, and a CARS signal and CARS spectrum with less deviation can be detected.
  • the working distance of the excitation lens 113 is preferably 0.1 mm or more. More preferably, if it is 0.2 mm or more, the sample can be observed through a general cover glass having a thickness of 0.17 to 0.19 mm. More preferably, if it is 0.5 mm or more, a deeper portion of the sample, for example, a depth of 100 ⁇ m or more can be observed. More preferably, if it is 1.5 mm or more, a deeper part of the sample, for example, a depth of 1000 ⁇ m or more can be observed.
  • a water immersion lens may be used as the excitation lens 113.
  • a sample is assumed to be an aqueous solution, a cell, a tissue, or a culture solution containing gel or hydrogel, a gel or a hydrogel, the refractive index of these samples is close to the refractive index of water. By adopting this, it is possible to suppress the influence of spherical aberration. In particular, when observing the deep part of the sample, it is advantageous in terms of signal light intensity and spatial resolution.
  • an oil immersion lens or a lens designed to use another immersion liquid may be used as the excitation lens 113.
  • the excitation lens 113 when observing a material including a material having a refractive index larger than that of water, such as glass or a polymer film, as a component of the sample, the influence of spherical aberration can be suppressed.
  • the water immersion lens since it is also possible to obtain an even larger numerical aperture than the water immersion lens, it is possible to obtain a larger excitation light power density at the focusing point of the excitation light 144 in the sample.
  • a non-immersion lens may be used as the excitation lens 113.
  • the liquid (immersion liquid) as the coupling medium is a sample although it is disadvantageous in terms of the numerical aperture than the immersion lens. Moreover, since it does not touch the cover glass etc. which cover a sample, handling can be made easy.
  • the influence of the chromatic aberration can be reduced. More preferably, the effect of chromatic aberration can be further reduced by using an apochromatic lens. Further, by using a lens whose chromatic aberration is corrected in the region including the pump light and the Stokes light, the influence of the chromatic aberration can be reduced in the CARS including the near infrared light in the excitation light 144.
  • the measurement accuracy can be improved in the CARS using pump light having a central wavelength of 1064 nm as in the present embodiment by using the lens in which the chromatic aberration is corrected in the region including the near infrared region.
  • cost reduction can also be achieved by using the lens which does not correct
  • the light receiving lens 115 various lenses may be used, and various microscope objective lenses and condenser lenses may be used.
  • the numerical aperture of such a light receiving lens 115 is preferably 0.5 or more, more preferably 0.6 or more, still more preferably 0.9 or more, and most preferably 1.2 or more.
  • the working distance of the light receiving lens 115 is preferably 0.1 mm or more. More preferably, if it is 0.2 mm or more, CARS light generated in the sample can be detected through a general cover glass having a thickness of 0.17 to 0.19 mm. More preferably, if it is 0.5 mm or more, a deeper portion of the sample, for example, a depth of 100 ⁇ m or more can be observed. More preferably, if it is 1.5 mm or more, a deeper part of the sample, for example, a depth of 1000 ⁇ m or more can be observed.
  • a larger numerical aperture can be obtained.
  • an oil immersion lens as the light receiving lens 115, a still larger numerical aperture can be obtained.
  • a lens designed to use other immersion liquid can also be used as the light receiving lens 115.
  • a non-immersion lens air lens
  • liquid immersion liquid
  • it is disadvantageous in terms of the numerical aperture than the immersion lens. Since it does not touch the sample or the cover glass covering the sample, handling can be facilitated.
  • the scanning microscope 100 of this embodiment includes a sample stage 130 having three movable axes movable in the X, Y, and Z axes in FIG. 1, a light receiving lens stage 132 having an axis movable in the Z direction, and the Z axis And an excitation lens stage 131 having a movable axis.
  • the control unit 134 has a function of controlling operations of the short pulse laser light source 101, the spectral detector 119, the sample stage 130, the light receiving lens stage 132, and the lens stage 131 in synchronization with one another.
  • the control unit 134 can acquire a CARS image as follows by interlocking these.
  • the control unit 134 controls the short pulse laser light source 101 and the spectral detector 119 to detect a CARS spectrum while moving the sample stage 130 to scan the “measurement target area”.
  • the control unit 134 calculates the coordinates of the measurement point in the sample 114 from the current position of the sample stage 130.
  • the coordinates of the pixel in the CARS image are associated with the relative coordinates of the measurement point in the sample 114, and the detected CARS spectrum is associated with the pixel in the CARS image.
  • a representative value is calculated from the CARS spectrum associated with each pixel, and the representative value is converted into color or luminance and assigned to the pixel to generate a CARS image.
  • the generated CARS image is output as an image by the display unit 137.
  • the control unit 134 can combine the bright-field images acquired by the bright-field light source 129 and the bright-field camera 127 and output the combined image to the display unit 137, a sheet of paper, or another medium.
  • the bright field image and the CARS image may be arranged, or the bright field image and the CARS image may be superimposed.
  • control unit 134 includes an electronic circuit including a storage device and an input / output port, and the display unit 137 is a liquid crystal monitor connected to the control unit 134.
  • Software and control parameters necessary for control are held as electronic data in a storage device connected to the inside or outside of the control unit 134.
  • FIG. 6 is a schematic view showing an outline of the GUI 160 of this embodiment.
  • the GUI 160 is displayed on the display unit 137.
  • a bright field image display area 161 a CARS image display area 164, an automatic focusing button 165, a correction parameter setting GUI 166, a light receiving lens position box 171, a sample stage coordinate box 172, a sample scanning range box 173, A target wave number box 175 is arranged.
  • the bright field image acquired by the bright field camera 127 can be displayed in real time.
  • the CARS image 162 can be superimposed on the bright field image 163 and displayed in the CARS image display area 164.
  • the current position coordinates of the sample stage 130 can be displayed in the sample stage coordinate box 172, or the user can instruct to move the sample stage 130 to a designated position by inputting the coordinates.
  • the sample scanning range box 173 can display and input information for specifying a measurement target area. For example, it is possible to designate a rectangular parallelepiped having the coordinates of the sample stage coordinate box 172 as the start point and the coordinates of the sample scanning range box 173 as the end point and the start point and the end point as two diagonal points.
  • an offset value to the end point of the difference starting from the coordinates of the sample stage coordinate box 172 may be input to the sample scanning range box 173.
  • the automatic focusing button 165 When the user presses the automatic focusing button 165, the focusing operation of step 205 in FIG. 2 described later is automatically executed.
  • a box 174 There is a box 174.
  • the excitation-side coupling medium selection box 167 and the light-reception-side coupling medium selection box 168 can display and input the names of the excitation-side coupling medium 140 and the light-reception-side coupling medium 141, respectively.
  • the set values of the refractive index of the excitation side coupling medium 140 and the light receiving side coupling medium 141 can be displayed and input to the excitation side coupling medium refractive index box 169 and the light receiving side coupling medium refractive index box 170, respectively. These set values of the refractive index are used as control parameters for the operation of maintaining the focusing state in step 209 in FIG. 2 described later.
  • the correction coefficient box 174 can display the value of the correction coefficient ⁇ described later, or can be input by the user.
  • the light receiving lens position box 171 can display current position coordinates including at least the Z coordinate of the light receiving lens 115 or the light receiving lens stage 132, and the light receiving lens 115 and the light receiving can be changed by changing the coordinates.
  • the movement of the lens stage 132 can be instructed from the user.
  • the focusing mode switching button displays the current focusing mode, and the user can switch the focusing mode by clicking. When the mode is ON, various stages are controlled in conjunction to maintain the focusing state. When it is OFF, this interlocking control is invalidated.
  • the target wave number box 175 the target wave number of the CARS light used for the purpose of focusing, calculation of the correction coefficient ⁇ , display of the CARS image, and the like can be displayed and input.
  • a plurality of target wave number boxes 175 may be provided on the GUI 160 according to the above-described plurality of purposes.
  • FIGS. 2 and 3 are a flow chart and a schematic view for explaining the operation at the time of imaging a sample by the scanning microscope 100 of this embodiment.
  • the procedure of the imaging operation will be described based on the flowchart of FIG.
  • the flowchart starts the procedure from the START of 201.
  • the apparatus is powered on.
  • the respective components including the laser light source 101, various stages, the spectral detector 119, the control unit 134, and the visual field light source 129 are activated to stabilize the operation.
  • the sample is placed on the sample stage 130 and fixed.
  • the sample position is roughly adjusted so that the portion of the sample to be observed is in the vicinity of the field of view of the microscope.
  • the position is confirmed visually or with reference to the bright field image of the microscope displayed in the bright field image display area 161 on the GUI 160.
  • the adjustment of the position is performed by moving the various stages manually or via the GUI 160, mainly by moving the sample stage 130.
  • focusing is performed.
  • the purpose is to increase the detection efficiency of the CARS light 145.
  • the method of focusing in this embodiment is to move the receiving lens 115 in the Z-axis direction (the direction of the optical axis of the excitation light 144) in FIG. By measuring at 119, the position of the light receiving lens 115 is determined so that the intensity is maximized.
  • the image of the measurement point 150 is projected to the position of the opening 122 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condensing lens 120.
  • FIG. 3A is a schematic view showing an optical path before focusing.
  • Arrows 146 and 147 in the figure indicate the traveling directions of the excitation light 144 and the CARS light 145, respectively.
  • the excitation light 144 transmitted through the excitation lens 113 travels through the excitation-side coupling medium 140, is refracted at the surface of the sample 114, and is collected at one point. Since the CARS light 145 is generated at this point, the focusing point of the excitation light 144 is called a measurement point 150. In the present embodiment, since the excitation light 144 is arranged to be parallel light, the measurement point 150 coincides with the focal point of the excitation lens 113. Since FIG.
  • 3A is a state before focusing is performed, the measurement point 150 and the focal point 151 of the light receiving lens 115 do not coincide with each other. At this time, the generated CARS light travels through the sample 114 and the light receiving side coupling medium 141, is incident on the light receiving lens 115 and is refracted, but the refracted CARS light 145 does not become parallel light. At this time, the light amount of the CARS light 145 detected by the spectral detector 119 is not maximum.
  • FIG. 3B is a schematic view of the light path after the focusing is completed.
  • the position of the light receiving lens 115 is adjusted so that the light amount of the CARS light 145 detected by the spectral detector 119 is maximized.
  • the measurement point 150 and the focal position of the light receiving lens 115 coincide with each other, and the CARS light 145 transmitted through the light receiving lens 115 becomes parallel light.
  • the focal point of the condenser lens 120 is arranged to coincide with the center of the opening 122 of the slit 121. Therefore, as shown in FIG.
  • the focal position of the excitation lens 113 and the focal position 151 of the light receiving lens 115 do not necessarily coincide after the completion of focusing.
  • the measurement point 150 which is the focusing point of the excitation light 144 does not coincide with the focal point of the excitation lens 113. It is sufficient that the focal positions 151 of the lenses coincide with each other.
  • Such an example is particularly useful in polychromatic CARS microscopes using non-monochromatic light, such as broadband light, for either or both of the pump and / or Stokes light that make up the excitation light 144.
  • the position adjustment of each condensing point can be realized by changing the diverging / converging state of the excitation light 144 by, for example, adjusting the excitation lens 113, the collimator 106, the collimator 111 and the like. Therefore, the excitation light 144 in this case is not necessarily parallel light, and the measurement point 150 is an area of overlap of the condensing point of the pump light and the condensing point of the Stokes light.
  • the position of the focal point 151 of the light receiving lens 115 after focusing does not have to coincide with the measurement point 150.
  • a band pass filter may be inserted between the light receiving lens 115 and the spectral detector 119 according to an instruction from the control unit 134.
  • the setting of the spectral detector 119 may be changed according to an instruction from the control unit 134, or only data in a specific band may be extracted from the spectrum obtained by the spectral detector 119 by calculation processing in the control unit 134. .
  • focusing on only the CARS light of a specific substance can monitor the focusing state with a good SN ratio, and can achieve more accurate focusing.
  • designation of the substance to be measured may be designation of the substance name or the peak position in the CARS spectrum of the substance, and the peak position may designate the absolute wavelength or Raman shift as the wavelength or wave number. These designations may be directly input by the user using the GUI on the display unit 137, may be selected from options, or may be information previously stored in the storage device 133.
  • a band of all or part of the spectrum may be detected by the spectral detector 119.
  • multiple bands may be detected.
  • the maximum value or various average values in the detected spectrum may be used. In these cases, since the influence of the substance composition present at the measurement point 150 can be averaged, focusing can be performed more stably.
  • the measurement target area 148 in FIG. 3 is an area in a sample to be a target of acquiring a CARS image in the subsequent steps, and is determined by the user's intention. In the present step 206, this measurement target area 148 is designated as a measurement target. Specifically, the sample stage 130 is moved while mainly confirming the bright field image, and the position of the measurement point 150 is positioned at the end of the measurement target area 148 by relying on the scattered light of the excitation light 144 or the like. .
  • the control unit 134 determines a scanning range parameter at the time of measurement from the set range information of the measurement target region 148, and stores the scanning range parameter in the storage device 133.
  • measurement conditions are set. For example, parameters such as an exposure time per point at the time of measurement and a moving speed at the time of scanning are set.
  • the user may be made to input from a GUI on the display unit 137, or information in the storage device 133 or information in an electronic file on an external storage may be used.
  • the timing for performing step 207 may be any time between power on 202 and measurement start instruction 208.
  • step 208 the user issues an instruction to start measurement.
  • step 209 the CARS light 145 and the CARS spectrum are detected while the measurement point 150 scans on the sample 114.
  • FIG. 3C shows the state in the middle of step 209.
  • the CARS spectrum is measured while raster scanning each point of the measurement scheduled point 153 shown in the figure in the measurement target area 148.
  • raster scan a two-dimensional image is first scanned (scanned) at a measurement point one-dimensionally to obtain measurement data on a line, and then the line is scanned in the direction perpendicular to that line.
  • 3C shows a state in which the CARS spectrum has been measured with each point indicated as a set of measured points 149 as a measurement point, and then the CARS spectrum of the position of the measurement point 150 is measured.
  • the user is notified that the measurement has ended.
  • a GUI on the display unit 137 may be used.
  • step 211 the user confirms the report on the end of measurement in the previous step, and then removes the sample 114 from the sample stage 130.
  • the apparatus power is turned off.
  • FIGS. 4 and 5 are schematic views showing the positional relationship between the measurement point 150 and the focal point 151 of the light receiving lens in step 209.
  • FIG. In the example described here, the sample 114 is sandwiched between the glass 143 and the glass 142. However, even if the glass 143 and the glass 142 do not exist, since there is essentially no difference in the phenomenon described below, the present invention can be applied to the case where such a sample 114 is measured.
  • the excitation light 144 transmitted through the excitation lens 113 travels through five layers of the excitation side coupling medium 140, the glass 142, the sample 114, the glass 143, and the light receiving side coupling medium 141 to reach the light receiving lens 115. .
  • the thicknesses of the five layers in the Z-axis direction (the optical axis direction of the excitation light 144) in the figure are d 1 , d 2 , d 3 , d 4 and d 5 respectively, and the refractive indices are n 1 , n 2 , and n 3 , n 4 , n 5 .
  • the sample 114, the glass 143 and the glass 142 can be moved in the optical axis direction by the sample stage 130.
  • an object moved in the optical axis direction by the sample stage 130 is generically referred to as a moving body 159 by the sample stage.
  • the moving body 159 by the sample stage may be made of the sample 114, the glass 143 and the glass 142, or may be the sample 114 alone. Also, it may be made of more different refractive index materials, and in any case, the following operation can be used.
