JP6997767B2

JP6997767B2 - Ｃｄ２００変異体及びその使用

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Publication number: JP6997767B2
Application number: JP2019511816A
Authority: JP
Inventors: ハクスリーフィリップ; シェリダンジョセフ; ヒールジョナサン
Original assignee: デュセンティスバイオセラピューティクスリミテッド
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2037-05-10
Also published as: AU2017264825A1; KR20190003761A; GB201608197D0; BR112018073280A2; CN109219614B; KR20230025937A; CN109219614A; IL262846B; EA201892554A1; EP3455247A1; SG11201809677XA; MX2018013778A; JP2019518788A; CA3023601A1; IL262846B2; KR102498901B1; WO2017194941A1; US20190367580A1; AU2017264825B2; IL262846A

Description

（発明の分野）
本発明は一般に、野生型CD200よりも高い親和性でCD200受容体と結合する変異体CD200タンパク質に関し、特に本発明はアミノ酸残基位置130及び/又は131に変異を含む変異型CD200タンパク質に関する。また、本発明は任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分と融合された、本明細書で規定するタンパク質を含む融合タンパク質、本明細書で規定するタンパク質を含む医薬組成物、及びそれらの使用に関する。

（発明の背景）
自己免疫性疾患は世界的に第二位の慢性的疾病の原因であり、この疾患は米国においては女性の病的状態の第一位の原因である。2008年の国際調査によれば、米国における慢性的に不調を訴える患者は他の国の患者と比較して、費用の負担が大きいために、適正な治療を受けないで済ませる見込みが高い（Schoen, C.らの文献、(2008) Health Affairs Web Exclusive, w1-w16）。さらに、これらの患者は最も高い比率の医療過誤、治療の調整の問題、及び自費の高い医療費を経験する見込みが比較的高い。

現在、米国自己免疫性疾患協会（American Autoimmune Related Disease Association）（AARDA）は、5000万人の米国人が自己免疫性疾患を有すると推定している。自己免疫性疾患による医療システム全体への直接的及び間接的な総額の費用を決定するための疫学的データは欠落している。しかしながら、2001年に、米国立アレルギー・感染症研究所（National Institutes of Allergy and Infectious Diseases）（NIAID）の所長であるAnthony Fauci博士は、年間の自己免疫性疾患の治療費は、1000億ドルを超えると概算した。1000億ドルは驚異的な数字であるが、疫学的研究により100を超える既知の自己免疫性疾患のうちの7つ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）、関節リウマチ（RA）、乾癬、及び強皮症だけで年間費用は毎年総額518億～706億ドルにおよぶと概算されているため、この数字は自己免疫性疾患の本当の費用を大きく過小評価している見込みが高い。さらに、これらの概算値では移植の間の免疫抑制治療の費用が無視されている。

自己免疫性疾患は、治療法のない慢性的状態であり、免疫系が健常細胞を異物として決定し、それらを攻撃する際に生じる。種類に応じて、自己免疫性疾患は1つ又は多くの異なる種類の体組織を冒し、異常な器官成長及び器官機能の変化を引き起こし得る。免疫系の正常な調節は、概して免疫反応に関与する細胞が発現するタンパク質を含む受容体/リガンド対によるものである。しかしながら、これらの受容体/リガンド対はシグナル伝達カスケードに含まれることが多く、それにより自己免疫性疾患の治療に困難を提供する。現在の自己免疫性疾患の管理には、疾患のプロセスを制御し、特に再発の間の症状を減少させる試みを伴う。

OX-2膜糖タンパク質はCD200（表面抗原分類200）とも呼ばれ、様々な細胞種において発現するCD200遺伝子によってコードされるヒトタンパク質であり（Barclay, A. N.の文献、(1981) Immunology 44, 727）、免疫グロブリン遺伝子ファミリーの分子との高度の相同性を有する。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、2つの免疫グロブリンドメインを含み、CD200受容体（CD200R）と結合する1型膜糖タンパク質である。

CD200Rは骨髄細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好酸球）並びにT細胞の表面に発現する（Wrightらの文献、(2000), Immunity 12, 233-242; Wrightらの文献、(2003), J. Immunol, 171, 3034-3046）。

CD200のCD200Rとの結合により、骨髄細胞及びT細胞に阻害シグナルが送達され、従って免疫系の自然及び適応アームの両方に、免疫抑制作用が加えられる（Rahim S. A.の文献、(2005) AIDS, 19, 1907-1925; Shiratori, I. の文献、(2005) J. Immunol, 175, 4441-4449; Misstear, K.らの文献、(2012), Journal of Virology, 86(11), 6246-6257）。

CD200Rのアゴニストは、広範囲の疾患モデル、例えば関節炎（Gorczynskiらの文献、(2001) Clin. Immunol. 101, 328-34; Gorczynskiらの文献、(2002) Clin. Immunol. 104, 256-264）、移植片拒絶反応（Gorczynskiらの文献、(2002) Transplantation 73, 1948-1953）、妊娠体調不良（failed pregnancy）（Gorczynskiらの文献、(2002) Am. J. Reprod. Immunol., 48, 18-26）、接触過敏症（Rosenblumらの文献、(2004) Blood 103, 2691-8）、インフルエンザによって誘発された肺炎症（Snelgroveらの文献、(2008) Nat. Immunol., 9, 1074-1083）、及びHSVによって誘発された炎症性病変（Sarangiらの文献、(2009) Clin. Immunol. 131, 31-40）における病状を低下させることが示されている。

