JP6890833B2 - 細胞培養装置、および細胞培養方法 - Google Patents
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Description
前記のような細胞培養バッグは、従来、浮遊細胞の培養に用いられていたが、近年では、内面に親水処理や接着コートを施すことによって接着性細胞(足場依存性細胞とも呼ばれる)の培養にも用いられている。
しかしながら、細胞培養の需要が高度化し、より高濃度の細胞濃度での培養や、大容量の容器による大量培養、長期期間の培養、培養中の培地条件等の制御など、より高度な制御が必要になる場合がある。
前記細胞培養容器に取り付けられ、前記培地を循環するための循環ラインと、
前記循環ライン内に設けられ前記細胞培養容器に前記培地を送液する送液ポンプと、
前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段と、を有する細胞培養装置。
<2> 前記ガス交換手段の前記調整用ガスを調整するためのガス調整手段を有する前記<1>記載の細胞培養装置。
<3> 前記調整用ガスが、酸素濃度および、窒素濃度、二酸化炭素濃度、湿度からなる群から選択される少なくとも1以上が調整されたガスである前記<1>または<2>に記載の細胞培養装置。
<4> 前記中空糸膜が、シリコーン製の膜である前記<1>〜<3>のいずれかに記載の細胞培養装置。
<5> 前記細胞培養容器は、所定の間隔をおいて互いに対面するよう配置された2枚の板状部を有する前記<1>〜<4>のいずれかに記載の細胞培養装置。
<6> 前記細胞培養容器が、積層された板状部を有する前記<1>〜<5>のいずれかに記載の細胞培養装置。
<7> 中空状の内層を有する細胞培養容器に培地および細胞液を充填する充填工程と、
前記細胞培養容器に充填された前記細胞を培養する培養工程と、
前記細胞培養容器に取り付けられた前記培地を循環するための循環ライン内に設けられた送液ポンプにより前記循環ライン内の前記培地を送液することで前記循環ライン内の前記培地を循環する循環工程と、
前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段によりガス交換するガス交換工程と、を有する細胞培養方法。
本発明の細胞培養装置は、培地および細胞を充填する中空状の内層を有する細胞培養容器と、前記細胞培養容器に取り付けられ、前記培地を循環するための循環ラインと、前記循環ライン内に設けられ前記細胞培養容器に前記培地を送液する送液ポンプと、前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段とを有する。本発明の細胞培養装置により細胞を培養することで、細胞培養容器内の培地のガス濃度を制御しながらの培養を行うことができる。また、本発明の細胞培養装置は、細胞培養容器内に空気層を必要とせずに培養でき、閉鎖系で、大量の細胞培養に適した装置である。
本発明の細胞培養方法は、中空状の内層を有する細胞培養容器に培地および細胞を充填する充填工程と、前記細胞培養容器に充填された前記細胞を培養する培養工程と、前記細胞培養容器に取り付けられた前記培地を循環するための循環ライン内に設けられた送液ポンプにより前記循環ライン内の前記培地を送液することで前記循環ライン内の前記培地を循環する循環工程と、前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段によりガス交換するガス交換工程とを有する。
本発明の細胞培養方法により細胞を培養することで、細胞培養容器内の培地のガス濃度を制御しながらの培養を行うことができる。また、本発明の細胞培養方法は、細胞培養容器内に空気層が生じない培養に適しており、閉鎖系で、大量の細胞培養に適した方法である。
なお、本願において本発明の細胞培養装置により本発明の細胞培養方法を行うことができ、本願においてそれぞれに対応する構成は相互に利用することができる。
図1は、本発明の細胞培養装置の第一の実施形態を示す概要図である。図1は、細胞培養装置10を示すものである。細胞培養装置10は、細胞培養容器21と、循環ライン311、312、313と、送液ポンプ41と、ガス交換手段51とを有する。