  • the excitation lens 113 can be moved in the optical axis direction by the excitation lens stage 131.
  • the light receiving lens 115 can be moved in the optical axis direction by the light receiving lens stage 132.
  • FIG. 4A is a schematic view showing a state in which focusing is performed.
  • the measurement point 150 which is the focusing point of the excitation light 144, coincides with the focal point 151 of the light receiving lens 115, and the detection efficiency of the CARS light 145 by the spectral detector 119 is maximum.
  • focusing is performed under the condition that the excitation light 144 and the CARS light 145 are both kept parallel.
  • f 1 and f 2 indicate the excitation lens 113 and the light reception lens, respectively.
  • the focal length is 115, the following relationship is satisfied.
  • D 1 + f 2 d 1 / n 1 + d 2 / n 2 + d 3 / n 3 + d 4 / n 4 + d 5 / n 5
  • D 1 / N 1 + D 5 / N 5 constant ⁇ Formula 2
  • D 5 is the distance of CARS light 145 passes through the light receiving side coupling medium 141, here may use distance of the moving body 159 by the light receiving lens 115 and the sample stage.
  • N 1 is the refractive index of the excitation side coupling medium 140
  • N 5 is the refractive index of the light receiving side coupling medium 141.
  • the image point of the measurement point 150 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condensing lens 120 at the measuring point 150 instead of the focus 151 of the light receiving lens 115 is a spectral detector 119 And the opening 122 of the slit 121 in front of.
  • the image point is a point at which a plurality of light beams constituting the CARS light 145 emitted from the measurement point 150 converge again by the optical system.
  • the image point of the measurement point 150 coincides with the opening 122, the proportion of the component of the CARS light 145 detected by the spectral detector 119 is maximized.
  • the excitation light 144 and the CARS light 145 do not necessarily have to be parallel light, and the degree of freedom of the optical system is increased.
  • FIG. 4B is a schematic view showing a state immediately after moving the sample 114 in the Z-axis direction (the optical axis direction of the excitation light) in the figure at the scan in step 209.
  • the direction of the Z-axis is positive from the excitation lens 113 to the light receiving lens 115, and the direction of the movement amount follows this.
  • the sample stage 130 is moved in the Z-axis direction by the movement amount ⁇ d 1 from the state of FIG. 4A, and accordingly, the sample 114, the glass 142, and the glass 143 are moved by the movement amount ⁇ d 1 It is moving.
  • the position of the focal point 151 of the light receiving lens does not coincide with the measurement point 150. Since the CARS light 145 generated at the measurement point 150 is not parallel light, the image point of the measurement point 150 does not coincide with the opening 122, and the detection efficiency of the spectral detector 119 is reduced. Therefore, by repeating the same focusing operation as in step 205 during step 209, it is possible to further enhance the detection efficiency of the CARS light 145 and obtain a larger signal strength. However, the measurement time is extended by the focusing operation. Further, if the number of scans of the sample 114 in the Z-axis direction (the direction of the optical axis of the excitation light) increases, the number of focusing operations increases accordingly, and the overall measurement time further increases.
  • n 1 and n 3 are approximately equal, it is assumed that the positions of the measurement point 150 in the Z-axis direction in FIGS. 4 (a) and 4 (b) are substantially the same. In general, the measurement point 150 moves as the sample 114 moves.
  • the position of the light reception lens 115 is moved by the movement amount ⁇ d 5 by the light reception lens stage 132 to focus. Have recovered.
  • the value of ⁇ d 5 may be determined as follows.
  • f 1 and f 2 are focal lengths of the excitation lens 113 and the light reception lens 115, respectively. At this time, a change in Z when the sample stage 130 is moved by a small amount in the Z-axis direction is obtained by partial differentiation of Z with respect to d 1 .
  • ⁇ d 1 and ⁇ d 5 (constant) formula 4
  • the correction coefficient ⁇ is a constant determined only by the refractive index of the excitation side coupling medium 140 and the refractive index of the light receiving side coupling medium 141. That is, the value of ⁇ may be determined by Equation 5.
  • the value of the correction coefficient ⁇ When the value of the correction coefficient ⁇ is set to 0, the same operation as that in the related art in which the position correction of the light receiving lens 115 is not performed is possible.
  • the value of the correction coefficient ⁇ may be set to a positive value ( ⁇ > 0). In this case, a combination of lenses in which n 5 ⁇ n 1 can be used.
  • the value of the correction coefficient ⁇ may be set to a negative value ( ⁇ ⁇ 0). In this case, a combination of lenses in which n 5 > n 1 can be used.
  • the value of the correction coefficient ⁇ When the value of the correction coefficient ⁇ is set to 1, the distance between the sample 114 and the light receiving lens 115 can be kept constant.
  • the excitation lens 113 is a water immersion lens
  • the light reception lens 115 is an air lens (non-immersion lens).
  • the ratio of the preferable moving amount of the light receiving side lens 115 to the moving amount of the sample stage 130 is only the refractive index of water and air. It becomes settled with. Assuming that the refractive index of water is 1.333 and the refractive index of air is 1.000, the ratio is 0.2498. Therefore, the coefficient for determining the movement amount of the light receiving lens 115 from the movement amount of the sample stage 130 may be set to 0.2498.
  • the above coefficient may be set to an arbitrary constant between 0.24 and 0.26 in consideration of about 4% of the change of the refractive index of water or air due to temperature change and impurities.
  • the coefficient may be set to an arbitrary constant between 0.2 and 0.3, taking into account the above-mentioned fluctuation of about 20%.
  • the excitation lens 113 is an air lens (non-immersion lens), and the light receiving lens 115 is a water immersion lens.
  • the ratio of the preferable moving amount of the light receiving side lens 115 to the moving amount of the sample stage 130 is only the refractive index of water and air. It becomes settled with. Assuming that the refractive index of water is 1.333 and the refractive index of air is 1.000, the ratio is ⁇ 0.333. Therefore, the coefficient for determining the moving amount of the light receiving lens 115 from the moving amount of the sample stage 130 may be set to ⁇ 0.3333.
  • the coefficient may be set to an arbitrary constant between -0.32 and -0.346 in consideration of about 4% of the change of the refractive index of water or air due to temperature change and impurities. Further, the above coefficient may be set to an arbitrary constant between -0.278 and -0.4 in consideration of about 20% of the above fluctuation.
  • the excitation coupling medium 140 and the light reception coupling medium 141 are water, air, oil, glycerol, silicone oil or the like.
  • Table 1 is an example of a table of combinations of media and values of the correction coefficient ⁇ of the correction coefficient ⁇ , which are previously calculated from the refractive indexes of these media.
  • a and B in the table correspond to the excitation side coupling medium 140 and the light receiving side coupling medium 141, respectively.
  • a correspondence table as shown in Table 1 may be held in the storage device 133, and these values may be appropriately taken out when using the microscope and set as the correction coefficient ⁇ . This makes it possible to provide a product corresponding to a plurality of lenses for either or both of the excitation side coupling medium 140 and the light receiving side coupling medium 141. In addition, it is also possible for the user to switch and use lenses in accordance with the purpose of measurement and the type of sample.
  • a correspondence table of medium names and refractive indices may be held in the storage device 133.
  • R. I. represents the refractive index.
  • the control unit 134 may calculate and use the correction coefficient ⁇ by using the refractive index of the correspondence table, and in this case, the number of rows may be smaller than that of the correspondence table as shown in Table 1; It can save the space it occupies.
  • a display prompting the user to select and receiving input of selection information is displayed
  • the GUI on unit 137 may be used.
  • the information input by the user may be the value of ⁇ itself, one refractive index, two refractive indexes, one medium name, and two medium names.
  • the correction coefficient ⁇ may be calculated using these input values and the correspondence table of Table 1 or the correspondence table of Table 2.
  • two refractive indices may be substituted for n 5 and n 1 in equation 5 to obtain ⁇ .
  • the other medium name or refractive index may use a default value.
  • numerical value text input numerical value slide bar specification, selection of numerical value or substance name by pull-down menu, selection of numerical value or substance name by radio button, etc. may be used.
  • a sensor or an electronic circuit provided in the device is a lens of either or both of the excitation lens 113 and the light reception lens 115.
  • the controller 134 may recognize the type of and the refractive index of the medium, and may use the recognition result as an input to select an appropriate value.
  • the refractive index of a substance generally varies depending on the wavelength of light to be considered, CARS needs to handle light including a plurality of wavelengths as follows.
  • the excitation light 144 of the CARS is composed of light of different wavelengths: pump light and Stokes light.
  • the Stokes light component in the excitation light 144 also needs to use broadband light including multiple wavelengths.
  • CARS light 145 in multicolor CARS is also broadband light including multiple wavelengths. Therefore, even if the materials of the excitation-side coupling medium 140 and the light-receiving side coupling medium 141 are the same, depending on which wavelength of the plurality of wavelengths is focused on, One of the values of the refractive index n 5 and n 1 is different.
  • pump light 144 is narrow band pump light and broadband Stokes light is transmitted through excitation side coupling medium 140
  • broadband light CARS light 145 is light receiving side coupling medium It penetrates the inside of 141.
  • the refractive index of the excitation side coupling medium 140 with respect to the central wavelength of the pump light is used as n 1 .
  • the reason why the central wavelength of the pump light is selected as the wavelength when considering n 1 is that the pump light has a greater contribution than the Stokes light to the CARS light generation.
  • the target wavelength is chosen to correspond to the CARS light wavelength of the molecule the user is most interested in. Specifically, the wavelength is shifted from the wavelength of the pump light toward the high wave number (short wavelength) by the target wave number designated in the target wave number box 175.
  • the wavelength considering the refractive index may use a refractive index for any appropriate wavelength, for example, a refractive index for a wavelength of 589 nm. If the wavelength of the laser light source 101, the wavelength of the pump light, the excitation light 144 wavelength, or the refractive index to the wavelength of the CARS light 145 is used, focusing with higher accuracy can be realized.
  • the difference from the excitation light 144 wavelength may be designated by the wavelength or the wave number.
  • the designation of the wavelength of the excitation light 144 and the wavelength of the pump light and the wavelength of the CARS light 145 in the case of multicolor CARS may be set with reference to the central value of the spectrum of each light and the peak position of the light intensity.
  • the CARS spectrum of the fingerprint region can be measured more sensitively by using the anti-Stokes Raman shift from the wavelength of the excitation light 144 as the wavelength of the CARS light 145 and using 100 cm -1 to 2000 cm -1 , 2000 cm By using -1 to 4000 cm -1 , it is possible to measure water and organic substances containing a large amount of OH bonds and CH bonds with higher sensitivity.
  • n 1 is the wavelength of the excitation light 144
  • n 5 is the wavelength shifted from the wavelength of the excitation light 144 by the designated wave number, and the refractive index may be considered respectively.
  • focusing can be realized in consideration of the difference in the wavelength of the CARS light 145.
  • One or more wavelengths for considering the refractive index may be directly input by the user using the GUI on the display unit 137 or may be selected from options, and information stored in advance in the storage device 133 It is also good.
  • the selection from the options of the refractive index may be made based on the result of the controller 134 recognizing the types and settings of the excitation light source 139 and the spectral detector 119.
  • the values of the refractive index for each wavelength are also stored in the storage device 133, and the refractive index is selected from the combination of the selected medium name and wavelength, and complemented. It may be calculated and used.
  • step 209 scanning of the measurement point 150 in the sample 114 may be performed by moving the excitation lens 113 with the excitation lens stage 123 while the sample stage 130 is fixed.
  • the excitation lens stage 123 and the light reception lens stage 132 may be controlled so as to satisfy the relationship of Expression 2. For example, as shown in FIG.
  • step 209 the scanning of the measurement point 150 in the sample 114 moves the sample 114 by the sample stage 130 and the excitation lens 113 by the excitation lens stage 123 while the light receiving lens stage 132 is fixed. It is good also by doing.
  • the excitation lens stage 123 and the sample stage 130 may be controlled to satisfy the relationship of Equation 2. For example, as shown in FIG.
  • Such control of interlocking each stage according to a specific proportionality factor is set such that there is an effective time and an invalid time between step 201 device power ON and step 212 device power OFF.
  • the above control is effective at least at step 209.
  • the control is set to be invalid.
  • Such switching between the effective and invalid states of the control may be performed automatically by the device, or may be provided with a button or a radio button on the GUI 160 to provide a means for instructing the user to switch.
  • the image point of the measurement point 150 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condensing lens 120 is controlled to coincide with the opening 122 of the spectral detector 119.
  • the CARS light 145 transmitted through the light receiving lens 115 may not necessarily be parallel light.
  • the light receiving lens 115 and the condenser lens 120 may be taken as a combined lens, and the position of the principal point, the combined focal length, or both may be changed.
  • the position of the condenser lens 120 may be moved in the optical axis direction of the CARS light 145.
  • the focal length may be adjusted to satisfy the above condition.
  • the movement of the condenser lens can be moved by the condenser lens stage 138.
  • FIG. 4D shows a state in which the focusing state is realized by moving the condensing lens 120 by the moving distance ⁇ d 6 from the state of FIG. 4B.
  • the CARS light 145 generated at the measurement point 150 and traveling in the direction of the arrow 147 is collected at the opening 122 of the slit 121 in front of the spectral detector 119 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condensing lens 120. . That is, the image point of the measurement point 150 is at the position of the opening 122, and the detection efficiency of the CARS light 145 is maximum.
  • the movement distance ⁇ d 6 of the focusing lens 120 optimum for keeping the image point of the measurement point 150 at the position of the opening 122 and maintaining the focused state is Just ask.
  • ⁇ a ⁇ d 1 (1 / n 1 ⁇ 1 / n 5 ) equation 10
  • the distance between the image point of the measurement point 150 by the light reception lens 115 and the light reception lens 115 is b
  • the distance between the image point of the measurement point 150 by the light reception lens 115 and the condensing lens 120 is b ′
  • the light reception lens 115 Assuming that the distance c between the image point of the measurement point 150 by the two lenses of the condenser lens 120 and the condenser lens 120 is given by the following equation.
  • Equation 11 is modified and substituted into equation 12 to obtain the following equation.
  • Z 1 f 1 a / (a ⁇ f 1 ) ⁇ f 2 c / (c ⁇ f 2 ) + c formula 13
  • Z 1 ⁇ f 1 (A + f 1) / A ⁇ - ⁇ f 2 (C + f 2) / C ⁇ + (C + f 2) ... Equation 14
  • a change in the position Z 1 of the image point is obtained by partial differentiation of a of Z 1.
  • the measurement point 150 is close to the focal point of the light receiving lens 115 (when the CARS light 147 after passing through the light receiving lens 115 is close to parallel light), the following relationship is established.
  • an optical fiber may be used as a part of an optical system for guiding the CARS light 145 to the spectral detector 119.
  • the incident side opening of the optical fiber may be arranged to be equivalent to the opening 122 of the slit 121 of the scanning microscope 100 of the present embodiment, and a state in which such an optical system is focused is also obtained. It can be maintained and the measurement of step 109 can be performed.
  • the control combining the control of interlocking the sample stage 130 and the light receiving lens stage 132 using the correction coefficient ⁇ and the automatic focusing control as described above.
  • the lens for light reception according to the correction coefficient ⁇ until the accumulated movement amount reaches the threshold Focusing is maintained by moving the stage 132.
  • Automatic focusing control is performed when the accumulated movement amount reaches the threshold.
  • the threshold used here may be set to any value, the length may be sufficiently larger than the size of the measurement point 150.
  • the preferable threshold is about 10 times 10 ⁇ m, or about 100 times 100 ⁇ m, or about 1000 times 1000 ⁇ m.
