JP6954676B2 - Ｐｋｕ治療のためのフェニルアラニン非含有タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分に関し、前記タンパク質は、フェニルケトン尿症に罹患している患者の治療食に使用するために、フェニルアラニンを含んでいない。

フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）（ＯＭＩＭ ２６１６００、ＯＲＰＨＡ７１６）は、欧州では１：１０，０００の発生率である遺伝性の代謝障害である。ほとんどの場合、これは肝酵素フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）の不在又は機能障害に起因するアミノ酸代謝障害である。ＰＡＨの欠損は次には脳及び血漿中のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）過剰症をもたらす。ＰＡＨの欠損は最終的には、神経伝達物質の前駆物質であるチロシンの欠乏として現れる。プテリン代謝の酵素に関する突然変異と共に、ＰＫＵは高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）に関係している。

この疾患は通常、ほとんどの国々において誕生直後に新生児スクリーニングの際に、高い血中Ｐｈｅレベルにより診断される。幼少期に未検出かつ未治療のままであると、ＰＫＵは乳児の神経系の不可逆的損傷、重症精神遅滞及び不十分な脳発達をもたらす。未治療患者における知的障害以外の特徴には、神経学的合併症、神経心理学的障害及び実行機能障害が挙げられる。未治療のまま放置されると、乳児は乳児時の最初の１年の内にＩＱの低下を被ることが報告されている。治療開始時の年齢、様々な年齢期間の間の血中Ｐｈｅレベル、及び食餌療法の順守状況に応じて、ＰＫＵには必ず少なくともある程度のＩＱの低下を伴う。ひとたび検出されたならば、この病気は、その乳児、及びその後は小児にＰｈｅ制限食を提供することより治療される。成人では、古典型ＰＫＵの患者が日常的に摂取するタンパク質サプリメントは、そのような成人が、サプリメント以外の治療食であって厳密な食餌療法計画の下で管理された治療食によって十分な量のＰｈｅを摂取することになり、その結果として全体的な治療食は低Ｐｈｅ食である、という仮定の下で、Ｐｈｅ非含有である。特に、この病気に罹患している妊婦には、胎児の発育障害の危険及び先天性奇形（母性ＰＫＵ症候群）を回避するために、厳密なＰｈｅを制限した食餌療法計画を順守することが推奨される。

さらに近年になると、Ｐｈｅ過剰の状態から現われる、まとめて高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）と称される病理学的症状を、血漿中Ｐｈｅ濃度及びＰＡＨの補酵素への反応性に従って診断される複数の個別の障害に分けられることが示された。初期のレベルでは、ＨＰＡは、ビオプテリン代謝における酵素の欠陥に起因する補酵素６Ｒ−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の欠損の結果引き起こされるＨＰＡ（悪性ＰＫＵ）と、ＰＡＨの欠損に起因するＨＰＡとに分けることができる。後者はさらに細分されて、食餌療法的介入又はその他の治療的介入が存在しない状態におけるＰｈｅの血漿中濃度（本明細書中では「無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度（ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｌａｓｍａ Ｐｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる）及び補酵素ＢＨ４への応答性に応じて少なくとも４つのサブカテゴリーを生じる。

正常な血漿中Ｐｈｅのホメオスタシスは厳重に制御されて、６０μｍｏｌ／Ｌ±１５μｍｏｌ／Ｌの血漿中Ｐｈｅ濃度となっている。古典型ＰＫＵ（ＯＲＰＨＡ７９２５４）は最も重症な型のＰＫＵであり、かつＰＡＨのヌル突然変異又は重度の突然変異に起因するが、この突然変異は未治療のままおかれると１２００μｍｏｌ／Ｌを超える無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度をもたらす。古典型（又は重症型）ＰＫＵの個体は、その個体のＰｈｅ濃度を安全な範囲まで低減するために超低Ｐｈｅの治療食を基にした厳密な食餌療法計画を用いて治療されなければならない。より軽症の型のＰＫＵについても特徴付けがなされている。それほど重症でないＰＫＵは、１０〜２０ｍｇ／ｄＬ（６００〜１２００μｍｏｌ／Ｌ）の無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度として現れ、かつ一般に「軽症（ｍｉｌｄ）ＰＫＵ」（ＯＲＰＨＡ７９２５３）と称されるものである。この軽度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）ＰＫＵは、穏やかな食餌制限、例えばＰｈｅ非含有アミノ酸製剤の補足を必要としない比較的低タンパク質の治療食を用いることで管理される。軽症ＨＰＡは、良性ＨＰＡ又は非ＰＫＵ−ＨＰＡ（ＯＲＰＨＡ７９６５１）とも呼ばれ、１８０〜６００μｍｏｌ／Ｌの無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度を特徴とする。非ＰＫＵ−ＨＰＡの個体は、「安全な」範囲内にある血漿中Ｐｈｅレベルを有すると考えられるので、日常的には治療はされない。ＰＫＵ食餌療法では、最大６００μｍｏｌ／Ｌまでの範囲を許容可能と考えながら、＜３６０μｍｏｌ／Ｌ未満の範囲を目指す。最後に、ＢＨ４応答性ＰＫＵ／ＨＰＡ（ＯＲＰＨＡ２９３２８４）は、＞３６０μｍｏｌ／Ｌの無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度であって、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４；サプロプテリン二塩酸塩）の経口投与後に著しく低減又は正常化することが可能な無制約下血漿中Ｐｈｅ濃度を特徴とする。この軽症〜中等症型のＰＫＵ／ＨＰＡは、かなりの残存酵素活性を備えた突然変異タンパク質をもたらす、ＰＡＨ遺伝子中の特異的な突然変異によって引き起こされる。ＰＫＵ／ＨＰＡ管理の一部としてのＢＨ４の補足により、患者によってはＰｈｅを制限された食餌療法計画を緩めることが可能である。本明細書中で使用されるような用語「ＰＫＵの治療」又は「ＰＫＵ患者」は、次の型のＨＰＡ、例えば古典型ＰＫＵ、軽症ＰＫＵ、軽症ＨＰＡ及びＢＨ４応答性ＰＫＵ／ＨＰＡの治療及び患者を指すように意図されていることを理解すべきである。

１９５０年代初期にＰＫＵ食餌療法が始まったとき、患者にはタンパク質加水分解物による必須アミノ酸（Ｐｈｅ以外）が提供されてきた。したがって、比較的高レベルの必須アミノ酸を備えたタンパク質、例えばカゼイン（哺乳動物の乳汁中に一般に見出されるタンパク質であって、牛乳中のタンパク質の８０％を占める）又はウシ血清アルブミンが、加水分解された後に、可能なかぎり多くのＰｈｅ混入物を除去するためのペプチドの濾過ステップ、及び加水分解されたタンパク質を含む混合物中で遊離アミノ酸を組み合わせること、のうち少なくともいずれか一方に供された。現在では、必須アミノ酸（Ｐｈｅ以外）を含む遊離結晶アミノ酸の概してバランスのとれた混合物が患者に提供される。そのようなアミノ酸混合物は苦味を有する場合があり、砂のような舌ざわりをもたらす場合があり、かつある種の用途には適切でないか又は望ましくないと見なされる可能性がある。その結果、そのような混合物は、遊離アミノ酸及び加水分解タンパク質のうち少なくともいずれか一方の味をマスクするために香味料を含むこともある。ある場合には、ある比率のアミノ酸含有量がポリペプチド又はタンパク質によって提供される組成物は、総アミノ酸のうち高比率が遊離アミノ酸及びある種の加水分解タンパク質のうち少なくともいずれか一方として提供されている組成物よりも優れた味を有することが見出される。しかしながら、そのような組成物の利用可能性は制限されてきた、というのも、栄養処方物は伝統的に天然の食品から分離されたタンパク質、例えば乳汁から分離された乳清、又は大豆から分離された大豆タンパク質から、作製されてきたからである。それらのタンパク質のアミノ酸プロファイルは必ずしも哺乳動物についてのアミノ酸必要量に対応しない。加えて、商品タンパク質は典型的には、タンパク質組成に幅がある可能性のあるタンパク質混合物及びタンパク質加水分解物のうち少なくともいずれか一方で構成されており、よってその栄養的価値に関する予測不可能性をもたらす。さらに、高い生物学的栄養価を備えたそのようなタンパク質の供給源の数が限られていることは、アミノ酸のある一定の組み合わせしか、タンパク質の形態での摂食用に大規模に利用できないことを意味してきた。

