JP6951336B2 - 小分子カクテルによるヒトグリア細胞からニューロンへの化学的リプログラミング - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月４日出願の米国特許仮出願第６２／２６３，３５３号に対して優先権を主張するものであり、その開示は、参照によって本明細書に援用されている。

本開示は、一般に、それらに限定されないが、神経傷害、神経変性、加齢、小頭症、ニューロンの欠損をもたらす重篤な発作に関係する状態の予防及び治療に関し、より詳細には、神経修復、神経再生、及び神経保護のために、内部のグリア細胞を機能性ニューロンに変換するための化学物質の組み合わせを含む、組成物及び方法に関する。

脳卒中及びアルツハイマー病などの脳障害では、脳修復のための十分な数の新たなニューロンを再生するための方法がないため、その進行を大きく後退させ得る有効な治療法がない。脳又は脊髄に移植するための外部細胞を用いた細胞移植治療（Ｂｕｈｎｅｍａｎｎら、２００６；Ｅｍｂｏｒｇら、２０１３；Ｎａｇａｉら、２０１０；Ｎａｋａｍｕｒａ及びＯｋａｎｏ、２０１３；Ｏｋｉら、２０１２；Ｓａｈｎｉ及びＫｅｓｓｌｅｒ、２０１０）は、免疫拒絶反応、腫瘍形成、及び分化不確実性などの重大な困難に直面した（Ｌｅｅら、２０１３；Ｌｉｕら、２０１３ｂ；Ｌｕｋｏｖｉｃら、２０１４）。最近の研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でそれらをニューロンに変換する、細胞の転写因子を発現するウイルスが用いられた（Ｈｅｉｎｒｉｃｈら、２０１０；Ｇｒａｎｄｅら、２０１３；Ｔｏｒｐｅｒら、２０１３；Ｇｕｏら、２０１４；Ｎｉｕら、２０１３；Ｓｕら、２０１４）。いくつかの研究では、繊維芽細胞をニューロンに変換する化学物質が用いられるが、依然として、脳又は脊髄に移植する必要があり、免疫拒絶反応、腫瘍形成、及び分化不確実性などの細胞移植の困難全てに直面している（Ｈｕら、２０１５；Ｌｉら、２０１５）。神経変換のためにグリア細胞を用いることは、グリア細胞が神経系全体にわたって常在細胞であり、むしろ神経系内部に制限される幹細胞とは異なるため、大きな利点をもたらす。別の利点は、グリア細胞がそれ自体分裂し、再生できることである。したがって、いくつかのグリア細胞がニューロンに変換される場合、残存したグリア細胞は、分裂し、新しいグリア細胞を生じる可能性がある。本開示は、グリア細胞からニューロンへの変換を促進するための方法の必要性に関連する。

本開示の図及び説明において、セリチニブはＣｅｒと略記され、ピルフェニドンはＰＦＤと略記され、クリゾチニブはＣｒｉと略記され、フルルビプロフェンはＦｌｕと略記され、塩化リチウムはＬｉと略記され、ビタミンＣはＶＣと略記される。化合物の群に関して、ＣＣはクリゾチニブ及びセリチニブを指す。Ｆはフルルビプロフェンを指す。Ｌは塩化リチウムを指す。ＶはビタミンＣを指す。Ｐはピルフェニドンを指す。これらの化合物のそれぞれは、当分野で周知であり、市販されており、化合物はそれぞれ、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、特定の指示でヒトへの投与が個別に認可されているが、今のところ、本開示の用途はいずれも含まれていない。したがって、本開示で実施される手法は、既にヒトでの使用がＦＤＡにより認可されている、化学合成された化合物を用いてグリア細胞をリプログラミングすることを含むために、従来の方法とは少なくとも部分的に大きく異なる。したがって、外来遺伝子、ウイルスベクター、又は改変された細胞を患者へ導入することに関連するリスクを含まず、ニューロンへ分化させるために、あるいは対象に投与するための細胞を調製するために、培養中で幹細胞又は他の多能性細胞を操作する必要もない。代わりに、本開示は、以下により完全に説明される、小分子の組み合わせを用いて、個体に既存するグリア細胞を、ニューロンに変換するようにリプログラミングすることを包含する。組成物及び方法は、ニューロンの欠陥、例えば、傷害後のニューロンの欠損、神経変性、加齢、小頭症、又はニューロンの欠損をもたらす重篤な発作が関与する様々な状態を処置するための、便利で、かつ安全な手法を提供すると期待される。神経傷害は、典型的には、脳及び脊髄などの中枢神経系、ならびに末梢神経系における傷害又は疾患経過後のアストログリア増殖症を含む、当分野で公知のいくつかの原因から起こり得ることが、当業者に認識されるであろう。反応性星状細胞は、グリア性瘢痕の主な細胞成分であり、続いてＮＧ２グリア及びミクログリアがある。したがって、実施形態において、本開示は、星状細胞の化学的に誘起されたリプログラミングによって、星状細胞をニューロンに変換することを含む。しかし、同様の化学的リプログラミング方法を用いて、ＮＧ２グリア又はミクログリア又は脳血管を取り囲む他の細胞種をニューロンに変換することもできる。