  • each corresponds to a shift in focusing that may occur when there is a refractive index unevenness of the order of 10 ⁇ m, 100 ⁇ m, and 1000 ⁇ m in the sample, and manual focusing is also performed on such a sample. Measurement can be performed without execution.
  • the absolute value of the cumulative movement amount may be compared with the threshold. By doing this, it is possible to cope with the case where the sample stage 130 is moved in both positive and negative directions of the Z axis. Further, the execution timing of the confirmation of the cumulative movement amount and the focusing may be at the time of scanning at step 209 or may be at the time of operating the sample stage 130 manually or via a GUI.
  • the accumulated movement amount and the threshold may be set for movement amounts other than the Z-axis direction.
  • the X-axis direction, the Y-axis direction, or both when the sample 114 itself has an inclination with respect to the optical axis of the sample stage 130 or the excitation light 144, the X-axis direction or the Y-axis direction. Even if a shift in focusing occurs due to a change in the position of the surface of the sample 114 in the Z-axis direction due to the movement of the sample stage 130, the control can be controlled so that the shift does not become excessive.
  • automatic focusing control may be performed each time the sample stage 130 is moved in the Z-axis direction, or every specified number of times. Then, at the start of each automatic focusing control, position coordinates of the light receiving lens stage 132 are calculated using the correction coefficient ⁇ , and these coordinates are used as initial coordinates of the light receiving lens stage 132 at the time of automatic focusing. adopt.
  • the expected value of the deviation between the initial coordinates of the position coordinates of the light receiving lens stage 132 in automatic focusing and the coordinates of the best can be reduced, improvement in reliability of automatic focusing and shortening of the required time can be expected.
  • the sample stage 130 is moved to three or more different points at any timing after the sample is set in step 203 and before the start of step 209, and focusing is performed at each point.
  • the setting parameters for focusing at each point here, the Z coordinate of the light receiving lens stage 132 and the XYZ coordinates of the sample stage 130 are held in the storage device 133.
  • a reference value for focusing may be measured in any way, for example, a representative value of the Z coordinate of the sample 114.
  • the Z coordinate of the sample 114, the surface position of the sample 114 on the excitation lens 113 side, the surface position of the sample 114 on the light receiving lens 115 side, the center position in the Z axis direction, the glass 142 and the glass 143 The coordinates of the surface or center position of an object corresponding to a container or a substrate, the position of a position marker by marking or printing provided on the sample 114 or the container or substrate, or the like may be used.
  • the setting parameter of focusing may be calculated from the reference value of focusing acquired at three or more points by these methods.
  • the control unit 134 By calculation on the control unit 134, it is possible to complement or estimate the setting parameter at another position on the sample 114 from the setting parameter of focusing at each point or its reference value.
  • the X and Y coordinates of the sample stage 130 at each point and the Z coordinate of the light receiving lens stage 132 are a 1 , a 2 and a 3 respectively, and three or more of the points are a 1 and a 1 2 and a 3 Since they can be expressed as points in a three- dimensional space, it is desirable to obtain a light receiving lens stage 132 at a position other than each point by obtaining a plane including a point, a curved surface, a regression plane of each point, and a curved surface.
  • Z coordinate can be obtained. This can be used to automatically move the light receiving lens stage 132 to the desired Z coordinate when moving the sample stage 130 to the XY axis. In this way, focusing can be maintained even when scanning the sample 114 held in an inclined state.
  • FIG. 7 is a schematic view showing a basic configuration example of the scanning microscope 600 of the present embodiment.
  • the scanning microscope 600 is arranged to irradiate the excitation light transmitted through the excitation lens 113 to the sample 114, and the light receiving lens 115 is arranged to guide the light generated there to the detector. It is similar to the microscope 100.
  • the scanning microscope 600 is similar to the scanning microscope 100 in that imaging is possible by measuring while moving the sample stage 130.
  • the scanning microscope 600 differs from the scanning microscope 100 in that it comprises an excitation light source 639 for emitting excitation light 644 consisting of a plurality of narrow band lights.
  • the excitation light source 639 includes an AOTF (Acousto-Optic Variable Filter) 607 which extracts narrow band light from the wide band light emitted from the photonic crystal fiber 105.
  • the AOTF 607 can adjust the wavelength of light to be extracted according to an instruction of the control unit 134.
  • the excitation light 644 is a narrow band light
  • the generated CARS light 645 is also a narrow band light
  • the light detector 619 for detecting the CARS light 645 has no spectral function. , Is different from the scanning microscope 100.
  • a photodetector 619 As such a photodetector 619, a photomultiplier tube or a photodiode may be used.
  • the scanning microscope 600 can perform monochromatic CARS measurement.
  • the detector since the detector does not require spectral performance, it can be realized with a configuration of a simple detection system as compared with multicolor CARS.
  • An example of the wide-band light to the narrow-band light has been described above as the excitation light source 639 for emitting the excitation light 644 consisting of a plurality of narrow-band lights.
  • An optical element such as an OPO (optical parametric oscillator) may be used which receives light as an input and outputs narrow band light of another wavelength.
  • the output light of the short pulse laser light source 101 which is a narrow band light source, is divided into two light beams by the polarization beam splitter 103, and one light beam is wavelength-converted by the other light as it is.
  • the dichroic mirror 108 it is possible to realize a light source of narrow band light pulse light having different two wavelengths.
  • the CARS light 645 passes through a finite size aperture 622 in front of the light detector 619 to reach the light receiving surface of the light detector 619.
  • the openings 622 refer to one or both of the openings in the case where a special stop or slit is provided in front of the light detector 619. In the case where no special diaphragm or slit is provided in front of the light detector 619, the light receiving surface having a finite size of the light detector 619 may be considered as the opening 622.
  • the other points are the same as the scanning microscope 100 of the first embodiment.
  • the image point of the measurement point 150 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condenser lens 120 is positioned inside the opening 622, more preferably at the center of the opening 622.
  • the light receiving lens stage 132 is moved to position the light receiving lens 115 so as to be positioned. This allows the component of the CARS light 645 passing through the opening 622 to be maximized.
  • the scanning microscope 600 can maintain the focusing when moving the sample stage 130 by the same mechanism as the scanning microscope 100 of the first embodiment.
  • FIG. 8 is a schematic view showing a basic configuration example of a scanning microscope 700 of the present embodiment.
  • the scanning microscope 700 is arranged to irradiate the light transmitted through the excitation lens 113 to the sample 114, and the light receiving lens 115 is arranged to guide the light generated there to the light detector 619 It is similar to the type microscope 600.
  • the scanning microscope 700 is similar to the scanning microscope 600 in that imaging is possible by measuring while moving the sample stage 130.
  • the scanning microscope 700 differs from the scanning microscope 600 in that it comprises an excitation light source 739 for emitting monochromatic excitation light 744.
  • the excitation light source 739 comprises a short pulse laser light source 101.
