IT201800001168A1 - Nuovi farmaci senolitici inibitori alk - Google Patents

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Ajinkya Revandkar
Andrea Alimonti
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Description

"NUOVI FARMACI SENOLITICI INIBITORI ALK”
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce all’uso d’inibitori del recettore tirosin-chinasico ALK, in particolare Alectinib, e composizioni che lo comprendono, come farmaco senolitico. In particolare si riferiscono all’uso d’Inibitori del recettore tirosin-chinasico ALK, in particolare Alectinib, come farmaco senolitico in un metodo di trattamento del tumore o di altre condizioni associate alla senescenza cellulare.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
La senescenza è uno stato in cui la cellula, in risposta a precisi stimoli, perde la capacità replicativa pur mantenendosi metabolicamente attiva. Essa svolge ruoli fisiologicamente importanti durante i processi di invecchiamento e risulta essere cruciale nel contrastare la crescita incontrollata delle cellule tumorali. Nonostante le cellule senescenti si trovino in uno stato non proliferativo, rimangono comunque metabolicamente attive e iniziano a secernere un ampio numero di citochine e fattori pro-infiammatori, assumendo quindi un fenotipo secretorio (senescence-associated secretory phenotype, SASP). Questo “secretoma” è in grado di attivare la risposta immunitaria antitumorale e promuovere la rimozione delle cellule senescenti stesse (“sorveglianza della senescenza”). Tuttavia, ci sono casi in cui le cellule senescenti evadono l’azione protettiva del sistema immunitario permanendo nel sito canceroso e svolgendo, tramite il secretoma, un’azione pro-tumorale in grado di promuovere angiogenesi, migrazione ed invasività cellulare e, di conseguenza, la capacità prometastatica. In questo contesto quindi, la terapia senolitica, ossia la rimozione specifica delle cellule senescenti, emerge come nuova strategia clinica atta a migliorare l’efficacia delle canoniche chemioterapie.
Ad oggi, il numero di farmaci senolitici in commercio risulta essere esiguo e la maggior parte di questi è diretta contro Bcl-2, un noto regolatore di sopravvivenza tipicamente sovra espresso dalle cellule senescenti. L’efficacia di questi composti è tuttavia variabile e strettamente connessa con la genetica delle cellule senescenti stesse, di conseguenza varia a seconda delle diverse caratteristiche inter e intratumorali. Inoltre i farmaci senolitici possono trovare applicazione nella prevenzione e/o trattamento di tutte le patologie associate alla senescenza cellulare.
Scopo della presente invenzione è fornire nuove sostanze con attività senolitica per uso nel trattamento dei tumori e altre patologie associate alla senescenza cellulare.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si basa sulla scoperta che l’inibizione di ALK è in grado di rimuovere selettivamente le cellule senescenti, tale scoperta è supportata dagli esperimenti riportati in dettaglio nella relativa sezione sperimentale della presente descrizione. In sintesi gli esperimenti mostrano che l’inibizione di ALK tramite Alectinib è in grado di rimuovere selettivamente le cellule senescenti. Alectinib, è attualmente impiegato in clinica come farmaco antitumorale nella cura del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). L’Alectinib è stato selezionato come agente senolitico dopo uno screening di circa 1650 composti. I dati sperimentali riportati nella presente domanda di brevetto mostrano che l’Alectinib ha un’attività senolitica paragonabile al composto a ABT-263 (gold standard), in termini di rimozione di cellule senescenti (PICS), ma risulta essere più selettivo impattando meno severamente sui MEF wt (NS). Ulteriori dati in vitro su linee cellulari tumorali e fibroblasti umani dimostrano che Alectinib è un potente farmaco in grado di eliminare selettivamente le cellule senescenti determinando un rallentamento della crescita della maggior parte delle cellule tumorali.