細胞培養容器21は、開口部211、212を有し、開口部211は循環ライン311と接続され、開口部212は循環ライン313に接続されている。
循環ライン311はガス交換手段51の開口部511に接続されている。ガス交換手段の開口部512は、循環ライン312に接続されている。循環ライン312は、送液ポンプ41に接続され、送液ポンプ41は循環ライン313にも接続されている。循環ライン311、312、313は細胞培養容器21内の培地を移送することができるチューブである。
送液ポンプ41は、培地を送液することができ、循環ライン312側から循環ライン313側へのF11方向へ送液するものでもよいし、逆方向のF12方向へ送液するものでもよい。送液ポンプ41の送液により、循環ライン311、312、313や、これらと適宜接続されている細胞培養容器21内や、ガス交換手段51内の培地が順に移送され、培地はこれらの系内で循環する。
ガス交換手段51は、開口部511、512のように培地が循環する部分とは別に、培地が漏出しない開口部513、514を有している。この開口部513、514は、ガスが通過することができる。開口部511、512から導入・導出された培地は、開口部513、514から導入・導出されたガスと、ガス交換し、培地中のガス濃度が調整される。
この培地は、前述のように系内を循環するため、ガス交換手段51内でガス濃度が調整された状態で、細胞培養容器21にも移送される。これにより、細胞培養容器21内で培養されている細胞は、ガス濃度が調整された培地により培養される。また、細胞培養装置10は、細胞培養容器21等の系内の培地がガス交換できる部分を実質ガス交換手段51内のみの閉鎖系として運転でき、開口部513と開口部514とから導入・導出するガスの湿度やガス濃度を管理するだけで、培地のガス交換を制御することができる。
細胞培養容器21は、培地および細胞を充填する中空状の内層を有する。図2〜図4は細胞培養容器21の詳しい構造を説明するための図である。
この内層には、容器内には培地や細胞が充填され、さらに培養中は培地が循環ラインにより循環されるため、液体や細胞による充填率が高い状態で用いることができる。細胞培養を行うときの細胞培養容器21内の培地および細胞の充填率(培地および細胞の総量/内層の容量)は80容積%以上や90容積%以上、95容積%以上、99容積%以上とすることができる。すなわち、実質的に、細胞培養容器21内に空気層を含まない状態で培養を行うことができる。これにより、2枚の板状部の内層側のそれぞれの面(上下の面)が、細胞が接着する場となり、大量の細胞を効率よく培養することができる。
細胞培養装置10は、細胞培養容器21に取り付けられ、細胞培養容器内の培地を循環するための循環ライン311、312、313を有する。循環ライン311〜313には、樹脂製のチューブ等を用いることができる。
細胞培養装置10は、循環ライン312、313間に設けられ細胞培養容器21に培地を送液するための送液ポンプ41を有する。送液ポンプ41は、培地を送液できる任意のポンプを用いることができる。細胞培養装置10、特に細胞培養容器21の内容量や、培養する細胞の種類、培養する量等にもよるが、本発明の細胞培養装置で培養するような通常の細胞培養容器21の大きさに対して、0.01mL/min〜100mL/min程度の送液ができるものなどを用いることができる。この送液は、培養中、連続的に送液し続けるものでもよいし、断続的に送液するものでもよい。また、培養初期は、送液量を少なくしてガス交換手段51でガス交換する培地の量を抑制し、培養後期は送液量を多くしてガス交換手段51でガス交換する培地の量を増加させることができるように、送液量を適宜変更できるものや、プログラムして運転することができるものが好ましい。