  • the scanning microscope 700 can detect two-photon excitation fluorescence as follows.
  • the excitation light 744 passes through the excitation lens 113 and is collected at the measurement point 150 in the sample 114.
  • the substance existing at the measurement point 150 is excited by two photons by the excitation light 744 to generate two photon excited fluorescence 745.
  • the two-photon excitation fluorescence 745 transmitted through the light receiving lens 115 passes through the opening 622 to reach the light detector 619 and is detected.
  • other multi-photon excitation fluorescence such as three-photon excitation fluorescence, a second harmonic, a third harmonic, a sum frequency, and a high-order sum frequency may be detected.
  • the wavelength characteristics of the notch filter 117, the short pass filter 118, and the dichroic mirror 124 may be appropriately selected, and the spectral detector 121 and the slit 119 used in the first embodiment may be used as a detection system.
  • Focusing of the scanning microscope 700 is preferably performed so that the image point of the measurement point 150 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condenser lens 120 is located inside the opening 622, more preferably at the center of the opening 622.
  • the light receiving lens stage 132 is moved to position the light receiving lens 115 so as to be positioned. Thereby, the component of the two-photon excitation fluorescence 745 passing through the opening 622 can be maximized.
  • the scanning microscope 700 can maintain the focusing when moving the sample stage 130 by the same mechanism as the scanning microscope 600 of the second embodiment.
  • FIG. 9 is a schematic view showing a basic configuration example of a scanning microscope 800 of the present embodiment.
  • the scanning microscope 800 is arranged to irradiate the light transmitted through the excitation lens 113 to the sample 114, and the light receiving lens 115 is arranged to guide the light generated there to the light detector 619 Similar to the type microscope 700.
  • the scanning microscope 800 is similar to the scanning microscope 700 in that imaging is possible by measuring while moving the sample stage 130.
  • the scanning microscope 800 can detect two-photon excitation fluorescence as follows.
  • the excitation light 744 passes through the excitation lens 113 and is collected at the measurement point 150 in the sample 114.
  • the substance existing at the measurement point 150 is excited by two photons by the excitation light 744 to generate two photon excited fluorescence 745.
  • the two-photon excitation fluorescence 745 transmitted through the light receiving lens 115 passes through the opening 622 to reach the light detector 619 and is detected.
  • the excitation light source 739 includes the short pulse laser light source 101, but a continuous wave (CW) light source may be used as the laser light source.
  • CW continuous wave
  • the scanning microscope 800 detects not only the two-photon excitation fluorescence 745, but also other multi-photon excitation fluorescence such as three-photon excitation fluorescence, second harmonics, third harmonics, sum frequencies, and high-order sum frequencies. good.
  • the wavelength characteristics of the notch filter 117, the short pass filter 118, and the dichroic mirror 124 may be appropriately selected, and the spectral detector 121 and the slit 119 used in the first embodiment may be used as a detection system.
  • the scanning microscope 800 may detect fluorescence excited by one photon instead of the two-photon excitation fluorescence 745.
  • the specifications of the short pass filter 118 and the dichroic mirror 124 may be appropriately changed.
  • a long pass filter having a cutoff wavelength longer than the wavelength of the excitation light 744 or a band pass filter may be used so as to transmit the fluorescence without transmitting the excitation light 744.
  • the focusing of the scanning microscope 800 is more preferably an aperture such that the image point of the measurement point 150 by the optical system including the light receiving lens 115 and the condenser lens 120 is located inside the aperture 822 of the pinhole 821.
  • the light receiving lens stage 132 is moved to position the light receiving lens 115 so as to be positioned at the center of the line 822. Thereby, the component of the two-photon excitation fluorescence 745 passing through the opening 622 can be maximized.
  • the scanning microscope 800 can maintain the focusing when moving the sample stage 130 by the same mechanism as the scanning microscope 700 of the third embodiment.
  • the present invention is not limited to the embodiments described above, but includes various modifications.
  • the embodiments described above are described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • Reference Signs List 100 scanning microscope 101 short pulse laser light source 102 half wave plate 103 polarization beam splitter 104 collimator 105 photonic crystal fiber 106 collimator 107 long pass filter 108 dichroic mirror 109 collimator 110 optical fiber 111 collimator 112 dichroic mirror 113 excitation lens 114 sample 115 light receiving lens 117 notch filter 118 short pass filter 119 spectral detector 120 condensing lens 121 slit 122 opening 123 excitation lens stage 124 dichroic mirror 125 mirror 126 imaging lens 127 two dimensional sensor 128 mirror 129 light source 130 for bright field Sample stage 131 Excitation lens stage 132 Light reception lens stage 133 Storage device 134 Control Section 135 Piezo controller 136 Motor controller 137 Display 138 Focusing lens stage 139 Excitation light source 140 Excitation side coupling medium 141 Light receiving side coupling medium 142 Slide glass 143 Cover glass 144 Excitation light 145 CARS light 146 Direction of travel of excitation light 147 CARS Direction of travel of light 148 Measurement target

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Abstract

走査型顕微鏡では、測定時に励起用レンズと受光レンズの焦点位置を一致させる必要がある。測定中にいったん２つの焦点位置を合わせても、試料の断層像観察等のために測定点を光軸方向に移動すると、２つの焦点位置がずれる。よって、そのつどオートフォーカス動作が必要となり、測定時間が長くなってしまう。 例えば、試料ステージの光軸方向の移動と、前記受光レンズの光軸方向の移動と、前記励起用レンズの光学方向の移動と、を連動して動作するように制御する制御部を備える光学分析装置を提供する。

Description

光学分析装置
　光学分析装置に関する。特に走査型顕微鏡に関する。
　光学顕微鏡の一種として、走査型顕微鏡がある。これは、照明光を試料の一部に照射して、この時に発生する信号光を検出することで試料の情報を得る観察手段である。照明光の照射位置を走査することで、試料のより広い範囲を観察し、画像や映像の形で情報を得ることができる。信号光としては、散乱光や蛍光など種々の光を含む。また、照射位置を試料の深さ方向に走査することで、試料の各種断層像を取得したり、試料内部の３次元的な像を取得したりすることが可能である。
　このような走査型顕微鏡の例は、例えば特許文献１や非特許文献１に開示されている。
　特許文献１に開示されている多光子励起レーザ顕微鏡は、対物レンズ（励起用レンズ）側から透過照明を行い、コンデンサレンズ（受光用レンズ）側で透過検出を行うことが可能となっている。また、この多光子励起レーザ顕微鏡は、対物レンズを光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットとコンデンサレンズを光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットを含んでいる。以上のように構成された多光子励起レーザ顕微鏡では、対物レンズ及びコンデンサレンズの各々の焦点位置調整ユニットにより、各々の焦点位置の調整が行われる。特に、透過照明を行う場合には、対物レンズとコンデンサレンズの焦点位置が一致するように調整される。非特許文献１には、走査型顕微鏡の一例として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡が開示されている。ＣＡＲＳ顕微鏡では、振動数ωｐのポンプ光と、振動数ωｓ（ωｐ＞ωｓ）のストークス光を同軸で重ね合わせて（合波）、試料上の一点に焦点を結ばせる。これにより、アンチストークス振動数（ωａｓ＝２ωｐ－ωｓ）を持つ信号光（ＣＡＲＳ光）を生じる。ωｐ－ωｓがラマン活性な振動の振動数に一致するときＣＡＲＳ光は増強される。これを利用して、化学種特異的な信号コントラストを得ることができる。２光子励起蛍光顕微鏡と同じく、ＣＡＲＳ光は焦点の占める空間の中でのみ発生するので、おのずと３次元的な空間分解能を持つ。よって、深さ方向の分解能を持つ画像を得るために、特段の画像処理等を設ける必要は無い。
　非特許文献１のＣＡＲＳ顕微鏡の構成においては、前記の２つのレーザビームは同軸上に合波され、励起光として共焦点レーザ走査顕微鏡に導入される。励起光は水浸対物レンズ（倍率６０倍、ＮＡ＝１．２）を透過して試料中に焦点を結ぶ。前方ＣＡＲＳ光は空気を介したコンデンサレンズ（ＮＡ＝０．５５）で集光され、光電子増倍管で検出される。
　非特許文献１では、上記のような構成によって、厚さ約１７μｍのポリマーフィルムの深さ方向の断層像（励起光の光軸と平行な面での断層像）を取得した例を示している。また、フィルム表面から０、６、１２、１６μｍの深さにある断層像（光軸に垂直な面での断層像）を取得した例を示している。
　特許文献２では、多色ＣＡＲＳにおいて、ポンプ光の発散収束状態調整機構、ストークス光の発散収束状態調整機構を備え、所望の波長帯域の強調調整を可能とした例が開示されている。
特開２０１５－１０８７１８ ＷＯ２０１６／１４３０８４
Ｋａｎｇ，　Ｅｕｎａｈ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２００６，　７８，　８０３６－４３
　走査型顕微鏡では、励起光の照射位置を深さ方向に走査することで、試料の深さ方向の断層像を取得できる。しかし、励起光の照射位置を試料の深さ方向に移動すると、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置がずれてしまう場合がある。しかし、励起光の照射位置を移動するたびに、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整を行うと画像の取得に要する時間が長くなってしまう。
　上記課題を解決するために、代表的な本発明の光学分析装置の一つは、励起光源と、試料に向けて励起光を集光する励起用レンズと、前記試料の位置を調整する試料ステージと、
　前記励起光により前記試料から発生する前記励起光とは波長の異なる信号光を集光する受光用レンズと、受光用レンズを通過した前記信号光を集光する集光レンズと、前記信号光を検出する検出器と、を備え、
前記励起光用レンズの光軸方向の移動、前記試料ステージの光軸方向の移動、前記受光用レンズの光軸方向の移動、前記集光レンズの光軸方向の移動のうち、少なくとも前記移動の２種類の移動を指定する補正係数に連動して動作するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
　前記の構成によれば、例えば、励起光の照射位置を試料の深さ方向に移動しても、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置がずれないため、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整を行う必要がなく、より高速な画像取得が可能になる。そのため、例えば、スキャンをしながらＣＡＲＳスペクトルの検出が可能となる。
実施例１の走査型顕微鏡の基本構成模式図 実施例１の動作手順のフローチャート 実施例１のイメージング動作の模式図 測定点とレンズ焦点の関係を示した模式図 測定点とレンズ焦点の関係を示した模式図 実施例１のＧＵＩの模式図 単色ＣＡＲＳ顕微鏡の実施例の模式図 ２光子励起蛍光顕微鏡の実施例の模式図 透過型共焦点顕微鏡の実施例の模式図