さらに、インフルエンザウイルスを負荷されたCD200^-/-マウスは、野生型対照と比較して、肺浸潤物の増加及び肺内皮の損傷と関連付けられるより重度の疾患を発症した（Rygiel. T. P.らの文献、(2009) J. Immunol. 183(3), 1990-1996）。CD200^-/-マウスは実にウイルス負荷を抑制することができる免疫反応を発達させ、重度の疾患は免疫反応の激化によって引き起こされることが示唆された。ウイルス負荷の前にT細胞を除去することにより、それがもたらすウイルス負荷の劇的な増加にもかかわらず、疾患を予防することができた。Rygiel. T. P.らの文献、(2009)では、インフルエンザ感染の間の疾患症状の顕在化にはT細胞が不可欠であり、ウイルス負荷よりもむしろ下方調節を担うCD200-CD200Rシグナル伝達の欠如が免疫病状を増加させると結論付けられた。

プロファイリング研究により、hCD200の発現は多様な患者集団、例えば多発性硬化症（Koningらの文献、(2007) Ann. Neurol. 62, 504-514）、喘息増悪（Aokiらの文献、(2009) Clin. Exp. Allergy 39, 213-221）、アルツハイマー病（Walkerらの文献、(2009) Exp. Neurol. 215, 5-19）、原発性肥大性骨関節症（Renらの文献、(2013) Rheumatol. Int. 33(10), 2509-2512）、妊娠体調不良（Clarkの文献、(2009) Am. J. Reprod. Immunol. 61, 75-84）、及び毛孔性扁平苔癬（脱毛）（Harriesらの文献、(2013) J. Pathol. 231(2), 236-247）を有する患者において下方調節されることが示されている。

アゴニストであるCD200タンパク質は例えば、WO 2000/061171及びWO 2008/089022に開示されている。文献には、免疫細胞の機能を調節するために野生型CD200分子を使用することが記載されている。本発明は、野生型CD200よりも高い親和性でCD200受容体と結合する変異体CD200タンパク質に関する。

従って、現在利用可能な自己免疫性疾患の治療と関連付けられる問題を克服する、低用量での臨床有効性の向上を提供する必要がある。

（発明の概要）
本発明の第1の態様に従って、アミノ酸残基位置130及び/又は131に変異を含む変異型CD200タンパク質を提供する。

本発明の第2の態様に従って、任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分と融合された、本明細書で規定するタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。

本発明の第3の態様に従って、本明細書で規定するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

本発明のさらなる態様に従って、本明細書で規定するタンパク質を含む医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様に従って、自己免疫性疾患の治療において使用するための、本明細書で規定するタンパク質又は本明細書で規定する組成物を提供する。

（図面の簡単な説明）
WT-CD200-Fc、K130Y、及びI131YのSDSゲル。 A：K130Yのサイズ排除クロマトグラフ。B：I131Yのサイズ排除クロマトグラフ。センサーチップ表面への抗ヒトFc抗体の固定化。ハーセプチンの捕捉及びhCD200Rの結合/解離。 A：CD200Rの捕捉された野生型CD200との結合の結合及び解離段階を示すセンサーグラム。B：CD200Rの捕捉されたK130Yとの結合の結合及び解離段階を示すセンサーグラム。 PMAで刺激された単離ヒト好中球の酸化的破裂の、野生型CD200-Fc及びK130Yによる阻害を比較する、用量反応結果。

（発明の詳細な説明）
本発明の第1の態様に従って、アミノ酸残基位置130及び/又は131に変異を含む変異型CD200タンパク質を提供する。本発明者らは、これらの特定のアミノ酸残基でのCD200の細胞外ドメインに変異を入れると、CD200受容体（CD200R）との結合親和性が増加した変異体CD200が生産されることを見出した。さらに、本明細書に記載の変異型CD200タンパク質は、特に臨床有効性がより高い低用量での治療を提供する観点で、顕著な利益を有する。

本明細書で使用する「CD200タンパク質」という用語は、野生型CD200タンパク質を指す。

本明細書で使用する「野生型」という用語は、天然に存在するタンパク質、ペプチド、アミノ酸、及びヌクレオチド配列を指す。例えば、本明細書で使用する「野生型CD200タンパク質」という用語は、CD200受容体と結合するCD200の任意の全長アイソフォーム（UNIPROT P41217 OX2G_HUMAN; 配列番号1）又はその任意の部分を指す。CD200タンパク質はまた、OX-2膜糖タンパク質としても知られる。

野生型CD200はN末端細胞外ドメイン並びに短い膜貫通及び細胞質ドメインを有する細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはCD200受容体のような標的受容体と結合する。一実施態様において、CD200タンパク質はCD200受容体と結合するCD200の細胞外ドメイン又はその任意の部分である。さらなる実施態様において、CD200タンパク質はシグナル配列を含む全長タンパク質において＋31位のグルタミンで開始し、＋231位のリシンで終わる野生型CD200（配列番号1）の細胞外ドメイン（配列番号2）である。

本明細書で使用する「位置」という用語は、1を最初に翻訳されるアミノ酸とするアミノ酸配列中の残基番号を指す。

本明細書で使用する「変異型」又は「変異」という用語は、野生型同等物からその形態に変化を受けて変異体となったタンパク質、ペプチド、アミノ酸、及びヌクレオチド配列を指す。例えば、変異型又は変異体タンパク質は対応する野生型配列と比較した際にアミノ酸及び/又はヌクレオチド配列の変化を受け得るものであり、そのような変化もまた、変異と呼ぶことができる。

一般的な変異には、置換、欠失、付加、末端切断（truncations）、転座、及び逆位がある。従って、一実施態様において、変異は置換、転座、又は逆位である。さらなる実施態様において、変異は置換変異である。さらなる実施態様において、該置換変異はK130Y及び/又はI131Yである。