チーズ作製時に生じる天然の乳清タンパク質であるグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）は、ＰＫＵの治療に使用されてきた。ＧＭＰはその純粋な形態では芳香族アミノ酸のフェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、並びにアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）及びシステイン（Ｃｙｓ；Ｃ）を欠くが、大型の中性アミノ酸であるイソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）及びトレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）が豊富である。市販の食餌療法タンパク質としては、これは最少量のＰｈｅを含有する。しかしながら、ＰＫＵの食餌管理のための病人用特別食において単一のタンパク質源として使用されると、ＧＭＰには、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｙｒを、これらの必須及び準必須アミノ酸の１日に必要とされる摂取量の必要を満たすために、かつ適正な低いＰｈｅ／Ｔｙｒ比率（＜１）を提供するように、補足しなければならない。ＰＫＵ患者において必須となりながら、Ｔｙｒは、神経伝達物質の合成のための利用可能性に依存している患者の情動行動を改善する。

本発明は、高い生物学的栄養価又は中立的な味などの改善された性質を有する、全ての必須アミノ酸（Ｐｈｅを期待する（ｅｘｐｅｃｔ））を含む食餌療法タンパク質を提供することにより、上記の問題に対処する。さらに、該食餌療法タンパク質は、焼成食品、シリアル又は押し固めバーのような、患者の普通食の一部を形成することが可能な栄養製品として提供されうる。別例として、食餌療法タンパク質は、予め調製されたベーキングミックス又は野菜スープ混合物のような、患者による栄養製品の作成に適した形態で提供されてもよい。

したがって本発明は、全てのＰＫＵ患者が最適な脳の発達のためにＰｈｅの少ない特別食を着実に実行しなければならないことから、ＰＫＵ患者の生活の質を改善することを目指す。「生命を守る治療食（Ｄｉｅｔ ｆｏｒ ｌｉｆｅ）」は、ほとんどの専門家が推奨する基準となってきた。該治療食は、肉、鶏肉、魚、卵、ナッツ、チーズ、豆果、乳汁及びその他の乳製品のような、Ｐｈｅの多い食品を厳しく制限又は排除することを必要とする。じゃがいも、パン、パスタ及びトウモロコシのような澱粉質食品についてはモニタリングが行われなければならない。多くのダイエット食品及びソフトドリンクの中に存在する甘味料のアスパルテームも、アスパルテームが２つのアミノ酸すなわちフェニルアラニン及びアスパラギン酸で構成されているので、回避されなければならない。

乳児はまだ、母乳の利点を全て与えるために母乳で育てられてもよいが、その量もモニタリングされなければならず、不足している栄養素の補足が必要とされよう。補足用の乳児用調合乳は、これがなければ低いフェニルアラニン食には不足しているであろうアミノ酸及びその他の必要な栄養素を提供するために、これらの患者において使用される。小児が成長するにつれて、これらは錠剤、調合食（ｆｏｒｍｕｌａ）及び特別に調合された食品に置き換えることが可能である。Ｐｈｅは数多くのタンパク質の合成に必要であるので、適正な発育のために必要であるが、レベルはＰＫＵ患者では厳密に制御されなければならない。加えて、通常はフェニルアラニンに由来するチロシンが、ＰＫＵ患者の治療食に補足されなければならない。

テトラヒドロビオプテリン（又はＢＨ４）（フェニルアラニンの酸化のための補酵素）の経口投与は、ある一定の患者におけるＰｈｅの血中濃度を低減することが可能である。テトラヒドロビオプテリンの一形態である化合物サプロプテリン二塩酸塩の錠剤調製物（Ｋｕｖａｎ（登録商標））が市販されている。Ｋｕｖａｎ（登録商標）は、ＢＨ４応答性ＰＫＵ患者（ＯＲＰＨＡ２９３２８４、臨床医の間でＰＫＵ個体群の約２５〜５０％として定義された臨床設定による）がＰｈｅレベルを推奨される範囲まで下げるのを助けることが可能な最初の薬物である。栄養士と密接に連絡を取って取り組みながら、Ｋｕｖａｎ（登録商標）に応答する一部のＰＫＵ患者は、自身が食べることができる天然タンパク質の量を増やすことができる場合がある。しかしながら、患者はなおもＰｈｅ制限食を必要とするであろう。

理論上、所望のアミノ酸混合物を含む合成ポリペプチド配列を実験室環境で設計及び生産するということも考えられる。しかしながらこの手法は様々な懸念をもたらす可能性があり、したがって必ずしも適用可能とは限らない。第１に、当業者はそのような合成配列の高レベル生産を達成することが非常に困難である場合があることを知っている。第２に、そのような合成タンパク質が合成されたとしても、栄養製品に使用するための該タンパク質の適性は不確かであろう。例えば、そのような天然に存在しないポリペプチドがアレルゲン又は毒素であることも考えられる。よって、天然のタンパク質が好ましい。

天然タンパク質中のＰｈｅ残基の置換に続くそれらのタンパク質の組換え生産も、それぞれ卵及び乳汁の中の２つの非常に豊富なタンパク質であるオボアルブミン及びカゼインに関する特許文献１、並びにトウモロコシ中に存在するタンパク質群であるガンマ・ゼインを開示している特許文献２に提案されている。しかしながら、天然タンパク質中のＰｈｅの置換は、必ずしも可能とは限らず、かつそのタンパク質がもはや発現されないようにタンパク質構造を変化させる場合もある。

特許文献３は、Ｐｈｅを全く含有しないか又はＰｈｅを少ししか含有しないアミノ酸の組み合わせから構成された天然に存在する栄養ポリペプチド配列であって、その一部が分泌される配列に関する。特許文献４は、例えば栄養上の目的のための、そのような単離された栄養ポリペプチドの処方物に関する。特許文献５は、組換えのＰｈｅ非含有又は低Ｐｈｅタンパク質を調製する方法に関する。

米国特許第６４９５３４４号明細書 米国特許第６００４９３０号明細書 国際公開第２０１３／１４８３３２号 国際公開第２０１４／０８１８８４号 国際公開第２０１６／０４６２３４号

本発明は、体内にフェニルアラニンが蓄積する患者のための食餌療法組成物に使用される、食餌療法として十分なバランスの全ての他の必須アミノ酸を提供するための、高い生物学的栄養価を備えた組換えのＰｈｅ非含有の食餌療法タンパク質を提供することを目的とする。

１つの態様では、本発明は、配列番号２と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む組換え食餌療法タンパク質に関する。１つの実施形態では、組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一であるポリペプチド配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と１００％同一であるポリペプチド配列を含む。組換え食餌療法タンパク質は、選好度の低い順に配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、配列番号２の配列の食餌療法として十分な部分であってもよい。

別の実施形態では、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、精製タグ又はラベルである１以上の追加のタンパク質配列を含む。好ましい実施形態では、追加のタンパク質配列は配列番号３を含む。

別の態様では、本発明は、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードする核酸配列を含むベクターに関する。
別の態様では、本発明は、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードするベクターを含む組換え微生物に関する。１つの実施形態では、微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ジゴサッカロマイベス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｖｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で構成されている群から選択される。好ましい実施形態では、微生物はバチルス属又はシュードモナス属で構成されている群から選択される。より好ましい実施形態では、前記微生物はバチルス・サブティリス又はシュードモナス・フルオレッセンスである。

別の態様では、本発明は、食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を生産する方法であって、該組換えタンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードするベクターを担持している組換え微生物を、生産に適した条件下で培養することを含む方法に関する。組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は精製されてもよい。１つの実施形態では、精製は精製タグを利用して実施される。精製された組換えタンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、タンパク質１００ｇあたり１ｇ以下のＰｈｅ、好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．４５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．３５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．２５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１３ｇ以下のＰｈｅ混入物、及び最も好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１０ｇ以下のＰｈｅ混入物しか含まないことが好ましい。

別の態様では、本発明は、食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を含む食餌療法組成物に関する。１つの実施形態では、食餌療法組成物は食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分で構成される。別の実施形態では、食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分はさらなる添加剤と組み合わされる。好ましい実施形態では、食餌療法組成物は、タンパク質１００ｇあたり０．２ｇ以下のＰｈｅ、好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０４ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０３ｇ以下のＰｈｅ混入物、及び最も好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０２ｇ以下のＰｈｅ混入物しか含有しない。