　以下、本発明の実施例を、図面を用いて説明する。
　以下本発明の一実施例を、図１、図２、図３、図４、図５、図６に沿って説明する。
　図１は、本実施例の走査型顕微鏡１００の基本的な構成例を示す模式図である。本装置は、励起光源１３９と励起用レンズ１１３、受光用レンズ１１５、分光検出器１１９、制御部１３４を備えている。以下、その他の各構成要素を含め、詳細に説明する。
（顕微鏡の基本構成）
　制御部１３４は、調整機構を含む装置全体の制御を行うとともに、ユーザからの測定指示の受け付けや測定結果の表示を行うインターフェースを備える。このインターフェースの一部は表示部１３７上に表示されるＧＵＩとして実装される。制御部１３４は記憶装置１３３、表示部１３７と論理的に接続されている。記憶装置１３３は制御部１３４の内部に備えつけられるか、制御部１３４と外部接続されるか、またはその両方の形態で備え付けられている。
　短パルスレーザ光源１０１は、制御部１３４の指示に基づいて短パルスレーザ光を出射する。短パルスレーザ光源１０１はチタンサファイアレーザやファイバレーザ、マイクロチップレーザなどであり、パルス幅はナノ秒オーダー以下である。また、ピークパワーは非線形光学効果を誘起可能なキロワットオーダ以上が望ましい。波長については測定対象の吸収帯域や用いる光学部品の対応波長から選定すればよい。細胞資料などを対象とする場合には、生体組織、水の吸収帯による影響を避けるために、波長１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧレーザや、８００ｎｍ付近で発振できるＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザを用いるのが好適である。
　（１０６４ｎｍであれば、小型のＮｄ：ＹＡＧマイクロチップレーザを利用することができる。８００ｎｍではＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅレーザを用いるのに好適である。また、８００ｎｍも１０６４ｎｍも、水の吸収帯域による影響が小さい。）
　レーザ光はパワー分岐比調整機構である１／２波長板１０２及び偏光ビームスプリッタ１０３に入射する。１／２波長板１０２は制御部１３４の指示に基づいてレーザ光の偏光方向を変化させ、偏光ビームスプリッタ１０３は偏光方向に基づいたパワー分岐比でレーザ光を透過成分と反射成分とに分岐する。偏光ビームスプリッタ１０３を透過したレーザ光は、コリメータ１０４によってフォトニック結晶ファイバ１０５の端面に集光される。フォトニック結晶ファイバはコアの周囲に蜂の巣状の中空のクラッドが形成された光ファイバであり、入射光をコアに強く閉じ込める。短パルスレーザ光を入射することによって自己位相変調や四光波混合等の非線形光学現象が誘起され、入射光より幅広い帯域を有するスーパーコンティニューム光が生成される。スーパーコンティニューム光は広帯域ストークス光として利用することが可能である。ストークス光として広帯域な光を用い、発生するＣＡＲＳ光を分光検出するものは多色ＣＡＲＳ顕微鏡（もしくはマルチプレックスＣＡＲＳ顕微鏡）と呼ばれる。多色ＣＡＲＳ顕微鏡は、ＣＡＲＳ光の分光スペクトルからラマンスペクトルを推定できるため、取得できる情報が多く、測定対象のより詳細な解析に適している。これに対して、ストークス光として狭帯域な光を用いるものを本明細書では単色ＣＡＲＳと呼ぶ。単色ＣＡＲＳを採用する場合、検出器に分光性能が必要でないので、比較的簡素な構成で実現することができる。
　生成されたスーパーコンティニューム光は、コリメータ１０６によって平行光となり、ロングパスフィルタ１０７によって短波長成分がカットされたのち、ポンプ光波長を反射しそれ以外の波長の光を透過するダイクロイックミラー１０８を透過して、ダイクロイックミラー１１２によって反射され、ストークス光として励起用レンズ１１３に入射する。一方、偏光ビームスプリッタ１０３を反射したレーザ光は、コリメータ１０９によって光ファイバ１１０の入射端に集光される。光ファイバ１１０中を伝搬して出射されたレーザ光は、コリメータレンズ１１１によって平行光となり、ダイクロイックミラー１０８、およびダイクロイックミラー１１２によって反射され、ポンプ光として励起用レンズ１１３に入射する。
　励起用レンズ１１３は、ダイクロイックミラー１０８によって同軸上に合波されたストークス光とポンプ光とをサンプル１１４に集光する、励起用レンズとして作用する。合波されたストークス光とポンプ光は励起光としてＣＡＲＳ光生成に寄与する。サンプル１１４では前記の励起光１４４により、サンプル１１４の分子種に対応する波長のＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光は受光用レンズ１１５によって開口部１２２へ導かれて分光検出器１１９にて検出される。すなわち、ＣＡＲＳ光は受光用レンズ１１５を透過して平行光となり、ダイクロイックミラー１２４で反射して、ノッチフィルタ１１７及びショートパスフィルタ１１８によってポンプ光及びストークス光の透過成分がカットされ、集光レンズ１２０で集光されたのち、スリット１２１の開口部１２２を通して分光検出器１１９に入射する。分光検出器１１９はＣＡＲＳスペクトルを検出する。ここで、受光用レンズ１１５を透過したＣＡＲＳ光が平行光になるよう配置することで、ＣＡＲＳ光はノッチフィルタ１１７及びショートパスフィルタ１１８の表面に対して直交して入射するので、フィルタ表面での屈折の影響などを排除できる。
　試料ステージ１３０は、試料１１４を保持して移動する機能を備える。これにより、試料１１４上の観察する部位（測定点）を変更できる。受光用レンズステージ１３２は受光用レンズ１１５をＣＡＲＳ光の光軸方向に移動できるように、励起用レンズステージ１３１は励起用レンズ１１３を励起光１４４の光軸方向に移動できるように、それぞれ配置されている。これら３つのステージの全てまたは一部を動かすことで、励起用レンズの焦点位置と受光用レンズの焦点位置を一致させるための調整に使うことができる。制御部１３４には、試料ステージ１３０の移動量と受光用レンズステージ１３２の移動量を一定の比率で連動して移動する機能を備えている。この機能は以下の構成により実現される。試料ステージ１３０は３軸ピエゾアクチュエータで駆動され、ピエゾコントローラ１３５を介して、制御部１３４に接続されている。受光用レンズステージ１３２はステッピングモータとボールねじ、またはラックピニオン機構で駆動され、モータコントローラ１３６を介して、制御部１３４に接続されている。例えば、比率Ａで受光用レンズステージ１３２を連動する場合、制御部１３４上のソフトウェアが試料ステージ１３０をＺ軸の正の向きに１０μｍ移動させる際、まず制御部１３４はピエゾコントローラ１３５に対し、Ｚ軸アクチュエータを現在位置から正方向に１０μｍ移動するよう指示を送る。続いて制御部１３４はモータコントローラ１３６に対し、現在位置からＺ軸の正の方向にＡ×１０μｍ移動するよう指示を送る。制御部１３４は、ピエゾコントローラ１３５とモータコントローラ１３６の位置決め完了の信号を、両方とも受けとった時点で、一連のステージ制御が完了したと判断する。これによって、制御部１３４によって試料ステージ１３０の移動量と受光用レンズステージ１３２の移動量を一定の比率Ａで連動して移動させることができる。
　この比率を０以外の定数に設定可能で、この比率に従って連動して移動することが可能である。この比率は、あらかじめ記憶装置１３３内に保持された値を設定することもできる。また、この比率として、表示部１３７の操作画面上からユーザが入力した値を設定することもできる。また、この比率として、表示部１３７の操作画面上からユーザが入力した値に応じて、記憶装置１３３内に保持された複数の値を選択して設定することもできる。
　明視野用光源１２９から出射した光の少なくとも一部はダイクロイックミラー１２４を透過して、受光用レンズ１１５を介して試料１１４を照明する。試料１１４を透過した光は励起用レンズ１１３、ダイクロイックミラー１１２、ミラー１２５、結像レンズ１２６を経て、２次元センサ１２７のセンサ面に、試料１１４の明視野像を結ぶ。制御部１３４で２次元センサ１２７の出力を読み取ることで、明視野像情報を得ることができる。取得した明視野像情報は表示部１３７の操作画面上に画像として出力される。そのほか、明視野像情報は、各種媒体（電子データや印刷物）に出力してもよい。試料ステージ１３０や受光用レンズステージ１３２、励起用レンズステージ１３１を動かしながら明視野像を取得することで、試料１１４の中のＣＡＲＳ顕微鏡で観察したい部位を探すことができる。
　（レンズの選択）
　本実施例の走査型顕微鏡１００は、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５を備える。
　励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５として、顕微鏡用の各種対物レンズを含む各種光学レンズを用いることができる。また、同様の働きをもつ凹面鏡やその組合せなどを用いても良い。
　対物レンズには各種のカップリング媒質を想定して設計されたレンズ、すなわち各種カップリング媒質用のレンズが存在する。ここでカップリング媒質とは、レンズの試料側表面を覆う媒質のことを指す。例えば、カップリング媒質として水を想定した水浸レンズ、同じくオイルを想定した油浸レンズ、空気を想定した空気用レンズ（非液浸レンズ）などがある。
　このような各種レンズの中から、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せとして、異なるカップリング媒質を想定して設計したレンズを組み合わせてよい。異なるカップリング媒質に対して設計したレンズ同士の組み合わせを用いることで、レンズ選択の自由度を高めることができる。例えば、水浸の励起用レンズ１１３と空気用（非液浸）の受光用レンズ１１５の組み合わせを用いることができる。この場合、励起光１４４を大きな開口数の励起用レンズ１１３で集光することで励起効率を高め、生成するＣＡＲＳ光強度を高めつつ、空気用の受光レンズ１１５による使い勝手の良さを両立することができる。他にも例えば、油浸の励起用レンズ１１３と空気用（非液浸）の受光用レンズ１１５の組み合わせであれば、励起用レンズ１１３の開口数をより大きくすることも可能なため、より大きなＣＡＲＳ光強度を得ることが可能になる。
　励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せの１つは、励起用レンズ１１３のカップリング媒質の屈折率Ｒ１と受光用レンズ１１５のカップリング媒質の屈折率Ｒ２について、Ｒ１≠Ｒ２である。このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の組合せの１つではＲ１＞Ｒ２であり、この場合は励起用レンズ１１３のカップリング媒質の屈折率がより大きいために、励起用レンズ１１３の開口数をより大きく取ることが可能で、ＣＡＲＳ光生成効率を高めることができる。また、このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の別の組合せの１つではＲ１＜Ｒ２であり、この場合は受光用レンズ１１５のカップリング媒質の屈折率がより大きいために、ＣＡＲＳ光の受光効率（生成したＣＡＲＳ光の光量のうち、受光用レンズ１１５に入射する光量の割合）、および検出効率（生成したＣＡＲＳ光の光量のうち、開口部１２２を通過して分光検出器１１９に入射するに入射する光量の割合）を高め、ひいては検出感度を高めることができる。
　励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の好ましい組合せの１つでは、励起用レンズ１１３のカップリング媒質の開口数Ｍ１と受光用レンズ１１５のカップリング媒質の開口数Ｍ２について、Ｍ１≠Ｍ２である。このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の組合せの１つではＭ１＞Ｍ２であり、励起用レンズ１１３の開口数がより大きいために、ＣＡＲＳ光生成効率を高めることができる。このとき、一般的に同じレンズ口径であれば開口数と作動距離（ＷＤ）は逆相関の関係にあるため、より長い作動距離を持つ受光用レンズ１１５を用いることで作業性を高めることができる。
　また、このような励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の別の組合せの１つではＭ１＜Ｍ２であり、この場合は受光用レンズ１１５の開口数がより大きいために、ＣＡＲＳ光の受光効率および検出感度を高めることができる。このとき、より長い作動距離を持つ励起用レンズ１１３を用いることで作業性を高めることができる。
　励起用レンズ１１３について、好ましい開口数は例えば０．８以上で、さらに好ましくは開口数０．９５以上である。サンプル１１４内でのストークス光とポンプ光のエネルギー密度を増加させ、ＣＡＲＳ光生成効率を向上させるためである。好ましい開口数を持つ励起用レンズ１１３としては液浸レンズを使ってよい。
　また、励起用レンズ１１３として、色収差を補正したレンズを用いてよい。色収差を補正したレンズを用いることで、励起光１４４の強度やビームスポット形状への色収差の影響を低減し、偏りの少ないＣＡＲＳ信号およびＣＡＲＳスペクトルを検出することができる。
　励起用レンズ１１３について、好ましい作動距離（ＷＤ）は大きければ大きいほど作業性が高まるので、また、深部観察を可能にするので好ましい。励起用レンズ１１３の作動距離は好ましくは０．１ｍｍ以上である。より好ましくは０．２ｍｍ以上であれば、一般的な厚み０．１７－０．１９ｍｍのカバーガラス越しに試料を観察できる。さらに好ましくは０．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１００μｍ以上、を観察しうる。さらに好ましくは１．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１０００μｍ以上、を観察しうる。
　励起用レンズ１１３として水浸レンズを用いてよい。試料として、水溶液や細胞、組織、または細胞や組織を含む培養液やゲルやハイドロゲルを想定する場合、これらの試料の屈折率は水の屈折率に近いため、励起用レンズ１１３として水浸レンズを採用することで、球面収差の影響を押えることができる。特に試料の深部を観察する際に信号光強度と空間分解能の点で有利となる。
　また、励起用レンズ１１３として油浸レンズや、その他の浸液を用いるよう設計されたレンズを用いてもよい。この場合、試料の成分として、ガラスやポリマーフィルムなど水より大きな屈折率をもつ材料を含むものを観察する際に、球面収差の影響を押さえることができる。また、水浸レンズよりさらに大きな開口数を得ることも可能になるため、試料中の励起光１４４の集光点においてより大きな励起光パワー密度を得ることができる。
　励起用レンズ１１３として非液浸レンズ（空気用レンズ）を用いてもよく、この場合、液浸レンズよりも開口数の面では不利であるものの、カップリング媒質としての液体（浸液）が試料や試料を覆うカバーガラス等に触れることがないため、取り扱いを容易にすることができる。
　色収差を補正した励起用レンズ１１３として、好ましくはアクロマートレンズを用いることで色収差の影響を低減することができる。さらに好ましくはアポクロマートレンズを用いることで、色収差の影響をさらに低減できる。また、ポンプ光とストークス光を含む領域で色収差を補正したレンズを用いることで、励起光１４４に近赤外光を含むＣＡＲＳにおいて色収差の影響を低減できる。近赤外領域を含む領域で色収差補正したレンズを用いることで、本実施例のように中心波長１０６４ｎｍのポンプ光を用いたＣＡＲＳにおいて、測定精度を向上することができる。なお、励起用レンズ１１３として、色収差を補正しないレンズを用いることで、コスト低減を図ることもできる。
　受光用レンズ１１５には、各種レンズを用いてよく、各種の顕微鏡用対物レンズやコンデンサレンズを用いてもよい。
　受光用レンズ１１５として、開口数の大きなレンズを用いることで、より多くのＣＡＲＳ光を受光し、開口部１２２を通して分光検出器１１９へと導くことができ、受光効率および検出感度を上げることができる。このような受光用レンズ１１５の開口数は好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、さらに好ましくは０．９以上、最も好ましくは１．２以上である。
　受光用レンズ１１５について、好ましい作動距離（ＷＤ）は大きければ大きいほど作業性が高まるので、また、深部観察を可能にするので好ましい。受光用レンズ１１５の作動距離は好ましくは０．１ｍｍ以上である。より好ましくは０．２ｍｍ以上であれば、一般的な厚み０．１７－０．１９ｍｍのカバーガラス越しに試料中で生成したＣＡＲＳ光を検出できる。さらに好ましくは０．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１００μｍ以上、を観察しうる。さらに好ましくは１．５ｍｍ以上であれば試料のより深部、例えば深さ１０００μｍ以上、を観察しうる。
　このような受光用レンズ１１５として水浸レンズを用いることで、より大きな開口数を得ることができる。また、受光用レンズ１１５として油浸レンズを用いることで、さらに大きな開口数を得ることができる。また、受光用レンズ１１５として、その他の浸液を用いるよう設計されたレンズを用いることもできる。
　また、受光用レンズ１１５として非液浸レンズ（空気用レンズ）を用いてもよく、この場合、液浸レンズよりも開口数の面では不利であるものの、カップリング媒質としての液体（浸液）が試料や試料を覆うカバーガラス等に触れることがないため、取り扱いを容易にすることができる。
　（イメージング用の機構）
　本実施例の走査型顕微鏡１００は、図１中のＸＹＺ軸方向に移動可能な３つの移動軸を持つ試料ステージ１３０、Ｚ軸方向に移動可能な軸を持つ受光用レンズステージ１３２、Ｚ軸方向に移動可能な軸を持つ励起用レンズステージ１３１を備える。制御部１３４は、短パルスレーザ光源１０１、分光検出器１１９、試料ステージ１３０、受光用レンズステージ１３２、レンズステージ１３１の各部の動作を同期して制御する機能を備える。制御部１３４は、これらを連動することで、以下のようにＣＡＲＳイメージを取得することができる。
　制御部１３４は、試料ステージ１３０を移動させて「測定対象領域」を走査しながら、短パルスレーザ光源１０１および分光検出器１１９によるＣＡＲＳスペクトルを検出させるよう制御する。制御部１３４は試料ステージ１３０の現在位置から、試料１１４中の測定点の座標を算出する。ＣＡＲＳイメージ中の画素の座標と、試料１１４中の測定点の相対座標を対応付け、検出したＣＡＲＳスペクトルをＣＡＲＳイメージ中の画素に対応づける。各画素に対応付けたＣＡＲＳスペクトルから代表値を算出し、代表値を色や輝度に変換して画素に割り当てることで、ＣＡＲＳイメージを生成する。生成したＣＡＲＳイメージは表示部１３７にて画像として出力する。
　制御部１３４は、明視野用光源１２９、明視野用カメラ１２７で取得した明視野画像を合せて表示部１３７や紙面やその他の媒体へ出力することができる。出力の様式としては、明視野画像とＣＡＲＳイメージを並べても、明視野画像とＣＡＲＳイメージを重畳してもよい。
　本実施例では、制御部１３４は記憶装置と入出力ポートを備えた電子回路を備え、表示部１３７は制御部１３４に接続された液晶モニタである。制御部１３４の内部または外部に接続された記憶装置には、制御に必要なソフトウェアと制御パラメータが電子データとして保持されている。