ある特定の実施形態において、本開示は、セリチニブ（Ｃｅｒ）、ピルフェニドン（ＰＦＤ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン、塩化リチウム（Ｌｉ）、ビタミンＣ（ＶＣ）、及びその組み合わせからなる群から選択される薬物の組み合わせを投与することを含む。セリチニブは未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤である。ピルフェニドンはＴＧＦ−ベータ合成阻害剤である。クリゾチニブはＡＬＫ及びｃ−ＭＥＴを阻害する。フルルビプロフェンはγ−セクレターゼ阻害剤である。ＬｉＣｌはグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤である。したがって、本開示を推進するために試験した、全部で６種の薬剤がある。特定の実施形態において、本開示は、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕの組み合わせに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される、少なくとも１種の追加の薬剤を投与することを含む。この基準を満たし、本開示の機能を明示する群には、以下の組み合わせ、ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、及びｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕが含まれる。非限定的な実証において、群は、Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、又はそれからなる。これらの群のいずれかは、変換に必要かつ十分であると考えられるが、本開示には、これらの組み合わせのそれぞれが、各群に含まれていない、６種の薬剤の群の他のメンバーのうちの少なくとも１種を含むことも含まれる。

本開示は、本明細書に記載される、任意の化合物の群を含む、又はそれからなる医薬組成物を含む。また、製品、例えば、化合物及び印刷物を含むキットも提供される。印刷物は、化合物が、神経発生を必要とする個体を処置するのに使用されるという指示を示す。個体は、多様な状態に対して、及び／又はニューロン傷害のために、神経発生を必要とする可能性がある。

本開示の図において、代表的な色は、テキストラベル及び矢印によって示される。

示されたＦＤＡ認可済みの薬物群が、培養されたヒトグリア細胞をニューロンへｉｎ ｖｉｔｒｏでリプログラミングすることを示す結果である。図１Ａ。クリゾチニブ、セリチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、及びビタミンＣの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｂ。クリゾチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、ピルフェニドン、及びビタミンＣの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｃ。クリゾチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、及びピルフェニドンの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｄ。クリゾチニブ、セリチニブ、フルルビプロフェン、及び塩化リチウムの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｅ。Ｃｅｒ、ＰＦＤ、Ｃｒｉ、及びＦｌｕ用の溶媒である、ビヒクル対照０．２％ＤＭＳＯでは、１４日後ＮｅｕＮ＋細胞をほとんど示さなかった。図１Ｆ。薬物処置後、ＮｅｕＮ＋細胞数の有意な増加を示す定量解析。図１Ｇ。星状細胞特異的マーカーグルタミン酸輸送体１（Ｇｌｔ１）（緑色（Ｇｒｅｅｎ）、図１Ｇ）、及びヒト核マーカーＨｕＮｕ（青色（Ｂｌｕｅ）、図１Ｈ）の免疫染色によるヒト星状細胞の特性決定、ならびに重ね合わせ画像（図１Ｉ）。 示された化合物によって変換されたニューロンが、培養中で少なくとも２ヶ月生存できることを示す結果。ＣＣＦＬＶ（図２Ａ）又はＣＦＬＰＶ（図２Ｂ）の処置後、星状細胞から変換されたヒトニューロンは、培養中で少なくとも２ヶ月生存し、成熟ニューロンマーカーＭＡＰ２（薄青色（ｌｉｇｈｔ ｂｌｕｅ））及びＮｅｕＮ（赤色（ｒｅｄ））を示した。ＤＡＰＩ（濃青色（ｄａｒｋ ｂｌｕｅ））は細胞核を標識する。 示されたＦＤＡ認可済み薬物の頭蓋内（intracranial）注射により、成体マウス脳において、海馬の成体神経発生が増加することを示すデータ。図３Ａは、新生ニューロンマーカーダブルコルチン（ＤＣＸ、緑色（ｇｒｅｅｎ））及び細胞増殖マーカーＫｉ６７（赤色（ｒｅｄ））の免疫染色によって明らかなように、クリゾチニブ５０μＭ、フルルビプロフェン０．２ｍＭ、ピルフェニドン２μＭ、ビタミンＣ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＬｉＣｌ０．４Ｍを含む小分子カクテル（cocktail；「混合物」ともいう。）２μｌを３ヶ月のＷＴマウスの海馬に頭蓋内注射することによって、成体神経発生が促進されたことを示す。図３Ｂ。ＤＣＸ陽性の新たなニューロン及びＫｉ６７陽性増殖細胞の数の増加によって支持されるように、１歳の成体ＷＴマウスの海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって、歯状回（ＤＧ）の成体神経発生が有意に促進された。図３Ｃ。５ヶ月の、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって、ＤＧのＤＣＸ陽性の新たなニューロンの数が有意に増加した。図３Ｄ。ＧＦＡＰ：：ＧＦＰマウスにおいて、星状細胞はＧＦＰによって標識される。系列追跡分析によれば、ＤＣＸ＋の新たなニューロンが、小分子カクテルによってＧＦＰ標識星状細胞から誘発された。図３Ｅ、図３Ｆ、及び図３Ｇは、ＤＣＸ＋の新たなニューロンの数が、３ヶ月のＷＴマウス（図３Ｅ）、１歳の成体ＷＴマウス（図３Ｆ）、及び５ヶ月のアルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデル（図３Ｇ）の海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって増加したことを示す定量解析を表す。スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、１群あたりｎ＝３マウス。 示されたＦＤＡ認可済み薬物を腹腔内（intraperitoneal）注射することによって、マウス脳の成体神経発生を増やすこともできることを実証するデータ（図４Ａ、図４Ｂ）。ビヒクル対照（図４Ａ、２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、又はクリゾチニブ５０μＭ、フルルビプロフェン０．２ｍＭ、ピルフェニドン２μＭ、ビタミンＣ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＬｉＣｌ０．４Ｍを含む小分子カクテル（図４Ｂ）を腹腔内注射した後の（投与量０．１ｍｌ／１０ｇ重量、１ヶ月間毎日注射された３ヶ月のＷＴマウス）、海馬の歯状回の成体神経発生を示す典型的な画像である。化学的処置の７日後、マウスを屠殺して、新生ニューロンマーカーＤＣＸの免疫染色を用いて調べた（図４Ｃ）。定量解析によれば、ＦＤＡ認可済みの薬物カクテルで処置されたＤＣＸ＋ニューロンの数が増加したことが明らかになった。スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２ペア。

