JP6933500B2 - 酵素電極およびそれを用いたバイオセンサ - Google Patents
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Description
(SAM:Self assembled monolayer)を形成する分子を用いる方法は非特許文献1において開示されており、具体的には、HRP(Horseraddish Peroxydase)などの酵素をSAMを形成す
る分子を介して集電体表面に固定化させたことが例示されている。しかし、酵素を吸着等によりSAM形成分子を介して固定する方法については、これまでグルコース測定用バイオ
センサで最も使用される酵素の一つであるグルコース脱水素酵素(Glucose dehydrogenase)においては成功事例は報告されていない。その理由として、一般的なグルコース脱水素酵素の触媒部位は酵素中心部に位置し、電極近傍に固定したとしても集電体に電子伝達が生じにくく、特に、ランダムな吸着等による酵素の固定化では、集電体と酵素の距離が制御できないことなどが考えられた。
そこで、本発明は、グルコース濃度を測定するための酵素電極であって、酵素と集電体の距離が制御され、グルコース濃度を高感度かつ定量的に測定することのできる酵素電極を提供することを課題とする。
集電体を含む電極と、
該集電体表面に結合した単分子膜を形成する分子と、
該分子に結合したCytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素とを含み、
前記グルコース脱水素酵素の酸化還元反応により、グルコース脱水素酵素と集電体間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極を提供する。
前記単分子膜は、分子が一層に配列して形成した膜であり、Cytochrome Cサブユニットを
含むグルコース脱水素酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子伝達サブユニットとしてシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素であり、前記触媒サブユニットは、基質の反応を触媒する機能を持つサブユニットであり、前記電子伝達サブユニットは、電子受容体に電子を伝達する機能をもつサブユニットである。前記酵素電極は、酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接、電極に伝達されることにより、酵素と電極間の電子授受が行われる“直接電子移動型の酵素電極”である。
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、基質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から基質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された基質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置を提供する。
図1は、本発明の実施形態に係る酵素電極を模式的に示した図である。図1において、酵素電極Aは、絶縁性基板4と、電極(集電体)1と、電極1の表面(図1では上面)に単分子膜形成分子2を介して固定化された酵素(Cytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素)3を含む。ただし、絶縁性基板4は必須ではない。
電極1は、集電体である、金(Au)、白金(Pt)、銀(Ag)及びパラジウム(Pd)のような金属材料、或いはグラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、メソポーラスカーボンなどのカーボンに代表される炭素材料を用いて形成される。電極1は、例えば、図1に示すような絶縁性基板4上に形成される。絶縁性基板4は、ポリエーテルイミド(PEI)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレン(PE)のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂(プラスチック)、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極1及び絶縁性基板4の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
本発明の酵素電極を用いて測定されるのは、物質の拡散に依存する電流(拡散律速電流)ではなく、測定対象物質(基質)に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流である。これは、酵素と測定対象物質との反応によって、該酵素から電極へ電子が移動する際に生じる電流である。
単分子膜形成分子は前記集電体に結合し、かつ、酵素分子を結合させることのできる化合物であり、集電体表面に一定方向で複数結合することにより単分子膜を形成できる化合物である。好ましくは、集電体に親和性を有する第一の官能基と、スペーサー部位と、酵素分子の有する官能基と反応しうる第二の官能基を有する。より好ましくは、スペーサー部位の第一の端に集電体に親和性を有する第一の官能基が結合し、スペーサー部位の第二の端に酵素分子の有する官能基と反応しうる第二の官能基が結合した構造を有する。