送液ポンプ41の送液方向は、ガス交換手段51から吸い込み方向となるF11方向でもよいし、ガス交換手段51に対して送り出し方向となるF12方向でもよい。ガス交換手段51から培地が送出されにくい条件のとき、ガス交換手段51側に送り出すF12方向として、積極的に送り出されるものとしてもよいし、ガス交換手段51で、培地中に開口部513、514から導入されている調整用ガスを吸い込む負圧となりやすいようにガス交換手段51から吸い込み方向となるF11方向としてもよい。なお、送液ポンプは、1台でもよいが送液量やガス交換の効率等を考慮して、適宜複数台設けてもよい。
細胞培養装置10は、循環ライン311、312内に設けられ循環される培地に含まれるガスを調整用ガスとガス交換するためのガス交換手段51を有する。
このガス交換手段51は中空糸膜を有し、中空糸膜の内外に、それぞれ、培地または調整用ガスを流通させることで、中空糸膜を介して、培地と調整用ガスとでガス交換させる。
このガス交換手段は、例えば、複数の中空糸膜を有する中空糸束の両端がその中空部分を開口状態に保持されたまま中空部材内に固定された中空糸膜カートリッジ(いわゆる、ホローファイバーカートリッジ)を用いることができる。中空糸膜の内層又は外層の一方に循環ラインにより循環される培地が流通され、その他方に調整用ガスが流通され、中空糸膜を介して培地と調整用ガスとのガス交換が行われる。
細胞培養装置10では、ガス交換手段51の開口部511、512は、中空糸膜の外層に流通する流体の流路に連通させ、開口部513、514は中空糸膜の内層に流通する流体の流路に連通するものとして設計されている。このため、培地は、中空糸膜の外層を流通し、調整用ガスは内層を流通する。
ガス交換手段51内では、ガス交換のみ行われることが好ましい。このため中空糸膜は、液体の透過率が極めて低い、または透過しないものであり、ガスのみ選択的に透過するものであることが好ましい。このようなガス交換性を有するものとしては、例えば、シリコーン製の中空糸膜などを用いることができる。
図6は、本発明の細胞培養装置の第二の実施形態を示す図である。細胞培養装置11は、第一の細胞培養装置10に加えて、さらに、培地の入れ替え等を行うことができる培地の移送ラインを有する。循環ライン311内に三方継手などを設けて配管611をつないでいる。また、循環ライン313にも三方継手などを設けて配管612をつないでいる。循環ライン311には開閉弁321が、配管611には開閉弁621が設けられており、循環ライン313には開閉弁322が、配管612には開閉弁622が設けられている。これらの開閉弁を調整することで、ガス交換手段51を通る循環を停止して、配管611、配管612を介して細胞培養容器21を系外とつなぐことができる。さらに、外部の送液ポンプ等を利用してF211方向およびF222方向で培地等を流通させたり、F212方向およびF221方向で培地等を流通させることができる。
この配管611、配管612を用いる構成は、運転開始時に、培養容器21に培地等を充填するときや、細胞の種類や実験目的に応じて培養時期等に応じて、培養中に培地を入れ替えるとき、培養を終了し細胞を回収するときなどに用いることができる。
図7は、本発明の細胞培養装置の第三の実施形態を示す図である。細胞培養装置12は、第二の細胞培養装置11に加えて、さらに、ガスポンプ71と、フィルター72を有する。第一の実施形態の細胞培養装置10等に示すように、ガス交換手段51の開口部513、514は単に開放して、雰囲気の空気等が流通するものとしてもよく、空気中の酸素や窒素と、ガス交換手段51に流通される培地とでガス交換し、空気中の酸素濃度等に対応したガス濃度に調整することもできる。
細胞培養装置12は、ガスポンプ71、フィルター72により、さらに積極的にガス交換量の制御等を行うものである。ガスポンプ71は、雰囲気の空気の流通量を上昇させてガス交換量を向上させるものでもよいし、ガスポンプ71で送り出すガスを、ガス濃度を調整したものとしてもよい。
本発明の細胞培養装置は、ガス交換手段51で、調整用ガスと培地とのガス交換を行う。この調製用ガスは、培地のガス濃度を調整するためのものである。調製用ガスは、培地で消費されている酸素を供給するために空気でもよい。また、培養対象に応じて、適宜、酸素濃度や、窒素濃度、二酸化炭素濃度、湿度などを調整したものを用いてもよい。このような各種ガス濃度等が調整されたガスを安定供給するために、前述したようなガスポンプ71を用いて調整用ガスが収容されているタンク等のガスを供給する構成とすることができる。また、このとき、調整用ガスから不純物等が流入したり、ガス交換されたガス中の不純物や副生物を除去するために、適宜、フィルターを介してガス交換手段に導入・導出するガスを調整することもできる。