当業者であれば、アミノ酸配列を変化させないヌクレオチド配列の変異はそれでも変異したものと考えられることを理解されよう。その結果、タンパク質を変化させないヌクレオチド配列の変異は、それでも変異したものと考えられる。

本明細書で使用する「変異型CD200タンパク質」という用語は、アミノ酸配列中に変異アミノ酸残基又は複数の変異アミノ酸残基を含み、その結果野生型CD200タンパク質と類似しているが、もはや同一ではない、CD200受容体と結合する全長CD200タンパク質又はその任意の部分を指す。

一実施態様において、変異型CD200タンパク質は、合成又は組換えにより作製することができる。さらなる実施態様において、変異型CD200タンパク質は、合成により作製することができる。代替の実施態様において、変異型CD200タンパク質は、組換えにより作製することができる。

一実施態様において、変異型CD200タンパク質は、野生型CD200よりも高い親和性でCD200受容体と結合する。

一実施態様において、変異型CD200タンパク質は、その内に、又はそれと結合された生物学的又は化学的に活性のある非CD200構成要素を含み得る。

一実施態様において、変異型CD200タンパク質は、可溶性（すなわち、循環する）であるか、又は表面に結合し得る。さらなる実施態様において、変異型CD200タンパク質は、可溶性である。代替の実施態様において、変異型CD200タンパク質は、表面に結合している。

一実施態様において、変異型CD200タンパク質は、CD200の完全な細胞外ドメイン又はその部分を含み得る。

本明細書でタンパク質、ペプチド及びアミノ酸、並びにヌクレオチド配列を参照して使用する「部分」という用語は、機能的である、すなわち、それらの標的と結合する断片及び誘導体を指す。

本明細書で使用する「断片」という用語は、その標的、例えば受容体を認識し、かつこれと結合するタンパク質、ペプチド、アミノ酸、又はヌクレオチド配列の一部を指す。

本明細書で使用する「の誘導体」及び「変異体」という用語は、野生型同等物と少なくとも70％（例えば75％、80％、85％、90％、95％、又は99％）の配列類似性及び同様の機能を共有するタンパク質、ペプチド、アミノ酸、又はヌクレオチド配列を指す。従って、変異体は野生型同等物の誘導体とし得る。さらなる実施態様において、変異型CD200タンパク質は＋31位のグルタミンで開始し、＋231位のリシンで終わる野生型CD200の細胞外ドメインの部分である。

本明細書で使用する「アミノ酸残基」という用語は、重合鎖中のモノマー単位、すなわちタンパク質中の単一アミノ酸を指す。

一実施態様において、タンパク質はアミノ酸配列中に存在する1以上の変異、例えば1～15個の変異をさらに含む。

さらなる実施態様において、該変異型タンパク質は、1以上の追加の変異、例えばG129I、F128R、及び/又はN81Kから選択される変異を含む。

一実施態様において、本明細書で規定するタンパク質は、該タンパク質の細胞外ドメイン（ECD）を含む。さらなる実施態様において、本明細書で規定するタンパク質は、配列番号3又は配列番号4の配列を含む。

一実施態様において、本明細書で規定するタンパク質は、全長CD200配列を含む。さらなる実施態様において、本明細書で規定するタンパク質は、配列番号12又は配列番号13の配列を含む。

図5及び表2において提示するように、本明細書で開示する変異型CD200タンパク質は、CD200受容体とより堅く結合し、受容体上で野生型CD200タンパク質よりも長い滞留時間を示す。

（融合タンパク質）
本発明の第2の態様に従って、任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分と融合された本明細書で規定するタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。

本明細書で使用する「融合タンパク質」という用語は、当技術分野で周知かつ例えば、米国特許第5,434,131号及び第5,637,481号に記載された方法を使用して相互に結合された1以上のアミノ酸配列、ペプチド、及び/又はタンパク質を指す。それにより結合されたアミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質は、1つの融合タンパク質を形成する。

一実施態様において、本明細書におけるタンパク質は、任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分とN末端又はC末端で融合されている。さらなる実施態様において、本明細書におけるタンパク質は、任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分とN末端で融合されている。代替の実施態様において、本明細書におけるタンパク質は、任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分とC末端で融合されている。

一実施態様において、該リンカー部分は1～15アミノ酸を含むペプチドである。さらなる実施態様において、リンカーは、グリシンで開始し、セリンで終わる10アミノ酸のリンカーである。なおさらなる実施態様において、リンカーは

の配列を含むペプチドである。

本明細書で使用する「非CD200タンパク質コード部分」という用語は、CD200受容体と結合せず、CD200のその標的との結合に干渉しない任意のペプチド又はタンパク質を指す。例としては、これらに限定はされないが、免疫グロブリン（Ig）定常領域又はその部分がある。

さらなる実施態様において、該非CD200タンパク質コード部分は、抗体又はその断片である。さらなる実施態様において、該非CD200タンパク質コード部分は、Fc断片である。従って、本明細書に記載の変異型CD200融合タンパク質も、変異体CD200-Fcと呼ぶことができる。さらなる実施態様において、Fc断片は哺乳動物由来、例えばヒト又はサル由来の、例えばヒンジ、CH2、及びCH3領域を含むヒトC（γ）1である。Fc断片は本発明の変異型CD200タンパク質の半減期（すなわち、受容体占有度）を増加させるという利点を提供すると考えられている。当業者であれば、Fc領域を変異させてそのエフェクター機能を低下させることができることを理解されよう（例えば、US 5,637,481号及びUS 6,132,992号を参照されたい）。

変異型CD200タンパク質は野生型、すなわち非変異型CD200タンパク質と比較して高いCD200受容体への親和性を有しているため、本明細書中の図5及び表2に提示するように、任意の融合非CD200タンパク質コード部分も、この特徴から恩恵を受ける。これにより、本明細書に記載の医薬組成物及び治療法に十分な強みがもたらされる。