単分子膜形成分子の集電体表面への結合様式は共有結合、配位結合、イオン結合などの化学的結合やファンデルワールス力などによる物理的結合が挙げられるが、共有結合もしくは、配位結合が好ましい。前記集電体に結合できる第一の官能基としては、集電体が金属の場合、チオール基またはジチオール基が挙げられる。一方、集電体がカーボンの場合、ピレン、ポルフィリンが挙げられる。
なお、Lはスペーサーであり、Xは酵素分子の有する官能基と反応しうる官能基である。
SH-L-X・・・(1)
X-L-S-S-L-X・・・(2)
また、表1に記載のDSO(Dithiobis(succinimidyl octanoate))、DSU(Dithiobis(succinimidyl undecanoate))も使用できる。
このようなジチオールを有する単分子膜形成分子の場合は、1分子につき、酵素分子を2分子結合させることができる。
なお、Pyはピレン、Poはポルフィリン、Lはスペーサーであり、Xは酵素分子の有する官能基と反応しうる官能基である。
Py-L-X・・・(3)
Po-L-X・・・(3’)
1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester :PySE
J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3838-3839,Noncovalent Sidewall Functionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes for Protein
J. Electroanal. Chem., 1994, 365, 157-164,Application of bifunctional reagents for immobilization of proteins on a carbon electrode surface: Oriented immobilization of photosynthetic reaction centers
例示されたPHTの末端はSHとなっているが、例えばN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)ス
クシンイミドなどでSH基の先にスクシンイミド基を付加して酵素のアミノ基と反応させたり、マレイミド基を導入した酵素を用いてマレイミド基を介してPHTに酵素を固定化する
ことが可能である。
17-(1-pyrenyl)- 13-oxo-heptadecanethiol:PHT
Chemical Physics Letters 367 (2003) 747-752
Self-assembly of gold nanoparticles to carbon nanotubes using a thiol-terminated
pyrene as interlinker
酵素3としては、Cytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素(GDH)を用い
る。Cytochrome Cサブユニットを含むGDHは、少なくとも触媒サブユニットおよび電子伝
達サブユニットとしてシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。前記、触媒サブユニットは、基質の反応を触媒する機能を持つサブユニットであり、前記電子伝達サブユニットは、電子受容体に電子を伝達する機能をもつサブユニットである。
GDHの触媒サブユニット及び触媒ドメインは、ピロロキノリンキノン(PQQ)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含むGDHとして、PQQグルコース脱水素酵素(PQQGDH)が挙げられ、FADを含むGDHとして、FADを含んだαサブユニットを持つシトクロムグルコース脱水素酵素が挙げられる。PQQグルコース脱水素酵素(PQQGDH)は、例えば、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ(G3DH from Agrobacterium tumefasience)やPQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質を使用することができる。PQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質は、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。
FADを含むGDHとして、Burkholderia cepacia由来FAD依存グルコース脱水素またはその変
異体が挙げられる。Burkholderia cepacia由来FAD依存グルコース脱水素の変異体として
は、472位及び475位のアミノ酸残基が置換された変異体(WO 2005/103248)、326位、365位および472位のアミノ酸残基が置換された変異体(特開2012-090563)
、365位と326、472、475、及び529位等が置換された変異体(WO 2006/137283)などが挙げられる。
上記酵素電極Aは、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板4の片面に、電極1として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ(例えば100μm程度)のフィルム状の絶縁性基板4の片面に、金属材料を物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜することによって、所望の厚さ(
