CN109661401B - 用于治疗pku的无苯丙氨酸的蛋白质 - Google Patents

用于治疗pku的无苯丙氨酸的蛋白质 Download PDF

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Abstract

提供了一种不含苯丙氨酸的重组膳食蛋白质，它是一种具有高生物学价值的膳食蛋白质。还提供了编码所述膳食蛋白质的载体、表达所述蛋白质的微生物、所述蛋白质的生产方法以及包含所述蛋白质的膳食组合物，在一个实施方案中，所述膳食组合物在体内积聚苯丙氨酸的患者中被用作特殊医学目的的药物和/或食物。

Description

用于治疗PKU的无苯丙氨酸的蛋白质
技术领域
本发明涉及重组膳食蛋白质或其膳食充足部分，其中所述蛋白质不包含苯丙氨酸，该蛋白质用于患有苯丙酮尿症的患者的膳食。
背景技术
苯丙酮尿症(PKU)(OMIM 261600，ORPHA716)是一种遗传性代谢疾病，在欧洲的发病率为1：10,000。在大多数情况下，这是由肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)的功能缺失或受损引起的氨基酸代谢紊乱。PAH的缺乏反过来导致脑和血浆中过量的苯丙氨酸(Phe)。PAH的缺乏最终表现为缺乏酪氨酸，酪氨酸是神经递质的前体。与涉及蝶呤代谢的酶的突变一起，PKU与高苯丙氨酸血症(HPA)相关。
由于血液Phe水平升高，大多数国家通常会在出生后的新生儿筛查期间诊断出该疾病。如果在生命早期未被发现和未经治疗，PKU会导致婴儿神经系统不可逆转的损害、严重的智力迟钝和大脑发育不良。未经治疗的患者除智力障碍外的其他特征包括神经系统并发症、神经心理受损以及执行功能缺陷。据报道，如果不及时治疗，婴儿在出生后的第一年就会损失智商。根据治疗开始时的年龄，不同年龄期间的血液Phe水平和膳食治疗PKU的依从性不可避免地会伴随着至少一些智商的丧失。一旦检测到，通过向婴儿和之后的儿童提供Phe限制膳食来治疗该病症。在成人中，典型PKU患者常规服用的蛋白质补充剂是无Phe的，假设这样的成年人将通过剩余膳食接受足够量的Phe，在严格的方案下控制，使得整体膳食是低Phe膳食。特别是，建议患有这种疾病的孕妇遵守严格的Phe限制膳食方案，以避免胎儿发育受损和先天性畸形(母源性PKU综合征)的风险。
近年来，已经表明，从Phe过量的状态表现出来的病理症状(统称为高苯丙氨酸血症(HPA))，可以被分成多种离散性疾病，根据血浆Phe浓度和对PAH辅因子的反应性进行诊断。在初始水平，HPA可被分为由于生物喋呤代谢中的酶缺陷导致的辅因子6R-L-赤式-5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH4)缺乏引起的HPA(恶性PKU)，和由PAH缺乏引起的HPA。后者被进一步细分，产生至少四种亚类别，其取决于不存在膳食或其他治疗干预下的Phe血浆浓度(本发明称为“无限制血浆Phe浓度”)和对辅因子BH4的反应性。
正常血浆Phe稳态受到严格控制，导致血浆Phe浓度为60μmol/L±15μmol/L。经典型PKU(ORPHA79254)是最严重的PKU形式，它是由PAH中的无效或严重突变引起的，当未经治疗时，其导致不受限制的血浆Phe浓度大于1200μmol/L。具有经典型(或严重)PKU的个体必须采用基于极低Phe膳食的严格膳食方案进行治疗，以将其Phe浓度降低至安全范围。更温和形式的PKU也已被表征。较不严重形式的PKU是表现为无限制血浆Phe浓度为10-20mg/dL(600-1200μmol/L)的PKU，通常称为“轻度PKU”(ORPHA79253)。这种中等程度形式的PKU通过使用适度的膳食限制来管理，例如：相对低蛋白质的膳食，不需要补充无Phe的氨基酸配方。轻度HPA，也称为良性或非PKU-HPA(ORPHA79651)，其特征在于无限制血浆Phe浓度在180-600μmol/L之间。患有非PKU-HPA的个体通常不被治疗，因为他们被认为具有在“安全”范围内的血浆Phe水平。在膳食PKU治疗中，目标范围是<360μmol/L，高达600μmol/L的范围也被认为是可接受的。最后，BH4反应性PKU/HPA(ORPHA293284)的特征是无限制血浆Phe浓度>360μmol/L，其在口服四氢生物蝶呤(BH4；沙丙蝶呤(sapropterin)二盐酸盐)后可以显著降低或标准化。这种轻度至中度形式的PKU/HPA是由PAH基因中的特定突变引起的，其导致突变蛋白具有显著的残留酶活性。补充BH4作为PKU/HPA管理的一部分使一些患者能够放松他们的Phe限制性膳食方案。应理解，本发明所用的术语“PKU治疗”或“PKU患者”意指用以下形式的HPA的治疗和患者，例如经典PKU、轻度PKU、轻度HPA和BH4反应性PKU/HPA。
在20世纪50年代早期的膳食PKU治疗开始时，通过蛋白质水解产物向患者提供必需氨基酸(Phe除外)。因此，具有相对高水平的必需氨基酸的蛋白质，例如酪蛋白(哺乳动物乳中常见的蛋白质，占牛奶中蛋白质的80％)或牛血清白蛋白被水解，然后通过肽的过滤步骤去除尽可能多的Phe污染，和/或通过在包含水解蛋白质的混合物中结合游离氨基酸。今天，通常为患者提供包含必需氨基酸(Phe除外)的游离结晶氨基酸的平衡混合物。这样的氨基酸混合物会具有苦味，导致沙质口感并且对于一些用途来说会被认为是不合适的或不合需要的。结果，这种混合物有时包含调味剂以掩盖游离氨基酸和/或水解蛋白质的味道。在一些情况下，发现其中一部分氨基酸含量由多肽或蛋白质提供的组合物比其中高比例的总氨基酸由游离氨基酸和/或某些水解蛋白质提供的组合物具有更好的味道。然而，这种组合物的可用性受到限制，因为营养制剂传统上由分离自天然食品的蛋白质制成，例如从牛奶中分离的乳清，或从大豆中分离的大豆蛋白。这些蛋白质的氨基酸谱不一定满足哺乳动物的氨基酸要求。此外，商品蛋白质通常由蛋白质和/或蛋白质水解产物的混合物组成，其蛋白质组成可以变化，因此导致其营养价值的不可预测性。此外，具有高生物学价值的此类蛋白质的有限数量的来源意味着只有某些氨基酸组合可被大规模获得以用于以蛋白质形式摄取。
糖巨肽(GMP)是在制作奶酪期间产生的天然乳清蛋白，已用于治疗PKU。纯GMP缺乏芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)和色氨酸(Trp；W)以及精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)和半胱氨酸(Cys；C)但富含大的中性氨基酸异亮氨酸(Ile；I)和苏氨酸(Thr；T)。作为市售的膳食蛋白质，它含有最少量的Phe。然而，用作PKU膳食管理的医疗食品中的单一蛋白质来源，其需要补充Trp、Arg、Leu、His和Tyr，以满足日常所需摄入这些必需和半必需氨基酸的需要并提供足够低的Phe/Tyr比(<1)。Tyr成为PKU患者的必需品，根据神经递质合成的可用性，Tyr改善患者的情绪行为。
本发明通过提供包含所有必需氨基酸(除了Phe)的膳食蛋白质解决了上述问题，该膳食蛋白质具有改善的性质，例如高生物价值或中性味道。此外，膳食蛋白质可以作为营养产品提供，其可以形成患者正常膳食的一部分，例如烘焙食品、谷物或压制棒。或者，膳食蛋白质可以适于患者制备营养产品的形式提供，例如预先制备的烘焙混合物或蔬菜汤混合物。
因此，本发明旨在改善PKU患者的生活质量，因为所有PKU患者必须坚持低Phe的特殊膳食以实现最佳的脑发育。“终身膳食”已成为大多数专家推荐的标准。膳食需要严格限制或消除Phe含量高的食物，如肉类、鸡肉、鱼类、鸡蛋、坚果、奶酪、豆类、牛奶和其他乳制品。必须监测淀粉类食物，如土豆、面包、意大利面和玉米。还必须避免存在于许多膳食和软饮料中的甜味剂阿斯巴甜，因为阿斯巴甜由两种氨基酸组成：苯丙氨酸和天冬氨酸。
婴儿仍然可以母乳喂养以提供母乳的所有益处，但也必须监测量，并且需要补充缺少的营养素。在这些患者中使用补充婴儿配方食品来提供低苯丙氨酸膳食中缺乏的氨基酸和其他必需营养素。随着孩子的成长，这些可以替换为片剂、配方和特殊配方的食物。由于Phe是许多蛋白质合成所必需的，因此是适当生长所需的，但必须严格控制PKU患者的Phe水平。此外，通常衍生自苯丙氨酸的酪氨酸必须在PKU患者的膳食中补充。