Pertanto un primo oggetto della presente invenzione sono Inibitori del recettore tirosinchinasico ALK, in particolare Alectinib per uso come farmaco senolitico in un metodo di trattamento di un tumore o di una qualsiasi patologia associata alla senescenza cellulare. Un secondo oggetto sono composizioni comprendenti Inibitori del recettore tirosin-chinasico ALK, in particolare Alectinib, per tale uso.
Ulteriori vantaggi, così come le caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione preferite.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura 1 Piattaforma di screening senolitico in PICS. (A) Il grafico a torta rappresenta la composizione in percentuale delle librerie utilizzate in questo screening. (B) Disegno sperimentale dello screening. Le cellule MEFs Pten-/- sono state trattate per 48 ore con Docetaxel alla concentrazione di 750 nM al fine indurre la senescenza. Lo screening inizia quando la proliferazione cellulare è arrestata e l’80% delle cellule mostra un fenotipo senescente. I composti sono stati testati alla singola dose di 10 µM. (C) Rappresentazione dei diversi passaggi di cui si compone lo screening. Al primo posto vi è la validazione dei composti in cellule dove Pten è deleto, successivamente viene indagata la selettività di questi composti introducendo anche le MEF wt, ed infine viene valutata l’IC50. I composti che sodisfano questi filtri verranno poi testati su linee cellulari di cancro, ed infine su modelli preclinici in vivo.
Figura 2. Identificazione di Alectinib come farmaco senolitico. (A) Lo screening senolitico condotto in PICS ha portato all’identificazione di Alectinib come potente farmaco senlitico. Questo composto mostra una forte abilità nell’uccisione delle cellule PICS, rispetto a ABT-263 considerato come controllo positivo. Alectinib mostra una spiccata abilità nella rimozione delle cellule senescenti pur mantenendo vitali le cellule non senescenti, NS. Alectinib è in grado di rimuovere le cellule MEFs (B) ed IMR90 (C) in senescenza replicativa (RS) causata dall’invecchiamento dovuta dall’accorciamento dei telomeri, senza uccidere le cellule non senescenti (NS) come dimostrato dai saggi di Crystal violetto e SA-β-Gal. Una volta dimostrato l’attività senolitica di questo composto in linee primarie, ne abbiamo testato l’attività in linee cellulari di cancro alla prostata, come TrampC1 (D) e PC3 (E). I nostri dati dimostrano la capacità di Alectinib di rimuovere le cellule senescenti in entrambe le linee cellulari.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si compone dei seguenti aspetti, descritti in dettaglio di seguito. Un primo oggetto della presente invenzione riguarda l’uso di inibitori del recettore tirosin chinasico ALK come induttori della morte selettiva di cellule senescenti. Esempi di inibitori del recettore tirosin chinasico ALK sono Ceritinib (CAS 1032900-25-6), Brigantinib (CAS 1197953-54-0), PLB1003, TPX-0005 (CAS#: 2058227-19-1), ASP3026 (CAS № 1097917-15-1), CEP-37440(CAS № 1391712-609). Secondo una forma di realizzazione preferita l’inibitore usato come farmaco senolitico è Alectinib. Di seguito è riportata la formula di struttura del Alectinib:
Nella presente descrizione con il termine “farmaco senolitico” s’intende una sostanza in grado di rimuovere selettivamente le cellule senescenti.
Inibitori del recettore tirosin chinasico ALK, in particolare Alectinib, come farmaco senolitico potrà essere usato in un metodo di prevenzione e/o trattamento di una qualsiasi patologia associata alla senescenza cellulare. Nella presente descrizione con il termine “patologia associata alla senescenza cellulare” s’intende una qualsiasi condizione patologica dovuta all’accumulo di cellule senescenti. La rimozione selettiva di cellule senescenti si propone di apportare un effetto terapeutico, come ad esempio nelle patologie relate all’invecchiamento ed in malattie tumorali.