本発明の細胞培養装置は、細胞培養中に、実質的に細胞培養容器等に含まれる培地が外気と接する場が、ガス交換手段内でのみとする構成のため、このガス交換手段内のガスの制御や管理を行うだけで培養系の管理ができる点で優れている。
これは、例えば、細胞培養容器を常温低湿度の環境においたままの安定した培養もできることを意味し、細胞培養しながら顕微鏡観察を容易に行ったり、細胞培養環境の清浄度が低くともガス交換手段のみ清浄度を高くすることで細胞培養の系内は汚染されない培養ができるといった利点を有する。
図8は、本発明の細胞培養装置に用いられる細胞培養容器の他の実施形態を示すものである。本発明の細胞培養装置において、細胞培養容器は、積層された板状部を有するものであることが好ましい。細胞培養容器21は、それぞれ板状部を有し、容器内の上下の各面が細胞培養時に細胞が接着する接着面となる。このような細胞培養容器21は、複数層積層して用いてもよい。図8においては、6層積層したものである。このとき、各細胞培養容器21の開口部211、212は、開口部211側を多岐管213で連結することができる。多岐管213は、細胞培養容器21の開口部211側に分岐を有し、循環ライン311側は集約され接続口2131の1か所で連結される。同様に、開口部212側は、多岐管214を介して循環ライン313と連結することができる。このような構成とすれば、一の循環ラインや送液ポンプ、ガス交換手段でも、複数の細胞培養容器に、培地循環することができ、省スペースで効率的に多量の接着性の細胞培養を行うことができる。さらに、板状部を有する細胞培養容器を用いているため、培養後の細胞の回収も操作性に優れ、効率的に行うことができる。なお、細胞培養容器の中空状の内層が積層される数は、特に制限はなく、例えば、2以上や、3以上、5以上とすることができ、20以下や、15以下、12以下とすることができる。このとき、各層を構成する部分ごとに分離できるものでもよいし、1枚の板が上下の仕切りとなるように共通するものとしてもよい。
本発明は、このような細胞培養装置を用いた培養方法に関する。本発明の培養方法は、一部前述したように、中空状の内層を有する細胞培養容器に培地および細胞を充填する充填工程と、前記細胞培養容器に充填された前記細胞を培養する培養工程と、前記細胞培養容器に取り付けられた前記培地を循環するための循環ライン内に設けられた送液ポンプにより前記循環ライン内の前記培地を送液することで前記循環ライン内の前記培地を循環する循環工程と、前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段によりガス交換するガス交換工程とを有する。
本発明の培養方法は、中空状の内層を有する細胞培養容器に培地および細胞を充填する充填工程を有する。この充填工程は、細胞培養容器内や、循環ライン等の空気層を細胞懸濁液や培地で満たすように充填する。また、この充填にあたっては、培養対象となる細胞と培地とを細胞培養容器に充填する。細胞懸濁液は、培地を先に充填して細胞を播種することで細胞懸濁液としてもよいし、予め培地に細胞を播種して細胞懸濁液とした状態で、細胞培養容器等に充填してもよい。また、細胞培養容器等から空気層を取り除くために、適宜、脱気して充填したり、排気路を設けて除去してもよい。
本発明の培養方法は、細胞培養容器に充填された細胞を培養する培養工程を有する。なお、培養工程で、細胞は、細胞懸濁液の状態で培養される必要はなく、細胞培養容器に接着した状態で培養される。
培養の対象となる細胞は、特に限定しないでもよい。細胞培養容器内に接着して培養することが好ましいため、接着性を有する細胞などが好適な培養対象となる。例えば、ES細胞や、iPS細胞、幹細胞、線維芽細胞、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞、HEK293(ヒト胎児腎細胞293:Human Embryonic Kidney cells 293)細胞、脂肪細胞などが挙げられる。