食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は食餌療法組成物は、特殊な医療目的のための食物として使用するためのものであり；ＥＵ指令２００９／３９／ＥＧ（「食餌療法一般指針（Ｄｉａｅｔｒａｈｍｅｎｒｉｃｈｔｌｉｎｉｅ）」）及び１９９９／２１／ＥＧ（「特別医療目的用栄養食品（ｄｉａｔｅｔｉｓｃｈｅ Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ ｆｕｅｒ ｂｅｓｏｎｄｅｒｅ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｚｗｅｃｋｅ）」）並びに２０１６年７月２０日に発効することになるＥＵ規則ＥＵ６０９／２０１３（「特定集団用食品（Ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｇｒｏｕｐｓ）」；「乳幼児向け食品、特別医療目的用食品及び全食事代替型ダイエット食品（Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ ｆｕｅｒ Ｓａｅｕｇｌｉｎｇｅ ｕｎｄ Ｋｌｅｉｎｋｉｎｄｅｒ， Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ ｆｕｒ ｂｅｓｏｎｄｅｒｅ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｚｗｅｃｋｅ ｕｎｄ Ｔａｇｅｓｒａｔｉｏｎｅｎ ｆｕｅｒ ｇｅｗｉｃｈｔｓｋｏｎｔｒｏｌｌｉｅｒｅｎｄｅ Ｅｒｎａｅｈｒｕｎｇ）」）を参照のこと。特に、食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は前記食餌療法組成物は、体内へのフェニルアラニンの蓄積を特徴とする障害、例えば高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）、好ましくはフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）などの管理に使用するためのものであってよい。よって、別の態様では、食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は前記食餌療法組成物は、医薬として使用するためのものである。好ましい実施形態では、食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、体内へのフェニルアラニンの蓄積を特徴とする障害の治療に使用するためのものである。より好ましい実施形態では、障害はＨＰＡであり、より好ましくはＰＫＵである。

２８日間にわたって給餌された標準的なマウス用飼料（第１群、治療なし）、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食（第２群）又はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食（第３群、標準治療）を用いて治療したＰＫＵマウスの体重の推移を示す図。Ｘ軸は給餌期間の日数を示し、Ｙ軸は動物の体重をグラムで示している。 ２８日間にわたる給餌の間の３つの異なるマウス群の血漿中におけるＰｈｅの平均濃度をプロットする図。Ｘ軸は給餌期間の日数を示し、Ｙ軸はＬ−Ｐｈｅレベルを血漿１リットル当たりのマイクロモル数で示している。 ２８日間の給餌の後でマウスの毛皮の色素沈着減少に多少の部分的変化が様々に現れた、各治療食群の例示のマウスを示す図。 ２８日間にわたる給餌の間の３つの異なるマウス群の血液中における、フェニルアラニンとチロシンとの比率を示す図。Ｘ軸は給餌期間の日数を示し、Ｙ軸は血液中のフェニルアラニン／チロシンを示している。 野生型（ＷＴ）マウス、及び標準的なマウス用飼料、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食又はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で治療されたＰＫＵマウスの脳におけるＰｈｅ及びＴｙｒの平均濃度を示す図。 ＷＴマウス、及び標準的なマウス用飼料、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食又はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で治療されたＰＫＵマウスの脳における平均Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比を示す図。

本明細書中で使用されるように、「組換え（の）、組換え体（の）」とは、生体分子（例えば遺伝子又はタンパク質）であって、（１）その天然に存在する環境から取り出されている、（２）自然界においてその遺伝子が中に見出されるポリヌクレオチドの全体若しくは一部を伴っていない、（３）自然界においてその遺伝子が連結していないポリヌクレオチドに作動可能なように連結している、及び（４）自然界には存在しない、のうち少なくともいずれかである生体分子を指す。用語「組換え（の）、組換え体（の）」は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチド類似物、又は異種の系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似物、並びにそのような核酸によってコードされたタンパク質及びｍＲＮＡのうち少なくともいずれかに関して使用することが可能である。よって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、それが細胞内に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成される場合、組換え体である。

用語「食餌療法タンパク質」は、本明細書中で使用されるように、ヒトの摂食に適しているタンパク質を指す。必須アミノ酸をすべて提供する食餌療法タンパク質は、高い生物学的栄養価を備えたタンパク質と称される。他のすべての必須アミノ酸を提供するＰｈｅ非含有タンパク質も、高い生物学的栄養価を備えたタンパク質であると考えられる。カゼイン（哺乳動物の乳汁中に一般に見出されるタンパク質であって、牛乳中のタンパク質の８０％を占める）及び乳清（乳汁が凝固せしめられて濾された後に残る液体中のタンパク質）は、高い生物学的栄養価を備えた食餌療法タンパク質の主要な供給源である。本発明の食餌療法タンパク質は、Ｐｈｅ以外の必須アミノ酸を全て含む。用語「その食餌療法として十分な部分（ｄｉｅｔａｒｉｌｙ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｏｒｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」とは、食餌療法タンパク質の一部を指す。食餌療法タンパク質の食餌療法として十分な部分は、本発明の食餌療法タンパク質よりアミノ酸が少ないが、なおもＰｈｅ以外の必須アミノ酸を全て含む。

用語「食餌療法として十分な」は、本明細書中で使用されるように、フェニルアラニン以外の必須アミノ酸を全て含み、かつ高い生物学的栄養価を備えたタンパク質である、ポリペプチド配列を指す。

用語「必須アミノ酸」は、本明細書中で使用されるように、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を指し、これらは健康及び発育に必要なアミノ酸であるが、人体が合成することはできず、食物から獲得されなければならない。

用語「組換え微生物」は、本明細書中で使用されるように、組換え遺伝子のコピーを担持するように改変されている微生物を指す。
本明細書中で使用されるように、「食餌療法組成物」はヒトの食用に適している組成物である。食餌療法組成物は主にタンパク質を含むことができる。本発明の食餌療法組成物は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を含み、かつ総フェニルアラニン量が少ない。

用語「天然に存在するタンパク質」は、本明細書中で使用されるように、天然の宿主の中に存在する人為変化を受けていない配列から生成されるタンパク質を指す。したがって、該タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列も、該タンパク質自体のアミノ酸配列も、天然の宿主中に見出される配列から変化していない。

本開示の目的上、「栄養製品（ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物を含み、かつ望ましい量の必須アミノ酸を含有する、ヒトの食用に適した製品である。患者に必要な１日当たりの望ましい量の必須アミノ酸は、患者の年齢及び患者の治療食、すなわちタンパク質制限及びＰｈｅ制限のうち少なくともいずれか一方のレベル、によって決まる。１日あたりの望ましい量は、当分野で既知の方法によって医師及び栄養士のうち少なくともいずれか一方が決定することができる。典型的な量は、例えば、成人について１日当たり体重１ｋｇにつき０．８ｇのタンパク質、又は小児について１日当たり体重１ｋｇにつき１．２ｇのタンパク質、を基にする。栄養製品自体、すなわち本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物が添加される前は、タンパク質を全く含有しないか又は少量のタンパク質成分しか含有しない。

本明細書中で使用されるように、「精製タグ」は、該精製タグに融合された対象の第２のタンパク質又はポリペプチド配列の検出、単離、及び精製のうち少なくともいずれかに使用可能な結合パートナーを有している、任意のポリペプチドである。いくつかの実例が当分野においてよく知られており、Ｈｉｓ−６タグ、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、Ｓｔｒｅｐ−ＴＡＧＩＩ、ビオチンタグ、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、金属アフィニティータグ若しくはＴａｇ５４（ラッシェ（Ｒａｓｃｈｅ）ら、ジ・オープン・バイオテクノロジー・ジャーナル（Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ）、２０１１年、第５巻、ｐ．１−６）、又はこれらの改変物が挙げられる。