一実施態様において、本明細書で規定する融合タンパク質は、配列番号6又は配列番号7の配列を含む。

本発明のタンパク質は、好ましくは変異型CD200タンパク質をコードする核酸配列又はその任意の部分を、組換え発現ベクターに挿入し、発現を促進する条件下、組換え発現系中で核酸配列を発現させることによる、組換えDNA法により生産する。従って、一実施態様において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、pcDNA 3.4などのベクターを含む。一実施態様において、融合タンパク質は1以上の制限酵素部位、例えばHind III及び/又はXho Iに隣接している。さらなる実施態様において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはHind III及びXho I制限部位に隣接している。

一実施態様において、融合タンパク質は1以上の制限酵素部位、例えばBam HIを含む。

本発明の第3の態様に従って、本明細書で規定するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明によって提供されるタンパク質をコードする核酸配列は、cDNA断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカー、又は一連のオリゴヌクレオチドから組立て、合成遺伝子をもたらすことができ、該合成遺伝子は組み換え発現ベクターに挿入し、組換え転写ユニット中で発現させることができる。

組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳の調節エレメントと作用可能に連結された変異型CD200をコードする合成又はcDNA由来の核酸断片を含む。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。通常複製起点によって付与される宿主における複製能、及び形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子を、追加して組み込むことができる。

（治療上の使用）
本発明は、CD200タンパク質及びCD200受容体の間の相互作用が、ひいてはCD200のCD200受容体への親和性を減少させる急速な「オン」速度及び急速な解離（「オフ」）速度を特徴とするため、治療に際する特定の応用性を有する。従って、本明細書で提示する変異体CD200タンパク質のCD200受容体への親和性の増加は、より強力な特性を有する医薬組成物の製造において使用することができる。

さらに、組換えタンパク質の製造コストは高く、より高い親和性を有する変異体CD200タンパク質は、野生型、すなわち非変異型CD200タンパク質よりも顕著に低い用量で医薬組成物中で使用して、治療効果を達成することができる。変異体CD200タンパク質の使用は従って、臨床上より有効であることに加え、より費用効果を高くし得る。

一実施態様において、本明細書で規定する変異型CD200タンパク質は、CD200受容体の調節因子である。本明細書で使用する「調節因子」という用語は、動力学的変化をもたらす物質を指し、例えばタンパク質の調節因子は、該タンパク質の活性の増加又は減少をもたらし得る。本発明の変異型CD200タンパク質の特性に鑑みて、それらはCD200受容体のアゴニストであると考えられ、従って自己免疫性疾患の治療における有用性を見出す。従って、さらなる実施態様において、本明細書で規定する変異型CD200タンパク質は、CD200受容体のアゴニストである。

従って、本発明のさらなる態様に従い、自己免疫性疾患の治療において使用するために、本明細書で規定するタンパク質又は本明細書で規定する組成物を提供する。

本明細書で規定する変異体CD200タンパク質を含む融合タンパク質は、野生型、すなわち非変異型CD200タンパク質を含む融合タンパク質よりも高い効率で、活性化された免疫細胞を非活性化させ得る。

一実施態様において、自己免疫性疾患は、神経筋系、脈管系、眼、消化管、肺、腎臓、肝臓、末梢若しくは中枢神経系、骨、軟骨、又は関節を冒す自己免疫性疾患から選択される。