口服四氢生物蝶呤(或BH4)(用于苯丙氨酸氧化的辅因子)可降低一些患者的血液Phe水平。化合物沙丙蝶呤二盐酸盐的片剂制剂是四氢生物蝶呤的一种形式，可商购获得。是第一种可以帮助BH4反应性PKU(ORPHA293284，取决于临床医生确定的临床设置，约占PKU人群的25-50％)患者将Phe水平降低至推荐范围的药物。与营养师密切合作，一些对有反应的PKU患者可以增加他们可以吃的天然蛋白质的量。然而，患者仍需要Phe限制的膳食。
理论上，可以在实验室环境中设计和生产包含所需氨基酸混合物的合成多肽序列。然而，这种方法可引起各种担忧，因此并不总是适用。首先，技术人员意识到获得这种合成序列的高水平制备可以是非常具有挑战性的。其次，即使合成了这种合成蛋白质，其在营养产品中的适用性也是不确定的。例如，这种非天然存在的多肽可以是过敏原或毒素。因此，天然蛋白质是优选的。
在美国专利No.6,495,344中提出了替代天然蛋白质中的Phe残基，然后重组生产这些蛋白质，该专利涉及卵清蛋白和酪蛋白，分别是鸡蛋和牛奶中的两种高丰度蛋白质；以及美国专利No.6,004,930公开了γ-玉米蛋白，一种存在于玉米中的蛋白质。然而，替代天然蛋白质中的Phe并不总是可能的，并且可改变蛋白质结构，使得蛋白质不再被表达。
WO 2013/148332涉及天然存在的营养多肽序列，其由不含Phe或低Phe的氨基酸组合所组成，其中一些是分泌的。WO2014/081884涉及这种分离的营养多肽的制剂，例如用于营养目的。WO2016/046234涉及制备重组无Phe或低Phe蛋白的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有高生物学价值的重组无Phe膳食蛋白质，用于在体内积聚苯丙氨酸的患者的膳食组合物中，以提供营养充足平衡的所有其它必需氨基酸。
一方面，本发明涉及重组膳食蛋白，其包含与SEQ ID NO 2具有至少70％同一性的多肽序列。在一个实施方案中，所述重组膳食蛋白质包含与SEQ ID NO 2具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％同一性的多肽序列。在还更优选实施方案中，重组膳食蛋白质包含与SEQ ID NO 2具有100％同一性的多肽序列。重组膳食蛋白质可为SEQ ID NO 2序列的营养充足部分(dietarilysufficient portion)，其优选与SEQ ID NO 2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，且优选程度逐渐增加。
在另一实施方案中，所述重组膳食蛋白质或其营养充足部分包含一种或多种其它蛋白序列，其为纯化标签或标记。在一个优选实施方案中，所述其它蛋白序列包括SEQ IDNO 3。
在另一方面，本发明涉及包含编码重组膳食蛋白质或其营养充足部分的核酸序列的载体。
在另一方面，本发明涉及包含编码重组膳食蛋白质或其营养充足部分的载体的重组微生物。在一个实施方案中，所述微生物选自埃希杆菌(Escherichia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄单胞杆菌(Xanthomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、酵母属(Saccharomyces)、棒状杆菌(Corynebacterium)、链霉菌(Streptomyces)、沙门氏菌(Salmonella)、曲霉(Aspergillus)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、分枝杆菌(Mycobacterium)、放线菌(Actinomycetes)、柄杆菌(Caulobacter)、毕赤酵母属(Pichia)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、游海假交替单细胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、真氧产碱杆菌(Ralstom'a eulropha)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、Arxula adeninivorans、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyves bailii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。在一个优选实施方案中，所述微生物选自芽孢杆菌或假单胞菌。在更优选实施方案中，所述微生物为枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
在另一方面，本发明涉及制备膳食蛋白质或其营养充足部分的方法，该方法包括将重组微生物在合适的生产条件下培养，该重组微生物携带编码重组蛋白质或其营养充足部分的载体。该重组膳食蛋白质或其营养充足部分可被纯化。在一个实施方案中，所述纯化在纯化标签辅助下进行。优选该纯化重组蛋白质或其营养充足部分包含不超过1g Phe/100g蛋白质，优选不超过0.45g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.35g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.25g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.15gPhe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.13g Phe污染物/100g蛋白质且最优选不超过0.10g Phe污染物/100g蛋白质。
在另一方面，本发明涉及包含膳食蛋白质或其营养充足部分的膳食组合物。在一个实施方案中该膳食组合物由膳食蛋白质或其营养充足部分组成。在另一实施方案中膳食蛋白质或其营养充足部分与其它赋形剂组合。在一个优选实施方案中，所述膳食组合物包含不超过0.2g Phe/100g蛋白质，优选不超过0.1g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.05g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.04g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.03g Phe污染物/100g蛋白质且最优选不超过0.02g Phe污染物/100g蛋白质。
膳食蛋白质或其营养充足部分或膳食组合物被用作特殊医学目的的食物；参考欧盟指令2009/39/EG和1999/21/EG(“Lebensmittel für besondere medizinische Zwecke”)以及欧盟法规EU 609/2013(“Food for specialgroups”；“Lebensmittel fürund Kleinkinder，Lebensmittel für besonderemedizinische Zwecke und Tagesrationen für gewichtskontrollierende”)，其将于2016年7月20日生效。特别是，膳食蛋白质或其营养充足部分或所述膳食组合物可用于治疗以体内苯丙氨酸积聚为特征的疾病，例如高苯丙氨酸血症(HPA)，优选苯丙酮尿症(PKU)。因此，在另一方面，膳食蛋白质或其营养充足部分或所述膳食组合物被用作药物。在一个优选的实施方案中，所述膳食蛋白质或其营养充足部分用于治疗以体内苯丙氨酸积聚为特征的疾病。在更优选的实施方案中，该疾病是HPA，更优选PKU。
附图说明
图1显示用标准小鼠膳食(第1组，未治疗)、无Phe GSP105蛋白膳食(第2组)或无Phe氨基酸膳食(第3组，标准治疗)经28天喂食治疗的PKU小鼠的体重进展。x轴标记喂食期的天数，y轴标记动物的重量(克)。
图2描绘了在喂食28天期间三种不同小鼠组的血浆中Phe的平均浓度。x轴标记喂食期的天数，y轴标记每升血浆中微摩尔的L-Phe水平。
图3显示了每种膳食组差异表达的示例性小鼠，其在喂食28天后在小鼠皮毛色素减退中或多或少具有部分改变。
图4显示了喂食28天期间三种不同小鼠组血液中苯丙氨酸与酪氨酸的比例。x轴标记喂食期的天数，y轴标记血液中的苯丙氨酸/酪氨酸。