例えば30nm程度)を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
次に、電極1上に単分子膜形成分子2を結合させる。そして、単分子膜形成分子の反応性官能基と、酵素3のアミノ基またはカルボキシル基を反応させて、単分子膜形成分子を介して酵素3を電極1上に固定化することができる。
本発明の酵素電極はグルコースセンサとしてのバイオセンサに使用できる。バイオセンサは、本発明の酵素電極とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀/塩化銀電極を用いることができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や
、物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜した金属電極を参照極とした3電極系を用いてもよい。
次に、図面を用いて、本発明の測定装置について説明する。ここでは、グルコース測定装置の一態様について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。
図2は、測定装置B内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ18,ポテンショスタット19,電力供給装置11が、筐体内に収容された基板20上に設けられている。
制御コンピュータ18は、ハードウェア的には、CPU(中央演算処理装置)のようなプロセッサと、メモリ(RAM(Random Access Memory),ROM(Read Only Memory))
のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体(例えばROM)に記憶されたプログラムをRAMにロードして実行することによって、出力部10、制御部12、演算部13及び検出部14を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ18は、半導体メモリ(EEPROM,フラッシュメモリ)やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいても良い。
電力供給装置11は、バッテリ16を有しており、制御部コンピュータ18やポテンショスタット19に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置11は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット19は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部12によって制御され、端子CR,Wを用いて、グルコースセンサ17の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Wで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部14に送る。
である。制御コンピュータ18のCPU(制御部12)は、グルコース濃度測定の開始指示を受け付けると、制御部12は、ポテンショスタット19を制御して、作用極への所定の電圧(例えば、銀/塩化銀電極に対し、+100〜500mV、+100〜400mV、または+100〜200mV)を印加し、作用極からの応答電流の測定を開始する(ステップS01)。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。
ップS05)を行っているが、これらのステップの順番を入れ替えることも可能である。
後、アセトンで洗浄し、DSHのアセトン溶液(濃度1μM、10μMまたは90μM)に浸漬し、
25℃で8時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた。続いて、ア
セトンで洗浄し、酵素(Burkholderia cepacia由来FADGDH(濃度0.028mg/ml))を含むHEPES(100μl)に浸漬し、4℃で2時間インキュベートしてDSHの官能基を介して酵素を結合させ、酵素電極を得た。
上記酵素電極(DSH濃度1μM、10μM、90μMのそれぞれで調整したもの各2ロット)を用いて、0mM(バックグラウンド)、1mM、3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極(Ptワイヤ)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を+0.4V
(vs.銀/塩化銀)とし、37℃で行った。
結果を図4に示す。図4に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子(DSH)の濃度が1
μMのときはS/B比が低く、再現性も十分ではなかったが、濃度を10μMにしたときはグル
コース濃度測定に適した再現性及びS/B比が得られた。
(酵素電極の作製)
単分子膜形成分子の有無による直接電子移動効率の違いを確認するため、単分子膜形成分子無しで作製した電極と単分子膜形成分子ありで作製した電極の応答を比較した。具体的には、単分子膜形成分子無しの電極は、金ワイヤ(先端3mm)をピランハ溶液(200μl)
に室温で一晩浸漬し、その後、アセトンで洗浄し、酵素(Burkholderia cepacia由来FADGDH(濃度0.028mg/ml))を含むHEPES(100μl)に浸漬し、4℃で2時間インキュベートし