さらなる実施態様において、自己免疫性疾患は：急性播種性脳脊髄炎（ADEM）; 急性壊死出血性白質脳炎; アジソン病; 無ガンマグロブリン血症; 円形脱毛症; アミロイドーシス; 強直性脊椎炎; 抗GBM/抗TBM腎炎; 抗リン脂質抗体症候群（APS）; 自己免疫性血管浮腫; 自己免疫性再生不良性貧血; 自己免疫性自律神経障害; 自己免疫性肝炎; 自己免疫性高脂血症; 自己免疫性免疫不全症; 自己免疫性内耳疾患（AIED）; 自己免疫性心筋炎; 自己免疫性卵巣炎; 自己免疫性膵炎; 自己免疫性網膜症; 自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）; 自己免疫性甲状腺疾患; 自己免疫性蕁麻疹様（autoimmune urticarial）; 軸索及び神経細胞ニューロパシー; バロー病; ベーチェット病; 水疱性類天疱瘡; 心筋症; キャッスルマン病; セリアック病; シャーガス病; 慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIDP）; 慢性再発性多発性骨髄炎（chronic recurrent multifocal ostomyelitis）（CRMO）; チャーグ・ストラウス症候群; 瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡; クローン病; コーガン症候群（Cogans syndrome）; 寒冷凝集素症; 先天性心ブロック; コクサッキー心筋炎; クレスト病; 本態性混合型クリオグロブリン血症; 脱髄性ニューロパシー; ヘルペス状皮膚炎; 皮膚筋炎; デビック病(視神経脊髄炎）; 円板状狼瘡; ドレスラー症候群; 子宮内膜症; 好酸球性食道炎; 好酸球性筋膜炎; 結節性紅斑; 実験的アレルギー性脳脊髄炎; エヴァンス症候群; 線維性肺胞炎; 巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）; 巨細胞性心筋炎; 糸球体腎炎; グッドパスチャー症候群; 多発血管炎性肉芽腫症（GPA）（かつてはウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）; バセドウ病; ギラン・バレー症候群; 橋本脳炎; 橋本甲状腺炎; 溶血性貧血; ヘノッホ・シェーンライン紫斑病; 妊娠ヘルペス; 低ガンマグロブリン血症; 特発性血小板減少性紫斑病（ITP）; IgA腎症; IgG4関連硬化性疾患; 免疫調節性リポタンパク質; 封入体筋炎; 間質性膀胱炎; 若年性関節炎; 若年性糖尿病（1型糖尿病）; 若年性筋炎; 川崎症候群; ランバート・イートン症候群; 白血球破壊性血管炎; 扁平苔癬; 硬化性苔癬; 木質性結膜炎; 線状IgA病（LAD）; 狼瘡（SLE）; ライム病、慢性型; メニエール病; 顕微鏡的多発血管炎; 混合性結合組織病（MCTD）; モーレン潰瘍; ムッハ・ハーベルマン病; 多発性硬化症; 重症筋無力症; 筋炎; ナルコレプシー; 視神経脊髄炎（デビック）; 好中球減少症; 眼瘢痕性類天疱瘡; 視神経炎; 回帰性リウマチ; PANDAS（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害）; 傍腫瘍性小脳変性症; 発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）; パリー・ロンバーグ症候群; パーソネイジ・ターナー症候群; 毛様体扁平部炎（末梢性ぶどう膜炎）; 天疱瘡; 末梢性ニューロパシー; 静脈周囲脳脊髄炎; 悪性貧血; POEMS症候群; 結節性多発動脈炎; I、II、及びIII型自己免疫性多腺性症候群; リウマチ性多発筋痛症（polymyalgia rheumatic）; 多発性筋炎; 心筋梗塞後症候群; 心膜切開後症候群; プロゲステロン皮膚炎; 原発性胆汁性肝硬変; 原発性硬化性胆管炎; 乾癬; 乾癬性関節炎; 特発性肺線維症; 壊疽性膿皮症; 赤芽球癆; レイノー現象（Raynauds phenomenon）; 反応性関節炎; 反射性交感神経性ジストロフィー; ライター症候群; 再発性多発軟骨炎; 下肢静止不能症候群; 後腹膜線維症; リウマチ熱; 関節リウマチ; サルコイドーシス; シュミット症候群; 強膜炎; 強皮症; シェーグレン症候群; 精子及び精巣の自己免疫; 全身硬直症候群; 亜急性細菌性心内膜炎（SBE）; スザック症候群（Susac’s syndroms）; 交感性眼炎; 高安関節炎; 側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎; 血小板減少性紫斑病（TTP）; トロサ・ハント症候群; 横断性脊髄炎; 1型糖尿病; 潰瘍性大腸炎; 未分化結合組織病（UCTD）; ぶどう膜炎; 脈管炎; 小水疱性皮膚症; 白斑; 及びウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（GPA）と呼ばれる）から選択される1以上の自己免疫性疾患である。

本発明のさらなる態様に従って、対象における自己免疫性疾患の治療方法であって、少なくとも1つの自己免疫性疾患を有する対象に本発明のタンパク質を投与することを含む、前記方法を提供する。

本発明のタンパク質は単独の治療剤として投与することもできるし、それは自己免疫性疾患の治療のための1以上の他の化合物（又は治療法）との併用療法において投与することもできることは認識されよう。

従って、本発明のさらなる態様に従って、本発明で規定するタンパク質を1以上の追加の治療剤との組合わせで含む、医薬組成物を提供する。

自己免疫性疾患の治療について、本発明のタンパク質を1以上の他の医薬、より詳細には免疫抑制治療における1以上の免疫抑制剤又はアジュバントとの組合わせで有利に利用することができる。

本発明の化合物と一緒に（同時にでも、異なる時間間隔をおいてもよい）施すことができる他の治療剤又は治療の例には、これらに限定はされないが：アザチオプリン; メトトレキサート; シクロスポリン; モノクローナル抗体（バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブ）; 並びにコルチコステロイドがある。

本発明の組合わせ中に存在する治療剤の各々は、個別に変化する用量スケジュールで、かつ異なる経路により投与することができる。さらに、2以上の薬剤の各々の薬量学は異なり得る：各々は同時に、又は異なる時に投与することができる。当業者であれば、その共通する一般知識を通じて使用すべき投薬レジメン及び併用療法を知っているだろう。例えば、本発明のタンパク質は、その既存の併用レジメンに従って投与される1以上の他の薬剤と併用して使用することができる。

一般に、本明細書で開示するタンパク質は、薬理学的に適切な賦形剤又は担体と一緒に、精製された形態で利用する。典型的に、これらの賦形剤又は担体には、水性又はアルコール/水性液剤、乳剤又は懸濁剤があり、これらは生理食塩水及び/又は緩衝媒体を含む。非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、並びに乳酸加リンゲル液がある。好適な生理的に許容し得るアジュバントは、懸濁剤中にポリペプチド複合体を維持する必要がある場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギネートなどの増粘剤から選択することができる。

本発明に従う医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られている経路のいずれかとし得る。限定することなく免疫療法を含む治療法について、本発明のタンパク質は、任意の患者に標準技術に従って投与することができる。投与は非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路を介するものを含む任意の適切な様式によるものとし、又は同様に適切にカテーテルを用いた直接注入によるものとすることができる。投薬量及び投与頻度は患者の年齢、性別、及び状態、他の薬物の同時投与、使用禁忌、並びに臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに応じて決まる。

本発明のタンパク質は保存用に凍結乾燥させ、使用前に好適な担体中で再構成することができる。この技術は有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥技術及び再構成技術を利用することができる。当業者であれば、凍結乾燥及び再構成は、様々な度合いの活性の損失をもたらし得ること、並びに埋め合わせのためにレベルを上向きに調整しなくてはならない場合があることを認識されよう。