本発明の細胞培養に当たって用いる培地は、循環させるため液状培地のような流動性が高い培地であることが好ましい。培地の具体的な組成は、培養対象や、培養目的に応じて適宜調製したものを用いることができる。例えば、DMEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)、MEM培地(Minimum Essential. Medium)、StemFit(登録商標)培地などや、これらを基に適宜成分調整を行ったり、培養目的等に応じて任意の成分を混合したものなどを用いることができる。
培養開始時は、細胞懸濁液などを調整して培地および細胞を細胞培養容器に充填させる。このとき、培養対象の細胞が細胞培養容器の内壁に接着するまでは、培地の循環を停止して培養することが好ましい。播種する細胞量は、細胞の種類や培地との相性、培養期間等を鑑みて適宜設定される。
本発明の細胞培養方法は、細胞培養容器に取り付けられた培地を循環するための循環ライン内に設けられた送液ポンプにより循環ライン内の培地を送液することで循環ライン内の培地を循環する循環工程を有する。この循環工程は、細胞培養容器内で細胞が接着して安定したころから、適宜、連続的や断続的に循環させながら、培養工程と併行して行われる。
本発明の細胞培養方法は、前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするための中空糸膜を有するガス交換手段によりガス交換するガス交換工程とを有する。このガス交換は、限られた場でのガス交換であり、培養条件の管理が行いやすい。一方で、ガス交換手段内では、培地と、調整用ガスとの接触面積を中空糸膜の表面積に応じて広いものとすることができるため、調整用ガスを制御すると優れた応答性でガス交換させて培地のガス濃度を制御することもできる。
・細胞数
細胞計数装置NC−100(株式会社エステムテクノシステムズ社)を用いて細胞数を測定した。
・溶存酸素
DO計(Scientific Bioprocessing社製)により、溶存酸素濃度を測定した。なお、培養温度(37℃)における水の飽和溶存酸素濃度に対する比率で、溶存酸素濃度(%)を求めた。
・顕微鏡観察
倒立顕微鏡(オリンパス社製)により、培養された細胞の状態を顕微観察した像を撮像した。
・細胞培養器
板厚約3mmのポリスチレン製の板を上下の板として用いて、幅260mm、長さ210mm、上下の板間隔8mmの薄い略直方体状の細胞培養容器として使用した。下側に用いる板の内面側は、プラズマ処理を行い接着性が向上するものとした。側壁部分は、ガス透過性のシリコーン膜を四方に配置し、四隅に剛性が高いポリスチレン製の柱を設けて高さを保持するものとした(特開2018−33387号公報参照)。さらに、上面の板に幅方向の両端付近に2か所貫通孔を設け循環ライン用チューブの接続部とした。
・循環ライン
シリコーン製チューブにより、循環ラインを設けた。
・送液ポンプ
送液量約20mL/minまで送液可能な送液ポンプ(ウエルコ社製)を、循環ラインのチューブに接続して送液した。培養開始時は約1〜5mL/minの送液とし、培養状態を観察しながら培養後期は5〜10mL/minの送液を行った。
・シリコーン中空糸ガス分離膜カラム
シリコーン製の中空糸膜を内蔵するシリコーン中空糸ガス分離膜(永柳工業株式会社製「M60(膜本数:4500本)」)を、ガス交換手段として用いた。
・細胞
株式会社アステック内で継代培養している、MRC−5(人、肺組織、正常二倍体線維芽細胞, 胎児肺由来)を用いた。
・培地
MEM培地に牛胎児血清(FBS)を10%添加したものを培養用培地として用いた。
・初期播種細胞数
前記細胞4×106cellsを、細胞培養容器内に播種して、培養を開始した。
第一の実施形態に準じる構成で、前記細胞培養容器に、循環ライン、送液ポンプ、シリコーン中空糸ガス分離膜カラム(ガス交換手段)を取り付けて細胞培養を行った。培養温度は、温度37℃、CO2濃度5%のCO2インキュベーターで培養した。