　図６は、本実施例のＧＵＩ１６０の概要を示した模式図である。ＧＵＩ１６０は表示部１３７上に表示される。ＧＵＩ１６０上には、明視野画像表示領域１６１、ＣＡＲＳイメージ表示領域１６４、自動焦点合わせボタン１６５、補正用パラメータ設定用ＧＵＩ１６６、受光用レンズ位置ボックス１７１、試料ステージ座標ボックス１７２、試料走査範囲ボックス１７３、ターゲット波数ボックス１７５が配置されている。
　明視野画像表示領域１６１には、明視野用カメラ１２７で取得した明視野画像をリアルタイムに表示できる。ＣＡＲＳイメージ表示領域１６４には、明視野画像１６３にＣＡＲＳイメージ１６２を重ね合わせて表示できる。試料ステージ座標ボックス１７２には試料ステージ１３０の現在位置座標を表示したり、座標を入力することで指定位置に試料ステージ１３０を移動するようユーザから指示したりすることができる。試料走査範囲ボックス１７３は、測定対象領域を指定するための情報を表示、入力することができる。例えば、試料ステージ座標ボックス１７２の座標を始点、試料走査範囲ボックス１７３の座標を終点とし、始点と終点を対角の２点とする直方体を測定対象領域として指定できる。または、試料走査範囲ボックス１７３には、試料ステージ座標ボックス１７２の座標を始点とした差異の終点までのオフセット値を入力しても良い。自動焦点合わせボタン１６５をユーザが押下すると、後述する図２中ステップ２０５の焦点合わせ動作を自動実行する。補正用パラメータ設定用ＧＵＩ１６６上には、励起側カップリング媒質選択ボックス１６７、受光側カップリング媒質選択ボックス１６８、励起側カップリング媒質屈折率ボックス１６９、受光側カップリング媒質屈折率ボックス１７０、補正係数ボックス１７４がある。励起側カップリング媒質選択ボックス１６７、受光側カップリング媒質選択ボックス１６８は、それぞれ励起側カップリング媒質１４０、受光側カップリング媒質１４１の物質名を表示と入力できる。励起側カップリング媒質屈折率ボックス１６９、受光側カップリング媒質屈折率ボックス１７０には、それぞれ励起側カップリング媒質１４０、受光側カップリング媒質１４１の屈折率の設定値を表示、入力できる。これらの屈折率の設定値は、後述する図２中ステップ２０９で、焦点合わせ状態を維持する動作のための制御パラメータとして利用される。補正係数ボックス１７４は、後述する補正係数αの値を表示したり、ユーザから入力したりすることができる。受光用レンズ位置ボックス１７１には、受光用レンズ１１５または受光用レンズステージ１３２の少なくともＺ座標を含む現在位置座標を表示することができ、また、この座標を変更することで受光用レンズ１１５および受光用レンズステージ１３２の移動をユーザから指示することができる。１７６　焦点合わせモード切換ボタンは、現在の焦点合わせモードを表示し、ユーザがクリックすることで焦点合わせモードを切換可能である。同モードがＯＮのときには、焦点合わせ状態を維持するように各種ステージを連動して制御する。ＯＦＦの時には、この連動制御を無効にする。
　ターゲット波数ボックス１７５には、焦点合わせや，補正係数αの算出，ＣＡＲＳイメージの表示などの目的に用いるＣＡＲＳ光のターゲット波数を表示と入力することができる。ターゲット波数ボックス１７５は前記の複数目的に応じて，ＧＵＩ１６０上に複数個備えてもよい。
　（測定点の位置調整と焦点合わせ）
　図２と図３はそれぞれ、本実施例の走査型顕微鏡１００で試料をイメージングする際の動作を説明したフローチャートと模式図である。
　図２のフローチャートに基づきでイメージング動作の手順を説明する。フローチャートは２０１のＳＴＡＲＴから手順を開始する。まずステップ２０２で装置の電源を投入する。レーザ光源１０１や各種ステージ、分光検出器１１９、制御部１３４、視野用光源１２９を含む各部を起動し、動作を安定させる。次のステップ２０３で、試料を試料ステージ１３０に載せて固定する。ステップ２０４では試料の観察したい部位が顕微鏡の視野付近に来るように、試料位置の粗調整を行う。位置の確認は目視やＧＵＩ１６０上の明視野画像表示領域１６１に表示される顕微鏡の明視野像を参考に行う。位置の調整は、手動またはＧＵＩ１６０を介した各種ステージの移動、主に試料ステージ１３０の移動によって行う。
　次のステップ２０５では焦点合わせを行う。その目的は、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率を上げることである。本実施例での焦点合わせの方法は、受光用レンズ１１５を受光用レンズステージ１３２によって図３中のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向）に移動しながらＣＡＲＳ光の強度を分光検出器１１９で測定し、その強度が最大となるよう受光用レンズ１１５の位置を定めることによる。焦点合わせ後の配置では、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系によって、測定点１５０の像は開口部１２２の位置に投影される。
　図３（ａ）は焦点合わせ前の光路を示した模式図である。図中の矢印１４６と矢印１４７はそれぞれ、励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５の進行方向を表す。励起用レンズ１１３を透過した励起光１４４は、励起側カップリング媒質１４０中を進み、試料１１４の表面で屈折して一点に集光する。この点においてＣＡＲＳ光１４５が生成するため、この励起光１４４の集光点を測定点１５０と呼ぶ。なお本実施例では、励起光１４４は平行光となるよう配置しているので、測定点１５０は励起用レンズ１１３の焦点と一致する。図３（ａ）は焦点合わせ実施前の状態なので、測定点１５０と受光用レンズ１１５の焦点１５１とは一致していない。このとき、生成したＣＡＲＳ光は試料１１４と受光側カップリング媒質１４１中を進んで受光用レンズ１１５に入射して屈折するが、屈折した後のＣＡＲＳ光１４５は平行光にはならない。この時、分光検出器１１９で検出されるＣＡＲＳ光１４５の光量は最大ではない。
　図３（ｂ）は焦点合わせ完了後の光路の模式図である。分光検出器１１９で検出されるＣＡＲＳ光１４５の光量が最大となるように、受光用レンズ１１５の位置が調整されている。このとき、測定点１５０と受光用レンズ１１５の焦点位置は一致しており、受光用レンズ１１５を透過した後のＣＡＲＳ光１４５は平行光となる。本実施例の走査型顕微鏡１００では、集光レンズ１２０の焦点がスリット１２１の開口部１２２の中央に一致するように配置している。このため、図３（ｂ）のように受光用レンズ１１５を透過したＣＡＲＳ光が平行光として集光レンズ１２０に入射するときに、スリット１２１の開口部１２２を通過して分光検出器１１９に入射するＣＡＲＳ光の量が最大になる。
　なお、他の好ましい実施例においては、焦点合わせ完了後の励起用レンズ１１３の焦点位置と受光用レンズ１１５の焦点位置１５１は必ずしも一致しなくてもよい。たとえば、あえて平行光でない励起光１４４を励起用レンズ１１３に入射する場合は、励起光１４４の集光点である測定点１５０は励起用レンズ１１３の焦点と一致しないが、測定点１５０と受光用レンズの焦点位置１５１が一致すればよい。このような例は、特に励起光１４４を構成するポンプ光またはストークス光のいずれかまたは両方に、広帯域光などの非単色光を用いた多色ＣＡＲＳ顕微鏡において有用である。この際、各集光点の位置調整は、例えば励起用レンズ１１３やコリメータ１０６、コリメータ１１１などの調整によって、励起光１４４の発散収束状態を変更することにより実現できる。したがって、この場合の励起光１４４は必ずしも平行光ではなく、測定点１５０はポンプ光の集光点とストークス光の集光点の重なりの領域である。
　また、集光レンズ１２０の焦点とスリット１２１の開口部１２２が一致していない配置の場合、焦点合わせ後の受光用レンズ１１５の焦点１５１位置は、測定点１５０と一致しなくてよい。
　上記の焦点合わせにおいてＣＡＲＳ光１４５を検出する際，特定波長の光のみを検出しても良い。このために，制御部１３４の指示により，受光用レンズ１１５と分光検出器１１９の間にバンドパスフィルタを挿入してもよい。または，制御部１３４の指示によって分光検出器１１９の設定を変更したり，分光検出器１１９で得られたスペクトルから制御部１３４での計算処理によって特定帯域のデータのみを抽出したりしてもよい。この場合，特定物質のＣＡＲＳ光のみに注目することで，焦点合わせ状態をＳＮ比よくモニタし，より精度の高い焦点合わせを実現できる。特に，測定対象の物質があらかじめ決められている場合，たとえば水溶液中の有機物を測定したい場合などには，それ以外の物質の影響によって誤った位置に焦点合わせしてしまうリスクを低減できるのでよい。この場合，測定対象の物質の指定は，物質名や，物質のＣＡＲＳスペクトル中のピーク位置を指定してよく，ピーク位置は，絶対波長やラマンシフトを波長または波数として指定してよい。これらの指定は，表示部１３７上のＧＵＩを用いてユーザに直接入力させても，選択肢から選択させてもよく，記憶装置１３３にあらかじめ保持された情報によってもよい。
　上記の焦点合わせにおいてＣＡＲＳ光１４５を検出する際，スペクトルの全部または部分の帯域を分光検出器１１９で検出してよい。または，複数の帯域を検出しても良い。光量の最大値を求める際に用いる光量としては，検出したスペクトル中の最大値や各種平均値を用いてよい。これらの場合，測定点１５０に存在する物質組成の影響を平均化できるため，より安定的に焦点合わせを実施することができる。
　次のステップ２０６では、試料位置の微調整と測定対象領域の設定を行う。図３の測定対象領域１４８は、以降のステップでＣＡＲＳイメージを取得する対象となる、試料中の領域であり、ユーザの意志により決定される。本ステップ２０６では、この測定対象領域１４８を測定対象として指定する。具体的には、主に明視野像を確認しながら試料ステージ１３０を移動し、励起光１４４の散乱光などを頼りに測定点１５０の位置が、測定対象領域１４８の端に位置するようにする。その上で、表示部１３７上のＧＵＩを用いて測定対象領域１４８の各軸方向の幅を指定することで、現在の測定点１５０の位置を起点とした測定対象領域１４８の範囲を設定する。制御部１３４は、設定された測定対象領域１４８の範囲情報から、測定時の走査範囲パラメータを決定し、記憶装置１３３に記憶する。
　ステップ２０７では測定条件を設定する。例えば、測定時の１点あたりの露光時間や走査時の移動速度などのパラメータを設定する。設定方法としては、表示部１３７上のＧＵＩからユーザに入力させてもよく、記憶装置１３３中の情報や、外部記憶上の電子ファイル中の情報を用いてもよい。なお、ステップ２０７を実施するタイミングは、電源投入２０２から、測定開始指示２０８の間のいつでもよい。
　ステップ２０８では、ユーザから測定開始の指示を出す。
　ステップ２０９では、試料１１４上を測定点１５０が走査しながら、ＣＡＲＳ光１４５およびＣＡＲＳスペクトルを検出する。図３（ｃ）は、ステップ２０９の途中の状態を示している。測定対象領域１４８の中を、図中に示した測定予定点１５３の各点をラスタースキャンしながら、ＣＡＲＳスペクトルを測定する。ここでラスタースキャン　（Ｒａｓｔｅｒ　ｓｃａｎ）　とは、２次元の画像を、まず測定点を１次元的にスキャン（走査）して線上の測定データを得て、次いでその直角方向にその線でスキャンして、２次元の面の点で測定データを得る方法である。図３（ｃ）は、測定済みの点の集合１４９として示した各点を測定点として、ＣＡＲＳスペクトルを測定し終えた状態であり、この後測定点１５０の位置のＣＡＲＳスペクトルを測定する。ステップ２０６で設定された走査範囲パラメータで規定される走査と測定の動作を終えると、全ての測定予定点１５３での測定は完了するので、次のステップに進む。
　ステップ２１０では、測定が終了した旨をユーザに報告する。これには、例えば表示部１３７上のＧＵＩを用いてよい。
　ステップ２１１では、ユーザが前ステップの測定終了の報告を確認した上で、試料１１４を試料ステージ１３０から撤去する。
　ステップ２１２では、装置電源をＯＦＦする。
　最後に２１３のＥＮＤでイメージング動作の手順のフローチャートは終了となる。
　（焦点の調整）
　図２のフローチャート中のステップ２０９中の動作について、図４、図５を用いてより詳細に説明する。
　図４，図５は、ステップ２０９中の、測定点１５０と受光用レンズの焦点１５１の位置関係を示した模式図である。ここで説明する例では、試料１１４はガラス１４３とガラス１４２に挟まれている。ただし、ガラス１４３とガラス１４２が無くとも、以下で説明する現象に本質的な違いは無いため、このような試料１１４を測定する場合にも適用できる。励起用レンズ１１３を透過した励起光１４４は、励起側カップリング媒質１４０、ガラス１４２、試料１１４、ガラス１４３、受光側カップリング媒質１４１、の５層の中を進んで受光用レンズ１１５に到達する。前記５層の図中Ｚ軸方向（励起光１４４の光軸方向）の厚みはそれぞれｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ４、ｄ５であり、屈折率はそれぞれ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５である。
　試料１１４とガラス１４３とガラス１４２は共に、試料ステージ１３０によって光軸方向に移動することができる。ここで、試料ステージ１３０によって光軸方向に移動される物体を試料ステージによる移動体１５９と総称する。試料ステージによる移動体１５９には、たとえば前述のように試料１１４とガラス１４３とガラス１４２からなっていてもよく、試料１１４だけの場合もありうる。また、より多くの屈折率の異なる材料からなっていてもよく、いずれの場合でも以下の操作を用いることができる。
　励起用レンズ１１３は、励起用レンズステージ１３１によって光軸方向に移動することができる。受光用レンズ１１５は、受光用レンズステージ１３２によって光軸方向に移動することができる。
　図４（ａ）は、焦点合わせがなされた状態を示した模式図である。励起光１４４の集光点である測定点１５０は、受光用レンズ１１５の焦点１５１と一致しており、ＣＡＲＳ光１４５の分光検出器１１９による検出効率は最大となっている。
　図４（ａ）では、励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５をともに平行光に保つという条件で焦点合わせを行ってある。この条件下で、励起用レンズ１１３、試料ステージ１３０、受光用レンズ１１５を光軸方向に移動することで焦点合わせを行った場合、ｆ１、ｆ２はそれぞれ、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の焦点距離であるとき、次の関係を満たす。
　ｆ１＋ｆ２＝ｄ１／ｎ１＋ｄ２／ｎ２＋ｄ３／ｎ３＋ｄ４／ｎ４＋ｄ５／ｎ５　・・・式１
したがって、より一般的には図５（ｇ）において、試料ステージ１３０、励起用レンズステージ１３１、受光用レンズステージ１３２を動かす際に、
　Ｄ１／Ｎ１＋Ｄ５／Ｎ５＝一定　・・・式２
　という関係式を満たすように制御することで、焦点合わせされた状態を維持することができる。ここで、Ｄ１は励起光１４４が励起側カップリング媒質１４０の中を通る距離であり、ここでは励起用レンズ１１３と試料ステージによる移動体１５９の距離を用いてよい。Ｄ５はＣＡＲＳ光１４５が受光側カップリング媒質１４１の中を通る距離であり、ここでは受光用レンズ１１５と試料ステージによる移動体１５９の距離を用いてよい。Ｎ１は励起側カップリング媒質１４０の屈折率、Ｎ５は受光側カップリング媒質１４１の屈折率である。
　また、焦点合わせの考え方として、受光用レンズ１１５の焦点１５１の代わりに、測定点１５０について、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点を、分光検出器１１９の前のスリット１２１の開口部１２２と一致させてもよい。ここで像点とは、測定点１５０から出たＣＡＲＳ光１４５を構成する複数本の光線が、光学系によって再び収束する点である。測定点１５０の像点が開口部１２２に一致するとき、ＣＡＲＳ光１４５のうち分光検出器１１９で検出される成分の割合が極大になる。この考え方によれば、励起光１４４やＣＡＲＳ光１４５は必ずしも平行光でなくともよくなり、光学系の自由度が増す。
　図４（ｂ）は、ステップ２０９での走査において試料１１４を図中のＺ軸方向（励起光の光軸方向）に移動した直後の状態を示した模式図である。なお、Ｚ軸の向きは、図４中の右上に示したように、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とし、移動量の向きもこれに従う。図４（ｂ）は、図４（ａ）の状態から試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量ΔΔｄ１だけ移動しており、これに伴い試料１１４とガラス１４２、ガラス１４３が移動量ΔΔｄ１だけ移動している。その結果、受光レンズの焦点１５１の位置は測定点１５０と一致していない。測定点１５０で生成したＣＡＲＳ光１４５は平行光になっていないので、測定点１５０の像点が開口部１２２に一致せず、分光検出器１１９による検出効率が落ちてしまう。そこで、ステップ２０９の間にステップ２０５と同様の焦点合わせの動作を繰り返すことで、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率をより高め、より大きな信号強度を得ることが可能になる。しかし、焦点合わせ動作の分だけ測定時間はのびることになる。さらに試料１１４のＺ軸方向（励起光の光軸方向）への走査回数が増えれば、その分だけ焦点合わせ動作の回数が増え、全体の測定時間はさらに長くなってしまう。なお、図４の例ではｎ１とｎ３がおよそ等しい例をしているため、図４（ａ）と図４（ｂ）で測定点１５０のＺ軸方向の位置はほぼ一致しているように描かれているが、一般的には試料１１４の移動に伴い測定点１５０は移動する。
　図４（ｃ）では、試料ステージ１３０が移動量ΔΔｄ１だけ移動したのに合せて、受光用レンズステージ１３２によって受光用レンズ１１５の位置を移動量ΔΔｄ５だけ移動することにより、焦点合わせした状態を回復している。
このとき、ΔΔｄ５の値は以下のように求めてよい。図４（ｃ）に示された焦点合わせされた受光用レンズ１１５のＺ軸方向の位置Ｚは、励起用レンズ１１３の位置を基準（Ｚ＝０）として、式３で表される。
　Ｚ＝ｄ１＋ｄ２＋ｄ３＋ｄ４＋ｄ５
　　＝ｄ１＋ｄ２＋ｄ３＋ｄ４＋ｎ５（ｆ１＋ｆ２）－ｎ５（ｄ１／ｎ１）－ｎ５（ｄ２／ｎ２）－ｎ５（ｄ３／ｎ３）－ｎ５（ｄ４／ｎ４）　・・・式３
ただしｆ１、ｆ２はそれぞれ、励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５の焦点距離である。このとき、試料ステージ１３０をＺ軸方向に微小量動かした時のＺの変化はＺのｄ１についての偏微分で得られる。ｄ２、ｄ３、ｄ４は定数でありｄ１とは独立であることに注意して、
　∂Ｚ／∂ｄ１＝１－ｎ５／ｎ１＝（一定）　・・・式４
よって、ΔΔｄ１とΔΔｄ５の関係は比例関係である。その比例定数を用いて、補正係数を、
　α＝ΔΔｄ５／ΔΔｄ１　・・・式５
と定義する。補正係数αは励起側カップリング媒質１４０の屈折率と受光側カップリング媒質１４１の屈折率のみによって決まる定数となる。すなわち、式５によってαの値を定めてよい。
　α＝１－ｎ５／ｎ１　・・・式６
これを用いて、試料ステージ１３０を移動量ΔΔｄ１移動したときに、受光用レンズ１１５を
　ΔΔｄ５＝ΔΔｄ１×α＝ΔΔｄ１×（１－ｎ５／ｎ１）・・・式７
の移動をすれば、焦点合わせされた状態を維持することができる。これによって、ステップ２０５と同様の焦点合わせ動作をステップ２０９の中で実施する必要は無くなり、ステップ２０９の所要時間を短縮し、全体の測定時間も短縮できる。