以下の研究及びプロトコルは、本明細書に記載の方法の実施態様を示す。

（実施例1：変異体及び野生型CD200-Fc分子の製造）
（遺伝子合成）
Uniprot P412178（OX2G_Human）の変異体又は野生型ヒトCD200の残基1～231をコードするDNA配列はN末端シグナル配列を含み、そのC末端で2つのタンパク質ドメインの間のリンカー配列

とともに、P01857（IHG1_Human）のIgG1 Fcの残基99～330と融合させた。野生型及び変異体コンストラクトのために遺伝子合成をGeneArtで実施した。

発現コンストラクトを5' Hind III及び3' Xhoを含む哺乳動物発現ベクターpcDNA3.4を使用して作製した。内部Bam HIをFcドメインの交換を容易にするために導入した。

（ミディプレップ）
受け取りからすぐに、CD200-Fc標的タンパク質（野生型及び変異体CD200-Fcタンパク質の両方）の凍結乾燥DNAコンストラクトを50 μlのMQに懸濁し、DH 5α細胞に形質転換した。各標的タンパク質の単一コロニーを選択して5.0mlのアンピシリン含有LBに接種した。次に、培養物2.0 mlからのDNAを確認のために単離し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。コンストラクトをHind III及びXhoIを用いたDNAの消化によって確認した。各変異体又は野生型コンストラクトをミディスケールでのDNA調製のために100 mlのLB中で培養した。DNAをpurelink Hipureプラスミドミディプレップキットを使用して単離した。

（タンパク質発現）
CD200-Fc標的タンパク質を、25 mlの培養体積用の製造業者の説明書に従い、Thermo Fisher Gibco（商標）ExpiCHO（商標）発現系を使用して製造した。発現されたCD200-Fcを含む培地上清を収集し、使用まで-80℃で保存した。

（タンパク質の精製）
アフィニティーカラム精製用に培地条件を整えるために、53 mlのSephadexG25を充填されたHiprep脱塩カラム（XK26/10）を使用して、緩衝液交換を実施した。脱塩カラムをAKTA explorerプラットフォームで緩衝液A（150 mM NaClを含む20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4）で平衡化した。清澄化した培養培地30 mlを直列に接続された2つの脱塩カラムに1 ml/分の速度で装荷した。タンパク質を2 ml/分の速度で溶出し、画分ごとに収集した。最大の吸光度及びpH 7.4～7.2を示した画分をプールした。より低いpHを示した画分は排除した。脱塩後、試料を希釈しておよそ45 mlの野生型又は変異体CD200-Fc上清を補った。全ての精製手順は氷上で4℃として実施した。

カラムを10カラム体積の緩衝液A(10 mlの20 mMリン酸ナトリウム pH 7.4、150 mM NaCl)で洗浄した。CD200-Fcタンパク質を線形勾配の20 mMリン酸ナトリウム pH 7.4、150 mM NaCl及び100 mMクエン酸緩衝液 pH 3.5を使用して10カラム体積にわたりpH 7.4～3.5の勾配により溶出した。140 kDaの二量体形態のタンパク質を含むCD200-Fc画分をSDS PAGEデータに基づいて単離した。タンパク質緩衝液を10 kDaのカットオフを有するAmicon ultra centriconを使用して交換し、タンパク質をおよそ1 mg/mlに濃縮した。

図1は野生型CD200-Fc、K130Y、及びI131YのSGSゲルを示す。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、調製したCD200-Fcタンパク質が結合解析を実施する前に溶液中で凝集物を形成していないことを実証した（図2）。

（実施例2：野生型及び変異体CD200-Fc分子の結合解析）
Biacore実験はSyngene International社で実施された（Biocon Park, Plot No 2&3, Bommasandra Industrial Area, Bommasadra-Jigani Link Road, Bangalore-560099, India）。

（アッセイ原理）
BIAcore装置は光学的方法、表面プラズモン共鳴（SPR）を使用して2つの相互作用分子の結合特性；この事例では野生型CD200-Fc又はCD200-Fc変異体のCD200受容体（CD200R）との結合を測定する。この技術では、チップ(センサー)表面に捕捉された2つの相互作用分子のうちの一方の、第2の分子が溶液中捕捉されたパートナーの上を流れる際の屈折率の変化を測定する。これらの実験においては、CD200-Fcをチップ（センサー）表面に固定化し、CD200Rを水性緩衝液中に注入して、連続フロー条件で捕捉されたCD200-Fcの上を通した。CD200Rの結合に続くCD200-Fcの屈折率の変化をリアルタイムで測定し、結果を反応単位（RU）対時間としてプロットし、センサーグラムを作成した（図5a及び5b）。

（計装及び試薬）
本実験はGE Healthcare BIAcore T200上で実施した。表1では、アッセイを開発し、実施する際に使用した試薬の詳細を示す。

表1：BIAcore実験の過程で使用した試薬

（CD200-Fcの固定化）
抗ヒトFcを製造業者の説明書に従って、GE Healthcareキットを使用し、アミンカップリングによりBIAcore CM5センサーチップ表面に共有結合で固定化した。最大の固定化標的は、10000～15000 RUに設定した。図3に、チップ表面の抗ヒトFc抗体の捕捉を示す。フローセル1は固定化リガンドを含まない参照として使用し、チップ表面への非特異的結合を差し引けるようにした。FcリガンドはBIAcore実行緩衝液（HBS-EP+: 2 mM EDTA及び0.05 ％界面活性剤P-20を含む10 mM HEPES緩衝生理食塩水）中で0.5 μg/mLに希釈した。最後の固定化工程では、野生型CD200-Fc、変異体CD200-Fc、及び無関係の対象タンパク質（ハーセプチン/トラスツズマブ）を120秒間、最低250反応単位（RU）を生じる濃度で、チップ上を通過させ（それぞれフローセル2、3、及び4を使用した）、続いて実行緩衝液中で120秒間表面を安定化させた。CD200-Fc捕捉の手順は、全てのCD200R濃度ごとに繰り返した。図4には、CD200受容体が予想通りチップ表面に固定化されたハーセプチンと結合しないことを示す。