本明細書において特に断りのない限り、本開示で用いられる、全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味をもつ。

本明細書を通して所与される、全ての数値範囲は、その上限値及び下限値を含むだけでなく、その範囲内の全てのより狭い数値範囲も、あたかもこうしたより狭い数値範囲が本明細書に全て明確に記載されているように含む。

本開示は、ヒトグリア細胞を機能性ニューロンに変換するように設計された、組成物及び方法を含む。実施形態において、本開示は、それらに限定される必要はないが、内在性グリア細胞からの新たなニューロンの発生を含み、中枢神経系又は末梢神経系の傷害又は疾患状態のために創出されたグリア様細胞から、示された化合物を用いて新たなニューロンを発生させることを含むことができ、それは、様々な治療法、脳及び脊髄修復を含む治療法の非限定的な実施形態に有用であると期待される。方法は、一般に、それを必要とする個体に、セリチニブ（Ｃｅｒ）、ピルフェニドン（ＰＦＤ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）、ビタミンＣ（ＶＣ）、及びその組み合わせを含む群、又はセリチニブ（Ｃｅｒ）、ピルフェニドン（ＰＦＤ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）、ビタミンＣ（ＶＣ）、及びその組み合わせからなる群から選択される化合物の組み合わせの有効量を投与することを含む。したがって、以下により完全に説明されるように、全部で６種の、試験された薬剤がある。本開示は、これらの薬剤のいずれか１種又は任意の組み合わせを投与することを含む。実施形態において、組み合わせは、化合物のうちの２種、３種、４種、５種、又は６種全てを含み、他の化合物を含んでもよい。実施形態において、本開示は、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕの組み合わせに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される、少なくとも１種の追加の薬剤の使用に関する。

上記の発明の概要に記載したように、特定の実施形態において、本開示は、以下の組み合わせ：ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、及びｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕを含む、またそれらからなる薬物群を投与することを含む。本開示は、これらの組み合わせのそれぞれについて、４種の列挙された各群に含まれない、６種の薬剤の群以外の薬剤の少なくとも１種を含む選択肢を含む。化合物を個体に投与することによって、個体の、少なくともいくつかのグリア細胞がニューロンに変換されることになると予測される。実施形態において、このような化合物は、上記で列挙された化合物と同じ効果、又は類似の効果を有し、その組み合わせの投与によって、グリア細胞からニューロンへの変換をもたらす、代替的な化合物が用いられる。実施形態において、ニューロンへの変換は、およそ７〜１４日間の期間をかけて生じる。

実施形態において、本開示は、ニューロン発生を必要とする任意のヒト対象の治療に広く適用されると期待される。ニューロン発生の必要性は、個体の、ニューロン機能に影響を及ぼし、及び／又は機能性ニューロンの数を減らす、多様な状態、障害、又は傷害のいずれかの結果として生じる。したがって、本開示は、それらに必ずしも限定されないが、虚血性脳損傷、例えば、脳卒中、低酸素症、もしくは他の脳外傷によって引き起こされるもの、又はグリア性瘢痕、又は神経変性、又は加齢、又は小頭症、又はニューロンの欠損を引き起こす重篤な発作を含む状態の予防及び／又は治療に関連する。実施形態において、本開示は、それらに限定されないが、アルツハイマー病、又は痴呆を示す他の状態、又は急性又は反復性の脳外傷（すなわち、震とう）の病歴のある運動選手などの慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、又はパーキンソン病、又はハンチントン病、又は多発性硬化症、又は神経膠腫、又は脊髄傷害、又は脊髄性筋萎縮症、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性障害を処置することに関連する。非限定的な実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏでの神経発生促進の実証は、アルツハイマー病の動物モデルで明らかにされる。