　補正係数αの値を０に設定した場合は、受光用レンズ１１５の位置補正を行わない従来と同じ動作が可能である。この補正係数αの値を正の値（α＞０）に設定してもよい。この場合ｎ５＜ｎ１となるレンズの組合せが使用できる。この補正係数αの値を負の値（α＜０）に設定してもよい。この場合ｎ５＞ｎ１となるレンズの組合せが使用できる。なお、補正係数αの値を１に設定した場合は、試料１１４と受光用レンズ１１５との距離を一定に保つことができる。
　前述のように、好ましい実施形態の一つでは、励起用レンズ１１３は水浸レンズで、受光用レンズ１１５は空気用レンズ（非液浸レンズ）である。このとき、励起側カップリング媒質１４０が水、受光側カップリング媒質１４１が空気であるので、試料ステージ１３０の移動量に対する受光側レンズ１１５の好ましい移動量の比率は、水と空気の屈折率のみで定まる。水の屈折率を１．３３３、空気の屈折率を１．０００とすると、前記の比率は０．２４９８となる。よって、試料ステージ１３０の移動量から受光用レンズ１１５の移動量を定める係数を０．２４９８に定めてもよい。または、温度変化や夾雑物による水や空気の屈折率の変動を４％程度考慮して、前記の係数を０．２４から０．２６の間の任意の定数に定めても良い。また、前記の変動を２０％程度考慮して、前記の係数を０．２から０．３の間の任意の定数に定めても良い。
　好ましい実施形態の一つでは、前記の例とは逆に、励起用レンズ１１３は空気用レンズ（非液浸レンズ）で、受光用レンズ１１５は水浸レンズである。このとき、励起側カップリング媒質１４０が空気、受光側カップリング媒質１４１が水であるので、試料ステージ１３０の移動量に対する受光側レンズ１１５の好ましい移動量の比率は、水と空気の屈折率のみで定まる。水の屈折率を１．３３３、空気の屈折率を１．０００とすると、前記の比率は、－０．３３３となる。よって、試料ステージ１３０の移動量から受光用レンズ１１５の移動量を定める係数を－０．３３３３に定めてもよい。または、温度変化や夾雑物による水や空気の屈折率の変動を４％程度考慮して、前記の係数を－０．３２から－０．３４６の間の任意の定数に定めても良い。また、前記の変動を２０％程度考慮して、前記の係数を－０．２７８から－０．４の間の任意の定数に定めても良い。
　また、ほかの好ましい実施形態では、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１は水、空気、オイル、グリセロール、シリコーンオイルなどである。表１は、あらかじめこれらの媒質の屈折率から計算した、媒質の組合せと補正係数αの補正係数αの値の表の例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表中のＡとＢはそれぞれ、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１に対応する。表１のような対応表を記憶装置１３３に保持しておいてよく、顕微鏡の使用時に適宜これらの値を取り出して補正係数αとして設定してよい。これによって、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１のいずれか、または両方について、複数のレンズに対応する製品を提供できる。また、ユーザが測定目的や試料の種類に応じてレンズを切り替えて使用することも可能になる。
　また、表２に示すように、媒質名と屈折率の対応表を記憶装置１３３に保持してもよい。なお、表中のＲ．Ｉ．は屈折率を表す。制御部１３４で、この対応表の屈折率を用いて、補正係数αを算出して用いても良く、その場合は表１のような対応表よりも行数が少なくてよいため、記憶装置１３３中に占める容量を節約できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、記憶装置１３３中に保持した補正係数α、屈折率、または媒質名の複数の選択肢のうち、どれを用いるかを選択する手段としては、ユーザに選択を促して選択情報の入力を受け付ける表示部１３７上のＧＵＩを用いてよい。このときユーザが入力する情報としては、αの値そのもの、１つの屈折率、２つの屈折率、１つの媒質名、２つの媒質名、でよい。これらの入力値と表１の対応表や表２の対応表を用いて補正係数αを算出してよい。αの算出法として、２つの屈折率を数５のｎ５とｎ１に代入してαを求めてよい。なお、１つの媒質名、または１つの屈折率だけを入力する場合は、他方の媒質名または屈折率はデフォルト値を用いればよい。ユーザが入力する形態としては、数値のテキスト入力、数値のスライドバーでの指定、プルダウンメニューによる数値または物質名の選択、ラジオボタンによる数値または物質名の選択、などを用いてよい。
　また、記憶装置１３３に保持した複数の値のうちどれを用いるかを選択する手段として、装置に備え付けられたセンサまたは電子回路が励起用レンズ１１３と受光用レンズ１１５のいずれかまたは両方の、レンズの種類や媒質の屈折率を認識し、認識結果を入力として制御部１３４が適切な値を選択してもよい。
　物質の屈折率は一般に，考慮する光の波長によって変わるが，ＣＡＲＳでは以下のように複数の波長を含む光を扱う必要がある。まず、ＣＡＲＳの励起光１４４はポンプ光とストークス光という波長の異なる光からなる。多色ＣＡＲＳにおいては、励起光１４４中のストークス光成分もまた複数波長を含む広帯域光を用いる必要がある。さらには、多色ＣＡＲＳにおけるＣＡＲＳ光１４５も複数波長を含む広帯域光である。したがって、励起側カップリング媒質１４０と受光側カップリング媒質１４１の物質がそれぞれ同じであっても、複数波長のどの波長に着目するかで、前記のα算出時に用いるために式５に代入する２つの屈折率ｎ５とｎ１の値は異なってくる。
　例えば、多色ＣＡＲＳでは、励起光１４４は狭帯域光であるポンプ光と広帯域光であるストークス光が励起側カップリング媒質１４０中を透過し、広帯域光であるＣＡＲＳ光１４５が受光側カップリング媒質１４１中を透過する。
　そこで、好ましくは、励起側カップリング媒質１４０のポンプ光の中心波長に対する屈折率をｎ１として用いる。また、受光側カップリング媒質１４１のターゲット波長に対する屈折率をｎ５として、それぞれ指定する。
　ｎ１を考慮する際の波長としてポンプ光の中心波長を選ぶ理由は、ＣＡＲＳ光発生に対してポンプ光はストークス光より大きな寄与をもつためである。
　なお、ターゲット波長はユーザが最も興味を持つ分子のＣＡＲＳ光波長に対応するように選ぶ。具体的には、ポンプ光の波長からターゲット波数ボックス１７５に指定されたターゲット波数分だけ高波数（短波長）側にシフトした波長とする。
　αを求める際に用いる波長を以上のように選ぶことによって、ユーザの最も興味を持っている分子に対応するＣＡＲＳ光の検出効率を極大にできる。
　屈折率を考慮する波長は，任意の適切な波長に対する屈折率を用いてよく，例えば，波長５８９ｎｍに対する屈折率でもよい。レーザ光源１０１の波長や，ポンプ光の波長，励起光１４４波長や，ＣＡＲＳ光１４５の波長に対する屈折率を用いれば，より精度の高い焦点合わせが実現できるので良い。ＣＡＲＳ光１４５の波長の指定は，励起光１４４波長からの差分を波長や波数で指定してもよい。多色ＣＡＲＳの場合の励起光１４４の波長，ポンプ光の波長やＣＡＲＳ光１４５の波長の指定は，各光のスペクトルの帯域の中央値や，光強度のピーク位置を参考に設定してよい。たとえば，ＣＡＲＳ光１４５の波長として，励起光１４４の波長からのアンチストークスラマンシフトで表現して，１００ｃｍ－１～２０００ｃｍ－１を用いれば指紋領域のＣＡＲＳスペクトルをより感度よく測定可能であり，２０００ｃｍ－１～４０００ｃｍ－１を用いればＯ－Ｈ結合やＣ－Ｈ結合を多く含む，水や有機物をより感度高く測定できる。
また，例えば，前記のｎ１は励起光１４４の波長で，ｎ５は励起光１４４の波長から指定波数分だけずれた波長で，それぞれ屈折率を考慮してもよく，この場合，励起光１４４とＣＡＲＳ光１４５の波長の違いを考慮したより高精度の焦点合わせを実現できる。
　屈折率を考慮するための１つまたは複数の波長は，表示部１３７上のＧＵＩを用いてユーザに直接入力させても，選択肢から選択させてもよく，記憶装置１３３にあらかじめ保持された情報によってもよい。前記の屈折率の選択肢からの選択は，制御部１３４が励起光源１３９や分光検出器１１９の種類や設定を認識し，その結果に基づいて選択してもよい。
　さらには，表２の対応表中に，波長ごとの屈折率の値も含めて，記憶装置１３３に保持しておき，選択された媒質名と波長の組合せから，屈折率を選択し，補完して算出して，用いても良い。
　ステップ２０９で、測定点１５０の試料１１４中での走査は、試料ステージ１３０を固定したままで、励起用レンズ１１３を励起用レンズステージ１２３で移動することによってもよい。このとき、式２の関係を満たすように励起用レンズステージ１２３と受光用レンズステージ１３２を制御すればよい。たとえば、図５（ｆ）のように、励起用レンズ１１３のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とする）の移動量をΔΔｄｅ、受光用レンズ１１５の移動量をΔｄｒとすれば、一度焦点を合わせた状態を維持するためには、式５によって定まるαを用いてΔｄｒ／Δｄｅ＝－ｎ５／ｎ１となるように各ステージを制御すればよい。
　また、ステップ２０９で、測定点１５０の試料１１４中での走査は、受光用レンズステージ１３２を固定したまま、試料１１４を試料ステージ１３０で、励起用レンズ１１３を励起用レンズステージ１２３で、それぞれ移動することによってもよい。このとき、式２の関係を満たすように励起用レンズステージ１２３と試料ステージ１３０を制御すればよい。たとえば、図５（ｅ）のように、励起用レンズ１１３のＺ軸方向（励起光１４４の光軸方向、励起用レンズ１１３から受光用レンズ１１５へと向かう向きを正とする）の移動量をΔｄｅ、試料１１４の移動量を－Δｄｓとすれば、一度焦点を合わせた状態を維持するためには、式５によって定まるαを用いて
　Δｄｅ／Δｄｓ＝１＋ｎ１／ｎ５　・・・式８
となるように各ステージを制御すればよい。
　また、前記の例も含めて一般には、図５（ｇ）において励起用レンズ１１３とガラス１４２の間の距離Ｄ１の変化をΔＤ１（距離が増える方を正として）、受光用レンズ１１５とガラス１４３の間の距離Ｄ５の変化をΔＤ５とすれば（距離が増える方を正として）、いずの場合も、
　ΔＤ５／ΔＤ１＝－Ｎ５／Ｎ１　・・・式９
となるように各ステージを制御すればよい。
　このような各ステージを特定の比例係数に従って連動させる制御は、ステップ２０１装置電源ＯＮからステップ２１２装置電源ＯＦＦまでの間で、有効な時期と無効な時期があるように設定される。少なくともステップ２０９では前記の制御は有効である。未だ焦点合わせが行われていないステップ２０５では、前記制御は無効に設定する。このような前記制御の有効、無効の切換は、装置が自動で行ってよいし、ＧＵＩ１６０上のボタンやラジオボタンなどを備えることで、ユーザに切換を指示する手段を提供してもよい。
ステップ２０９で焦点を合わせた状態を維持するために、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点を、分光検出器１１９の開口部１２２に一致させるよう制御してもよい。この場合、受光用レンズ１１５を透過した後のＣＡＲＳ光１４５は必ずしも平行光でなくてよい。具体的には、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を組合せレンズとして捉えて、その主点の位置、合成焦点距離、またはその両方を変化させればよい。例えば、図４（ｄ）に示したように、集光レンズ１２０の位置をＣＡＲＳ光１４５の光軸方向に移動してもよい。また例えば、受光用レンズ１１５または集光レンズ１２０に複合レンズに焦点距離調整機構を備えたものを用いて、その焦点距離が前記条件を満たすように調整してもよい。集光レンズの移動は、集光レンズステージ１３８によって移動することができる。
　図４（ｄ）は、図４（ｂ）の状態から集光レンズ１２０を移動距離Δｄ６だけ移動することで、焦点を合わせた状態を実現した状態である。測定点１５０で発生して矢印１４７の向きに進むＣＡＲＳ光１４５は、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系によって、分光検出器１１９前面のスリット１２１の開口部１２２に集められている。すなわち、測定点１５０の像点が開口部１２２の位置にあり、ＣＡＲＳ光１４５の検出効率は極大となっている。ここで測定点１５０が移動したときに、測定点１５０の像点を開口部１２２の位置に保ち、焦点を合わせた状態を維持するために最適な集光レンズ１２０の移動距離Δｄ６は以下のように求めればよい。
　まず、図４（ａ）の状態から図４（ｂ）の状態まで、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量Δｄ１だけ移動したとき、これに伴って測定点１５０と受光用レンズ１１５の空気換算距離ａは、次の式で表されるΔａだけ変化する。
　Δａ＝Δｄ１（１／ｎ１－１／ｎ５）　・・・式１０
　受光用レンズ１１５による測定点１５０の像点と受光用レンズ１１５との距離をｂ、受光用レンズ１１５による測定点１５０の像点と集光レンズ１２０との距離をｂ’、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０のレンズ２枚の光学系による測定点１５０の像点と集光レンズ１２０との距離ｃとすると、次の式が成り立つ。
　１／ａ＋１／ｂ＝ｆ１、１／ｂ‘＋１・ｃ＝ｆ２　・・・式１１
　また、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０のレンズ２枚の光学系による測定点１５０の像点のＺ軸方向の位置Ｚ１を、受光用レンズ１１５の位置を基準として表すと、
　Ｚ１＝ｂ－ｂ‘　・・・式１２
式１１を変形して式１２に代入して次の式を得る。
　Ｚ１＝ｆ１ａ／（ａ－ｆ１）－ｆ２ｃ／（ｃ－ｆ２）＋ｃ　・・・式１３
ここで、Ａ＝ａ－ｆ１、Ｃ＝ｃ－ｆ２とおけば、
　Ｚ１＝｛ｆ１（Ａ＋ｆ１）／Ａ｝－｛ｆ２（Ｃ＋ｆ２）／Ｃ｝＋（Ｃ＋ｆ２）　
　・・・式１４
測定点１５０がＺ軸方向に微小量動いた時、その像点の位置Ｚ１の変化はＺ１のａについての偏微分で得られる。
　∂Ｚ１／∂ａ
　＝（∂Ｚ１／∂Ａ）・（∂Ａ／∂ａ）
　＝－ｆ１ ２／Ａ２＋（ｆ２ ２／Ｃ２）・∂Ｃ／∂Ａ＋∂Ｃ／∂Ａ　・・・式１５
　Ｚ１を一定に保つための条件は、式１５＝０なので、
　｛１＋（ｆ２ ２／Ｃ２）｝・∂Ｃ／∂Ａ＝ｆ１ ２／Ａ２　・・・式１６
　∂Ｃ／∂Ａ＝（ｆ１ ２／Ａ２）／｛１＋（ｆ２ ２／Ｃ２）｝
　　　　　　＝｛ｆ１ ２／（ａ－ｆ１）２｝・｛（ｃ－ｆ２）２／｛（ｃ－ｆ２）２＋ｆ２ ２｝　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・式１７
　ここで、集光レンズ１２０と開口部１２２の距離が焦点距離ｆ２に近い場合は、（ｃ－ｆ２）２＜＜ｆ２ ２なので、
　∂Ｃ／∂Ａ＝｛ｆ１ ２／（ａ－ｆ１）２｝・｛（ｃ－ｆ２）２／ｆ２ ２｝
　　　　　　＝｛ｆ１ ２／ｆ２ ２｝・｛（ｃ－ｆ２）２／（ａ－ｆ１）２｝
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・式１８
　試料ステージ１３０の移動量Δｄ１に対して、集光レンズ１２０の望ましい移動量Δｃを算出するための補正係数を、β＝Δｄ６／Δｄ１と定義する。式１０と式１８から、
　β＝Δｄ６／Δｄ１＝Δｃ／Δｄ１
　　＝∂Ｃ／∂Ａ・Δａ／Δｄ１
　　＝（ｆ１ ２／ｆ２ ２）｛（ｃ－ｆ２）２／（ａ－ｆ１）２｝（１／ｎ１－１／ｎ５）　・・・式１９
さらに、測定点１５０が受光用レンズ１１５の焦点に近い場合（受光用レンズ１１５を通ったあとのＣＡＲＳ光１４７が平行光に近い場合）には、次の関係が成り立つ。
　（ｃ－ｆ２）２／（ａ－ｆ１）２＝（ｆ１／ｆ２）４　・・・式２０
よって式１９は、
　β＝（ｆ１／ｆ２）６・（１／ｎ１－１／ｎ５）　・・・式２１
　したがってこのとき、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動量Δｄ１だけ移動したときに、集光レンズ１２０を移動量Δｄ６＝β・Δｄ１だけ移動すれば、図４（ｄ）のように、焦点を合わせた状態を実現でき、ＣＡＲＳ光１４７の検出効率を極大にすることができる。またこのとき、集光レンズ１２０と開口部１２２の間の距離Ｄ６の変化をΔＤ６（距離が増える方を正として）、励起用レンズ１１３とガラス１４２の間の距離Ｄ１の変化をΔＤ１（距離が増える方を正として）とすればΔＤ６とΔＤ１を用いて
　ΔＤ６＝β×ΔＤ１・・・式２２
となるように各ステージを制御してもよい。また、集光レンズ１２０と開口部１２２の間の距離と受光用レンズ１１５とガラス１４３の間の距離でも同様に類似した関係が成り立つ。
　他の好ましい実施例として、ＣＡＲＳ光１４５を分光検出器１１９まで導くための光学系の一部に光ファイバを用いてもよく、この場合は分光検出器１１９の配置の自由度が高まるメリットがある。この場合、光ファイバの入射側開口を、本実施例の走査型顕微鏡１００のスリット１２１の開口部１２２と同等になるように配置すればよく、このような光学系においても焦点を合わせた状態を維持してステップ１０９の測定を行うことができる。
　ステップ２０９で焦点を合わせた状態を維持するためには、前記のような、試料ステージ１３０と受光用レンズステージ１３２とを補正係数αを用いて連動する制御と、自動焦点合わせ制御を組み合わせた制御を行ってもよい。具体的には、最後に焦点合わせを実行してからのＺ軸方向の累積移動量を記憶装置１３３に保持しておいて、累積移動量が閾値に達するまでは、補正係数αに従って受光用レンズステージ１３２を移動することで焦点合わせを維持する。累積移動量が閾値に達した時点で、自動焦点合わせ制御を実行する。これによって、試料ステージ１３０のＺ軸方向への移動時に毎回焦点合わせを実行する場合に比べて測定時間を短縮することができる。
　なお、ここで用いる閾値としては任意の値を設定してよいが、測定点１５０のサイズより十分大きい長さでよく、例えば測定点１５０のサイズが１μｍ前後の場合、好ましい閾値は約１０倍の１０μｍ、または約１００倍の１００μｍ、または約１０００倍の１０００μｍである。この場合、それぞれ、試料中に１０μｍオーダー、１００μｍオーダー、１０００μｍオーダーの屈折率ムラが存在する場合に生じうる、焦点あわせのズレに対応し、このような試料に対しても、手動の焦点合わせを実行することなく測定を実行できる。
　また、累積移動量と閾値を比較する際に、累積移動量の絶対値と閾値を比較してもよい。こうすることで、Ｚ軸の正負両方の向きに試料ステージ１３０を移動する場合にも対応できる。また、累積移動量の確認と焦点合わせの実行タイミングは、ステップ２０９の走査時でもよいし、手動またはＧＵＩを介して試料ステージ１３０を動作している時でもよい。
　さらには、累積移動量と閾値をＺ軸方向以外の移動量について設定してもよい。例えば、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向、またはその両方について設定した場合、試料１１４自体が試料ステージ１３０や励起光１４４の光軸に対して傾きを持っていた場合に、Ｘ軸方向やＹ軸方向への試料ステージ１３０移動に伴って試料１１４表面のＺ軸方向の位置が変動してしまうことによって焦点合わせのズレが生じたとしても、そのズレが過大にならないよう制御することができる。
　または、試料ステージ１３０をＺ軸方向に移動した際に毎回、または規定回数ごとに、自動焦点合わせ制御を実行してもよい。そして、各回の自動焦点合わせ制御を開始する時点で、補正係数αを用いて受光用レンズステージ１３２の位置座標を算出し、この座標を自動焦点合わせ実行時の受光用レンズステージ１３２の初期座標として採用する。これによって、自動焦点合わせにおける受光用レンズステージ１３２の位置座標の初期座標と、ベストの座標との乖離の期待値を小さくできるため、自動焦点合わせの信頼性向上と所要時間短縮が期待できる。