Inibitori del recettore tirosin chinasico potranno essere usati come farmaci senolitici nella cura di pazienti affetti da cancro, preferibilmente in associazione ad uno o più chemioterapici, ad esempio Docetaxel, Palbociclib, Cisplatino e Doxorubicina. Alectinib sarà vantaggiosamente usato in associazione con uno o più chemioterapici privi di attività senolitica.
Il tumore trattato potrà essere scelto ad esempio tra prostata, ghiandola mammaria, polmoni, pancreas e colon-retto.
L’inibitore del recettore tirosin chinasico ALK, in particolare Alectinib come farmaco senolitico potrà essere utilizzato anche per il trattamento di altre patologie associate alla senescenza cellullare come ad esempio osteoartrite, aterosclerosi, demenza senile, Alzheimer ed altre malattie geriatriche. Nella presente descrizione, con l’espressione malattie associate alla senescenza cellulare, s’intendono anche malattie il cui trattamento, come effetto collaterale, implica un invecchiamento cellulare, come ad esempio il trattamento di neoplasie con raggi-X.
È oggetto della presente anche una composizione farmaceutica comprendente inibitori del recettore tirosin chinasico ALK, come ad esempio Alectinib ed un veicolante e/o un diluente per uso come farmaco senolitico in un metodo di trattamento di una qualsiasi delle condizioni da trattare qui descritte. La composizione comprendente l’inibitore del recettore tirosin chinasico ALK potrà essere orale, parenterale, rettale, transdermica, topica o idonea per altra via di somministrazione. Le composizioni per uso secondo la presente invenzione potranno essere somministrate mediante qualsiasi mezzo convenzionale disponibile per uso unitamente a farmaci, o come agenti terapeutici individuali o in una combinazione di agenti terapeutici. Essi possono essere somministrati da soli, ma generalmente somministrati con un veicolante farmaceutico scelto sulla base della via di somministrazione scelta e della pratica farmaceutica standard. Il dosaggio somministrato, ovviamente, varierà dipendentemente da fattori noti, come le caratteristiche farmacodinamiche del particolare agente e dalla sua modalità e via di somministrazione; dall'età, salute e peso del ricevente; dalla natura e grado dei sintomi, dal tipo di trattamento concomitante; dalla frequenza di trattamento; e dall'effetto desiderato. Si può prevedere che un dosaggio giornaliero di ingrediente attivo sia di circa 0,001 fino a 1000 milligrammi (mg) per chilogrammo (kg) di peso corporeo, con la dose preferita che è di 0,1 fino a circa 30 mg/kg. Forme di dosaggio (composizioni adatte per somministrazione) tipicamente contengono da circa 1 mg a circa 100 mg di ingrediente attivo per unità di dosaggio. In queste composizioni farmaceutiche, l'ingrediente attivo sarà normalmente presente in una quantità di circa 0,1-95% in peso in base al peso totale della composizione.
L’inibitore del recettore tirosin chinasico ALK, come ad esempio Alectinib può essere somministrato per via orale in forme di dosaggio solide, come capsule, compresse, e polveri, o in forme di dosaggio liquide, come elisir, sciroppi, e sospensioni. Esso può essere somministrato anche per via parenterale, in forme di dosaggio liquide sterili. Capsule di gelatina contengono l'ingrediente attivo e veicoli polverizzati, come lattosio, amido, derivati di cellulosa, stearato di magnesio, acido stearico, e simili. Diluenti simili possono essere usati per preparare compresse pressate. Sia compresse che capsule possono essere fabbricate come prodotti a rilascio prolungato per fornire rilascio continuo di medicazione per un periodo di alcune ore. Compresse pressate possono essere rivestite di zucchero o rivestite con pellicola per coprire qualsiasi sapore sgradevole e proteggere la compressa dall'atmosfera, o rivestite con rivestimento enterico per la disintegrazione selettiva nel tratto gastro-intestinale. Forme di dosaggio liquide per somministrazione orale possono contenere coloranti e aromi per aumentare l'accoglienza da parte del paziente. In generale, acqua, un olio adatto, soluzione salina, destrosio acquoso (glucosio), e soluzioni di zuccheri collegati e glicoli come glicole propilenico o glicoli polietilenici sono veicoli adatti per soluzioni parenterali. Soluzioni per somministrazione parenterale contengono preferibilmente un sale solubile in acqua dell'ingrediente attivo, adatti agenti stabilizzanti, e, se necessario, sostanze tamponanti. Agenti antiossidanti come sodio bisolfito, sodio solfito, o acido ascorbico, da soli o combinati, sono agenti stabilizzanti adatti. Vengono usati anche acido citrico e suoi sali e sodio EDTA. Inoltre soluzioni parenterali possono contenere conservanti, come cloruro di benzalconio, metil- o propil-parabene, e clorobutanolo. Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione oltre al Alectinib potranno comprendere uno o più ingredienti attivi, cioè sostanze farmacologicamente attive, in particolare chemioterapici.