本開示は、改変細胞又はウイルス構築体を対象に導入することを含まず、さらに幹細胞を個体に投与する必要がない。例えば、本発明の手法の態様は、幹細胞を含む細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を必要とせず、重要なことに、従来の技術のプロセスは、幹細胞が自然とニューロンへ分化することができるものの、グリア細胞は、本開示で明示されたようなリプログラミングプロセスを施さずにニューロンになることができないため、本発明者らのグリア細胞からニューロン細胞へのリプログラミングとは異なると予測される。さらに、当業者は、培養された幹細胞又はその分化ニューロンをヒト対象に、特に脳に注入することより、宿主に重大なリスクをもたらすことを認識するであろう。同様に、グリア細胞は神経系内部の内細胞であるが、繊維芽細胞は内細胞ではないため、本発明のグリアからニューロンへの変換技術は、繊維芽細胞からニューロンへのｉｎ ｖｉｔｒｏでの変換とも異なる。したがって、繊維芽細胞変換型ニューロンは、ヒト対象に移植されなければならず、一方で本発明のグリアからニューロンへの変換はｉｎ ｓｉｔｕであり、移植の必要がない。さらに、前述したように、星状膠細胞は、ニューロンへｉｎ ｖｉｖｏで変換することができるが、こうした手法は、対象に特定のリスクをもたらす、ウイルスベクター又は他の外来遺伝子の対象への導入を含むことが明らかである。

本開示は、様々な実施形態において、ニューロンに変換するための、グリア細胞又はグリア様細胞を引き出すように互いに共同して作用する化学化合物を含む、細胞及びウイルスを完全に含まない医薬製剤の使用を提供する。本開示では、これらの化合物が、全身投与によって血液脳関門を通過し、脳内部で作用することができることをｉｎ ｖｉｖｏでの実証を提示する。

実施形態において、本開示は、それを必要とする対象に、Ｃｅｒ、ＰＦＤ、Ｃｒｉ、Ｆｌｕ、Ｌｉ、ＶＣ、及びその組み合わせから選択される化合物の組み合わせを活性成分として含む、１種又は複数の組成物の有効量を投与することを含む。一態様において、本開示は、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕの組み合わせに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される少なくとも１種の追加の薬剤を投与することを含む。本開示に包含される特定の非限定的な化合物の群は、ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、及びｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕを含む。非限定的な実施形態において、これらの化合物の群は、頭蓋内投与及び腹腔内投与の両方を用いて、マウス脳の神経発生を促進することが示される。実施形態において、化合物の群は、Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、又はそれからなる。

これらの化合物のそれぞれは、当分野で公知であり、市販されている。本開示は、これらの化合物のうちの任意の３種、４種、５種、又は６種の群を含み、本明細書に記載されているか、又はそうでなければ所与の本開示の有益性から当業者に明らかである、追加の化合物を含むことができる、組成物及び方法を含む。本開示は、これらの化合物の薬学的に許容される塩、化合物及び塩の類似体、化合物と同じ又は類似の機能をもたらす化合物を含み、ただし、それらの組み合わせを個体に投与することによって、グリア細胞からニューロンへの変換をもたらす。概して、本明細書に記載の、グリア細胞からニューロンへの変換に使用される、任意の特定の化合物については、化合物の薬学的に許容される塩を含む。

実施形態において、本開示は、化合物の組み合わせを個体に（同時に又は逐次的に）投与することを含み、この組み合わせは、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される少なくとも１種の、もしくはたった１種の追加の薬剤を含む、又はそれからなる。

本発明者らが、本明細書に記載の小分子を組み合わせて、ヒト星状細胞から機能性ニューロンに直接的にリプログラミングすることができると発見したことは、本開示の説明、例、及び図から明らかであろう。これらの化学物質は、ＦＤＡによってヒトへの処置が認可され、薬局の店頭で得ることができるので、比較的安全であり、多様な神経傷害、ならびにそれらに限定される必要はないが、脳卒中及びアルツハイマー病などの神経変性状態の治療用の化学物質送達の好都合な手法をもたらすと期待される。

一般に、本開示の方法は、個体のニューロンの数が増えるように、対象に、本明細書に記載の化合物の有効量を投与することを含む。化合物は、ＦＤＡ認可実施済みのものと同じ量か、又は類似の量で投与することができる。ＦＤＡ認可済み薬物それぞれの投与量は、例えばｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ／で見出すことができる。実施形態において、個体の星状細胞などのグリア細胞はリプログラミングされ、その結果ニューロンに変換される。実施形態において、神経発生は、グルタミン酸作動性ニューロンを含む。実施形態において、本開示は、本開示の有益性から明らかなように、当業者によって必要に応じて適応させた、本明細書の方法を用いることによって、新しい皮質の、前脳ニューロン、又は中脳ニューロン、又は後脳ニューロン、又は脊髄ニューロン、又は末梢ニューロン、又はその組み合わせを容易に発達させると期待される。実施形態において、リプログラミングされたニューロンは、それらに限定される必要はないが、Ｄｃｘ及びＮｅｕＮなどのニューロンマーカーの発現によって特性決定される。実施形態において、グリア細胞などの脳の細胞は、ニューロンに変換される。実施形態において、ニューロンは機能性ニューロンである。機能性ニューロンは、それらに限定される必要はないが、興奮性反復活動電位（ｆｉｒｉｎｇ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、複数の樹状分岐の発達、ならびにそれらに限定される必要はないが、グルタミン酸塩（グルタミン酸）、ドーパミン、アセチルコリン、セロトニン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、及びγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの神経伝達物質の放出を含む特性を示すことができる。