图5显示了用标准小鼠膳食、无Phe GSP105蛋白质膳食或无Phe氨基酸膳食治疗的野生型(WT)小鼠和PKU小鼠的脑中平均Phe和Tyr浓度。
图6显示用标准小鼠膳食、无Phe GSP105蛋白膳食或无Phe氨基酸膳食治疗的WT小鼠和PKU小鼠的脑中平均Phe/Tyr比率。
发明详述
如本发明所用，“重组”是指生物分子，例如基因或蛋白质，其：(1)已从其天然存在的环境中移出；(2)与天然存在基因中的多核苷酸的全部或部分不相关；(3)可操作地连接到在自然界不与之连接的多核苷酸；和/或(4)在自然界中不存在。术语“重组”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物，或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这些核酸编码的蛋白质和/或mRNA。因此，例如，如果由细胞中存在的重组基因合成的mRNA合成，则由微生物合成的蛋白质是重组的。
如本发明所用，术语“膳食蛋白质”是指适合人摄取的蛋白质。提供所有必需氨基酸的膳食蛋白质被称为具有高生物学价值的蛋白质。提供所有其他必需氨基酸的无Phe蛋白质也被认为是具有高生物学价值的蛋白质。酪蛋白(一种常见于哺乳动物乳中的蛋白质，占牛奶中蛋白质的80％)和乳清(奶经过凝结和过滤后仍然存在的液体中的蛋白质)是具有高生物学价值的膳食蛋白质的主要来源。除Phe之外，本发明的膳食蛋白质包含所有必需氨基酸。术语“其营养充足部分”是指膳食蛋白质的一部分。膳食蛋白质的营养充足部分具有比本发明的膳食蛋白质更少的氨基酸，但除了Phe之外，仍然包含所有必需氨基酸。
术语“营养充足”，如本发明所述，是指除了苯丙氨酸之外包含所有必需氨基酸的多肽序列且为具有高生物学价值的蛋白质。
术语“必需氨基酸”，如本发明所述，是指组氨酸(His、H)、精氨酸(Arg、R)、异亮氨酸(Ile、I)、亮氨酸(Leu、L)、赖氨酸(Lys、K)、蛋氨酸(Met、M)、苯丙氨酸(Phe、F)、苏氨酸(Thr、T)、色氨酸(Trp、W)和缬氨酸(Val、V)，其是健康和生长所需的氨基酸，但不能被人体合成且必须从食物获得。
术语“重组微生物”，如本发明所述，是指被修饰以携带重组基因拷贝的微生物。
如本发明所述，“膳食组合物”为适合人消耗的组合物。膳食组合物可主要包含蛋白质。本发明的膳食组合物包含本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分且总苯丙氨酸含量低。
如本发明所用，术语“天然存在的蛋白质”是指由天然宿主中存在的未被人为改变的序列产生的蛋白质。因此，编码蛋白质的DNA序列和蛋白质本身的氨基酸序列都没有从天然宿主中发现的序列改变。
出于本发明的目的，“营养产品”是适合人类消费的产品，其包含本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物，并含有所需量的必需氨基酸。患者每天所需的必需氨基酸的理想量取决于患者的年龄和患者的膳食，即蛋白质和/或Phe限制的水平。每日所需量可由医生和/或营养学家通过本领域已知的方法确定。典型的量是例如基于：成人每天每kg体重0.8克蛋白质或儿童每天每kg体重1.2克蛋白质。营养产品本身，即在加入本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物之前，不含蛋白质或含低蛋白质组分。
如本发明所用，“纯化标签”是具有结合配偶体(binding partner)的任何多肽，其可用于检测、分离和/或纯化与纯化标签融合的感兴趣的第二蛋白质或多肽序列。几个实例是本领域熟知的并且包括His-6标签、FLAG表位、c-myc表位、Strep-TAGII、生物素标签、谷胱甘肽5-转移酶(GST)、甲壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金属亲和力标签或标签54
(Rasche等人，The Open Biotechnology Journal 2011，5:1-6)或其修饰物。
本发明一方面涉及具有高生物学价值的重组无Phe膳食蛋白。实施例1描述了用于产生本发明的重组无Phe膳食蛋白质中的鉴定这种膳食蛋白质的方法，该重组无Phe膳食蛋白质可用于体内积累苯丙氨酸的患者的膳食管理。将来自枯草芽孢杆菌(菌株168)的“普通应激蛋白(general stress protein)16O(G16O_BACSU)”(SEQ ID NO 1)(蛋白质数据库UniprotKb登录号P80872)鉴定为合适的蛋白质候选物。通过在cDNA水平上用编码色氨酸的碱基三联体替换编码Phe的碱基三联体，用结构上相似的氨基酸色氨酸(Trp)代替单个Phe残基。这种替代导致膳食蛋白质不含Phe但含必需氨基酸Trp，从而提供含有除Phe之外的所有必需氨基酸的膳食蛋白质。因此取代因两个原因是有利的：首先提供无Phe的膳食蛋白质，第二，所有其他必需氨基酸都存在于膳食蛋白质中，不需要补充。这是特别有利的，因为Trp味道非常苦，并且向膳食组合物中添加游离Trp会导致苦味。此外，令人惊讶地发现，引入苦味氨基酸Trp不会导致苦味的膳食蛋白质。因此，在一个实施方案中，具有高生物学价值且不含Phe并含有所有必需氨基酸的重组膳食蛋白质具有与SEQ ID NO 2相同的多肽序列。这种膳食蛋白质称为GSP105。在另一个实施方案中，重组膳食蛋白质包含与SEQ ID NO2具有至少70％同一性的多肽序列。更优选地，重组膳食蛋白质包含与SEQ IDNO 2具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％同一性、更优选至少99％同一性且最优选至少100％同一性的多肽序列。应理解序列同一性相对于序列SEQ ID NO 2在其整个长度上确定。例如，包含SEQ ID NO 2的序列并且具有其他氨基酸的膳食蛋白质C-和/或N-末端的蛋白质被认为与序列SEQ ID NO 2具有100％的序列同一性，因为C-和/或N-末端氨基酸可以在序列比较时忽略。
重组膳食蛋白质可包含SEQ ID NO 2序列的营养充足部分，优选与SEQID NO 2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，且优选程度逐渐增加。
重组膳食蛋白质或其营养充足部分可包含一种或多种另外的蛋白质序列，其是纯化标签或标记。可任选地通过切割除去所述另外的蛋白质序列。如果膳食蛋白质或其营养充足部分包含多于一种另外的蛋白质序列，则可以通过切割除去每一种、任何组合或全部。应理解，另外的蛋白质序列不引入Phe残基，或者在所述另外的蛋白质序列包含Phe残基的情况下，通过切割除去这种另外的蛋白质序列。在一个实施方案中，另外的蛋白质序列包含SEQ ID NO 3。在优选的实施方案中，另外的蛋白质序列包含修饰的TAG54(Rascheet等)(其中Phe残基被另一种氨基酸，优选酪氨酸或丙氨酸残基代替)。因此，在一个特别优选的实施方案中，另外的蛋白质序列包括SEQ ID NO 4，即其中Phe残基被丙氨酸残基代替的修饰的Tag54。在另一个特别优选的实施方案中，另外的蛋白质序列包括修饰的Tag54，其中Phe残基被酪氨酸残基替代(SEQ ID NO 5)。这种替代具有以下优点：Tyr含量增加并且膳食蛋白质的Phe/Tyr比率降低。在进一步优选的实施方案中，重组膳食蛋白质或其营养充足部分包含另外的C末端His-6标签。在一个特别优选的实施方案中，重组膳食蛋白质包含与SEQ IDNO 2相同的多肽序列，并包含C末端His-6标签和SEQ ID NO 4作为另外的蛋白质序列，产生具有SEQ ID NO 6(＝GSP105-6His-Tag54-P15)中公开的序列的标记的重组膳食蛋白质。标记的重组膳食蛋白(SEQ ID NO 6)与枯草芽孢杆菌的普通应激蛋白16O(GSP16O)相比的特征列于表1中。
表1：天然存在的蛋白质GSP16O和在枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌中产生的标记的重组膳食蛋白质GSP105(SEQ ID NO 6)的比较