本発明は、１つの態様では、高い生物学的栄養価を備えた組換えのＰｈｅ非含有食餌療法タンパク質に関する。実施例１は、体内にフェニルアラニンが蓄積する患者の食餌管理に使用することが可能な本発明の組換えＰｈｅ非含有食餌療法タンパク質の生産に使用される、そのような食餌療法タンパク質を同定する過程について述べている。バチルス・サブティリス（菌株１６８）由来の「一般ストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）１６Ｏ（Ｇ１６Ｏ＿ＢＡＣＳＵ）」（配列番号１）（タンパク質データバンクＵｎｉｐｒｏｔＫｂアクセス番号Ｐ８０８７２）が、適切なタンパク質候補として同定された。１個のＰｈｅ残基を、ｃＤＮＡレベルにてＰｈｅをコードする塩基トリプレットをトリプトファンをコードする塩基トリプレットに置き換えることにより、構造的に類似したアミノ酸であるトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換した。この置換により、Ｐｈｅを含有しないが代わりに必須アミノ酸のＴｒｐを含有している食餌療法タンパク質が得られ、これによりＰｈｅ以外の全ての必須アミノ酸を含有する食餌療法タンパク質が提供される。したがって、この置換は２つの理由すなわち：第１にＰｈｅ非含有食餌療法タンパク質が提供されること、第２に該食餌療法タンパク質中に他の全ての必須アミノ酸が存在しており補足の必要がないことから好都合である。これは特に好都合である、というのも、Ｔｒｐは非常に苦味が強く、遊離のＴｒｐを食餌療法組成物に添加すれば苦味のある風味を生じるであろうからである。さらに、驚くべきことに、苦味のあるアミノ酸Ｔｒｐを導入しても苦味のある食餌療法タンパク質を生じないことが見出された。よって、１つの実施形態では、Ｐｈｅを含まずかつ全ての必須アミノ酸を含有する、高い生物学的栄養価を備えた組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と同一のポリペプチド配列を有する。そのような食餌療法タンパク質はＧＳＰ１０５と称される。別の実施形態では、組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む。より好ましくは、組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一、より好ましくは少なくとも９９％同一、及び最も好ましくは少なくとも１００％同一であるポリペプチド配列を含む。配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は配列番号２の配列に関してその全長にわたって測定されることになっていることが、理解されるべきである。例えば、配列番号２の配列を含み、かつ該食餌療法タンパク質のＣ末端及びＮ末端のうち少なくともいずれか一方にさらにアミノ酸を有しているタンパク質は、そのＣ末端及びＮ末端のうち少なくともいずれか一方のアミノ酸を配列比較について無視することができるので、配列番号２の配列に対して１００％の配列同一性を有すると考えられる。

組換え食餌療法タンパク質は、選好度の低い順に配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、配列番号２の配列の食餌療法として十分な部分を含むことができる。

組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、精製タグ又はラベルである１以上の追加のタンパク質配列を含み得る。追加のタンパク質配列は、任意選択で切断により除去することが可能である。食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分が２以上の追加のタンパク質配列を含む場合、１つずつ、任意の組み合わせ、又は全部が、切断により除去可能である。追加のタンパク質配列はＰｈｅ残基を導入しない、又は、追加のタンパク質配列がＰｈｅ残基を含む場合はそのような追加のタンパク質配列は切断により除去される、ということが理解されるべきである。１つの実施形態では、追加のタンパク質配列は配列番号３を含む。好ましい実施形態では、追加のタンパク質配列は、Ｐｈｅ残基が別のアミノ酸、好ましくはチロシン又はアラニン残基に置き換えられた改変型のＴＡＧ５４（ラッシェ（Ｒａｓｃｈｅ）ら）を含む。よって、特定の好ましい実施形態では、追加のタンパク質配列は、Ｐｈｅ残基がアラニン残基に置き換えられた改変型Ｔａｇ５４である配列番号４を含む。別の特定の好ましい実施形態では、追加のタンパク質配列は、Ｐｈｅ残基がチロシン残基に置き換えられた改変型Ｔａｇ５４（配列番号５）を含む。そのような置換は、Ｔｙｒ含有量が増加して食餌療法タンパク質のＰｈｅ／Ｔｙｒ比率が低下するという利点を有する。さらに好ましい実施形態では、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、Ｃ末端Ｈｉｓ−６タグを追加として含む。特に好ましい実施形態では、組換え食餌療法タンパク質は、配列番号２と同一のポリペプチド配列を含み、かつ追加のタンパク質配列としてＣ末端Ｈｉｓ−６タグ及び配列番号４を含み、その結果として配列番号６に開示された配列を有するタグ付き組換え食餌療法タンパク質（＝ＧＳＰ１０５−６Ｈｉｓ−Ｔａｇ５４−Ｐ１５）を生じる。Ｂ．サブティリスの一般ストレスタンパク質１６Ｏ（ＧＳＰ１６Ｏ）と比較したタグ付き組換え食餌療法タンパク質（配列番号６）の特性を、表１に記載する。

Ｈｉｓ−６タグ及び改変型Ｔａｇ５４のうち少なくともいずれか一方は、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分の精製に使用することが可能である。驚くべきことにＴａｇ５４−Ｐ１５タグはＢ．サブティリスにおけるタンパク質の発現を向上させることが見出された。さらに、改変型Ｔａｇ５４の追加のタンパク質配列は、好都合なことに、食餌療法タンパク質の全アミノ酸組成にアミノ酸を与えることにより、組換え食餌療法タンパク質の全アミノ酸組成を改善する。さらになお、改変型Ｔａｇ５４は、融合タンパク質のための検出エピトープとしての役割を果たすことが可能である。

本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、デザイナーテールをさらに含むことができる。「デザイナーテール（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｔａｉｌ）」とは、タンパク質のＣ末端又はＮ末端に付加することが可能な短い一続きのアミノ酸を指す。デザイナーテールは１〜５個のアミノ酸を含有する。１つの実施形態では、食餌療法タンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列及びデザイナーテールを含む。任意選択で、食餌療法タンパク質は、１以上の追加のタンパク質配列、例えばＨｉｓ−６タグ及び改変型Ｔａｇ５４のうち少なくともいずれか一方などを、さらに含むことができる。好ましい実施形態では、デザイナーテールはチロシンで作られる。特に好ましい実施形態では、デザイナーテールは１個のチロシンを、より好ましくは２個のチロシン、及び最も好ましくは３個のチロシンを有する。よって、１つの実施形態では、食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、配列番号２と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列、少なくとも１個のチロシン残基を含むチロシンで作られたデザイナーテール、Ｈｉｓ−６タグ及び改変型Ｔａｇ５４を含む。

別の態様では、本発明は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードする核酸配列を含むベクターに関する。１つの実施形態では、ベクターはプラスミドである。好ましい実施形態では、プラスミドはＩＰＴＧ誘導型発現プラスミドｐＨＴ４３（モビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ））又はＩＰＴＧ誘導型発現プラスミドｐＤＡＢ１０７２０９（ダウ（Ｄｏｗ）；米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０Ａ１号明細書）である。

本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードする核酸配列は、逆翻訳のような既知の方法を使用して当業者により容易に決定可能である。逆翻訳とは、タンパク質配列を入力として使用し、かつコドン利用表を使用した後に最も確実そうな非縮重コード配列を表わすＤＮＡ塩基配列を得る方法である。得られた核酸配列は、既知の最適化アルゴリズムの使用により最適化することが可能である。これにより当業者は特定の宿主内での発現のために最適化された核酸配列を得ることが可能となった。当業者はさらに、所望のアミノ酸配列及びそのタンパク質が生産されることになっている宿主生物を提供することにより、商業的に核酸を得ることも可能である。Ｂ．サブティリスにおける配列番号６のポリペプチド配列を有する組換え食餌療法タンパク質の生産のための例示の核酸配列は、配列番号７に示されている。しかしながら理解されるべきなのは、他の核酸配列、例えば特定の宿主細胞用に最適化されたコドンである核酸配列などが、例示の配列から逸脱する一方でなおも本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を生産してもよい。たとえ同一の生物用であっても、核酸配列は、商業的製造業者及び使用されるアルゴリズムに応じて様々となりうる。

別の態様では、本発明は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分をコードする核酸配列を含むベクターを含む組換え微生物に関する。よって、本発明は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を発現する組換え微生物に関する。１つの実施形態では、微生物は、エシェリキア属、クレブシェラ属、シュードモナス属、キサントモナス属、バチルス属、スタフィロコッカス属、サッカロミセス属、コリネバクテリウム属、ストレプトマイセス属、サルモネラ属、アスペルギルス属、グルコノバクター属、マイコバクテリウム属、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、カウロバクター属、ピキア属、コリネバクテリウム・グルタミカム、サッカロミセス・セレビシエ、クロストリジウム・ボツリヌム、フラボバクテリウム・ヘパリナム、ラクトコッカス・ラクティス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、ラルストニア・ユートロファ、ニューロスポラ・クラッサ、アルクスラ・アデニニボランス、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイウェロマイセス・ラクティス、ジゴサッカロマイベス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｖｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス、バチルス・サブティリス及びバチルス・メガテリウムで構成されている群から選択される。好ましい実施形態では、微生物はバチルス属又はシュードモナス属で構成されている群から選択される。より好ましい実施形態では、微生物はバチルス・サブティリス又はシュードモナス・フルオレッセンスである。