（CD200RのCD200-Fcが結合されたチップ表面上の通過）
Fcタグ付けされたタンパク質の捕捉後、CD200R（異なる濃度の）を捕捉されたCD200-Fc及び対照タンパク質上で120秒間流し（結合を観察するため）、続いて120秒間実行緩衝液を流した（解離を観察するため）。その後チップ表面を10 mMグリシン-HCl（pH 2）を使用して30秒間再生させ（30 μL/分の流速）、続いて次のサイクルの前にBIAcore実行緩衝液で60秒間表面を安定化させた。以下の濃度：1 μM、500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nM、15.6、及び0 nMの全てのCD200R濃度を2連で実行した。

（データ解析）
結果を時間に対する反応又は共鳴単位（RU）としてプロットしたセンサーグラムで表した。実験的センサーグラムをBIAevaluationソフトウェアバージョン1.0（GE Healthcare）で解析した。曲線フィッティングを1:1ラングミュア結合モデルを使用して実施した。標準パラメータ（例えば、リガンド濃度、時間）を用いた速度式を使用して、反復的曲線フィッティングを行った。フィッティングの精度（Closeness）を、BIAevaluationソフトウェアバージョン1.0において製造業者の提供するアルゴリズムによって決定した。

（結果）
図4には、CD200受容体が予想通りチップ表面に固定化されたハーセプチンと結合しないことを示す。図5には、CD200受容体の野生型CD200-Fc（図5A）及びK130Y変異体CD200-Fc（図5B）との結合のセンサーグラムを示す。図5におけるセンサーグラムの比較から、K130Yが野生型CD200-Fcよりも高い親和性及び遅いオフ速度でCD200受容体と結合することが明らかである。表2には、野生型及び変異体CD200-Fc分子：WT、K130Y、I131Y、G129I、F128R、N81Kに対するオン速度（M^-1s^-1）、オフ速度（s^-1）、及び結合親和性値（nM）が記録されている。半減期を関係式t_1/2(s)＝0.693/k_off(s^-1)を使用して計算した。

表2：変異体CD200-Fc分子に対するオン速度（M^-1s^-1）、オフ速度（s^-1）、及び結合親和性値（nM）

（実施例3：機能的細胞モデルを使用した解析）
酸化的破裂アッセイをGVK Biosciences Private社（Campus MLR 1, Survey Nos. 125 & 126, IDA Mallapur, Hyderabad-500076, India）で実施した。

酸化的破裂を、製造業者の説明書に従って、市販のフローサイトメトリーベースのキット（CAY601130, Cayman Chemicals, Michigan, 48108, USA）を用いて単離ヒト好中球において測定した。このアッセイでは、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩（PMA）を使用して酸化的破裂を開始させた後、フローサイトメトリーにより酸化的破裂を定量する。酸化活性をPMA刺激後の酸化的活動によって蛍光化合物ローダミン123へと変換される、細胞透過性の非蛍光色素、ジヒドロローダミン123を使用して測定した。PMA刺激を行い、CD200-Fcのインキュベーションを行わない試料は、陽性対照を提供した。PMA刺激を行わない試料は、陰性バックグラウンド対照としての機能を果たした。

（アッセイプロトコル）
ヒト好中球をficoll-paque分離及びデキストラン沈降法によって末梢血から単離した。細胞を1×10⁶細胞/mLの濃度でアッセイ緩衝液（500 mL RPMI基礎培地、5g BS及び500 μLの1 M塩化カルシウム）中に懸濁した。細胞を参照分子（野生型CD200-Fc）又はCD200-Fc変異体とともにウォーターバス中37℃で30分間インキュベートした。次に10 μLの体積のジヒドロローダミン123の10×作業ストックを細胞に加え、これをウォーターバス中37℃で15分間インキュベートした。細胞を200 nMのPMA（1 mMストック）で刺激し、ウォーターバス中37℃でさらに45分間インキュベートした。最後のインキュベーション工程の後、細胞を室温で10分間遠心分離（500×g）した。上清を捨て、ペレットを0.5 mLのアッセイ緩衝液で再懸濁させた。細胞をフローサイトメトリー（BD FACSVerse, BD Biosciences, New Jersey, US）によって解析した。PMA単独で処理された細胞の平均の蛍光強度値を使用してデータをプロットし、PMA及び試験化合物（野生型CD200-Fc又は変異体CD200-Fc）で処理した細胞と比較した。GraphPad Prismバージョン6.0を使用してデータ解析を実施した。好中球のクラスターを解析プログラムにおいて前方及び後方散乱を使用してゲーティングし（FSC対SSC）、適切な細胞集団のデータが確実に収集されるようにした。最後に、蛍光ヒストグラムを解析し、酸化的破裂への野生型及び変異体CD200-Fcタンパク質の効果を定量した。

（データ解析）
酸化的破裂のCD200-Fc仲介性の阻害を式：
パーセント阻害＝100-(100×(試験化合物のカウント平均-陰性対照のカウント平均)/（陽性対照のカウント平均-陰性対照のカウント平均)）
を使用して測定した。

上記式におけるカウントは、ゲーティングした細胞集団からの蛍光強度値の平均から得る。データは一元配置ANOVAとボンフェローニ事後検定で全てのカラムを比較することによって、統計的有意差について解析した。