　ＸＹ軸方向のサイズが比較的大きな試料１１４が傾いて保持されている場合など、試料ステージ１３０をＸＹ軸方向に移動した際に、これに伴って試料１１４が意図せずＺ軸方向に移動してしまう場合がある。本実施例を応用することで、このような場合にも対応することが可能である。
　ステップ２０３で試料を設置してから、ステップ２０９の開始までの間のいずれかのタイミングで、試料ステージ１３０を３点以上の異なる点に移動し、各点で焦点合わせを実施する。　各点での焦点合わせの設定パラメータ、ここでは受光用レンズステージ１３２のＺ座標と試料ステージ１３０のＸＹＺ座標と共に記憶装置１３３に保持しておく。
　または、実際に焦点合わせを実施する代わりに、何からの方法で焦点合わせの参考となる値、たとえば試料１１４のＺ座標の代表値を測定しても良い。試料１１４のＺ座標としては、試料１１４の励起用レンズ１１３側の表面位置、試料１１４の受光用レンズ１１５側の表面位置、Ｚ軸方向の中心位置、ガラス１４２やガラス１４３のように試料１１４の容器や基板にあたる物体の表面や中心位置、試料１１４やその容器や基板に設けられた刻印や印刷などによる位置マーカの位置、等の座標を用いてよい。これらの方法で、３点以上で取得した焦点合わせの参考値から焦点合わせの設定パラメータを算出しても良い。
　制御部１３４上での計算により、前記各点での焦点合わせの設定パラメータやその参考値から、試料１１４上のほかの位置での設定パラメータを補完または推定することが可能である。例えば、前記各点での試料ステージ１３０のＸ座標、Ｙ座標、受光用レンズステージ１３２のＺ座標を、それぞれａ１、ａ２、ａ３として、３つ以上の前記各点をａ１、ａ２、ａ３３次元空間上の点として表現できるので、各点を含む平面、曲面や、各点の回帰平面、曲面を求めることで、各点以外の位置での受光用レンズステージ１３２の望ましいＺ座標を求めることができる。これを用いて、試料ステージ１３０をＸＹ軸に移動する際に、自動的に受光用レンズステージ１３２を望ましいＺ座標に移動することができる。これによって、傾いて保持された試料１１４を走査する際にも、焦点合わせを維持することができる。
　図７は、本実施例の走査型顕微鏡６００の基本的な構成例を示す模式図である。
　走査型顕微鏡６００は、励起用レンズ１１３を透過した励起光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を検出器に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡１００と同様である。走査型顕微鏡６００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡１００と同様である。
　走査型顕微鏡６００は、複数の狭帯域光からなる励起光６４４を出射する励起光源６３９を備える点が走査型顕微鏡１００と異なっている。励起光源６３９は、フォトニック結晶ファイバ１０５から出射された広帯域光から狭帯域光を抽出するＡＯＴＦ（音響光学可変フィルタ）６０７を備える。ＡＯＴＦ６０７は制御部１３４の指示により抽出する光の波長を調節可能である。また、励起光６４４が狭帯域光からなるために、生成されるＣＡＲＳ光６４５も狭帯域光である点と、そのためにＣＡＲＳ光６４５を検出する光検出器６１９は分光機能をもたない点も、走査型顕微鏡１００と異なっている。このような光検出器６１９として、光電子増倍管やフォトダイオードを用いてよい。この構成によって、走査型顕微鏡６００は単色ＣＡＲＳ測定が可能である。単色ＣＡＲＳを採用する場合、検出器に分光性能が必要でないので、多色ＣＡＲＳに比べ簡素な検出系の構成で実現することができる。
　（単色ＣＡＲＳ用の別の狭帯域光源構成）上記では複数の狭帯域光からなる励起光６４４を出射する励起光源６３９として、広帯域光から狭帯域光の例を示したが、この代わりに狭帯域光を入力として別の波長の狭帯域光を出力するＯＰＯ（光パラメトリックオシレータ）のような光学素子を用いてもよい。この場合は、狭帯域光の光源である短パルスレーザ光源１０１の出力光を偏光ビームスプリッタ１０３で２つの光線に分割し、片方の光線をそのまま、他方の光線をＯＰＯによって波長変換したうえで、２つの光線をダイクロイックミラー１０８で合波することで、２つの波長の異なる狭帯域光パルス光の光源を実現できる。
　ＣＡＲＳ光６４５は、光検出器６１９の前の有限の大きさを持つ開口部６２２を通過して、光検出器６１９の受光面に到達する。前記の開口部６２２とは、光検出器６１９の前に特段の絞りやスリットを設ける場合は、それらの開口部の１つまたは両方を指す。また、光検出器６１９の前に特段の絞りやスリットを設けない場合は、光検出器６１９の有限の大きさを持つ受光面を開口部６２２と考えてよい。その他の点は、実施例１の走査型顕微鏡１００と同様である。
　走査型顕微鏡６００の焦点合わせでは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点が開口部６２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部６２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、ＣＡＲＳ光６４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。
　走査型顕微鏡６００は、実施例１の走査型顕微鏡１００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。
　図８は、本実施例の走査型顕微鏡７００の基本的な構成例を示す模式図である。
　走査型顕微鏡７００は、励起用レンズ１１３を透過した光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を光検出器６１９に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡６００と同様である。走査型顕微鏡７００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡６００と同様である。
　走査型顕微鏡７００は、単色の励起光７４４を出射する励起光源７３９を備える点が走査型顕微鏡６００と異なる。励起光源７３９は短パルスレーザ光源１０１を備える。
　走査型顕微鏡７００は、以下のようにして２光子励起蛍光を検出可能である。励起光７４４は励起用レンズ１１３を透過して、試料１１４中の測定点１５０に集光される。励起光７４４により測定点１５０に存在する物質が２光子励起され、２光子励起蛍光７４５を生成する。受光用レンズ１１５を透過した２光子励起蛍光７４５は、開口部６２２を通過して光検出器６１９に到達して検出される。なお、２光子励起蛍光７４５でなく、３光子励起蛍光など、その他の多光子励起蛍光や、２次高調波、３次高調波、和周波、高次和周波を検出しても良い。この場合、ノッチフィルタ１１７、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の波長特性を適切に選択すればよく、また検出系として、実施例１で用いた分光検出器１２１とスリット１１９を用いてもよい。
　走査型顕微鏡７００の焦点合わせは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点が開口部６２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部６２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、２光子励起蛍光７４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。
　走査型顕微鏡７００は、実施例２の走査型顕微鏡６００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。
　図９は、本実施例の走査型顕微鏡８００の基本的な構成例を示す模式図である。
　走査型顕微鏡８００は、励起用レンズ１１３を透過した光を試料１１４に照射するよう配置し、そこで生成された光を光検出器６１９に導くよう受光用レンズ１１５を配置している点は、走査型顕微鏡７００と同様である。走査型顕微鏡８００は、試料ステージ１３０を移動しながら測定することで、イメージングが可能である点も走査型顕微鏡７００と同様である。　
　走査型顕微鏡８００は、以下のようにして２光子励起蛍光を検出可能である。励起光７４４は励起用レンズ１１３を透過して、試料１１４中の測定点１５０に集光される。励起光７４４により測定点１５０に存在する物質が２光子励起され、２光子励起蛍光７４５を生成する。受光用レンズ１１５を透過した２光子励起蛍光７４５は、開口部６２２を通過して光検出器６１９に到達して検出される。
　走査型顕微鏡８００では、励起光源７３９は短パルスレーザ光源１０１を備えるが、レーザ光源として連続波（ＣＷ）光源を用いても良い。
　走査型顕微鏡８００では、２光子励起蛍光７４５でなく、３光子励起蛍光など、その他の多光子励起蛍光や、２次高調波、３次高調波、和周波、高次和周波を検出しても良い。この場合、ノッチフィルタ１１７、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の波長特性を適切に選択すればよく、また検出系として、実施例１で用いた分光検出器１２１とスリット１１９を用いてもよい。
　走査型顕微鏡８００では、２光子励起蛍光７４５でなく、１光子で励起される蛍光を検出してもよい。この場合、蛍光の波長は励起光７４４の波長より長いので、ショートパスフィルタ１１８、ダイクロイックミラー１２４の仕様を適切に変更すればよい。例えば、ショートパスフィルタ１１８の代わりに励起光７４４を透過せずに前記蛍光を透過するように、励起光７４４の波長より長波長のカットオフ波長を持つロングパスフィルタや、バンドパスフィルタを用いてよい。
　走査型顕微鏡８００の焦点合わせは、受光用レンズ１１５と集光レンズ１２０を含む光学系による測定点１５０の像点がピンホール８２１の開口部８２２の内部に位置するように、より好ましくは開口部８２２の中心に位置するように、受光用レンズステージ１３２を移動して受光用レンズ１１５を配置する。これによって、２光子励起蛍光７４５のうち開口部６２２を通過する成分を最大にすることができる。
　走査型顕微鏡８００は、実施例３の走査型顕微鏡７００と同様の機構によって、試料ステージ１３０を移動する際に焦点合わせを維持することができる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。　
１００　走査型顕微鏡
１０１　短パルスレーザ光源
１０２　１／２波長板
１０３　偏光ビームスプリッタ
１０４　コリメータ
１０５　フォトニック結晶ファイバ
１０６　コリメータ
１０７　ロングパスフィルタ
１０８　ダイクロイックミラー
１０９　コリメータ
１１０　光ファイバ
１１１　コリメータ
１１２　ダイクロイックミラー
１１３　励起用レンズ
１１４　試料
１１５　受光用レンズ
１１７　ノッチフィルタ
１１８　ショートパスフィルタ
１１９　分光検出器
１２０　集光レンズ
１２１　スリット
１２２　開口部
１２３　励起用レンズステージ
１２４　ダイクロイックミラー
１２５　ミラー
１２６　結像レンズ
１２７　２次元センサ
１２８　ミラー
１２９　明視野用光源
１３０　試料ステージ
１３１　励起用レンズステージ
１３２　受光用レンズステージ
１３３　記憶装置
１３４　制御部
１３５　ピエゾコントローラ
１３６　モータコントローラ
１３７　表示部
１３８　集光レンズステージ
１３９　励起光源
１４０　励起側カップリング媒質
１４１　受光側カップリング媒質
１４２　スライドガラス
１４３　カバーガラス
１４４　励起光
１４５　ＣＡＲＳ光
１４６　励起光の進行方向
１４７　ＣＡＲＳ光の進行方向
１４８　測定対象領域
１４９　測定済みの点の集合
１５０　測定点
１５１　受光用レンズの焦点
１５２　受光用レンズの焦点から発した光の光路
１５３　測定対象点
１５４　試料ステージの移動量
１５５　受光用レンズの移動量
１５６　集光レンズの移動量
１５７　励起用レンズの移動量
１５９　試料ステージによる移動体
１６０　ＧＵＩ
１６１　明視野画像表示領域
１６２　ＣＡＲＳイメージ
１６３　明視野画像
１６４　ＣＡＲＳイメージ表示領域
１６５　自動焦点合わせボタン
１６６　補正用パラメータ設定用ＧＵＩ
１６７　励起側カップリング媒質選択ボックス
１６８　受光側カップリング媒質選択ボックス
１６９　励起側カップリング媒質屈折率ボックス
１７０　受光側カップリング媒質屈折率ボックス
１７１　受光用レンズ位置ボックス
１７２　試料ステージ座標ボックス
１７３　試料走査範囲ボックス
１７４　補正係数ボックス
１７５　ターゲット波数ボックス
１７６　焦点合わせモード切換ボタン
２０１　イメージング動作のフローチャートの開始点
２０２　装置電源ＯＦＦ
２０３　試料を設置
２０４　試料位置の粗調整
２０５　焦点合わせ
２０６　測定対象領域の設定
２０７　測定条件の測定
２０８　測定開始指示
２０９　走査しながらＣＡＲＳ光を検出
２１０　測定終了を報告
２１１　試料を撤去
２１２　装置電源ＯＦＦ
２１３　イメージング動作のフローチャートの終了点
６００　走査型顕微鏡
６０７　ＡＯＴＦ
６１９　光検出器
６２２　開口部
６３９　励起光源
６４４　励起光
６４５　ＣＡＲＳ光
７００　走査型顕微鏡
７３９　励起光源
７４４　励起光
７４５　２光子励起蛍光
８００　走査型顕微鏡
８２１　ピンホール
８２２　開口部

Claims (16)

  1. 　励起光源と、試料に向けて励起光を集光する励起用レンズと、前記試料の位置を調整する試料ステージと、
    　前記励起光により前記試料から発生する前記励起光とは波長の異なる信号光を集光する受光用レンズと、受光用レンズを通過した前記信号光を集光する集光レンズと、前記信号光を検出する検出器と、を備え、
    　前記励起光用レンズ、前記試料、前記受光用レンズ、前記集光レンズのうち、少なくとも２種類が、予め指定された補正係数を基に、光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  2. 　請求項１において、前記試料と前記受光用レンズが、予め指定された補正係数を基に、
    　光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  3. 　請求項１において、励起用レンズと前記受光用レンズが、予め指定された補正係数を基に、
    　光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  4. 　請求項１において、前記励起用レンズと前記試料が、予め指定された補正係数を基に、
    　光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  5. 　請求項１において、前記試料と前記集光レンズが、予め指定された補正係数を基に、
    　光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  6. 　請求項１において、前記励起用レンズと前記集光レンズが、予め指定された補正係数を基に、
    　光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置
  7. 　請求項１において、前記受光用レンズと前記集光レンズが、
    　予め指定された補正係数を基に、光軸方向に移動するように制御する制御部を有することを特徴とする光学分析装置。
  8. 　請求項１、または請求項２、または請求項３、または請求項４、または請求項５、または請求項６、または請求項７に記載の光学分析装置において、
    　光軸方向に移動する前記２種類の距離の変化量は比例関係にあり、前記補正係数は、光軸方向に移動する前記２種類の距離の変化量の比例定数であることを特徴とする光学分析装置。
  9. 　請求項１、または請求項２、または請求項３、または請求項４に記載の光学分析装置において、
    　励起用レンズステージあるは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、受光用レンズステージが移動することによる受光用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ５と、補正係数をαとするとき、
    　前記距離の変化量ΔＤ１、前記距離の変化量ΔＤ５、前記補正係数αとの間には、
    　ΔＤ５＝α×ΔＤ１
    　の関係で示されることを特徴とする光学分析装置。
  10. 　請求項１、または請求項５、または請求項６に記載の光学分析装置において、
    　励起用レンズステージあるは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、前記集光レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ６、補正係数をβとするとき、
    　前記距離の変化量ｄ１、前記距離の変化量ｄ６、前記補正係数βとの間には、
    　ΔＤ６＝β×ΔＤ１
    　の関係で示されることを特徴とする光学分析装置。
  11. 　請求項１、または請求項２、または請求項３、または請求項４、または請求項５、または請求項６に記載の光学分析装置において、
    　励起用レンズステージあるは試料ステージが移動することによる励起用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ１と、受光用レンズステージが移動することによる受光用レンズと試料の間の光軸方向の距離の変化量ΔＤ５と、補正係数をαとするとき、
    　前記距離の変化量ΔＤ１、前記距離の変化量ΔＤ５、前記補正係数αとの間には、
    　ΔＤ５＝α×ΔＤ１
    　の関係で示され、
    　前記距離の変化量ΔＤ１と前記集光レンズの光軸方向の距離の変化量ΔＤ６、補正係数をβとするとき、
    　前記距離の変化量ΔＤ１、前記距離の変化量ΔＤ６、前記補正係数βとの間には、
    　ΔＤ６＝β×ΔＤ１
    　の関係で示されることを特徴とする光学分析装置。
  12. 　請求項９、または請求項１０、または請求項１１において、
    　前記励起用レンズと前記試料とを結合する第１の媒質と、前記受光用レンズと前記試料とを結合する第２の媒質とを有し、
    　前記補正係数α、βは、第１の媒質と第２の媒質の屈折率を用いて求められる係数であることを特徴とする光学分析装置。
  13. 　請求項１２において、
    　第１の媒質の屈折率をｎ１、第２の媒質の屈折率をｎ５とすると、前記補正係数αは、
    　α＝－ｎ５／ｎ１
    　で演算される値であることを特徴とする光学分析装置。
  14. 　請求項１２において、
    　第１の媒質の屈折率をｎ１、第２の媒質の屈折率をｎ５とし、
    受光レンズの焦点距離をｆ１、集光レンズの焦点距離をｆ２とすると、
    前記補正係数βは、
    　β＝（ｆ１／ｆ２）６・（１／ｎ１　－　１／ｎ５）
    　で演算される値であることを特徴とする光学分析装置。
  15. 　請求項１において、
    　前記検出器で検出される信号光がＣＡＲＳ光であって、前記試料上を測定点が走査しながら前記ＣＡＲＳ光を検出することを特徴とする光学分析装置。
  16. 　請求項１において、
    　前記受光レンズと前記検出器との間の光軸上に、共焦点光学系を構成するピンホールを備えることを特徴とする光学分析装置
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