His-6标签和/或修饰的Tag54可用于纯化重组膳食蛋白质或其营养充足部分。令人惊讶地发现Tag54-P15tag改善了枯草芽孢杆菌中蛋白质的表达。此外，修饰的Tag54的另外的蛋白质序列有利地为膳食蛋白质的总氨基酸组成提供氨基酸，从而改善重组膳食蛋白质的总氨基酸组成。此外，修饰的Tag54可以用作融合蛋白的检测表位。
本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分可以进一步包含设计者尾巴(designer tail)。“设计者尾巴”是指可以添加到蛋白质的C端或N端的短氨基酸链。设计者尾巴含有1至5个氨基酸。在一个实施方案中，膳食蛋白质包含与SEQ ID NO 2具有至少70％同一性的多肽序列和设计者尾巴。任选地，膳食蛋白质可以进一步包含一种或多种另外的蛋白质序列，例如His-6标签和/或修饰的Tag54。在优选实施方案中，设计者尾部由酪氨酸制成。在特别优选的实施方案中，设计者尾巴具有一个酪氨酸，更优选两个酪氨酸，最优选三个酪氨酸。因此，在一个实施方案中，膳食蛋白质或其营养充足部分包含与SEQ ID NO 2具有至少70％同一性的多肽序列、由包含至少一个酪氨酸残基的酪氨酸构成的设计者尾巴、His-6标签和修饰的Tag54。
在另一方面，本发明涉及包含编码本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的核酸序列的载体。在一个实施方案中，所述载体为质粒。在一个优选实施方案中，所述质粒为IPTG-可诱导的表达质粒pHT43(MoBiTec)或IPTG-可诱导的表达质粒pDAB107209(Dow；US2008/0269070A1)。
编码本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的核酸序列可以由本领域技术人员使用已知方法如反向翻译容易地确定。反向翻译是一种方法，其中蛋白质序列被用作输入，并且在使用密码子使用表后，获得代表最有可能的非简并(non-degenerate)编码序列的DNA序列。可以通过使用已知的优化算法来优化获得的核酸序列。这使得技术人员能够获得针对在特定宿主中表达而优化的核酸序列。本领域技术人员还可以通过提供所需的氨基酸序列和其中要产生该蛋白质的宿主有机体来商业获得核酸。用于产生具有枯草芽孢杆菌中SEQ ID NO 6的多肽序列的重组膳食蛋白的示例性核酸序列示于SEQ ID NO 7中。然而，应理解其他核酸序列，例如作为针对特定宿主细胞优化的密码子的核酸序列，可以偏离示例性序列，同时仍然产生本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分。即使对于相同的生物体，核酸序列也可以根据商业生产者和所使用的算法而变化。
在另一方面，本发明涉及重组微生物，其包含含有编码本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的核酸序列的载体。因此，本发明涉及表达本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的重组微生物。在一个实施方案中，所述微生物选自埃希杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌、黄单胞杆菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母属、棒状杆菌、链霉菌、沙门氏菌、曲霉、葡糖杆菌、分枝杆菌、放线菌、柄杆菌、毕赤酵母属、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、肉毒梭状芽孢杆菌、肝素黄杆菌、乳酸乳球菌、扭脱甲基杆菌、游海假交替单细胞菌、真氧产碱杆菌、粗糙脉孢菌、Arxula adeninivorans、多形汉森酵母、乳酸克鲁维斯酵母、拜耳接合酵母、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌。在一个优选实施方案中，所述微生物选自芽孢杆菌或假单胞菌。在更优选实施方案中，所述微生物为枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
另一方面，本发明涉及制备本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的方法，该方法包括在适于重组微生物产生膳食蛋白质或其营养充足部分的条件下培养本发明的重组微生物。在一个实施方案中，该方法包括培养重组微生物，提取重组膳食蛋白质或其营养充足部分，纯化重组膳食蛋白质或其营养充足部分和干燥所得蛋白质。在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：培养重组微生物例如芽孢杆菌，收获上清液，任选地浓缩上清液，纯化重组膳食蛋白质或其营养充足部分，将缓冲液更换为水并将所得蛋白质冻干和/或喷雾干燥和/或圆筒干燥和/或挤出干燥。所述重组微生物的培养优选包括使用起始物和主要培养物。上清液的收获和浓缩优选包括渗滤，更优选使用具有不同孔径的中空纤维的交叉流过滤。浓缩后的上清液优选被浓缩至少10倍。重组膳食蛋白质或其营养充足部分的纯化可包括固定化金属离子亲和层析(IMAC)，优选使用锌离子和螯合琼脂糖。任选地，可以在将缓冲液更换为水后浓缩纯化的蛋白质。因此，在一个优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：使用起始物和主要培养物培养重组微生物，收集上清液，将上清液浓缩至少10倍，纯化重组膳食蛋白质或其营养充足部分，将缓冲液更换为水，任选浓缩纯化的蛋白质，并冻干和/或喷雾干燥所得蛋白质。
制备本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分的方法导致高蛋白质产量，如在枯草芽孢杆菌中至少100-500mg/L或在荧光假单胞菌中至少2.4g/L。纯化的重组蛋白质或其营养充足部分包含不超过1g Phe/100g蛋白质，优选不超过0.45g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.35g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.25g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.15g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.13g Phe污染物/100g蛋白质且最优选不超过0.10g Phe污染物/100g蛋白质。
纯化的冻干和/或喷雾干燥和/或圆筒干燥和/或挤出干燥的蛋白质可在冷冻状态如-20℃、在冷却条件下如4℃、或在室温储存。在一个优选实施方案中，所述纯化的冻干和/或喷雾干燥和/或圆筒干燥和/或挤出干燥的蛋白质储存在-20℃。
在另一方面，本发明涉及膳食组合物，其包含本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分，其单独或任选与其它赋形剂一起。在一个实施方案中，本发明的膳食组合物补充有选自以下的其他赋形剂：必需的维生素，矿物质和微量元素，维生素类物质(例如但不限于牛磺酸、肌醇、胆碱和肉碱)、脂类(例如但不限于脂肪、油、脂肪酸、二十二碳六烯酸)(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、甘油三酯、磷脂、卵磷脂、脂肪酸酯或胆固醇)、碳水化合物(例如但不限于单糖/二糖/寡糖/多糖、淀粉、葡聚糖、果聚糖或戊聚糖)、核苷酸、蛋白质、肽、氨基酸(如酪氨酸)和其反应产物、酸、酸度调节剂、抗结块剂、抗发泡剂、抗氧化剂、结合剂、缓冲剂(例如但不限于柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙、碳酸氢钙)、填充剂、乳化剂、酶、固化剂、调味剂、增味剂、发泡剂、胶凝剂(例如但不限于瓜尔胶、黄原胶、藻酸盐、角叉菜胶、果胶)、上光剂、润湿剂、改性淀粉、防腐剂、推进气体、膨松剂、螯合剂、稳定剂、增稠剂(例如但不限于淀粉、纤维素)、增甜剂、食用色素、草药、调味料、植物提取物和植物化学物质。在一个优选实施方案中该膳食组合物可补充有酪氨酸。