本開示に示されたデータは、少なくとも以下の、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ及びＣｅｒ、ＶＣ、又はＰＦＤの少なくとも１種を含む化合物の群が、ヒトグリア細胞からヒトニューロンをｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成をするのに有効であることを実証している。特に、ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、及びｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕの各群は、ヒト星状細胞をニューロンに変換しただけでなく（図１Ａ〜１Ｆ）、変換されたニューロンが、培養中で少なくとも２ヶ月生存できた（図２Ａ及び図２Ｂ）。図１Ｇは、星状細胞特異的マーカーグルタミン酸輸送体１（Ｇｌｔ１）（緑色（Ｇｒｅｅｎ）、図１Ｇ）、及びヒト核マーカーＨｕＮｕ（青色（Ｂｌｕｅ）、図１Ｈ）の免疫染色によるヒト星状細胞の特性決定、ならびに重ね合わせ画像（図１Ｉ）を提示する。

さらに、本開示は、こうしたｉｎ ｖｉｖｏでの手法の非限定的な実証を提示する。特に、頭蓋内投与（図３）及び腹腔内投与（図４）の両方により、哺乳動物脳で神経発生の増加がもたらされる。本開示では、成体マウス脳においてだけでなく、アルツハイマー病をモデルに改変されたマウスの脳（例えば、図３Ｃ）においても、神経発生を増加させることが実証される。したがって、本開示は、哺乳動物脳のｉｎ ｖｉｖｏでの神経発生を促進する、有用な実施例を提示する。さらに、任意の特定の理論に捉われることなく、本開示は、血液脳関門を十分に通過すること（例えば、図４のｉ．ｐ．投与）を証明し、したがって、様々な投与経路に好適であると考えられる。ある特定の、及び非限定的な実施形態において、頭蓋内投与に限定されない投与を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの神経発生は、Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、又はそれからなる化合物の群を用いて促進される。しかし、全体的には本開示のデータに基づけば、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／Ｃｅｒ／ＶＣ／ＰＦＤの少なくとも３種を含む化合物の群も、頭蓋内投与に限定されることなく、神経発生を促進することになると予測される。実施形態において、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、及びＣｅｒ、ＶＣ、又はＰＦＤの少なくとも１種もまた、頭蓋内投与に限定されることなく、哺乳動物脳の神経発生を促進することになる。また、任意の特定の理論に捉われることなく、本明細書で表されたマウスデータは、特にヒト細胞で得られた結果と組み合わせて考えると、本開示の化合物の群のヒトへのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が、ヒト脳の神経発生を促進するのに有効であると予測する根拠を提示すると考えられる。

本開示の化合物を含む組成物は、医薬製剤で提供することができる。医薬調製物の形態は、特に限定されないが、一般に、これらの活性成分及び少なくとも１種の不活性成分を含む。ある特定の実施形態において、好適な医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤との化合物の、いずれか１種、又は組み合わせを混合することによって調製することができ、好適なこうした成分は、当分野で周知である。こうした担体、希釈剤、及び賦形剤のいくつかの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）第２１版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓで見出すことができる。実施形態において、医薬製剤は、血液脳関門をわたって、及び／又は脊髄に、又は中枢神経系の他の成分に、活性成分を送達するのに好適である。こうした組成物は、例えば、液体製剤又は他のナノ粒子ベース送達系を含むことができる。

一実施形態において、医薬製剤は、経口投与に好適であり、したがってエアロゾル化した液体、又は固体剤形で提供することができる。固体剤形は、それらに限定される必要はないが、飲み込むための、又は口内で溶解するための、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、及びストリップ剤を含み、迅速もしくは持続放出のために、又はある期間にわたって所望の系列で様々な化合物を放出するように提供され得る。化合物の１種、又は化合物の任意の組み合わせを含む、個々の医薬組成物を用いることもできる。したがって、医薬製剤は、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される、少なくとも１種の追加の薬剤を含むことができる。本明細書に記載の化合物のいずれかは、本発明の組成物及び方法から除外することができることを理解されたい。

医薬製剤の投与に関して、投与経路は、任意の好適な経路であってもよい。実施形態において、化合物（複数可）を含む組成物は経口で送達される。他の非限定的な実施形態において、組成物は、静脈内に、非経口で、皮下で、腹腔内に、経皮的に、鼻腔内滴下によって、移植によって、又は動脈内に投与される。実施形態において、埋め込み可能な医療機器、例えば、それらに限定されないが、浸透圧ポンプなどのポンプを用いることができる。実施形態において、化合物を含む組成物は、頭蓋内経路を介して送達される。