て酵素を吸着させ、酵素電極を得た。単分子膜形成分子ありの電極は上記工程のピランハ溶液処理後アセトンで洗浄した後、DSHのアセトン溶液(濃度10μM)に浸漬し、25℃で24時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた以外は、同じ工程で
電極を作製した。
上記酵素電極(DSHあり、なしでそれぞれで調製したもの各2ロット)を用いて、0mM(バックグラウンド)、1mM、 3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極(Ptワイヤ)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を+0.4V(vs.銀/塩
化銀)とし、37℃で行った。
結果を図5に示す。図5に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子(DSH)を介して酵
素を固定した場合において、DSHを用いない場合と比較し7.5倍高いグルコース濃度測
定電流値が得られた。
(酵素電極の作製)
単分子膜の鎖長による直接電子移動効率の違いを確認するため、金表面に各単分子膜形成分子を介してCytochrome Cサブユニットを含むGDHを固定化した酵素電極を作製した。単
分子膜形成分子としては、以下のDSH、DSO(Dithiobis(succinimidyl octanoate))、DSU(Dithiobis(succinimidyl undecanoate))を用いた。
具体的には、金ワイヤ(先端3mm)をピランハ溶液(200μl)に室温で一晩浸漬し、その
後、アセトンで洗浄し、各単分子膜形成分子のアセトン溶液(濃度10μM)に浸漬し、2
5℃で24時間インキュベートしてDSHのチオール基を金表面に結合させた。続いて、ア
セトンで洗浄し、酵素(Burkholderia cepacia由来FADGDH (濃度0.028mg/ml))を含むHEPES(100μl)に浸漬し、4℃で2時間インキュベートして酵素を吸着させ、酵素電極を得た。
上記酵素電極(DSH、DSO、DSUでそれぞれで調製したもの各3ロット)を用いて、0mM(バ
ックグラウンド)、1mM、 3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対す
る応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極(Ptワイヤ)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を+0.4V(vs.銀/塩
化銀)とし、37℃で行った。電流が定常になったときの電流値を測定値としてサンプリングした。
結果を図6に示す。図6に示す試験結果によれば、単分子膜形成分子の鎖長が短くなるにつれて高いグルコース濃度測定電流値が得られた。
(アスコルビン酸およびアスコルビン酸の影響の解析)
単分子膜形成分子を介して酵素を固定した電極がアスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響を受けるかを調べた。
具体的には、上記実施例2で作製した酵素電極(DSH、各3ロット)を用いて、1.1mM、0.55mMもしくは0mMアセトアミノフェン水溶液または100μM、50μMもしくは0μMアスコルビ
ン酸に対する応答電流値の測定をリニアスイープボルタンメトリーにより行った。グルコース測定は、対極(Ptワイヤ)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を−
0.2〜+0.8V(vs.銀/塩化銀)とした。結果を図7に示す。その結果、アセトアミノフェンでは400mVを越えたあたりから電流が流れ、アスコルビン酸では200mVを越えたあたりから電流が流れ、グルコースを測定する際にアスコルビン酸やアセトアミノフェンの混入が問題になると考えられた。
そこで、作用極への印加電圧を+100mV(vs.銀/塩化銀)として実施例2と同様の実
験(クロノアンペアメトリー)を行った(各3ロット)。その結果、図8に示すように、
印加電位を+100 mVに下げた場合でも単分子膜形成分子を介して酵素を固定化した電極(with DSH)では電流値を検出することができ、その応答電流値は酵素を直接吸着させた電極(without SAM)より10倍以上高い値であった。
がないかを確かめた。具体的には、上記実施例2で作製した酵素電極(DSH、各3ロット)を用いて、図8と同様の実験(クロノアンペアメトリー)を、100μMアスコルビン酸もしくは1.1mMアセトアミノフェンを含有するグルコース溶液を用いて行った。
その結果、図9,10に示すように、単分子膜形成分子を介して酵素を固定した電極を用い、+100mVの電位を印加したときはアスコルビン酸やアセトアミノフェンが存在すると
きと存在しないときの電流値はほとんど変わらず、アスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響を受けにくいことが分かった。このことは、+150mVの印加電位でも同様であった
。
響とリンカー長さの関係をリニアスイープボルタンメトリー(印加電圧−0.2〜+0.8V(vs.銀/塩化銀))調べた(各3または2ロット)。その結果、図11に示すように、同じ電圧を印加した時でもリンカー長さが長いほどアスコルビン酸やアセトアミノフェンの影響が少ないことが分かった。このことから、単分子膜形成分子のリンカーの長さを長くすることで電極表面への夾雑物の影響をブロッキング可能であることが示唆された。