在一个实施方案中该膳食组合物制备为粉末、颗粒、片剂、胶囊、凝聚体、冷冻组合物、丸剂、溶液、大分子溶液、水胶体、复合分散体系、悬浮液、乳剂、液体、泡沫、凝胶、溶胶、固体溶胶、固体泡沫、晶体、无定形固体、丸、挤出物或糊剂。该膳食组合物可在存在或不存在冷却的情况下以干燥、冻干、喷雾干燥、圆筒干燥或挤出干燥的形式储存。
在一个优选实施方案中，所述膳食组合物包含不超过0.2g Phe/100g蛋白质，优选不超过0.1g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.05g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.04g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.03g Phe污染物/100g蛋白质且最优选不超过0.02g Phe污染物/100g蛋白质。
本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物可以营养产品使用。营养产品可选自，但不限于，饮料、汤、压制棒、薄脆饼、华夫饼、布丁、凝胶状食品、肉类食品如包括非动物纤维的肉类似物、香肠类似物、烘焙食品、调味料、沙拉酱、谷物、薄片、烘焙混合物如松饼混合物、华夫饼混合物或薄饼混合物、谷物粗粉(meals)、饼干、薄脆饼干、奶油、慕斯、果馅饼、奶油冻、蜜饯、冰淇淋、雪葩、冻糕、蘸酱、涂抹酱、糖浆、果泥、糊状、果冻、黄油、果酱、奶酪类似物、奶油干酪类似物、酸奶类似物、牛奶类似物、薯片和挤压固体。可以生产和购买包含本发明的膳食组合物的营养产品，或由患者单独制备。例如，可以通过将膳食组合物添加到水、果汁、米浆或蔬菜汤中来制备饮料或汤。有利地，重组膳食蛋白质或其营养充足部分耐受热处理而不改变其营养价值、稠度或风味。因此，当制备营养产品，例如，烘焙食品、谷物、汤或压制棒时，该重组膳食蛋白质或其营养充足部分可以加热、烘烤、煮沸、油炸、深炸、炒、炖、焖、烤、蒸、煮、炖、炙烤、低温慢煮、均质、灭菌、廷德尔氏灭菌、高压-低温处理、真空烹饪、冷冻加工、巴氏消毒或挤压。
在一个实施方案中，所述营养产品包含非常少量的Phe。在一个优选实施方案中，所述营养产品不包含Phe。添加至营养产品的本发明的膳食组合物中Phe污染物的量可根据营养产品而改变。在一个实施方案中，所述营养产品包含不超过0.2g Phe/100g蛋白质，优选不超过0.1g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.05g Phe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.04gPhe污染物/100g蛋白质，更优选不超过0.03g Phe污染物/100g蛋白质且最优选不超过0.02g Phe污染物/100g蛋白质。
在另一方面，本发明涉及本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物以用作药物和/或用于特殊医疗目的的食物。重组膳食蛋白质或其营养充足部分或膳食组合物可为粉末、颗粒、片剂、丸剂、悬浮液、乳剂、液体、丸、挤出物或糊剂的形式。施用可为每天三至五次。剂量可为例如至少5、10、15、20、30、40或50g膳食蛋白质。可以与膳食一起给药。给药可以是口服或肠内给药。优选口服给药。该药物可以给予儿童、青少年和成人。在优选的实施方案中，本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物用于治疗特征在于体内积聚苯丙氨酸的疾病。在更优选的实施方案中，该疾病是高苯丙氨酸血症或苯丙酮尿症。
在另一优选的实施方案中，所述重组膳食蛋白质或其营养充足部分或膳食组合物与用于控制PKU或HPA的药物组合使用，如BH4或其类似物。
本发明的重组膳食蛋白质用于管理苯丙酮尿症(PKU)的适用性示于实施例3中。实施例3显示了一项先导研究的结果，其中PKU小鼠用以下治疗：其中唯一氨基酸源是不含Phe但含有1.5％Tyr的游离氨基酸混合物的膳食(Harlan Teklad TD.97152；Seagraves和McBride，Mol Genet Metab 2012，107(4):650-658)(本发明称为“无Phe氨基酸膳食”)，其类似于PKU患者医疗食品的现行标准，或用其中唯一的氨基酸来源是补充有0.2％Phe的重组膳食蛋白GSP105的膳食(本发明称为“无Phe GSP105蛋白质膳食”或“无PheGSP105膳食”)。在实验中用Phe补充膳食，因为小鼠否则无法获得这种必需氨基酸。用不含Phe的GSP105蛋白质膳食喂养的小鼠显示体重维持或体重增加，与用无Phe氨基酸膳食喂养的小鼠形成对照，这些小鼠显示体重减轻(图1)。这可以通过重组膳食蛋白质是结构完整的蛋白质来源的事实来解释。虽然在营养学领域存在以下争论，即与游离氨基酸的组合物相比，蛋白质和蛋白质片段是否仍可用于代谢目的，但认为来自结晶氨基酸组合物的可用氨基酸的集合必须被立即代谢，因为身体不能存储它们以供将来代谢使用。然而，蛋白质和蛋白质片段被连续消化，其提供游离氨基酸的连续释放，从而可在较长时间内用于代谢目的。因此，使用本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物可以在更长的时间内提供氨基酸，从而导致体重维持或体重增加。
不受理论束缚，用无Phe氨基酸膳食喂养的小鼠的体重减轻也可源于膳食中缺乏所需的最小Phe量，因为这些动物可实现分解代谢，其中内源性蛋白质被代谢以维持血液中所需的Phe水平。在患有营养不良的PKU患者中也可以观察到这种现象，其代谢内源性蛋白质并且反过来患有血液Phe水平升高。在PKU患者的膳食中完全和绝对的缺乏Phe是不可取的和不可能的，因此PKU患者从他们的食物中获得最少量的必需氨基酸Phe。另一方面营养不良可发生在PKU患者中，因为严格的膳食也会导致其他必需氨基酸的缺乏。因此，使用本发明的重组膳食蛋白质或其营养充足部分或本发明的膳食组合物可以预防PKU患者的营养不良。
实施例
实施例1–候选基因发现
为了鉴定符合无苯丙氨酸营养蛋白质所需标准的潜在蛋白质候选物，使用自行设计的搜索算法。来自各属或种的蛋白质序列使用CLC MainWorkbench 6.6.1的导入特征从UniProt数据库(http://www.uniprot.org)获得。
使用的蛋白质来源于食物的常见来源，如蔬菜(例如马铃薯)，但也来自微生物(例如酵母)或动物(例如牛)。种/属的拉丁名称或通用名称(取决于哪个名称导致较大数量的命中)被用作搜索字符串。下载除了未表征的蛋白质之外的所有命中，产生来自不同物种的总数为836,037个序列。以下搜索字符串被用于鉴定表2中列出的命中。
使用批量为5,000至10,000个序列的CLC内的“创建序列统计”功能进一步产生836,037个基因中的每一个中存在的氨基酸列表。将这些列表导入Excel中，将氨基酸组成与两种营养标准进行比较：所谓的马铃薯-蛋成分(Kartoffel-Ei Standard，KES)，以及制造商Milupa在其PKU1产品中使用的的氨基酸组合物，其为一种用于治疗PKU患者的无Phe氨基酸组合物。
另外，分析了氨基酸序列中Phe的总数以及氨基酸的总数。根据表3中的设置对所有分析的因子进行评级。
表2：用于选择基因和相应的命中数的搜索字符串
超过总分20(Phe含量、分子量和单个蛋白质的KES和PKU1的偏差的得分总和)的命中根据以下人工评级：序列状态(完全或部分)，蛋白质存在(蛋白质水平的证据，从同源性预测、推断)，蛋白质功能和过敏潜力(http://www.allergenonline.org，涵盖80聚体的窗口)。预先选择具有完整序列、蛋白质水平的证据和缺乏过敏潜力的蛋白质，并进一步分析其分子功能。具有已知或预测的DNA/RNA结合活性的所有蛋白质以及毒性蛋白质被排除在潜在候选物列表之外。
在剩余的候选物中，我们鉴定了来自枯草芽孢杆菌(菌株168)的“普通应激蛋白16O(G16O_BACSU)”作为合适的蛋白质候选物。
基于UniProt(www.uniport.org)上发表的蛋白质序列，我们使用CLCMainWorkbench的反向翻译功能设计了合成基因。
表3：蛋白质候选物评估
*偏差计算为在分析的蛋白质序列中的每个氨基酸与KES和PKU1参照组合物比较的相加绝对值(百分比)。