別の態様では、本発明は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を生産する方法であって、本発明の組換え微生物を、組換え微生物による食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分の生産に適した条件下で培養することを含む方法に関する。１つの実施形態では、該方法は、組換え微生物を培養するステップと、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を抽出するステップと、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を精製するステップと、得られたタンパク質を乾燥させるステップとを含む。別の実施形態では、該方法は、組換え微生物、例えばバチルス属菌を培養するステップと、上清を収集するステップと、任意選択で上清を濃縮するステップと、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を精製するステップと、バッファーを水に交換するステップと、得られたタンパク質の凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、及び押出乾燥のうち少なくともいずれかを行うステップとを含む。組換え微生物の培養は、種培養及び本培養の使用を含むことが好ましい。上清の収集及び濃縮は、透析濾過、より好ましくは様々な細孔径を有する中空ファイバーを使用する十字流濾過を含むことが好ましい。濃縮後の上清は少なくとも１０倍に濃縮されていることが好ましい。組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分の精製は、好ましくは亜鉛イオン及びキレートｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用する、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含むことができる。任意選択で、精製されたタンパク質を、バッファーを水に交換した後に濃縮することが可能である。よって、好ましい実施形態では、該方法は、種培養及び本培養を使用して組換え微生物を培養するステップと、上清を収集するステップと、上清を少なくとも１０倍に濃縮するステップと、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を精製するステップと、バッファーを水に交換するステップと、精製されたタンパク質を任意選択で濃縮するステップと、得られたタンパク質の凍結乾燥及び噴霧乾燥のうち少なくともいずれか一方を行うステップとを含む。

本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を生産する方法は、高いタンパク質収量、例えばＢ．サブティリスにおいて少なくとも１００〜５００ｍｇ／Ｌ又はシュードモナス・フルオレッセンスにおいて少なくとも２．４ｇ／Ｌの収量をもたらす。精製された組換えタンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、タンパク質１００ｇあたり１ｇ以下のＰｈｅ、好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．４５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．３５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．２５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１３ｇ以下のＰｈｅ混入物、及び最も好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１０ｇ以下のＰｈｅ混入物しか含まない。

精製されて、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥及び押出乾燥のうち少なくともいずれかが行われたタンパク質は、凍結状態、例えば−２０℃で、冷却条件下、例えば４℃で、又は室温で、保管することが可能である。好ましい実施形態では、精製され、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥及び押出乾燥のうち少なくともいずれかが行われたタンパク質は、−２０℃で保管される。

別の態様では、本発明は、本発明の組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分を、単独で又は任意選択でさらに添加剤とともに含む食餌療法組成物に関する。１つの実施形態では、本発明の食餌療法組成物は、必須ビタミン、ミネラル及び痕跡元素、ビタミン様物質（例えば、限定するものではないがタウリン、ミオイノシトール、コリン及びカルニチンなど）、脂質（例えば、限定するものではないが、脂肪、油、脂肪酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、トリグリセリド、リン脂質、レシチン、脂肪酸エステル又はコレステロールなど）炭水化物（例えば、限定するものではないが、単／二／オリゴ／多糖類、デンプン、グルカン、フルクタン又はペントサンなど）ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸（例えばチロシンなど）及びこれらの反応生成物、酸、酸度調節剤、固化防止剤、発泡防止剤、酸化防止剤、結合剤、バッファー（例えば、限定するものではないが、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウムなど）増量剤、乳化剤、酵素、固化剤、香味料、風味増強剤、発泡剤、ゲル化剤（例えば、限定するものではないが、グアー、キサンタン、アルギナート、カラゲーン、ペクチンなど）、光沢剤、湿潤剤、加工デンプン、保存剤、噴射ガス、膨張剤、金属イオン封鎖剤、安定化剤、増粘剤（例えば、限定するものではないが、デンプン、セルロースなど）、甘味料、食品着色料、ハーブ、香辛料、植物抽出物並びにファイトケミカルで構成されている群から選択された追加の添加剤で補足されている。好ましい実施形態では、食餌療法組成物にはチロシンが補足されてもよい。

１つの実施形態では、食餌療法組成物は、粉末、顆粒、タブレット、カプセル、集塊物、凍結組成物、ペレット、溶液、巨大分子溶液、親水コロイド、複合分散系、懸濁剤、乳剤、液体、発泡体、ゲル、ゾル、ソリッドゾル、ソリッドフォーム、結晶、非晶質固体、ピル、押出品又はペーストとして調製される。食餌療法組成物は、冷却の有無に関わらず、乾燥形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、ドラム乾燥形態又は押出乾燥形態で保管可能である。

好ましい実施形態では、食餌療法組成物は、タンパク質１００ｇあたり０．２ｇ以下のＰｈｅ、好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０４ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０３ｇ以下のＰｈｅ混入物、及び最も好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０２ｇ以下のＰｈｅ混入物しか含有しない。

本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物は、栄養製品に使用可能である。栄養製品は、限定するものではないが、飲料、スープ、押し固めバー、ウエハー、ワッフル、プディング、ゲル状食品、非動物繊維を含む食肉類似物のような肉様食品、ソーセージ類似物、焼成食品、ソース、サラダドレッシング、シリアル、フレーク、ベーキングミックス、例えばマフィンミックス、ワッフルミックス又はクレープミックス、ミール、クッキー、クラッカー、クリーム、ムース、フラン、カスタード、コンポート、アイスクリーム、シャーベット、パフェ、ディップ、スプレッド、シロップ、ピューレ、ペースト、ゼリー、バター、ジャム、チーズ類似物、クリームチーズ類似物、ヨーグルト類似物、ミルク類似物、クリスプ及び押出成形固形物で構成されている群から選択可能である。栄養製品は、本発明の食餌療法組成物を含む状態で生産及び購入されてもよいし、患者によって個別に調製されてもよい。例えば、飲料又はスープは、食餌療法組成物を水、果汁、米ミルク又は野菜の煮汁に加えることにより調製されてもよい。好都合なことに、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分は、その栄養価、粘稠度又は風味の変化を伴うことなく熱処理に耐える。よって、栄養製品、例えば焼成食品、シリアル、スープ又は押し固めバーを調製するときに、組換え食餌療法タンパク質又はその食餌療法として十分な部分の、加熱、焼成、煮沸、油炒め、揚げ、ソテー、煮込み（ｓｔｅｗｅｄ）、蒸し煮、焙り焼き、蒸し、ポシェ、弱火煮込み（ｓｉｍｍｅｒｅｄ）、グリル焼、低温真空調理（ｓｏｕｓ−ｖｉｄｅ ｃｏｏｋｅｄ）、均質化、滅菌、間欠滅菌、高圧低温処理、真空調理（ｖａｃｕｕｍ ｃｏｏｋｅｄ）、凍結加工、低温殺菌又は押出成形を行うことができる。

１つの実施形態では、栄養製品は極めて少ない量のＰｈｅしか含有していない。好ましい実施形態では、栄養製品はＰｈｅを含有していない。栄養製品に添加される本発明の食餌療法組成物中のＰｈｅ混入物の量は、栄養製品に応じて様々であってよい。１つの実施形態では、栄養製品は、タンパク質１００ｇあたり０．２ｇ以下のＰｈｅ、好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．１ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０５ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０４ｇ以下のＰｈｅ混入物、より好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０３ｇ以下のＰｈｅ混入物、及び最も好ましくはタンパク質１００ｇあたり０．０２ｇ以下のＰｈｅ混入物しか含有しない。

別の態様では、本発明は、医薬及び特殊な医療目的のための食品のうち少なくともいずれか一方として使用するための、本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物に関する。組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は食餌療法組成物は、粉末、顆粒、タブレット、ペレット、懸濁剤、乳剤、液体、ピル、押出品又はペーストの形態であることが可能である。投与は１日当たり３〜５回であってよい。用量は、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０ｇの食餌療法タンパク質であってよい。投与は食事と同時であってよい。投与は経口投与又は経腸投与であってよい。好ましくは、投与は経口投与である。医薬は、小児、十代の若者及び成人に投与可能である。好ましい実施形態では、本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物は、体内へのフェニルアラニンの蓄積を特徴とする障害の治療に使用するためのものである。さらにより好ましい実施形態では、障害は高フェニルアラニン血症又はフェニルケトン尿症である。

さらに好ましい実施形態では、組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は食餌療法組成物は、ＰＫＵ又はＨＰＡの管理のための医薬、例えばＢＨ４又はその類似化合物などと組み合わせて使用される。

フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の管理に使用するための本発明の組換え食餌療法タンパク質の適性は実施例３において示されている。実施例３は、ＰＫＵマウスを治療する試験的研究であって、その唯一のアミノ酸供給源がＰｈｅを含まないが１．５％のＴｙｒを含む遊離アミノ酸混合物である治療食（ハーラン・テクラド（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ）のＴＤ．９７１５２；シーグレイブ（Ｓｅａｇｒａｖｅｓ）及びマクブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・メタボリズム（Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ）、２０１２年、第１０７巻、第４号、ｐ．６５０−６５８）（本明細書中では「Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食」と称される）であってＰＫＵ患者のための病人用特別食における現行の標準品に類似のものを用いるか、又はその唯一のアミノ酸供給源が０．２％のＰｈｅを補足した組換え食餌療法タンパク質ＧＳＰ１０５である治療食（本明細書中では「Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食」若しくは「Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５治療食」と称される）を用いるかいずれかの、試験的研究の結果を示す。実験におけるＰｈｅを用いた治療食の補足は、そのようにしないとマウスがこの必須アミノ酸を全く得られないからであった。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食を与えられたマウスは、Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食を与えられた体重減少を示したマウスとは対照的に、体重維持又は体重増加を示した（図１）。これは、組換え食餌療法タンパク質が構造的に無傷のタンパク質源であるという事実によって説明されるかもしれない。食餌療法学の分野では、タンパク質及びタンパク質フラグメントが遊離アミノ酸の組成物と比較して代謝目的に利用可能であり続けるどうかについての論争がある一方、結晶状アミノ酸組成物由来の利用可能なアミノ酸のプールは、身体がそれらを将来代謝に使用するために保管することはできないので直ちに代謝されなければならない、と考えられている。しかしながら、タンパク質及びタンパク質フラグメントは逐次的に消化され、このことは、より長い期間にわたる代謝目的に利用可能な遊離アミノ酸の連続的な放出をもたらす。よって、本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物の使用が、より長い期間にわたってアミノ酸を提供することにより体重維持又は体重増加をもたらす、ということも考えられる。

理論に束縛されるものではないが、Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食を与えられたマウスの体重減少は、治療食中に最低限必要なＰｈｅの量が不足していることに由来することも考えられる、というのも、必要な血中Ｐｈｅレベルを維持するために内在性タンパク質が代謝される異化代謝に動物が到達した可能性があるからである。そのような現象は、内在性タンパク質を代謝して今度は高い血中Ｐｈｅレベルに苦しむ、栄養不良に悩まされているＰＫＵ患者においても観察可能である。ＰＫＵ患者の治療食の中にＰｈｅが完全かつ絶対的に欠如することは望ましくなく、かつ不可能であり、よってＰＫＵ患者は自身の食物を用いて最小限の量の必須アミノ酸Ｐｈｅを得る。その一方で栄養不良がＰＫＵ患者に生じる場合がある、というのは、厳密な治療食が他の必須アミノ酸の不足を同様に引き起こす可能性があるからである。よって、本発明の組換え食餌療法タンパク質若しくはその食餌療法として十分な部分又は本発明の食餌療法組成物を使用することで、ＰＫＵ患者の栄養不良を防止するということも考えられる。

実施例１−候補遺伝子の発見
フェニルアラニンを含まない栄養タンパク質について必要な基準を満たす潜在的なタンパク質候補を同定するために、自己設計した検索アルゴリズムを使用した。様々な属又は種に由来するタンパク質配列を、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ６．６．１のインポート機能を使用してＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から入手した。

野菜（例えばジャガイモ）のような一般的な食糧資源である生物種を起源とするタンパク質も、微生物（例えば酵母菌）又は動物（例えばウシ）を起源とするものも使用した。種／属のラテン名又は慣用名のいずれかを、どちらの名前がより多くのヒット数を生じるかに応じて、検索文字列として使用した。特徴解析されていないタンパク質以外のヒットを全てダウンロードし、様々な生物種から総数８３６，０３７個の配列が得られた。以降の検索文字列を使用して表２に記載したヒットを同定した。

配列５，０００〜１０，０００個のバッチを用いるＣＬＣ内の「配列統計データを作出する（Ｃｒｅａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）」機能をさらに使用して、８３６，０３７個の遺伝子の各々に存在するアミノ酸の一覧を作成した。これらの一覧をＥｘｃｅｌ（登録商標）にインポートし、そこで（ｗｅｒｅ）アミノ酸組成を、２つの栄養基準すなわち：いわゆるジャガイモ−卵の原則（Ｋａｒｔｏｆｆｅｌ−Ｅｉ Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＫＥＳ）及び製造業者ミルーパ（Ｍｉｌｕｐａ）が同社のＰＫＵ１製品に使用しているアミノ酸組成であってＰＫＵ患者の治療に使用されるＰｈｅを含まないアミノ酸組成、と比較した。

加えて、アミノ酸配列中のＰｈｅの総数をアミノ酸の総数とともに分析した。分析した要素全てを表３の設定に従って評価した。

総スコア２０（単一のタンパク質のＰｈｅ含有量、分子量、並びにＫＥＳ及びＰＫＵ１に照らした偏差についてのスコアの合計）を上回るヒットについて、配列の状態（完全配列又は部分配列）、タンパク質の存在（タンパク質レベルでの根拠、予測されるもの、相同性から推測されるもの）、タンパク質の機能及びアレルゲン性の可能性（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ、８０ｍｅｒウィンドウを移動させながら実施）に関して手作業で格付けした。完全配列、タンパク質レベルの根拠を備えかつアレルゲン性の可能性を欠いているタンパク質を予め選択して該タンパク質の分子機能に関してさらに分析した。既知であるか又は予測されるＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性を有する全てのタンパク質、及び毒性タンパク質を、有力候補の一覧から退けた。

残る候補の中から、本発明者らは適切なタンパク質候補としてバチルス・サブティリス（菌株１６８）由来の「一般ストレスタンパク質１６Ｏ（Ｇ１６Ｏ＿ＢＡＣＳＵ）」を同定した。

ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｏｒｔ．ｏｒｇ）に公開されたタンパク質配列に基づき、本発明者らはＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈの逆翻訳機能を使用して合成遺伝子を設計した。

特異的なタンパク質検出、定量化及び精製を可能にするために２つのエピトープタグ配列（Ｔａｇ５４−Ｐ１５、Ｈｉｓ６−タグ）を一般ストレスタンパク質（ＧＳＰ）コード配列の３’端に付加して、その結果配列番号７に示されるヌクレオチド配列を得た。加えて、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩ制限酵素部位を５’端及び３’端に付加して該遺伝子構築物の発現ベクターへのクローニングを可能にした。

該遺伝子配列をＧＳＰ１０５として指定し、バチルス・サブティリスにおける発現用にコドン使用頻度及びＲＮＡ安定性に関して最適化し、続いてジェンスプリクト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）（米国）による合成が行われた。

実施例２−Ｂ．サブティリスにおける生産
配列番号７に示すようなヌクレオチド配列を有する合成遺伝子ＧＳＰ１０５を、バチルス・サブティリス発現ベクターｐＨＴ４３（モビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）、ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン）に挿入して培地中への組換えタンパク質の分泌を可能とし、そしてプロテアーゼが欠損したＢ．サブティリス菌株ＷＢ８００Ｎ（モビテック）に製造業者の説明書に従って導入した。

形質転換の後、陽性のクローンを抗生物質選択プレート上で選択し；発現ベクターの存在を、ＰＣＲ、プラスミド抽出及びその後のＤＮＡ塩基配列決定によってさらに確認した。グリセロールストック培養液を作り−８０℃で保管した。

組換えＢ．サブティリスＧＳＰ１０５の種培養は、１ＬのＴＢ培地（カール・ロス（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、ドイツ連邦共和国カールスルーエ）にクロラムフェニコール（カール・ロス）及びネオマイシン（カール・ロス）をそれぞれ終濃度５μｇ／ｍｌとして補足したものに、１ｍｌのＢ．サブティリスＧＳＰ１０５ストック溶液を接種することにより準備した。該培養液を、２．５Ｌの「Ｕｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄ（商標）フラスコ」（トムソン・インストルメント・カンパニー（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国カリフォルニア）の中で２８℃及び１６０ｒｐｍで２４時間生育させた。

組換えタンパク質の発現については、クロラムフェニコール及びネオマイシンを補足したＴＢ培地に、種培養液を１：２０（ｖ／ｖ）の比率で接種した。標的タンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを終濃度０．５μＭとなるように添加した。培養液を３７℃及び１６０ｒｐｍで２０時間生育させた。

培養細胞を遠心分離によって除去した後、続いて０．２２μｍの中空糸濾過モジュール（Ｎ０２−Ｅ２０Ｕ−０５−Ｎ、スペクトラム・ラボラトリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）、米国ロサンゼルス）を使用する最大で１．６ｂａｒ（１６０ｋＰａ）の膜間差圧を用いた２．５Ｌ／分の濾過滅菌を行った。処理体積を縮小するために、清澄化した培養上清を、１０ｋＤａの中空糸モジュール（Ｎ０２−Ｅ０１０−０５−Ｎ、スペクトラム・ラボラトリーズ）を使用して最大で１．６ｂａｒ（１６０ｋＰａ）の膜間差圧を用いて２．５Ｌ／分で１０倍に濃縮した。