L’inibitore del recettore tirosin chinasico ALK, come ad esempio Alectinib, potrà anche essere usato come cosmetico per prevenire e/o rallentare la senescenza cellulare non legata a condizioni patologiche, ad esempio per il miglioramento e/o la prevenzione dei segni dell'invecchiamento cutaneo come rughe, diminuzione della morbidezza e/o della luminosità della pelle e simili.
Sono qui descritti anche i metodi di trattamento terapeutico o cosmetico delle condizioni patologiche sopra dette comprendente un passaggio di somministrazione d’inibitori del recettore ALK o di composizioni che li comprendono. Il metodo potrà essere di trattamento del tumore e comprendere un passaggio precedente alla somministrazione dell’inibitore in cui un campione del paziente è analizzato per rivelare la presenza o assenza di cellule senescenti.
Sono di sotto riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio le metodologie rivelate nella presente descrizione, tali esempi non sono in alcun modo da considerare come una limitazione della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.
SPERIMENTAZIONE
Allo scopo selezionare efficacemente farmaci senolitici è stata ulteriormente implementata la piattaforma per l’identificazione di composti in grado di promuovere la senescenza precedentemente sviluppata nel laboratorio degli inventori (ved.si Kalathur, M. et al. A chemogenomic screening identifies CK2 as a target for prosenescence therapy in PTEN-deficient tumour Nat. Commun.6, 7227 (2015)).
Al fine di poter identificare nuovi composti che possano essere rapidamente traslati alla clinica, senza andare incontro a problemi di sicurezza, tossicità e farmacocinetica, abbiamo scelto di testare l’abilità senolitica di farmaci già approvati per l’utilizzo in abito oncologico. Il nostro studio è iniziato con una libreria di 150 farmaci, che include molecole inibitorie in fase di sviluppo preclinico o correntemente utilizzate nella terapia oncologica. Successivamente, abbiamo esteso il nostro studio ad una gamma più vasta di 1500 composti che comprende:
(1) nuove entità chimiche;
(2) composti in fase avanzata di sviluppo;
(3) farmaci già utilizzati in clinica per la cura di patologie di natura non oncologica (Neurologia, HIV, virologia ecc.);
(4) nuovi farmaci in fase di sviluppo (LOPAC) e (5) composti di origine naturale (Figura 1.A).
La piattaforma che abbiamo messo a punto nel nostro laboratorio è in grado di identificare i composti senolitici sulla base di due parametri: (1) l’inibizione della vitalità cellulare e (2) la rimozione delle cellule positive al saggio di β-Galattosidasi (SA- β – Gal, marcatore di senescenza). Come controllo positivo dei composti in fase di test, abbiamo incluso ABT-263, precedentemente identificato come composto senolitico2. Infine la potenzialità senolitica di questi composti viene testata su fibroblasti murini embrionali (MEF) Pten-/- e WT.