将两个表位标签序列(Tag54-P15，His6-标签)添加到普通应激蛋白(GSP)编码序列的3'末端，以实现特异性蛋白质检测、定量和纯化，得到SEQ IDNO7所示的核苷酸序列。另外，将BamHI和AatII限制酶位点添加到5'和3'末端，使得将基因构建体克隆到表达载体中。
将基因序列命名为GSP105并针对在枯草芽孢杆菌中表达的密码子使用和RNA稳定性进行优化，随后由GenScript(USA)合成。
实施例2–枯草芽孢杆菌的制备
将具有SEQ ID NO 7所示核苷酸序列的合成基因GSP105插入枯草芽孢杆菌表达载体pHT43(MoBiTec，Germany)中，使重组蛋白能够分泌到培养基中，并导入蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株WB800N(MoBiTec)中，遵循制造商的说明。
转化后，在抗生素选择平板上选择阳性克隆；通过PCR、质粒提取和随后的DNA测序进一步证实了表达载体的存在。产生甘油储备培养物并储存在-80℃。
重组枯草芽孢杆菌GSP105的起始培养物如下制备：接种1L TB培养基(Carl Roth，Karlsruhe，Germany)，其补充有氯霉素(Carl Roth)和新霉素(Carl Roth)，每种的终浓度为5μg/ml，且使用1ml枯草芽孢杆菌GSP105储备液。培养物在28℃和160rpm在2.5L“UltraYield Flasks”(Thomson Instrument Company，California，USA)中生长24小时。
对于重组蛋白表达，用起始培养物以1:20(v/v)比接种补充有氯霉素和新霉素的TB培养基。为了诱导靶蛋白的表达，加入IPTG至终浓度0.5μM。将培养物在37℃和160rpm下生长20小时。
培养后，通过离心除去细胞，然后使用0.22μm中空纤维过滤组件(N02-E20U-05-N，Spectrum Labs，Los Angeles，USA)以2.5L/min无菌过滤，其具有高达1.6巴的跨膜压。为了减少处理体积，使用10kDa中空纤维组件(N02-E010-05-N，Spectrum Lab)以2.5L/min和高达1.6巴的跨膜压力将澄清的培养上清液浓缩10倍。
根据制造商的说明，使用装入XK 50/40柱并载有Zn离子的500ml螯合琼脂糖(GEHealthcare，Uppsala，Sweden)，通过IMAC从浓缩的培养上清液中纯化GSP105。将上清液以76cm/h加载到柱上；然后用5柱体积(CV)PBS以92cm/h洗涤柱子。用5CV PBS，pH 8.0,250mM咪唑以92cm/h从柱上洗脱结合的蛋白质。合并IMAC洗脱级分，并使用10kDa中空纤维组件(S02-Eo10-05N，Spectrum Labs)以900ml/min和高达1.6巴的跨膜压力将缓冲液更换为无盐水。为确保有效的缓冲液更换，样品体积被更换七次。将纯化和再缓冲的蛋白质储存在-20℃，随后冻干和喷雾干燥。
通过竞争ELISA(Piotrzkowski等人，PLoS ONE，2012，7(9):e45803)测定GSP105的浓度，通过SDS-Gel和免疫印迹(Rasche等)确认蛋白质完整性和纯度。
实施例3–小鼠进食研究(先导研究)
研究设计：
六只成年、雄性、纯合的PKU小鼠(Pahenu2/2；Shedlovsky等人，Genetics1993，134:1205；http://www.pahdb.mcgill.ca/？Topic＝Information&Section＝Mouse&Page＝1)被分成3组，每组2只小鼠。属于同一组的动物共用一只笼子。如表4中所列，饲喂这些组。膳食之间的主要差异是蛋白质组分和Phe含量，如表5所示。在饲喂研究之前，给PKU小鼠喂食标准小鼠膳食。喂养研究持续了28天，在此期间动物被随意给予食物和水。
表4：动物组和动物膳食(N＝6)
表5：动物膳食
“无Phe的GSP105蛋白质膳食”或“无Phe的GSP105膳食”是指其中唯一的氨基酸来源是补充有0.2％Phe的重组膳食蛋白GSP105的膳食。不含Phe的GSP105蛋白质膳食并非完全不含Phe。纯化的GSP105蛋白质级分含有少量污染物，其可来自痕量培养基或次级代谢物，每100g总蛋白质总计为0.45克Phe。GSP105蛋白本身完全不含Phe。轻微的Phe污染对PKU小鼠没有任何问题。此外，由于Phe是必需氨基酸并且没有替代营养源可供动物使用，因此将结晶Phe添加到无Phe的GSP105蛋白膳食中以达到最终Phe浓度约为0.2％。
“无Phe氨基酸膳食”是指其中唯一的氨基酸来源是不含Phe但含有1.5％Tyr的游离氨基酸混合物的膳食，其类似于PKU患者的医疗食品中的当前标准。无Phe的氨基酸膳食完全不含Phe，而酪氨酸含量增加至1.5％。
在“标准小鼠膳食”中，唯一的蛋白质来源是酪蛋白。
在第0、1、7、14、21和28天，在动物禁食4小时后，从动物的尾静脉取5-10μl血液。通过MS/MS分析确定血浆Phe和酪氨酸含量。
在第0、1、2、4和7天，对小鼠称重并检查它们的一般健康状况。
在第14、21和28天，仅对小鼠称重。在第28天，用CO2对所有动物实施安乐死。收获每只动物的肝脏、肾、脑和心脏并在液氮中冷冻以用于进一步测定。
结果：
体重
喂食标准小鼠膳食导致大体上维持体重(图1，具有正方形的实线)。当喂食无Phe的GSP105蛋白质膳食时，PKU小鼠体重增加(图1，带有圆圈的虚线)，而喂食无Phe氨基酸膳食的那些小鼠表现出轻微的体重减轻(图1，具有三角形的断线)。虽然小组大小不允许进行统计分析，但观察到的趋势支持GSP105作为适合于体重维持和/或体重增加的蛋白质组分。观察到的体重增加可由于其是一种具有比酪蛋白更高的生物学价值的膳食蛋白质。
降低血液Phe水平
具有标准小鼠膳食的PKU小鼠保持血液中升高的平均Phe水平(图2，具有正方形的实线)。无Phe氨基酸膳食导致血液中平均Phe水平急剧下降(<360微摩尔/升，以PKU治疗为目标的生理范围)(图2，具有三角形的断线)。无Phe GSP105蛋白质膳食的动物的平均血液Phe水平也明显降低，28天后接近<360微摩尔/升(图2，带圆圈的虚线)。这些结果表明所公开的重组膳食蛋白质适合于膳食PKU管理。
具有遗传背景C57BL/6的未经治疗的PKU小鼠具有棕色皮毛，而不是在相同背景的野生型小鼠中观察到的黑色皮毛，这种现象称为色素减退。升高的血液Phe水平抑制酪氨酸酶，这破坏了黑色素的合成。喂食无Phe膳食或低Phe膳食的小鼠血液Phe水平降低导致动物体内整体的色素减退不完全但部分地被逆转(图3)。图3显示了具有差异表达的每个膳食组的示例性小鼠在喂食28天后，小鼠皮毛色素减退的或多或少的部分变化。显示每只小鼠的背侧和腹侧。用不含Phe的GSP105蛋白质膳食喂养的小鼠在腹侧显示几乎完全的黑色。黑色和白色箭头表示在喂食期后达到的最强烈的色素减退逆转。我们认为，如果膳食中没有Phe或有低Phe，随着喂养时间延长，皮肤颜色将从棕色完全逆转到黑色。
血浆中的Phe/Tyr比例
不含Phe的氨基酸膳食导致PKU小鼠血浆中Phe/Tyr比率最低(图4，具有三角形的断线)，然后是无Phe的GSP105蛋白质膳食(图4，带圆圈的虚线)。标准小鼠膳食小鼠的PKU小鼠在图4中描绘为具有正方形的实线作为参考。通过减少来自纯化的重组膳食蛋白GSP105的Phe污染物的量和/或通过补充结晶酪氨酸(如无Phe氨基酸膳食中中使用的那样)，或添加含有酪氨酸的设计者尾巴，可以改善无Phe的GSP105蛋白质膳食的Phe/Tyr比率。
实施例4-测量实施例3的PKU小鼠脑中的Phe和Tyr浓度
方法：
小鼠脑组织的制备
使用实施例3的动物的脑。将整个冷冻的小鼠脑在冰上解冻并在含有50μM Tris-HCl、pH 7.5、0.1M KCl、1μM EDTA、1μM二硫苏糖醇、0.2μM苯甲基磺酰氟、1μM亮抑酶肽和1μM胃酶抑素的均质缓冲液(10μl/mg组织)中裂解，并使用Quiagen Tissue Lyser II在4℃下均质化。在13,000g和4℃下离心30分钟后，将上清液在-80℃下冷冻。
蛋白质测量
均质组织中的蛋白质浓度通过Bradford描述的分光光度法测定，使用γ-球蛋白作为校准物。
样品制备和衍生化