（結果）
表3は野生型CD200-Fc、K130Y、並びに陽性及び陰性対照についてのゲーティングされた細胞集団からの蛍光強度値の平均を詳細に示す。図6では酸化的破裂アッセイにおける野生型CD200-Fc及びK130Yの効果を比較する。

K130Y変異体CD200-Fcが酸化的破裂アッセイにおいて、PMAで刺激された酸化的破裂を野生型CD200-Fcよりも強力に、かつ低用量で阻害することは、図6から容易に読み取ることができる。さらに、この機能的活性の増加は、2つのタンパク質がK130Y変異を除いて同一であることから、K130Y変異に帰着することができる。好中球が炎症状態の組織（例えば、リウマチ性の関節及び滑液）中に多数見出されること、並びにさらに好中球はプロテアーゼ及び毒性酸素代謝物の分泌、並びに抗原提示並びにサイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジン、及びロイコトリエンの分泌を通じて炎症を駆動することにより、直接的に組織、骨、及び軟骨に損傷を負わせる非常に大きな潜在性を有することは、認識されている（Wright, H. L.らの文献、(2010) Rheumatology 49, 1618-1631）。好中球の活性化を阻害する薬剤は従って、その病理が完全に又は部分的に好中球の異常な活性化によって媒介される炎症性及び自己免疫性疾患の有用な治療薬としての機能を果たすと期待できる。

表3：野生型CD200-Fc、K130Y、並びに陽性及び陰性対照についてのゲーティングされた細胞集団からの蛍光強度値の平均。括弧内は2連の実験のSD値。

本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
アミノ酸残基位置130及び/又は131に変異を含む変異型CD200タンパク質。
（構成２）
前記変異が置換変異である、構成1記載のタンパク質。
（構成３）
前記置換変異がK130Y及び/又はI131Yである、構成2記載のタンパク質。
（構成４）
1以上の追加の変異、例えばG129I、F128R、及びN81Kから選択される変異を含む、構成1～3のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成５）
配列番号12又は配列番号13の配列を含む、構成1～4のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成６）
前記タンパク質の細胞外ドメイン（ECD）を含む構成1～5のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成７）
配列番号3又は配列番号4の配列を含む、構成1～6のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成８）
任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質コード部分と融合された、構成1～7のいずれか1項記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
（構成９）
前記リンカー部分が1～15アミノ酸を含むペプチドである、構成8記載のタンパク質。
（構成１０）
前記非CD200タンパク質コード部分が抗体又はその断片である、構成8又は9記載のタンパク質。
（構成１１）
前記非CD200タンパク質コード部分がFc断片である、構成8～10のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成１２）
配列番号6又は配列番号7の配列を含む、構成8～11のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成１３）
CD200受容体の調節因子である、構成1～12のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成１４）
前記CD200受容体のアゴニストである、構成1～12のいずれか1項記載のタンパク質。
（構成１５）
構成1～14のいずれか1項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（構成１６）
構成1～15のいずれか1項記載のタンパク質を含む医薬組成物。
（構成１７）
自己免疫性疾患の治療において使用するための、構成1～14のいずれか1項記載のタンパク質、又は構成16記載の組成物。

Claims

配列番号2のアミノ酸配列との少なくとも90%の配列同一性を有する細胞外ドメイン（ECD）、並びに配列番号1に対応するアミノ酸残基位置130及び/又は131の変異を含む、変異型CD200タンパク質であって、該変異がK130Y及び/又はI131Yから選択される置換基変異である、前記変異型CD200タンパク質。
G129I、F128R、及びN81Kから選択される1以上の追加の変異を含む、請求項1記載の変異型CD200タンパク質。
配列番号12又は配列番号13の配列を含む、請求項1記載の変異型CD200タンパク質。
配列番号3又は配列番号4の配列を含む、請求項1又は3記載の変異型CD200タンパク質。
任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質部分と融合された、請求項1、3又は4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質を含む、融合タンパク質。
前記リンカー部分が1～15アミノ酸を含むペプチドである、請求項5記載の融合タンパク質。
前記非CD200タンパク質部分が抗体又はその断片である、請求項5又は6記載の融合タンパク質。
前記非CD200タンパク質部分がFc断片である、請求項5～7のいずれか1項記載の融合タンパク質。
配列番号6又は配列番号7の配列を含む、請求項5～8のいずれか1項記載の融合タンパク質。
任意のリンカー部分を介して非CD200タンパク質部分と融合された、請求項2記載の変異型CD200タンパク質を含む、融合タンパク質。
前記リンカー部分が1～15アミノ酸を含むペプチドである、請求項10記載の融合タンパク質。
前記非CD200タンパク質部分が抗体又はその断片である、請求項10又は11記載の融合タンパク質。
前記非CD200タンパク質部分がFc断片である、請求項10～12のいずれか1項記載の融合タンパク質。
CD200受容体の調節因子である、請求項1～4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質又は請求項5～13のいずれか1項記載の融合タンパク質。
CD200受容体のアゴニストである、請求項1～4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質又は請求項5～13のいずれか1項記載の融合タンパク質。
請求項1～4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質、請求項5～13のいずれか1項記載の融合タンパク質、又は請求項14若しくは15記載の変異型CD200タンパク質若しくは融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
請求項1～4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質、請求項5～13のいずれか1項記載の融合タンパク質、又は請求項14若しくは15記載の変異型CD200タンパク質若しくは融合タンパク質を含む、医薬組成物。
自己免疫性疾患の治療において使用するための、請求項1～4のいずれか1項記載の変異型CD200タンパク質、請求項5～13のいずれか1項記載の融合タンパク質、請求項14若しくは15記載の変異型CD200タンパク質若しくは融合タンパク質、又は請求項17記載の医薬組成物。