(酵素電極の作製)
カーボン表面に単分子形成分子を介してCytochrome Cサブユニットを含むGDHを固定化し
た酵素電極を作製した。単分子形成分子としては、以下のPySEを用いた。
1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester :PySE
加え、1時間室温でインキュベート後、室温で1時間アセトンを揮発させPySE修飾メソポーラスカーボン粉末を得た。これにBurkholderia cepacia由来FADGDH(濃度27.7mg/ml)を3μlおよびHEPES (pH8.0, 濃度50mM)を6μl添加し、1時間室温でインキュベートし、スクロ
ース水溶液(濃度20%)を1μl加えて酵素修飾メソポーラスカーボン分散液を得た。これ
を金スパッタにより形成したフィルム状電極(電極面積0.1mm2)に0.05μlずつ4回滴下し、乾燥後、室温でグルタルアルデヒド飽和蒸気環境に1時間静置して架橋し、酵素/PySE修飾メソポーラスカーボンを金電極に固定した。その後、Tris-HCl水溶液(濃度10mM)に20分間電極を浸漬して未反応のGAをブロッキングし、酵素/PySE/メソポーラスカーボン電極を得た。また比較対照としてPySE無しで酵素電極を同時に調製した。具体的にはPySE修飾メソポーラスカーボンの代わりに、56μgの未修飾メソポーラスカーボンにBurkholderia cepacia由来FADGDH(濃度27.7mg/ml)を3μlおよびHEPES (pH8.0, 濃度50mM)を6μl添加し
、スクロース水溶液(濃度20%)を1μl加えて酵素を吸着させたメソポーラスカーボン分
散液を得た。これを金スパッタにより形成したフィルム状電極(電極面積0.1mm2)に0.05μlずつ4回滴下し、乾燥後、室温でグルタルアルデヒド飽和蒸気環境に1時間静置して架
橋し、酵素/PySE修飾メソポーラスカーボンを金電極に固定した。その後、Tris-HCl水溶
液(濃度10mM)に20分間電極を浸漬して未反応のGAをブロッキングし、酵素吸着メソポーラスカーボン電極を得た。
上記酵素電極(DSH濃度1μM、10μM、90μMのそれぞれで調製したもの各2ロット)を用いて、0mM(バックグラウンド)、1mM、3mM、 5mM、 10mM、15mMまたは20mMのグルコース水溶液に対する応答電流値の測定をクロノアンペアメトリーにより行った。グルコース測定は、対極(Ptワイヤ)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を+0.4V
(vs.銀/塩化銀)とし、37℃で行った。電流が定常になったときの電流値を測定値としてサンプリングした。
結果を図12に示す。図12に示す試験結果によれば、単分子形成分子(PySE)を用いて酵素を固定した場合において、吸着のみで電極を調製した場合と比較して2.5倍のグルコ
ース測定電流値が得られた。
1・・・電極
2・・・単分子膜形成分子
3・・・酵素
4・・・絶縁性基板
B・・・測定装置
10・・・出力部
11・・・電力供給装置
12・・・制御部
13・・・演算部
14・・・検出部
15・・・表示部ユニット
16・・・バッテリ
17・・・グルコースセンサ
18・・・制御コンピュータ
19・・・ポテンショスタット
20・・・基板
CR、W・・・端子
Claims (6)
- 集電体を含む電極と、
該集電体表面に結合した単分子膜を形成する分子と、
該分子に結合した、触媒サブユニットおよびCytochrome Cサブユニットを含むグルコース脱水素酵素とを含み、
前記グルコース脱水素酵素の酸化還元反応により、グルコース脱水素酵素と集電体間で電子授受が行われることを特徴とし、
前記集電体が金、パラジウム、銀および白金から選択される金属であり、
前記単分子膜を形成する分子はDithiobis(succinimidyl hexanoate)、Dithiobis(succinimidyl octanoate)またはDithiobis(succinimidyl undecanoate)である、酵素電極。 - 前記グルコース脱水素酵素は、自身のアミノ基と、前記単分子膜を形成する分子が有する官能基との反応により、前記単分子膜を形成する分子に結合している、請求項1に記載の酵素電極。
- 前記単分子膜を形成する分子はサクシンイミド基を有し、該サクシンイミド基と前記グルコース脱水素酵素のアミノ基との反応により、前記グルコース脱水素酵素と結合した、請求項2に記載の酵素電極。
- 直接電子移動型の酵素電極である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素電極。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の酵素電極を備えたバイオセンサ。
- 請求項5に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、基質に由来する電子の電極への移動に基づ
く電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から基質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された基質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
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