細胞培養容器単独で、循環ライン、送液ポンプ、シリコーン中空糸ガス分離膜カラムを取り付けずに、細胞培養を行った。
培養開始から、3日目および7日目の溶存酸度濃度(細胞培養容器の平面視方向(略長方形)の中央付近と、端部付近)と、7日培養後の細胞数を測定した。測定結果を表1に示す。また、7日時点での顕微鏡観察結果を図9、図10に示す。図9は比較例1、図10は実施例1の顕微観察結果である。
21 細胞培養容器
211、212 開口部
213、214 多岐管
2131 接続部
311〜313 循環ライン
321、322 開閉弁
41 送液ポンプ
51 ガス交換手段
511〜514 開口部
611、612 配管
621、622 開閉弁
71 ガスポンプ
72 フィルター
Claims (7)
- ポリスチレンおよび、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される樹脂を用いたものであり、2mm〜15mmの間隔をおいて互いに対面するよう配置された少なくとも2枚の板状部を有し、外部から観察することができる中空状の内層を有する細胞培養容器に培地および細胞を充填する充填工程と、
前記細胞培養容器に充填された前記細胞を培養する培養工程と、
前記細胞培養容器に取り付けられた前記培地を循環するための循環ライン内に設けられた送液ポンプにより前記循環ライン内の前記培地を送液することで前記循環ライン内の前記培地を循環する循環工程と、
前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと酸素濃度および、窒素濃度、二酸化炭素濃度、湿度からなる群から選択される少なくとも1以上が調整されたガスである調整用ガスとのガス交換をするためのシリコーン製の中空糸膜を有するガス交換手段によりガス交換するガス交換工程と、を有し、
前記細胞培養容器および前記循環ラインから、気相を脱気し、前記細胞培養容器の前記板状部の対面する両面に、接着性細胞を接着させて培養する細胞培養方法。 - 前記充填工程における、前記細胞培養容器内の培地および細胞の充填率(培地および細胞の総量/内層の容量)は、90容積%以上である、請求項1に記載の細胞培養方法。
- 前記循環工程の前記送液ポンプの送液量が、0.01mL/min〜100mL/minである請求項1または2に記載の細胞培養方法。
- 培地および細胞を充填する中空状の内層を有する細胞培養容器と、
前記細胞培養容器に取り付けられ、前記培地を循環するための循環ラインと、
前記循環ライン内に設けられ前記細胞培養容器に前記培地を送液する送液ポンプと、
前記循環ライン内に設けられ前記循環ライン内で循環される前記培地に含まれるガスと調整用ガスとのガス交換をするためのシリコーン製の中空糸膜を有するガス交換手段と、
前記細胞培養容器および前記循環ラインから脱気するための脱気部及び/または排気路を有し、
前記調整用ガスが、酸素濃度および、窒素濃度、二酸化炭素濃度、湿度からなる群から選択される少なくとも1以上が調整されたガスであり、
前記細胞培養容器が、ポリスチレンおよび、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される樹脂を用いたものであり、所定の間隔をおいて互いに対面するよう配置された少なくとも2枚の板状部を有し、外部から観察することができ、
前記互いに対面するように配置された2枚の板状部の間隔が、2mm〜15mmであり、
前記細胞培養容器の前記2枚の板状部の前記内層を挟んで対面する両面が、同時に接着性細胞が接着して培養される面である接着性細胞を培養するための細胞培養装置。 - 前記ガス交換手段の前記調整用ガスを調整するためのガス調整手段を有する請求項4に記載の細胞培養装置。
- 前記循環ラインが開閉弁を有し、前記開閉弁を切り替えることで、前記ガス交換手段を通る循環を停止して、培地を流通させるための配管を有する請求項4または5に記載の細胞培養装置。
- 前記細胞培養容器が、積層された板状部を有する請求項4〜6のいずれかに記載の細胞培養装置。
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