化合物（複数可）の適切な投与量は、本開示の有益性から当業者の知識と組み合わせて決めることができる。実施形態において、活性成分の有効量及び投与レジメンを決定するとき、個体の体重及び年齢、神経の損傷もしくは疾患の既往歴、ならびに同様の神経損傷を被るリスク、又はグリア性瘢痕もしくは反応性神経膠症の有無が考慮され得る。実施形態において、化合物は、用いられる送達方法に応じて、１日あたり約０．０１ｎｍｏｌ〜約５００ｎｍｏｌ（両端を含み、その間の全ての整数及び範囲を含む）の量で投与される。実施形態において、化合物は、単一の、複数の、又は制御された放出の投与レジメンで与えられる。

ある特定の実施形態において、セリチニブは、約５０ｎＭの濃度で用いられ、ヒト患者に投与される場合に、およそ５〜５００ｎＭのヒト血液中濃度に達するように調整することができる。ピルフェニドンについて、好適な濃度は、およそ５ｎＭであることができる。クリゾチニブについて、好適な濃度は、およそ１２５ｎＭであることができる。フルルビプロフェンについて、好適な濃度は、およそ５００ｎＭであることができる。ＬｉＣｌについて、好適な濃度は、およそ２ｍＭであることができる。ビタミンＣについて、好適な濃度は、およそ５０μｇ／ｍＬであることができる。

ある特定の実施形態において、本開示は、個体に、神経の健全性及び／又は神経の機能の改善に関する有益な効果をもたらすように設計された栄養補助組成物を含む。ある特定の実施形態において、本発明の組成物を用いて、個体の一般的な健康、又は個体の認識能力、例えば記憶力向上もしくは記憶の維持を改善することができる。実施形態において、組成物は、短期記憶、長期記憶、又はそれらに限定される必要はないが、粗大運動技能及び微細運動技能を含む運動技能のいずれか又は全てを改善するのに有用である。したがって、本明細書に記載の小分子を含む栄養補助剤の使用は、本開示に包含されている。

一実施形態において、本開示は、製品を含む。ある特定の態様において、製品は、本明細書に記載の化合物の、１種又は組み合わせを含有する、密閉包装又は密封包装、例えば、個別の錠剤、カプセル剤などを含む。包装は、販売用又は流通用又は薬剤の使用のための、密閉又は密封の、バイアル、ボトル、ブリスター（バブル）パック、又は任意の他の好適な包装などの、１種又は複数の容器を含むことができる。したがって、包装は、Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕに加えて、ＰＦＤ、Ｃｅｒ、ＶＣから選択される、少なくとも１種の追加の薬剤、及び／又は本明細書に記載される他の化合物、もしくは当業者によって好適な添加剤として認識された他の化合物を含む医薬組成物を含有することができる。これらの化合物のいずれか１種又は全てが含まれ、それぞれは、個別に、又は他の１種又は複数と組み合わせて、同じ投与製剤又は異なる投与製剤で提供することができ、その結果、同時に、又は逐次的に送達することができる。

医薬組成物の他に、包装は、印刷された情報を含むことができる。印刷された情報は、ラベル、挿入紙、又は包装材料それ自体に印刷されて施すことができる。印刷された情報は、包装の活性薬剤を識別する情報、不活性成分の量及び種類、医薬組成物（複数可）が処置しようとする状態（複数可）の指示、所与の期間にわたって行われる投与回数、組成物を摂取する順序などの医薬組成物を摂取するための指示を含むことができる。したがって、様々な実施形態において、本開示は、包装材料に包装された本発明の医薬組成物であって、包装材料上又は包装材料内に、組成物が、ニューロンの劣化、ニューロンの不足、又はニューロン機能の欠陥に関係する任意の疾患、状態、又は障害の処置又は予防に使用されることを印刷して識別された医薬組成物を含む。別の実施形態において、本開示は、医薬組成物の代わりに、栄養補助製剤（複数可）、及び認知機能、記憶、運動機能、全体的な健康などを改善するためにこうした製剤（複数可）の使用についての情報を与える印刷物を含む。