製造業者の説明書に従いＸＫ ５０／４０カラムに充填してＺｎイオンをチャージした５００ｍｌのキレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア、スウェーデン国ウプサラ）を使用するＩＭＡＣによって、ＧＳＰ１０５を濃縮培養上清から精製した。上清を７６ｃｍ／時でカラムに載せ；その後カラムを、５倍カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳを用いて９２ｃｍ／時として洗浄した。結合したタンパク質を、５ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭイミダゾールを用いて９２ｃｍ／時としてカラムから溶出させた。ＩＭＡＣ溶出フラクションをプールし、バッファーを、１０ｋＤａの中空糸モジュール（Ｓ０２−Ｅｏ１０−０５Ｎ、スペクトラム・ラボラトリーズ）を使用して最大で１．６ｂａｒ（１６０ｋＰａ）の膜間差圧を用いて９００ｍｌ／分で、塩を含まない水に交換した。効率的なバッファー交換を保証するために、試料体積を７回置換した。精製して再緩衝化したタンパク質を−２０℃で保管し、後に凍結乾燥及び噴霧乾燥した。

ＧＳＰ１０５の濃度は競合ＥＬＩＳＡ（ピオトルツコフスキ（Ｐｉｏｔｒｚｋｏｗｓｋｉ）ら、プロスワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）、２０１２年、第７巻、第９号：ｅ４５８０３）によって決定し、タンパク質の完全性及び純度はＳＤＳゲル及び免疫ブロット法（ラッシェ（Ｒａｓｃｈｅ）ら）によって確認した。

実施例３−マウス給餌研究（試験的研究）
研究計画：
６匹の雄の成体のホモ接合体のＰＫＵマウス（Ｐａｈ^{ｅｎｕ２／２}；シェドロフスキー（Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ）ら、ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９３年、第１３４巻、ｐ．１２０５；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｈｄｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／？Ｔｏｐｉｃ＝Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ＆Ｓｅｃｔｉｏｎ＝Ｍｏｕｓｅ＆Ｐａｇｅ＝１）を、それぞれマウス２匹の３群に分けた。同じ群に属する動物にケージを共用させた。これらの群には表４に記されるような治療食を与えた。治療食の間の主な違いは、表５に示されるように、タンパク質成分及びＰｈｅ含有量であった。給餌研究より以前は、ＰＫＵマウスに標準的なマウス用飼料を与えた。給餌研究は２８日間に及び、その間、動物は食物及び水を自由摂取とした。

「Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食」又は「Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５治療食」は、唯一のアミノ酸供給源が０．２％のＰｈｅを補足された組換え食餌療法タンパク質ＧＳＰ１０５である治療食を指す。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食はＰｈｅを全く含まないものではなかった。精製されたＧＳＰ１０５タンパク質画分は、１００ｇの全タンパク質あたり０．４５グラムのＰｈｅに達する恐らくは微量の培地又は二次代謝産物に由来する少量の混入物を含有していた。ＧＳＰ１０５タンパク質自体はＰｈｅを全く含んでいなかった。軽微なＰｈｅ混入はＰＫＵマウスにとって問題を起こすことはなかった。さらに、Ｐｈｅは必須アミノ酸であり、代替の栄養供給源は動物にとって利用可能ではなかったので、結晶状のＰｈｅを、約０．２％のＰｈｅ終濃度となるように、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食に添加した。

「Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食」は、ＰＫＵ患者のための病人用特別食における現行の基準に類似した、唯一のアミノ酸供給源がＰｈｅを含まないが１，５％のＴｙｒを含む遊離アミノ酸混合物である治療食を指す。Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食はＰｈｅを全く含まなかった一方、チロシン含有量は１．５％に高められた。

「標準的なマウス用飼料」では、唯一のタンパク質源はカゼインであった。
第０、１、７、１４、２１及び２８日目において、動物を４時間絶食させた後に該動物の尾静脈から５〜１０μｌの血液を試料採取した。血漿中のＰｈｅ及びチロシンの含有量を、ＭＳ／ＭＳ分析によって測定した。

第０、１、２、４及び７日目に、マウスの体重を計測して健康状態をチェックした。
第１４、２１及び２８日目には、マウスの体重計測のみを行った。第２８日目に、全ての動物をＣＯ_２で安楽死させた。各動物の肝臓、腎臓、脳及び心臓を、さらなる分析のために摘出して液体窒素中で凍結させた。

結果：
体重
標準的なマウス用飼料を与えると、原則として体重が維持された（図１、実線と正方形）。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食を与えられると、ＰＫＵマウスは体重が増加した（図１、点線と円）一方、Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食を与えられたマウスは軽微な体重減少を示した（図１、破線と三角形）。群の大きさが小さく統計分析はできなかったが、観察された傾向は、体重維持及び体重増加のうち少なくともいずれか一方に適したタンパク質成分としてＧＳＰ１０５を支持している。観察された体重増加は、これがカゼインより高い生物学的栄養価を備えた食餌療法タンパク質であるという事実に起因するかもしれない。

血中Ｐｈｅレベルの低減
標準的なマウス用飼料のＰＫＵマウスは、高い血中平均Ｐｈｅレベルを保持した（図２、実線と正方形）。Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食は、血中平均Ｐｈｅレベルの激的な低下をもたらした（１リットル当たり＜３６０マイクロモル、ＰＫＵ治療が目指す生理的範囲）（図２、破線と三角形）。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食の動物の平均血中Ｐｈｅレベルも明白に低下し、２８日後に１リットル当たり＜３６０マイクロモルに近づいた（図２、点線と円）。これらの結果は、開示された組換え食餌療法タンパク質が食餌療法によるＰＫＵ管理に適していることを示している。

遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６を有する未治療のＰＫＵマウスは、同じ背景の野生型マウスで観察される黒色の毛皮とは対照的な茶色の毛皮を有するが、これは色素沈着減少と呼ばれる現象である。高い血中Ｐｈｅレベルは酵素チロシナーゼを阻害し、このことが色素メラニンの合成を妨害する。Ｐｈｅが含まれないか又は少ない治療食を与えられたマウスの低い血中Ｐｈｅレベルは、動物における全身の色素沈着減少の、十分完全にではないが部分的な回復をもたらした（図３）。図３は、２８日間の給餌の後でマウスの毛皮の色素沈着減少に多少の部分的変化が様々に現れた、各治療食群の例示のマウスを示している。各マウスについて背部及び腹部が示されている。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食が与えられたマウスは、腹側にほぼ完全な黒色を示した。黒色及び白色の矢印は、給餌期間の後に到達した、色素沈着減少の最も強い回復を示している。本発明者らは、給餌期間を延長すればＰｈｅが含まれないか又は少ない治療食の場合には茶色から黒色へと毛皮の色が完全に回復するものと推測する。

血漿中のＰｈｅ／Ｔｙｒ比率
Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食がＰＫＵマウスの血漿中の最も低いＰｈｅ／Ｔｙｒ比率をもたらし（図４、破線と三角形）、続いてＰｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食であった（図４、点線と円）。標準的なマウス用飼料マウスのＰＫＵマウスは参照として実線と正方形とで図４に示されている。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食についてのＰｈｅ／Ｔｙｒ比率は、精製された組換え食餌療法タンパク質ＧＳＰ１０５からのＰｈｅ混入物の量を低減すること、及びＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で使用されるような結晶状のチロシンの補足又はチロシン含有デザイナーテールの添加、のうち少なくともいずれか一方により、改善されることもありうる。

実施例４−実施例３のＰＫＵマウスのＰｈｅ及びＴｙｒの脳内濃度の計測
方法：
マウス脳組織の調製
実施例３の動物の脳を使用した。凍結されたマウスの全脳を氷上で融解して、５０ｍｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍ ＫＣｌ、１ｍｍ ＥＤＴＡ、１ｍｍ ジチオトレイトール、０．２ｍｍ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μｍロイペプチン及び１μｍペプスタチンを含有する均質化バッファー（組織１ｍｇあたり１０μｌ）の中で溶解し、そしてキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）のＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを使用して４℃で均質化した。１３，０００ｇ及び４℃で３０分間の遠心分離の後、上清を−８０℃で凍結させておいた。

タンパク質の計測
均質化した組織中のタンパク濃度は、較正物質としてγ−グロブリンを使用して、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）が述べた分光光度法によって測定した。