根据Phenomenex EZ:faastTM试剂盒手册制备样品，并进行以下修改：在氨基酸提取和衍生化之前，将20μL含有100μmol/L Phe-d5和20μmol/L Tyr-d4(在50mmol/L HCl中)的每种内标溶液加入到40μL样品裂解物中。使用试剂盒的试剂，用氯甲酸丙酯衍生氨基酸，导致分别在氨基酸的胺部分加入甲酸丙酯，在氨基酸的羧基端加入丙基。Tyr的羟基也通过加入甲酸丙酯基团被衍生化。
仪器
对于氨基酸的RP(反相)-HPLC分离，使用250×2mm C18柱(Phenomenex EZ:faastTM)。使用以下程序分离衍生化的氨基酸：(i)等度流动75％溶剂B，持续6分钟；(ii)在9分钟内从75％至95％溶剂B(v/v)的线性梯度；(iii)在0.1分钟内从95％至100％溶剂B的线性梯度；(iv)等度流动100％溶剂B持续3分钟；(v)在0.1分钟内从100％至75％溶剂B的线性梯度；(vi)等度流动75％溶剂B，持续2分钟。溶剂A和B分别为H2O中的10mmol/L甲酸铵和甲醇中的10nmol/L甲酸铵。流速为150μL/min，进样体积为10μL。配备有PerkinElmer Series200自动进样器和两个PerkinElmer Series 200微泵的PerkinElmer SCIEX API 2000LC-ESI-MSMS系统被用于LC-ESI-MSMS分析。使用多反应模式(MRM)正离子模式获得氨基酸，具有以下转变：294→206(Phe)、299→211(Phe-d5)、302→214(Phe-d8)、396→308(Tyr)和400→312(Tyr-d4)。停留时间为500毫秒。在6至20分钟的时间范围内获得质谱。
结果：
脑Phe水平的降低
图5显示野生型(WT)小鼠、用标准小鼠膳食、无Phe GSP105蛋白膳食或无Phe氨基酸膳食治疗的PKU小鼠的脑中平均Phe和Tyr浓度。
野生型(WT)小鼠脑中的氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的平均浓度大致相同(0.31nmolPhe/mg蛋白质；0.36nmol Tyr/mg蛋白质)(图5)，类似于健康人类的情况。
相比之下，用标准小鼠膳食(组1)喂养的PKU小鼠脑中的平均Phe浓度显示10倍增加(Phe 3.82nmol/mg蛋白质)，同时具有0.18nmol/mg蛋白质的低平均Tyr浓度，对应于未经治疗的PKU患者的情况。
与喂食标准小鼠膳食相比，喂食无Phe的GSP105蛋白质膳食(第2组)导致平均脑-Phe浓度减少50％(Phe 1.78nmol/mg蛋白质)，同时保持低的平均Tyr浓度(0.15nmol/mg蛋白质)。
在第3组中使用无Phe氨基酸膳食(Phe 1.16nmol/mg蛋白质；0.22nmol/mg蛋白质)达到最低平均脑-Phe水平和最高平均脑-Tyr水平。
WT小鼠以及治疗和未治疗的PKU小鼠脑中Phe和Tyr浓度的分析结果与不同动物饲养组中相应的血液Phe和血液Tyr水平相匹配(图2和4)。
使用无Phe氨基酸膳食获得脑-Phe浓度的最强降低。考虑到低Phe膳食对脑Phe水平的影响被推迟并且不像对血液Phe浓度的影响那么急剧，我们认为在延长的喂养时间内使用无Phe GSP105蛋白质膳食会进一步减少脑中Phe。该假设基于以下观察结果：在喂食28天后该组内的血液Phe水平接近喂食无Phe氨基酸膳食的小鼠的血液-Phe浓度。
脑中的平均Phe/Tyr比率
图6显示了WT小鼠、用标准小鼠膳食、无Phe GSP105蛋白膳食或无Phe氨基酸膳食治疗的PKU小鼠的脑中的平均Phe/Tyr比率。
无Phe的氨基酸膳食导致PKU小鼠脑中Phe/Tyr比率最低(图6，格子花纹柱)，然后是无Phe的GSP105蛋白膳食(图6，对角条纹柱)。被喂食标准小鼠膳食的PKU小鼠在图6中描绘为具有黑色框架的白色柱。标准膳食的PKU小鼠的Phe/Tyr比率明显更好。通过减少来自纯化的重组膳食蛋白GSP105的Phe污染物的量和/或通过补充结晶酪氨酸(如无Phe氨基酸膳食中所使用的)或添加包含酪氨酸的设计者尾巴，可以改善无Phe GSP105蛋白质膳食。
序列表
<110> 梅泰克斯营养学研究所有限责任公司
<120> 用于治疗PKU的无苯丙氨酸的蛋白质
<130> M10927WO/RN
<150> 16186895.5
<151> 2016年9月1日
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 168
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
Met Ala Leu Thr Lys Glu Gln Thr Gln His Leu Tyr His Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asp Met Gln Lys Glu Leu Ser Gly Glu Lys Lys Glu Thr Glu Ser Met
20 25 30
Thr Glu Glu Val Gly Glu Leu Ser Asn Gly Val Asp Asn His Met Ala
35 40 45
Asp His Gly Thr Leu Val Thr Asp Arg Met Thr Asp Gln Thr Val Lys
50 55 60
Glu Ile Asp Arg Glu Leu Leu Glu Glu Val Asn Arg Ala Leu Gln Lys
65 70 75 80
Met Lys Asp Gly Thr Tyr Gly Val Cys Glu Lys Thr Gly Gln Glu Ile
85 90 95
Pro Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Val Pro Tyr Ala Arg Met Thr Val Glu
100 105 110
Ala Gln Ala Asp Val Glu Asp Asp Leu Glu Thr Asp Ala Pro Ser Tyr
115 120 125
Glu Arg Glu Phe His Glu Gln Val Lys Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr
130 135 140
Ile Asp Gln Lys Ser Ser Gln Thr Tyr Glu Ile Leu Asp Arg Glu Gln
145 150 155 160
Asp Ser Lys Ala Ala Ala Ser Arg
165
<210> 2
<211> 168
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GSP105
<400> 2
Met Ala Leu Thr Lys Glu Gln Thr Gln His Leu Tyr His Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asp Met Gln Lys Glu Leu Ser Gly Glu Lys Lys Glu Thr Glu Ser Met
20 25 30
Thr Glu Glu Val Gly Glu Leu Ser Asn Gly Val Asp Asn His Met Ala
35 40 45
Asp His Gly Thr Leu Val Thr Asp Arg Met Thr Asp Gln Thr Val Lys
50 55 60
Glu Ile Asp Arg Glu Leu Leu Glu Glu Val Asn Arg Ala Leu Gln Lys
65 70 75 80
Met Lys Asp Gly Thr Tyr Gly Val Cys Glu Lys Thr Gly Gln Glu Ile
85 90 95
Pro Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Val Pro Tyr Ala Arg Met Thr Val Glu
100 105 110
Ala Gln Ala Asp Val Glu Asp Asp Leu Glu Thr Asp Ala Pro Ser Tyr
115 120 125
Glu Arg Glu Trp His Glu Gln Val Lys Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr
130 135 140
Ile Asp Gln Lys Ser Ser Gln Thr Tyr Glu Ile Leu Asp Arg Glu Gln
145 150 155 160
Asp Ser Lys Ala Ala Ala Ser Arg
165
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Tag54的表位
<400> 3
Lys Asp Trp Glu His Leu
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有Phe-->Ala替代的Tag54
<400> 4
Lys His Ile Lys Asp Trp Glu His Leu Glu Glu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有Phe-->Tyr替代的Tag54
<400> 5
Lys His Ile Lys Asp Trp Glu His Leu Glu Glu Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 186
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> GSP105-6His-Tag54P15
<400> 6
Met Ala Leu Thr Lys Glu Gln Thr Gln His Leu Tyr His Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asp Met Gln Lys Glu Leu Ser Gly Glu Lys Lys Glu Thr Glu Ser Met
20 25 30
Thr Glu Glu Val Gly Glu Leu Ser Asn Gly Val Asp Asn His Met Ala
35 40 45
Asp His Gly Thr Leu Val Thr Asp Arg Met Thr Asp Gln Thr Val Lys
50 55 60
Glu Ile Asp Arg Glu Leu Leu Glu Glu Val Asn Arg Ala Leu Gln Lys
65 70 75 80
Met Lys Asp Gly Thr Tyr Gly Val Cys Glu Lys Thr Gly Gln Glu Ile
85 90 95
Pro Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Val Pro Tyr Ala Arg Met Thr Val Glu
100 105 110
Ala Gln Ala Asp Val Glu Asp Asp Leu Glu Thr Asp Ala Pro Ser Tyr
115 120 125
Glu Arg Glu Trp His Glu Gln Val Lys Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr
130 135 140
Ile Asp Gln Lys Ser Ser Gln Thr Tyr Glu Ile Leu Asp Arg Glu Gln
145 150 155 160
Asp Ser Lys Ala Ala Ala Ser Arg His His His His His His Lys His
165 170 175
Ile Lys Asp Trp Glu His Leu Glu Glu Ala
180 185
<210> 7
<211> 558
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> G105-6His-Tag54-P15 (枯草芽孢杆菌)
<400> 7
atggcactga caaaagaaca aacgcaacat ctgtatcata aactgcttga catgcaaaaa 60
gaactgagcg gagaaaagaa agaaacggaa tcaatgacag aagaagtcgg tgaattaagc 120
aatggcgtag ataaccatat ggccgatcat ggcacattgg ttacggatcg tatgacagac 180
caaacggtga aagaaattga tagagaactg cttgaagaag tcaatcgcgc attacaaaaa 240
atgaaagatg gcacatatgg agtatgcgaa aaaacgggtc aggaaatccc gtatgaacgt 300
ttagaagcgg tcccttacgc tcggatgaca gttgaagccc aagcagatgt ggaagatgac 360
ttggaaacgg acgcaccgtc ttatgaacgc gaatggcatg aacaggtgaa agatctgtcc 420
aacaaagaaa caattgacca aaaatcaagc cagacgtacg aaatccttga tagagaacag 480
gactctaaag cggccgcttc tagacatcat catcatcatc ataaacatat caaagactgg 540
gaacatctgg aagaagcc 558

Claims (15)

1.重组膳食蛋白质，其由多肽组成，所述多肽由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成。
2.重组膳食蛋白质，其由SEQ ID NO 2的多肽和一种或多种其它蛋白序列组成，其中所述其它蛋白序列为纯化标签或标记。
3.权利要求2的重组膳食蛋白质，其中所述其它蛋白序列为由氨基酸序列SEQ ID NO 3组成的多肽标签。
4.一种载体，其包含编码权利要求1至3任一项的重组膳食蛋白质的核酸序列。
5.重组微生物，其包含权利要求4的载体。
6.权利要求5的重组微生物，其中所述微生物选自埃希杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌、黄单胞杆菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母属、棒状杆菌、链霉菌、沙门氏菌、曲霉、葡糖杆菌、分枝杆菌、放线菌、柄杆菌和毕赤酵母属。
7.权利要求5的重组微生物，其中所述微生物选自谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、肉毒梭状芽孢杆菌、肝素黄杆菌、乳酸乳球菌、扭脱甲基杆菌、游海假交替单细胞菌、真氧产碱杆菌、粗糙脉孢菌、Arxula adeninivorans、多形汉森酵母、乳酸克鲁维斯酵母、拜耳接合酵母、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌。
8.权利要求6的重组微生物，其中所述微生物为芽孢杆菌或假单胞菌的物种。
9.权利要求6至8任一项的重组微生物，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
10.制备权利要求1至3任一项的重组膳食蛋白质的方法，该方法包括将权利要求5至9任一项的重组微生物在适合通过所述重组微生物产生膳食蛋白质的条件下培养。
11.膳食组合物，其包含权利要求1至3任一项的重组膳食蛋白质和任选其它赋形剂。
12.权利要求1至3任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食组合物，所述膳食蛋白质中每100 g蛋白质包含不超过0.45 g苯丙氨酸，所述膳食组合物中每100 g总蛋白质包含不超过0.1 g苯丙氨酸。
13.权利要求1至3任一项的膳食蛋白质或权利要求11的膳食组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗特征为体内苯丙氨酸积聚的疾病。
14.权利要求13的用途，其中所述疾病是高苯丙氨酸血症。
15.权利要求13的用途，其中所述疾病是苯丙酮尿症。
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