以下の特定の実施例は、本発明を例証するものであって、決して限定しようというものではない。

（実施例１）
本実施例は、本明細書に記載のＦＤＡ認可済み薬物群が、ヒトグリア細胞をニューロンへｉｎ ｖｉｔｒｏで変換できることを実証する。

ヒト星状細胞（ＨＡ１８００、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｉｎｃ．）を、セリチニブ（５０ｎＭ、Ｃｅｒ）、クリゾチニブ（１２５ｎＭ、Ｃｒｉ）、塩化リチウム（２ｍＭ、Ｌｉ）、フルルビプロフェン（５００ｎＭ、Ｆｌｕ）、ピルフェニドン（ＰＦＤ、５ｎＭ）、及びビタミンＣ（５０μｇ／ｍＬ、ＶＣ）を合わせた組み合わせで、又は示された異なる組み合わせで、６日間処置することによって、ヒト星状細胞をニューロンに変換したという結果を得た。薬物を含む媒体は、２日毎に変えた。薬物添加後１４日目、細胞をニューロンマーカーＮｅｕＮで免疫染色した。顕微鏡写真に、ニューロンに変換された、多くのヒトグリア細胞を示す。図１Ａ、クリゾチニブ、セリチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、及びビタミンＣの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｂ、クリゾチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、ピルフェニドン、及びビタミンＣの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｃ、クリゾチニブ、フルルビプロフェン、塩化リチウム、及びピルフェニドンの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｄ、クリゾチニブ、セリチニブ、フルルビプロフェン、及び塩化リチウムの組み合わせにより、ヒトグリア細胞がニューロンに変換された。図１Ｅ、Ｃｅｒ、ＰＦＤ、Ｃｒｉ、及びＦｌｕ用の溶媒である、ビヒクル対照０．２％ＤＭＳＯでは、１４日後ＮｅｕＮ＋細胞をほとんど示さなかった。図１Ｆ、薬物処置後、ＮｅｕＮ＋細胞数の有意な増加を示す定量解析：ＤＭＳＯ対照群（１視野あたり６．６±２．７ＮｅｕＮ＋細胞）と比較して、ＣＣＦＬＶ（１視野あたり５６．０±１２．９ＮｅｕＮ＋細胞、２０倍レンズ、０．１ｍｍ^２）、ＣＦＬＰＶ（１視野あたり４７．８±４．７、ＮｅｕＮ＋細胞）、ＣＦＬＰ（１視野あたり３３．３±４．３ＮｅｕＮ＋細胞）、ＣＣＦＬ（１視野あたり３２．４±１．３ＮｅｕＮ＋細胞）。ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。

図２Ａ〜図２Ｂは、示された化合物によって変換されたニューロンが、培養中で少なくとも２ヶ月生存できることを示す結果を提示する。特に、ＣＣＦＬＶ（図２Ａ）又はＣＦＬＰＶ（図２Ｂ）の処置後、星状細胞から変換されたヒトニューロンは、培養中で少なくとも２ヶ月生存し、成熟ニューロンマーカーＭＡＰ２（薄青色（ｌｉｇｈｔ ｂｌｕｅ））及びＮｅｕＮ（赤色（ｒｅｄ））を示した。ＤＡＰＩ（濃青色（ｄａｒｋ ｂｌｕｅ））は細胞核を標識する。

（実施例２）
本実施例は、成体マウス及びアルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルに、化合物の群を頭蓋内投与を用いることによって、本開示の態様である、ｉｎ ｖｉｖｏでの実施態様の非限定的な例を提示する。特に、図３Ａは、新生ニューロンマーカーダブルコルチン（ＤＣＸ、緑色（ｇｒｅｅｎ））及び細胞増殖マーカーＫｉ６７（赤色（ｒｅｄ））の免疫染色によって明らかなように、クリゾチニブ５０μＭ、フルルビプロフェン０．２ｍＭ、ピルフェニドン２μＭ、ビタミンＣ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＬｉＣｌ０．４Ｍを含む小分子カクテル２μｌを３ヶ月のＷＴマウスの海馬に頭蓋内注射することによって、成体神経発生が促進されたことを示す。図３Ｂ。ＤＣＸ陽性の新たなニューロン及びＫｉ６７陽性増殖細胞の数の増加によって支持されるように、１歳の成体ＷＴマウスの海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって、歯状回（ＤＧ）の成体神経発生が有意に促進された。図３Ｃ。５ヶ月の、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって、ＤＧのＤＣＸ陽性の新たなニューロンの数が有意に増加した。図３Ｄ。ＧＦＡＰ：：ＧＦＰマウスにおいて、星状細胞はＧＦＰによって標識される。系列追跡分析によれば、ＤＣＸ＋の新たなニューロンが、小分子カクテルによってＧＦＰ標識星状細胞から誘発された。図３Ｅ、図３Ｆ、及び図３Ｇは、ＤＣＸ＋の新たなニューロンの数が、３ヶ月のＷＴマウス（図３Ｅ）、１歳の成体ＷＴマウス（図３Ｆ）、及び５ヶ月のアルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデル（図３Ｇ）の海馬に小分子カクテルを頭蓋内注射することによって増加したことを示す定量解析を表す。スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、１群あたりｎ＝３マウス。

（実施例３）
本実施例は、本明細書に記載のＦＤＡ認可済み薬物群の腹腔内注射することによって、マウス脳の成体神経発生を増やすこともできることの実証を提示する。特に、図４Ａ及び図４Ｂは、ビヒクル対照（図４Ａ、２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、又はクリゾチニブ５０μＭ、フルルビプロフェン０．２ｍＭ、ピルフェニドン２μＭ、ビタミンＣ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＬｉＣｌ０．４Ｍを含む化合物の群カクテル（図４Ｂ）を腹腔内注射した後の（投与量０．１ｍｌ／１０ｇ重量、１ヶ月間毎日注射された３ヶ月のＷＴマウス）、海馬の歯状回の成体神経発生を示す代表的な画像を提示する。化学的処置の７日後、マウスを屠殺して、新生ニューロンマーカーＤＣＸの免疫染色を用いて調べた（図４Ｃ）。定量解析によれば、ＦＤＡ認可済み薬物カクテルで処理されたＤＣＸ＋ニューロンの数が増加したことが明らかになった。スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２ペア。