Tecnicamente lo screening è stato condotto in tre passaggi;
- Prima del trattamento, al mezzo di coltura dei MEF (DMEM, 10%FBS, 5% P/S) viene aggiunto Docetaxel, alla concentrazione di 750 nM per 48 ore. Questo farmaco è capace di incrementare all’80% la senescenza dei MEF Pten-/-, senza alterare il ciclo cellulare dei MEF WT (Fig 1B).
- In seguito alle cellule è stato cambiato il medium di coltura e sono state lasciate crescere per 24 ore. Le cellule sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti ad una densità di 5000 cellule per pozzetto. Nei pozzetti più esterni è stato aggiunto PBS, in modo da poter mantenere la corretta umidità all’interno della piastra.
- Infine, 24 ore dopo la semina delle cellule, i composti del nostro studio sono stati addizionati alle cellule per 48 ore alla concentrazione di 10 µM.
Lo screening senolitico permette di filtrare i composti sulla base di tre proprietà:
- Efficacia: il farmaco testato in triplicato, ad una singola concentrazione (10 µM), nei MEF Pten-/- deve essere in grado di apportare una massiccia diminuzione della vitalità cellulare.
- Specificità: il farmaco testato in triplicato, ad una singola concentrazione (10 µM), nei MEF Pten-/- e wt deve essere in grado di apportare una massiccia diminuzione della vitalità delle cellule Pten-/-senza impattare negativamente sui MEFs wt.
- Dose-Risposta: il farmaco testato in duplicato nel saggio di dose-risposta, sia nelle MEF Pten-/-che wt deve permettere il calcolo dell’IC50. I dati di ogni piastra sono stati normalizzati sul rispettivo controllo negativo, a seconda della popolazione cellulare, Ptenfl/fl e Pten-/- (Fig 1C).
Come risultato finale di questo screening di 1650 composti abbiamo identificato Alectinib (nome commerciale Allcensa). Questo farmaco è un inibitore di ALK (Clinical Efficacy of Alectinib in Patients with ALK-Rearranged Non-small Cell Lung Cancer After Ceritinib Failure. Anticancer Res. 37) è attualmente impiegato in clinica come farmaco antitumorale nella cura del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). I nostri dati mostrano che a 10µM Alectinib ha un’efficacia paragonabile a ABT-263, in termini di rimozione di cellule senescenti (PICS), ma risulta essere piú selettivo impattando meno severamente sui MEF wt (NS).
L’attività senolitica di Alectinib è stata validata nel contesto della senescenza replicativa: saggio che mima il naturale processo di invecchiamento cellulare dovuto all’accorciamento dei telomeri. I MEFs sono stati seminati in piatti da 10cm2 (3x105 cellule/piatto). Ogni 3 giorni queste cellule sono state staccate mediante tripsina, contate con Trypan Blu e piastrate nello stesso numero. Questo processo è stato eseguito per 8 passaggi prima di iniziare il trattamento senolitico. Ai passaggi 8 e 9 la senescenza di queste cellule è stata testata tramite il saggio di SA-β-Gal (circa 78% di cellule senescenti).
Al passaggio 8, cellule non senescenti (NS) e cellule in senescenza replicativa (RS) vengono seminate in una piastra da 96 pozzetti (5000 cellule/pozzetto) e trattate a concentrazioni differenti di Alectinib. Alla concentrazione di 10 µM, Alectinib è in grado di rimuovere le cellule senescenti senza impattare sulle cellule NS, come dimostrato dai saggi di Crystal Violetto e SA-β-Gal (Fig.2B).
Questo saggio è stato validati anche con fibroblasti umani, IMR90. Analogamente al protocollo utilizzato per i MEFs, i IMR90 stati seminati in piatti da 10cm2 (3x105 cellule/piatto). Ogni 3 giorni queste cellule sono state staccate mediante tripsina, contate con Trypan Blu e piastrate nello stesso numero. Questo processo è stato eseguito per 33 passaggi prima di iniziare il trattamento senolitico. Ai passaggi 33 e 34 la senescenza di queste cellule è stata testata tramite il saggio di SA-β-Gal (circa 78% di cellule senescenti).