試料の調製及び誘導体化
試料はフェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）のＥＺ：ｆａａｓｔ（商標）キットの手引書に従って調製したが、ただし次の改変を加えた：アミノ酸の抽出及び誘導体化に先立ち、（５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＣｌ中に）１００μｍｏｌ／ＬのＰｈｅ−ｄ５及び２０μｍｏｌ／ＬのＴｙｒ−ｄ４を含有する各内部標準溶液２０μＬを、４０μＬの試料溶解産物に加えた。キットの試薬を使用して、アミノ酸のアミン部分にギ酸プロピル及びカルボキシル端にプロピル基をそれぞれ付加するクロロギ酸プロピルを用いてアミノ酸を誘導体化する。Ｔｙｒの水酸基もギ酸プロピル基の付加によって誘導体化される。

機器装備
アミノ酸のＲＰ（逆相）−ＨＰＬＣ分離については、２５０×２ｍｍのＣ１８カラム（フェノメネクスのＥＺ：ｆａａｓｔ（商標））を使用した。誘導体化したアミノ酸を、次のプログラム：（ｉ）均一溶媒流の７５％溶媒Ｂを６分間；（ｉｉ）７５％から９５％への溶媒Ｂ（ｖ／ｖ）の直線濃度勾配、９分間；（ｉｉｉ）９５％から１００％への溶媒Ｂの直線濃度勾配、０．１分間；（ｉｖ）均一溶媒流の１００％溶媒Ｂを３分間；（ｖ）１００％から７５％への溶媒Ｂの直線濃度勾配、０．１分間；（ｖｉ）均一溶媒流の７５％溶媒Ｂを２分間、を使用して分離した。溶媒Ａ及びＢはそれぞれ、Ｈ_２Ｏ中に１０ｍｍｏｌ／Ｌのギ酸アンモニウム溶液及びメタノール中に１０ｎｍｏｌ／Ｌのギ酸アンモニウム溶液であった。流量を１５０μＬ／分とし、注入体積を１０μＬとした。パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ２０００ ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳＭＳシステムにパーキンエルマーのシリーズ２００オートサンプラー及びパーキンエルマーのシリーズ２００マイクロポンプ２台を装備したものを、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳＭＳ分析に使用した。アミノ酸は、多重反応モード（ＭＲＭ）陽イオンモードを使用して、次のトランジション：２９４→２０６（Ｐｈｅ）、２９９→２１１（Ｐｈｅ−ｄ５）、３０２→２１４（Ｐｈｅ−ｄ８）、３９６→３０８（Ｔｙｒ）及び４００→３１２（Ｔｙｒ−ｄ４）を伴って得られた。滞留時間は５００ミリ秒であった。質量スペクトルを６〜２０分の時間範囲で得た。

結果：
脳内Ｐｈｅレベルの低減
図５は、野生型（ＷＴ）マウス、及び標準的なマウス用飼料、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食又はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で治療されたＰＫＵマウスの脳内におけるＰｈｅ及びＴｙｒの平均濃度を示す。

野生型（ＷＴ）マウスの脳内のアミノ酸フェニルアラニン及びチロシンの平均濃度はほぼ同じ（タンパク質１ｍｇあたり０．３１ｎｍｏｌのＰｈｅ；タンパク質１ｍｇあたり０．３６ｎｍｏｌのＴｙｒ）（図５）であって、健康なヒトの状態に似ていた。

対して、標準的なマウス用飼料を与えられたＰＫＵマウス（第１群）の脳内の平均Ｐｈｅ濃度は１０倍高く（タンパク質１ｍｇあたりＰｈｅは３．８２ｎｍｏｌ）、タンパク質１ｍｇあたり０．１８ｎｍｏｌの低い平均Ｔｙｒ濃度を伴っており、治療を受けていないＰＫＵ患者の状態に相当していた。

Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食の給餌（第２群）は、標準的なマウス用飼料の給餌と比較して脳内Ｐｈｅ平均濃度の５０％低減をもたらした（タンパク質１ｍｇあたりＰｈｅは１．７８ｎｍｏｌ）、一方で平均Ｔｙｒ濃度を低く保った（タンパク質１ｍｇあたり０．１５ｎｍｏｌ）。

最も低い平均脳内Ｐｈｅレベル及び最も高い平均脳内Ｔｙｒレベルには、第３群のＰｈｅ非含有アミノ酸治療食を用いて到達した（Ｐｈｅはタンパク質１ｍｇあたり１．１６ｎｍｏｌ；タンパク質１ｍｇあたり０．２２ｎｍｏｌ）。

ＷＴマウス並びに治療されたＰＫＵマウス及び未治療のＰＫＵマウスの脳内のＰｈｅ濃度及びＴｙｒ濃度の分析結果は、様々な動物給餌群における対応する血中Ｐｈｅレベル及び血中Ｔｙｒレベル（図２及び４）と一致した。

脳内Ｐｈｅ濃度の最も大幅な減少はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で得られた。大脳Ｐｈｅレベルに対する低Ｐｈｅ治療食の影響は遅発し、血中Ｐｈｅ濃度に対する影響ほど急ではないことを考慮しつつ、本発明者らは、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食を用いた延長した給餌期間内で脳内Ｐｈｅがさらに低減すると仮定する。この仮説は、この群内の血中Ｐｈｅレベルが２８日の給餌期間の後にＰｈｅ非含有アミノ酸治療食を与えられたマウスの血中Ｐｈｅ濃度に近づいたという観察に基づいている。

脳内の平均Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比率
図６は、ＷＴマウス、及び標準的なマウス用飼料、Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食又はＰｈｅ非含有アミノ酸治療食で治療されたＰＫＵマウスの脳内の平均Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比率を示している。

Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食は、ＰＫＵマウスの脳内において最も低いＰｈｅ／Ｔｙｒ比率をもたらし（図６、格子縞のカラム）、続いてはＰｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食であった（図６、斜め縞のカラム）。標準的なマウス用飼料のＰＫＵマウスは黒枠の白色カラムとして図６に示されている。Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比率は標準的な飼料のＰＫＵマウスに関するよりも著しく良好である。Ｐｈｅ非含有ＧＳＰ１０５タンパク質治療食は、精製された組換え食餌療法タンパク質ＧＳＰ１０５由来のＰｈｅ混入物の量を低減すること、及び、Ｐｈｅ非含有アミノ酸治療食に使用されるような結晶状のチロシンの補足又はチロシン含有デザイナーテールの添加、のうち少なくともいずれか一方により、改善されることも考えられる。

Claims (15)

1. 配列番号２と少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含む組換え食餌療法タンパク質であって、前記タンパク質はフェニルアラニンを含んでいない、組換え食餌療法タンパク質。
2. 前記ポリペプチド配列は、配列番号２と少なくとも９５％、好ましくは９７％、より好ましくは９８％同一である、請求項１に記載の組換え食餌療法タンパク質。
3. タンパク質は１以上の追加のタンパク質配列をさらに含み、追加のタンパク質配列は精製タグ又はラベルである、請求項１又は２に記載の組換え食餌療法タンパク質。
4. 追加のタンパク質配列は、アミノ酸配列である配列番号３を含むポリペプチドタグである、請求項３に記載の組換え食餌療法タンパク質。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え食餌療法タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含む組換え微生物。
7. 微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ジゴサッカロマイベス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｖｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で構成されている群から選択される、請求項６に記載の組換え微生物。
8. 前記微生物はバチルス属細菌又はシュードモナス属細菌である、請求項７に記載の組換え微生物。
9. 前記微生物はバチルス・サブティリス又はシュードモナス・フルオレッセンスである、請求項８に記載の組換え微生物。
10. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え食餌療法タンパク質を生産する方法であって、前記方法は、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組換え微生物を、組換え微生物による食餌療法タンパク質の生産に適した条件下で培養することを含む、方法。
11. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え食餌療法タンパク質及び任意選択でさらなる添加剤を含む食餌療法組成物。
12. タンパク質１００ｇあたり０．４５ｇ以下のフェニルアラニンしか含んでいない請求項１〜４のいずれか１項に記載の食餌療法タンパク質、又は１００ｇの総タンパク質あたり０．１ｇ以下のフェニルアラニンしか含んでいない請求項１１に記載の食餌療法組成物。
13. 医薬及び特殊な医療目的のための食品のうち少なくともいずれか一方として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食餌療法タンパク質又は請求項１１に記載の食餌療法タンパク質組成物。
14. 体内へのフェニルアラニンの蓄積を特徴とする障害の治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食餌療法タンパク質又は請求項１１に記載の食餌療法タンパク質組成物。
15. 前記障害は高フェニルアラニン血症、好ましくはフェニルケトン尿症である、請求項１４に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の食餌療法タンパク質又は請求項１１に記載の食餌療法タンパク質組成物。

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