本発明は、特定の実施形態によって説明されてきたが、常法による改変は、当業者に明らかであり、こうした改変は、本発明の範囲内にあるものとする。

Claims (21)

1. グリア細胞からニューロンを生成するための医薬の製造における組成物の使用であって、
   前記組成物は、
   クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）からなる主化合物と、
   ビタミンＣ（ＶＣ）、セリチニブ（Ｃｅｒ）、及びピルフェニドン（ＰＦＤ）から選択される少なくとも１種の追加の化合物と
   を含む化合物の群を含む、医薬組成物の製造における使用。
2. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、前記主化合物と、前記追加の化合物が２種とを含む、請求項１に記載の医薬組成物の製造における使用。
3. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、前記主化合物と、前記追加の化合物が１種のみとを含む、請求項１に記載の医薬組成物の製造における使用。
4. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、前記主化合物と、前記追加の化合物が２種のみとを含む、請求項１に記載の医薬組成物の製造における使用。
5. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
   ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、
   ｉｉ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、
   ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、
   又はｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕを含む、請求項１に記載の医薬組成物の製造における使用。
6. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
   ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、
   ｉｉ）Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉ、
   ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、
   又はｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕのみからなる、請求項１に記載の医薬組成物の製造における使用。
7. 前記グリア細胞が、哺乳動物の脳、又は脊髄、又は末梢神経系に存在する、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造における使用。
8. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
   Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、請求項７に記載の医薬組成物の製造における使用。
9. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
   前記Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉのみからなる、請求項８に記載の医薬組成物の製造における使用。
10. 前記医薬組成物が、ニューロンの欠損、グリア性瘢痕、神経傷害、加齢、神経変性、小頭症、重篤な発作、又はそれらの任意の組み合わせから選択される状態のために、前記ニューロンを必要とする個体に投与されるものである、請求項７に記載の医薬組成物の製造における使用。
11. 前記医薬組成物が、虚血性脳損傷のために前記ニューロンを必要とする個体に投与されるものである、請求項７に記載の医薬組成物の製造における使用。
12. 前記医薬組成物が、アルツハイマー病と診断されたか、又はアルツハイマー病を患っていると疑われる個体に投与されるものである、請求項７に記載の医薬組成物の製造における使用。
13. クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）からなる主化合物と、
    ビタミンＣ（ＶＣ）、セリチニブ（Ｃｅｒ）、及びピルフェニドン（ＰＦＤ）から選択される少なくとも１種の追加の化合物と
    を含む化合物の群を含む、グリア細胞のニューロンへの変換するための医薬組成物。
14. クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）からなる主化合物と、
    ビタミンＣ（ＶＣ）、セリチニブ（Ｃｅｒ）、及びピルフェニドン（ＰＦＤ）から選択される少なくとも１種の追加の化合物と
    を含む化合物の群を含む、アルツハイマー病等の脳障害の治療するための医薬組成物。
15. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
    ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、
    ｉｉ）Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉ、
    ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、
    又はｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕを含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
16. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
    Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
17. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
    前記Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉのみからなる、請求項１５に記載の医薬組成物。
18. クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）からなる主化合物と、
    ビタミンＣ（ＶＣ）、セリチニブ（Ｃｅｒ）およびピルフェニドン（ＰＦＤ）から選択される少なくとも１種の追加の化合物と
    を含む化合物の群を含む、グリア細胞のニューロンへの変換するための医薬組成物を含む製品であって、前記化合物の群が、機能性ニューロンの必要性に関連する状態を処置するのに使用されるという指示を示す印刷物をさらに含む、グリア細胞のニューロンへの変換するための製品。
19. クリゾチニブ（Ｃｒｉ）、フルルビプロフェン（Ｆｌｕ）、塩化リチウム（Ｌｉ）からなる主化合物と、
    ビタミンＣ（ＶＣ）、セリチニブ（Ｃｅｒ）およびピルフェニドン（ＰＦＤ）から選択される少なくとも１種の追加の化合物と
    を含む化合物の群を含む、アルツハイマー病等の脳障害の治療するための医薬組成物を含む製品であって、前記化合物の群が、機能性ニューロンの必要性に関連する状態を処置するのに使用されるという指示を示す印刷物をさらに含む、アルツハイマー病等の脳障害の治療するための製品。
20. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
    ｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ／ＶＣ、
    ｉｉ）Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉ、
    ｉｉｉ）Ｃｅｒ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕ、
    又はｉｖ）ＰＦＤ／Ｃｒｉ／Ｌｉ／Ｆｌｕを含む、請求項１８又は１９に記載の製品。
21. 前記主化合物と前記追加の化合物を含む化合物の群は、
    Ｃｒｉ／Ｆｌｕ／ＰＦＤ／ＶＣ／Ｌｉを含む、請求項１８又は１９に記載の製品。

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