Al passaggio 33 cellule non senescenti (NS) e cellule in senescenza replicativa (RS) vengono seminate in una piastra da 96 pozzetti (5000 cellule/pozzetto) e trattate a concentrazioni differenti di Alectinib. Alla concentrazione di 2.5 µM, Alectinib è in grado di rimuovere le cellule senescenti senza impattare sulle cellule NS, come dimostrato dai saggi di Crystal Violetto e SA-β-Gal (Fig.2C).
Successivamente abbiamo testato gli effetti di Alectinib su linee cellulari di cancro pretrattate con stimolatori di senescenza. Nello specifico ci siamo avvalsi di TrampC1 e PC3, due linee cellulari di cancro alla prostata, rispettivamente murine ed umane. Al fine di indurre in queste cellule la senescenza, abbiamo utilizzato Palbociclib, un inibitore specifico delle cicline 4/6 attualmente impiegato in clinica nella cura del cancro al seno. Una volta che le cellule sono entrate in senescenza, Alectinib è stato addizionato al terreno di coltura alla concentrazione di 5 µM per 48 ore. I nostri dati dimostrano che Alectinib è in grado di rimuovere con successo le cellule senescenti come si evince dai saggi di Crystal Violetto e SA-β-Gal sia in TrampC1 che PC3 (Fig. 2D E).
In conclusione, i nostri dati in vitro mostrano che Alectinib è un potente farmaco in grado di eliminare selettivamente le cellule senescenti.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK come farmaco senolitico in un metodo di prevenzione e/o trattamento di una patologia associata alla senescenza cellulare.
  2. 2. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo la rivendicazione 1 in cui detta patologia è il tumore.
  3. 3. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo la rivendicazione 2 in cui detto tumore è scelto tra tumore del pancreas, prostata, polmoni, vescica, ghiandola mammaria, colo-retto, sarcomi, rene, tiroide.
  4. 4. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in associazione ad un farmaco chemioterapico, in particolare ad un farmaco chemioterapico in grado di attivare la senescenza.
  5. 5. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo la rivendicazione 4 in cui detto farmaco chemioterapico è scelto tra Docetaxel, Palbociclib, Cisplatino, Doxorubicina o loro miscele.
  6. 6. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso nella riduzione degli effetti collaterali derivati dalla senescenza cellulare sistemica indotta da chemioterapia.
  7. 7. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo la rivendicazione 1 in cui detta patologia è scelta tra osteopatie, aterosclerosi, demenza senile, Alzheimer, invecchiamento causato dall’esposizione ai raggi UV, segni dell’invecchiamento e/o delle condizioni patologiche ed invalidanti ad esso connesse.
  8. 8. Inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui detto inibitore è scelto tra Alectinib, Ceritinib,Brigantinib, PLB1003, TPX-0005, AP26113, ASP3026, CEP-37440.
  9. 9. Uso cosmetico di un inibitore del recettore tirosin-chinasico ALK, in particolare dell’ Alectinib, per il miglioramento e/o la prevenzione dei segni dell'invecchiamento cutaneo.
  10. 10. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 comprendente un inibitore del recettore tirosin chinasico ALK e uno o più veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti.
  11. 11. Composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 10 ulteriormente comprendente uno o più ingredienti attivi, in particolare chemioterapici.
  12. 12. Composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 10 o 11 in cui detti ulteriori ingredienti attivi non hanno attività senolitica.
  13. 13. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12 in cui detto inibitore del recettore tirosin chinasico ALK è scelto tra Alectinib, Ceritinib, Brigantinib, PLB1003, TPX-0005, AP26113, ASP3026, CEP-37440.
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